具有纖維素酶活性的多肽以及編碼它的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有纖維素酶活性的分離多肽。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及包含這些多核苷酸的宿主細(xì)胞，連同生產(chǎn)和使用這些多肽的方法。
【專利說明】具有纖維素酶活性的多肽以及編碼它的多核苷酸[0001] 參考序列表
[0002]本申請包含計算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及具有纖維素酶活性的多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及包含這些多核苷酸的宿主細(xì)胞連同生產(chǎn)和使用這些多肽的方法。
[0005]相關(guān)技術(shù)說明
[0006]蟄龍介屬魔玉蟲(Terebella Iapidaria)(林奈(Linaeus), 1767)是只在海洋環(huán)境中生活的一種多毛動物。標(biāo)本典型地長3-9cm并且直徑4-5_。
[0007]蟄龍介屬魔玉蟲(T.1apidaria)是將沙粒粘結(jié)在一起形成管狀生境的管構(gòu)建者。使用它們的多個帶槽的觸須，它們以有機(jī)材料、藻類和或小動物為食。蟄龍介屬魔玉蟲是具有廣泛生態(tài)分布的海洋物種，可以發(fā)現(xiàn)于深達(dá)30-40m的潮間帶和潮下帶，潮間帶和潮下帶兩者都是移動基體，例如沙、泥沙以及泥，而且還可以發(fā)現(xiàn)在硬基體上，例如巖層。
[0008]像很多食沙和巖屑的多毛動物一樣，蟄龍介(Terebella)具有有力的消化生物表面活性劑的系統(tǒng)，并且該消化系統(tǒng)產(chǎn)生的酶已經(jīng)明顯演化至在中性PH或近中性pH的表面活性劑環(huán)境中有效發(fā)揮作用。
[0009]本發(fā)明提供了具有纖維素酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明涉及具有纖維素酶活性的分離多肽，這些分離多肽選自下組，該組由以下各項組成:
[0012](a)與SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列一致性的一種多肽；
[0013](b)在中等嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)其基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的一種多肽；
[0014](c)與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸編碼的一種多肽；
[0015](d)在一個或多個(例如若干個)位置處包含一個取代、刪除、和/或插入的SEQID NO: 2的成熟多肽的變體；以及
[0016](e)具有纖維素酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一個片段。
[0017]本發(fā)明還涉及包含選自下組的GH9催化結(jié)構(gòu)域的分離多肽，該組由以下各項組成:
[0018](a)與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至428具有至少60%序列一致性的一個催化結(jié)構(gòu)域；
[0019](b)在中等嚴(yán)格條件下與⑴SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295，(ii)其基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的一個催化結(jié)構(gòu)域；
[0020](c)與SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295或其基因組DNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸編碼的一個催化結(jié)構(gòu)域；
[0021](d)在一個或多個(例如若干個)位置處包含一個取代、刪除、和/或插入的SEQID NO: 2的氨基酸I至428的變體；以及
[0022](e)具有纖維素酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的GH9催化結(jié)構(gòu)域的一個片段。
[0023]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載體；包含這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0024]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的纖維素的組合物，特別是洗滌劑組合物，以及用于織物處理和用于紙漿與紙?zhí)幚淼慕M合物。
[0025]附圖簡要說明
[0026]圖1示出對于纖維素酶的pH最佳值，使用具有還原糖試驗的PASC確定。該酶展示廣泛的PH最佳值并且對于此酶，最佳pH值為6。從pH6至9，活性為超過80%的最大活性。菱形，PASC+酶；三角形，PASC-酶。
[0027]圖2示出蟄龍介屬魔玉蟲的溫度曲線，在0.1M磷酸鈉，pH7的0.2%AZCL_HE_纖維素上確定。
[0028]圖3示出與兩種商品,Endolase和Whitezym相比,蟄龍介屬纖維素酶的洗漆性能，柱標(biāo)記為U33M5。
[0029]定義
[0030]纖維素酶:術(shù)語“纖維素酶”是指催化(6-1, 4-葡聚糖中連接兩個葡糖基殘基的
3-1，4-鍵水解的內(nèi)切3-1，4-葡聚糖`酶活性(EC3.2.1.4.)。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)實例中描述的程序確定纖維素酶活性。
[0031]本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的纖維素酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0032]葡聚糖內(nèi)切酶:術(shù)語“葡聚糖內(nèi)切酶”是指內(nèi)切-1，4-(1, 3; 1，4) - @ -D-葡聚糖
4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1，4-P-D-糖苷鍵，混合的(6-1, 3葡聚糖(例如谷物P-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的(6-1, 4鍵，以及含有纖維素組分的其他植物材料的內(nèi)切水解。可以通過測量底物粘度的減小，或通過還原糖試驗確定還原端增加來確定葡聚糖內(nèi)切酶活性(Zhang(張)等人,Biotechnology Advances (生物技術(shù)進(jìn)展)24:452-481)。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)Ghose (高斯)，1987，Pure and Appl.Chem (純粹化學(xué)和應(yīng)用化學(xué))59:257-268的程序，在pH5，40°C下，使用羧甲基纖維素作為底物，確定葡聚糖內(nèi)切酶活性。
[0033]等位變體:術(shù)語“等位變體”是指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可變形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽沒有變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0034]結(jié)合域:術(shù)語“纖維素結(jié)合域”是指介導(dǎo)酶結(jié)合至纖維素底物的非晶區(qū)域的酶的區(qū)域。纖維素結(jié)合域(CBD)典型地發(fā)現(xiàn)于葡聚糖內(nèi)切酶的N末端亦或C末端末尾。
[0035]催化結(jié)構(gòu)域:術(shù)語“催化結(jié)構(gòu)域”是指含有酶的催化機(jī)構(gòu)的酶的區(qū)域。
[0036]cDNA:術(shù)語“cDNA”是指可以通過得自真核或原核細(xì)胞的，從成熟的、剪接的mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄子是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。
[0037]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”是指多核苷酸，其直接明確多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放讀碼框確定，其以起始密碼子例如ATG、GTG或TTG開始，并以終止密碼子例如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0038]控制序列:術(shù)語“控制序列”是指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各個控制序列可以相對于編碼多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這樣的控制序列包括但不局限于前導(dǎo)序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詾檫@些控制序列提供為了特定限制性位點引入的接頭，促進(jìn)這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)連接。
[0039]表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括產(chǎn)生多肽涉及的任何步驟，包括但不局限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
[0040]表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地與提供了其表達(dá)的控制序列相連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0041]片段:術(shù)語“片段”是指具有從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基端刪除的一個或多個(例如，若干個)氨基酸的多肽或催化結(jié)構(gòu)域；其中，該片段具有纖維素酶活性。在一個方面，片段含有至少300個氨基酸殘基，例如含有SEQ ID NO: 2的氨基酸3-428的片段。
[0042]高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“高等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡(Southern blotting)程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE,0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0043]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指對轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細(xì)胞類型，其具有包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0044]分離的:術(shù)語“分離的”是指處于非天然出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括(I)任何非天然出現(xiàn)的物質(zhì)，(2)任何物質(zhì)，包括但不局限于從與其性質(zhì)上相關(guān)的一種或多種或所有天然發(fā)生的組分至少部分除去的任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；⑶相對于自然中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，由人手工修飾的物質(zhì)；或⑷通過相對于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝；使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子更強(qiáng)的啟動子)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0045]低等嚴(yán)格條件:術(shù)語“低等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0046]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”是指在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。在一個方面，成熟多肽是SEQ IDNO:2的氨基酸I至428。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽的混合物(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。[0047]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有纖維素酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295，或其基因組DNA序列。
[0048]中等嚴(yán)格條件:術(shù)語“中等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0049]中高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“中高等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0050]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸區(qū)段的、或合成的單鏈亦或雙鏈的核酸分子，它包含一個或多個控制序列。
[0051]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”是指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置處，這樣使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
[0052]純化的:術(shù)語“純化的”是指從語氣天然相關(guān)的至少一種組分除去的多肽或多核苷酸。例如，如通過SDS-PAGE確定的，多肽可以是至少1%純，例如至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純或至少95%純，并且如通過瓊脂糖電泳確定的，多核苷酸可以是至少1%純，例如至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純、或至少95%純。
[0053]序列一致性:用參數(shù)“序列一致性”來描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。
[0054]為了本發(fā)明的目標(biāo)，使用Needleman (尼德曼)-Wunsch (翁施)算法(Needleman (尼德曼)和Wunsch (翁施)，1970, J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)期刊)48:443-453)確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性，例如像在EMBOSS包中的Needle (尼德爾)程序中實施(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件套裝),Rice (賴斯)等人,2000, Trends Genet (遺傳學(xué)趨勢)，16:276-277)，優(yōu)選是版本5.0.0或更新版本。使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位拓展罰分0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長一致性”的Needle (尼德爾)的輸出(使用_ nobrief選項獲得)被用作百分比一致性并且被計算如下:
[0055](一致的殘基X100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0056]為了本發(fā)明的目標(biāo)，使用Needleman (尼德曼)-Wunsch (翁施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，1970,同上)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性，如在EMBOSS包中的Needle (尼德爾)程序中實施(EMB0SS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite (EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套裝),Rice (賴斯)等人，2000，同上)，優(yōu)選是版本5.0.0或更新版本。使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位拓展罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。標(biāo)記為“最長一致性”的Needle (尼德爾)的輸出(使用-nobrief選項獲得)被用作百分比一致性并且被計算如下:
[0057](一致的脫氧核糖核酸XlOO)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0058]子序列:術(shù)語“子序列”是指具有從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端刪除的一個或多個(例如，若干個)核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼具有纖維素酶活性的片段。在一個方面，子序列含有至少900個核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸9至1293)。
[0059]變體:術(shù)語“變體”是指包含一個變更(即在一個或多個位置處取代、插入、和/或刪除一個或多個(例如若干個)氨基酸殘基)的具有纖維素酶活性的一個多肽。取代是指用不同的氨基酸替換占據(jù)一個位置的氨基酸；刪除是指除去占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入是指添加與占據(jù)一個位置的氨基酸相鄰的氨基酸。
[0060]非常高等嚴(yán)格條件:術(shù)語“非常高等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0061]非常低等嚴(yán)格條件:術(shù)語“非常低等嚴(yán)格條件”是指進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0062]發(fā)明詳述
[0063]具有纖維素酶活性的多肽
[0064]在一個實施例中，本發(fā)明涉及與`SEQ ID N0:2成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的分離多肽，這
些多肽具有纖維素酶活性。在一個方面，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽只有不超過十個氨基酸不同，例如九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸、或一個氨基酸。
[0065]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位變體或由它們組成；或是其具有纖維素酶活性的片段。在另一個方面，多肽包含SEQ ID N0:2的成熟多肽或由其構(gòu)成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸I至428或由其構(gòu)成。
[0066]在另一個實施例中，本發(fā)明涉及在非常低等嚴(yán)格條件、低等嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中高等嚴(yán)格條件、高等嚴(yán)格條件、或非常高等嚴(yán)格條件下與以下雜交的多核苷酸編碼的具有纖維素酶活性的分離多肽:(i) SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)其基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長補(bǔ)體(Sambrook(薩姆布魯克)等人，1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南)，第二版,Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約)。
[0067]SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，連同SEQ ID NO: 2的多肽或其片段可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法用于設(shè)計核酸探針以鑒定和克隆來自不同屬或種的株系的、編碼具有纖維素酶活性的多肽的DNA。具體而言，標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，這樣的探針可以用于與感興趣的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。這樣的探針可以大大短于整個序列，但是長度應(yīng)該至少為15個，例如至少25個、至少35個、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、或至少900個核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測相應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0068]可以從制備自此類其他株系的基因組DNA或cDNA文庫中篩選出與上述探針雜交的并且編碼具有纖維素酶活性的多肽的DNA。來自此類其他株系的基因組或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或其他分離技術(shù)而進(jìn)行分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他合適的載體材料上。為鑒定與SEQ ID NO:1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印跡法中優(yōu)選使用載體材料。
[0069]對于本發(fā)明的目標(biāo)，雜交是指，在非常低等到非常高等的嚴(yán)格條件下，多核苷酸雜交到對應(yīng)于以下的標(biāo)記的核酸探針上:(i) SEQ ID NO:1 ；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(iii)或其基因組DNA序列；(iv)其全長補(bǔ)體；或(V)其一個子序列。在這些條件下，核酸探針雜交的分子可以使用例如X射線膠片而進(jìn)行檢測。
[0070]在一個方面，核酸探針是SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295。在另一個方面，核酸探針是編碼SEQ ID NO: 2的多肽；其成熟多肽；或其一個片段的一個多核苷酸。在另一個方面，核酸探針是SEQ ID NO:1或其基因組序列。
[0071]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，非常低等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在45 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0072]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，低等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0073]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，中等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0074]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，中高等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42 °C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和亦或35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0075]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，高等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。[0076]對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，非常高等嚴(yán)格條件被定義為最佳進(jìn)行12至24小時的標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序之后，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在70V下洗滌三次,每次15分鐘。
[0077]在另一個實施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸編碼的具有纖維素酶活性的分離多肽。
[0078]在另一個實施例中，本發(fā)明涉及在一個或多個(例如若干個)位置處包含一個取代、刪除、和/或插入的SEQ ID NO: 2的成熟多肽的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變的性質(zhì)小，即不會顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是一個至約30個氨基酸的小段刪除；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；高達(dá)約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而促進(jìn)純化的小段延伸，例如多組氨酸序列段、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0079]保守取代的實例在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)?？傮w上不會改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且例如由H.Neurath(諾伊拉特)和R.L.Hill (希爾)描述于The Proteins (蛋白質(zhì))中，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，紐約。常見取代是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly。
[0080]可替代地，氨基酸改變本質(zhì)是多肽的物理化學(xué)特性的改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性、改變最佳pH、等。
`[0081]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知程序來鑒定多肽中的必需氨基酸，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham(坎寧安)和 Wells (威爾斯)，1989，Science (科學(xué))244:1081-1085)。在后一技術(shù)中，在分子中的每個殘基處引入單一的丙氨酸突變，并對得到的突變體分子檢驗纖維素酶活性從而鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見Hilton (希爾頓)等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點氨基酸的突變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學(xué)相互作用。參見例如de Vos(德福斯)等人，Science (科學(xué))255:306-312 ;Smith (史密斯)等人，1992，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)224:899-904 ;Wlodaver (沃勒達(dá)爾)等人，F(xiàn)EBS Lett.(歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)盟通訊)309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對推斷鑒別必需氨基酸。
[0082]在SEQ ID N0:2的氨基酸I至428的序列中的必需氨基酸位于位置Asp56、Asp69和Glu216。因此不應(yīng)取代或刪除這些位置。
[0083]可以使用誘變、重組、和/或改組的已知方法，隨后是相關(guān)篩選程序，例如由Reidhaar (雷德哈爾)-Olson (奧爾森)和Sauer (薩奧爾)，1988，Science (科學(xué))241:53-57 ;Bowie(鮑伊)和 Sauer(薩奧爾),1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院院刊)86:2152-2156 ；W095/17413 ;或W095/22625披露的那些，進(jìn)行單個或多個氨基酸取代、刪除和/或插入并對其進(jìn)行檢驗。可以使用的其他方法包括易錯PCR、噬菌體展不(例如 Lowman (洛曼)等人，1991，Biochemistry (生物化學(xué))30:10832-10837 ;美國專利號 5，223，409 ;W092/06204)以及區(qū)域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire (德比希爾)等人，1986，Gene (基因)46:145 ;Ner(內(nèi)爾)等人，1988，DNA7:127)。
[0084]可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness (內(nèi)斯)等人，1999，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
[0085]在一個實施例中，引入SEQ ID NO: 2的成熟多肽的氨基酸取代、刪除和/或插入的個數(shù)不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。
[0086]多肽可以是雜合多肽，其中一個多肽的區(qū)域融合在另一多肽的區(qū)域的N末端或C末端。
[0087]多肽還可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本發(fā)明的多肽的N-末端或C-末端。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且融合多肽的表達(dá)處于相同的一個或多個啟動子和終止子的控制下。還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中在翻譯后產(chǎn)生融合多肽(Cooper(庫珀)等人，1993，EMB0J.(歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志)12:2575-2583 ;Dawson (道森)等人，1994，Science (科學(xué))266:776-779)。
[0088]融合多肽可以進(jìn)一步包括兩個多肽之間的一個切割位點。在融合多肽分泌時，切割該位點釋放兩個多肽。切割位點的實例包括但不局限于以下各項中披露的位點:Martin (馬丁)等人，2003, J.1nd.Microbiol.Biotechnol.(工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志?)3:568-5 76; Svetina (斯韋蒂納)等人，2000，J.Biotechnol.(生物技術(shù)期刊)76:245-251; Rasmussen (拉斯馬森)-Wilson (威爾遜)等人，1997, Appl.Environ.Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))63:3488-3493 ；ffard (華德)等人，1995, Biotechnology (生物技術(shù))13:498-503 ；以及 Contreras (孔特拉斯)等人，1991, Biotechnology (生物技術(shù))9:378-381 ；Eaton (伊頓)等人，1986, Biochemistry (生物化學(xué))25:505-512 ；Collins (柯林斯)-Racie (萊斯)等人，1995, Biotechnology (生物技術(shù))13:982-987 ；Carter (卡特)等人，I989，Proteins: Structure, Function, andGenetics(蛋白質(zhì):結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué))6:240-248 ;以及Stevens (史蒂文斯),2003, DrugDiscovery World(世界藥物發(fā)現(xiàn))4:35-48。
[0089]具有纖維素酶活性的多肽的來源
[0090]本發(fā)明的具有纖維素酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。為了本發(fā)明的目標(biāo)，結(jié)合給定來源，如在此使用，術(shù)語“獲得自”應(yīng)指由該來源或由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的株系產(chǎn)生的多核苷酸編碼的多肽。在一個方面，獲得自給定來源的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0091]該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性菌多肽，例如具有纖維素酶活性的芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、腸球菌、土芽孢桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、海洋芽胞桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、或鏈霉菌多肽，或革蘭氏陰性菌多肽，例如彎曲桿菌、大腸桿菌、黃質(zhì)菌、梭菌、螺桿菌、泥桿菌、奈瑟菌、假單胞菌、沙門氏菌、或脲原體多肽。
[0092]在一個方面，該多肽是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌多肽。
[0093]在另一方面，該多肽是馬鏈球菌、化膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸疫亞種多肽。 [0094]在另一方面，該多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰鏈絲菌、或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0095]該多肽還可以是真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵母、克魯維酵母菌、畢赤酵母、子囊菌、裂殖酵母、或亞羅酵母多肽；或絲狀真菌多肽，例如或一種絲狀真菌多肽例如支頂孢、落葉松蕈、支鏈孢、曲霉、短梗霉、一種輪紋病菌(Botryospaeria)、擬蠟菌、毛喙殼屬菌、金孢子菌、麥角菌、旋孢腔菌、擬鬼傘屬菌、家白蟻、棒囊孢殼菌、栗疫屬菌、隱球酵母、殼色單隔孢屬菌、黑耳屬菌、一種真菌(Filibasidium)、鐮刀菌、赤霉菌、全鞭毛蟲、腐質(zhì)霉、IE齒菌、香燕、小球腔菌、大毀殼屬菌、一種嗜熱菌(Melanocarpus)、亞灰樹花菌、毛霉菌、蝕絲霉屬菌、新美鞭菌、脈孢菌、擬青霉屬菌、青霉菌、平革菌、梨囊鞭菌屬、一種真菌(Poitrasia)、假黑盤菌、一種鞭毛蟲(Pseudotrichonympha)、根毛霉、裂裙菌、柱頂孢霉、踝節(jié)菌、嗜熱子囊菌、梭孢殼菌、彎頸霉、木霉屬菌、長毛盤菌、輪枝孢屬菌、小包腳菇、或炭角菌多肽。
[0096]在另一個方面，該多肽是卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯費酵母、諾地酶母、或卵形酵母多肽。
[0097]在另一個方面中，該多肽是解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、一種霉菌(Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、一種真菌(Chrysosporium Iucknowense)、一種真菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、一種真菌(Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、一種真菌(Chrysosporium zonatum)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白囊耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、無色梭孢殼、一種真菌(Thielavia albomyces)、一種真菌(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢殼、一種真菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、一種真菌(Thielavia peruviana)、毛梭孢殼、瘤孢梭孢殼、耐熱梭孢殼、太瑞斯梭孢殼霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉多妝。
[0098]在其他方面，該多肽衍生自海洋生物，例如多毛動物，例如蟄龍介屬物種,例如蟄龍介屬魔玉蟲(Terebella Iapidaria)。
[0099]將理解，對于上述物種，本發(fā)明涵蓋了完全和不完全狀態(tài)以及其他分類學(xué)上的等效物，例如無性型，不管它們所已知的種類名稱是什么。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地識別鑒定適當(dāng)?shù)刃铩?br> [0100]在多個培養(yǎng)物保藏，例如美國種質(zhì)保存中心(ATCC)、德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)、荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)、以及農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(NRRL)中，對于公眾而言，這些物種的株系是容易獲得的。該多肽可以被鑒定或獲得自其他來源，包括使用上述探針從自然界(例如土壤、堆肥、水、等)分離的微生物。用于從自然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可以通過類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼該多肽的多核苷酸。一旦已經(jīng)用這個或這些探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，那么可以通過利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸(參見例如Sambrook(薩姆布魯克)等人，1989,同上)。
[0101]多核苷酸
[0102]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的分離的編碼多肽的多核苷酸，如以上所述。
[0103]用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且包括分離自基因組DNA或cDNA或其組合。來自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以是有效的，例如通過使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選，以檢測具有共享的結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。參見例如Innis (英尼斯)等人，1990, PCR: A Guide to Methods andApplication (PCR:方法和應(yīng)用的指導(dǎo)),Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)。該多核苷酸可以克隆自蟄龍介屬株系或相關(guān)有機(jī)體，并且因此，例如可以是該多核苷酸多肽編碼區(qū)的等位基因的或物種的變體。
[0104]對于合成基本上類似于該多肽的多肽而言，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的修飾可以是必需的。術(shù)語“基本上類似于”該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽在一些工程化方式方面可以不同于從其天然來源分離的多肽，例如具體活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH、等方面不同的變體?？梢匀缦聵?gòu)建這些變體:在呈現(xiàn)為在SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列(例如其子序列)的多核苷酸的基礎(chǔ)上，和/或通過引入不導(dǎo)致多肽的氨基酸序列變化 的核苷酸取代，但是其對應(yīng)于旨在用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子使用，或通過引入可以引起不同氨基酸序列的核苷酸取代。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如 Ford(福特)等人，1991,Protein Expression and Purification(蛋白表達(dá)與純化)2:95-107。
[0105]核酸構(gòu)建體
[0106]本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至一個或多個控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列可比較的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0107]可以按多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0108]控制序列可以是啟動子序列，由宿主細(xì)胞識別的多核苷酸，用于表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。啟動子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的、和雜交的啟動子，并且可以獲得自編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因，對于宿主細(xì)胞而言，是同源的亦或異源的。[0109]在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，適合指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動子的實例是獲得自以下各項的啟動子:解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌a -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(Egon (埃貢)等人，1988, Gene (基因)69:301-315),天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因(dagA)、
[0110]和原核(6-內(nèi)酰胺酶基因(Villa(維拉)-Kamaroff (卡瑪諾夫)等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國國家科學(xué)院院刊)75:3727-3731)，連同tac啟動子(DeBoer (德波爾)等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院院刊)80:21-25)。另外的啟動子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria (來自重組細(xì)菌的有用蛋白)”, Gilbert (吉爾伯特)等人，1980, Scientific American (科學(xué)美國人)，242:74-94 ；以及Sambrook(薩姆布魯克)等人，1989,同上。
[0111]在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是獲得自以下各項的基因的啟動子:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶-樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢菌Daria (達(dá)莉亞)(W000/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn(奎恩)(W000/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉3 -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶1、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶I1、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶II1、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶IV、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉
木糖苷酶，連同NA2_tpi啟動子(來自編碼中性a-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子；非限制性實例包括來自編碼中性a-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子)；及其突變的、截短的、和雜交的啟動子。
`[0112]在酵母宿主中，有用的啟動子獲得自以下各項的基因:釀酒酵母烯醇酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992, Yeast (酵母)8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動子。
[0113]控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列。該終止子序列可操作地連接至編碼該多肽的多核苷酸的3’末端。本發(fā)明中可以使用在選擇的宿主細(xì)胞中具有功能的任何終止子。
[0114]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項的基因中獲得的:構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0115]酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項的基因中獲得的:釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸去氫酶。Romanos (羅馬諾斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子。
[0116]控制序列還可以是一個合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時是對于通過宿主細(xì)胞來翻譯而言重要的mRNA的一個非翻譯區(qū)。該前導(dǎo)序列可操作地連接至編碼該多肽的多核苷酸的5’末端?？梢允褂迷谶x擇的宿主細(xì)胞中具有功能的任何前導(dǎo)序列。
[0117]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從以下各項的基因中獲得的:米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。
[0118]酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)子是從以下各項的基因中獲得的:釀酒酵母烯醇酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a -因子、和釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。
[0119]控制序列還可以是一種多腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3’ -末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時由宿主細(xì)胞識別為將多腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號的序列?？梢允褂迷谶x擇的宿主細(xì)胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。
[0120]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的多腺苷酸化序列是從以下各項的基因中獲得的:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉a-葡糖苷酶。
[0121]Guo (郭)&Sherman (謝爾曼)，1995, Mol.Cellular Biol.(分子與細(xì)胞生物學(xué)雜志)15:5983-5990描述了酵母宿主細(xì)胞的有用的多腺苷酸化序列。
[0122]控制序列還可 以是編碼連接至多肽的N末端的信號肽并指導(dǎo)該多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)域。該多核苷酸的編碼序列的5’-端可以固有地包含在翻譯讀碼框內(nèi)與編碼該多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的信號肽編碼序列。可替代地，編碼序列的5’-端可以包含對編碼序列是外源的信號肽編碼序列。該編碼序列不天然地包含一個信號肽編碼序列時，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲?，外源信號肽編碼序列可簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑中的任何信號肽編碼序列。
[0123]細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項的基因中獲得的信號肽編碼序列:芽孢桿菌NCIB11837麥芽淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌(6-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA。Simonen(西蒙納)和Palva(帕爾瓦)，1993,Microbiological Reviews (微生物學(xué)評論)57:109-137描述了另外的信號肽。
[0124]絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項的基因中獲得的信號肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉葡聚糖內(nèi)切酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0125]酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽是從以下各項的基因中獲得的:釀酒酵母a -因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。Romanos (羅馬諾斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信號肽編碼序列。
[0126]控制序列還可以是編碼位于多肽的N末端的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原一般是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化切割或自動催化切割前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項的基因中獲得:枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母a-因子。
[0127]在多肽的N末端處信號肽序列和前肽序列都存在的情況下，前肽序列定位成緊鄰多肽的N末端并且信號肽序列定位成緊鄰前肽序列的N末端。
[0128]還會令人希望的是，添加相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些，包括調(diào)控化合物的存在。在原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、以及trp f呆縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKA a -淀粉酶啟動子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其他實例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤存在下，被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
[0129]表達(dá)載體
[0130]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以產(chǎn)生一個重組表達(dá)載體，這一重組表達(dá)載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這類位點處插入或取代編碼該多肽的多核苷酸。可替代地，通過將該多核苷酸或者包含該序列的核酸構(gòu)建體插入到用于表達(dá)的適當(dāng)載體中可以表達(dá)該多核苷酸。在產(chǎn)生該表達(dá)載體過程中，將編碼序列定位在該載體中，這樣使得編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0131]重組表達(dá)載體可為可便利地經(jīng)受重組DNA程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可為線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0132]該載體可以是一種自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，該載體的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自我復(fù)制任何裝置?？商鎌代地，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個或多個染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒、或兩個或更多個載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含了有待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總DNA)、或轉(zhuǎn)座子。
[0133]該載體優(yōu)選包含允許容易選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或類似細(xì)胞的一個或多個選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型、等。
[0134]細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar (草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG (乳清酸核苷_5’磷酸脫羧酶)、SC (硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌bar基因。[0135]該載體優(yōu)選包含允許將該載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者該載體在細(xì)胞中不依賴該基因組而自主復(fù)制的一個或多個元件。
[0136]對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組在一個或多個染色體內(nèi)的一個或多個精確位置處整合到該宿主細(xì)胞的基因組中的額外的多核苷酸。為了增加在一個精確位置處整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10，000個堿基對、400至10，000個堿基對、以及800至10，000個堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，通過非同源重組可以將該載體整合到該宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。
[0137]對于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細(xì)胞內(nèi)起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制因子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制因子”是指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0138]細(xì)菌的復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、PACYC177、以及pACYC184以及允許在芽孢桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060、以及PAM ^ I的復(fù)制起點。
[0139]用于在酵母宿主細(xì)胞內(nèi)使用的復(fù)制起點的實例是2微米的復(fù)制起點ARS1、ARS4、ARSl與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0140]在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI (Gems (格姆斯)等人，1991, Gene (基因)98:61-67; Cullen (卡倫)等人，1987, Nucleic Acids Res.(核酸研究)15:9163-9175 ;W000/24883)。根據(jù)W000/24883中披露的方法可以實現(xiàn)AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建。
[0141]可以將本發(fā)明的多 核苷酸的多于一個的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個額外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含一個可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因與該多核苷酸可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)選擇性試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因拷貝和由此額外的多核苷酸拷貝的細(xì)胞。
[0142]用于連接上文所述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是熟知的(參見，例如Sambrook(薩拉布魯克)等人，1989，同上)。
[0143]宿主細(xì)胞
[0144]本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至一個或多個控制序列，該一個或多個控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早先所述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。
[0145]宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽中有用的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。[0146]原核宿主細(xì)胞可以是任何格蘭氏陽性細(xì)菌或格蘭氏陰性細(xì)菌。格蘭氏陽性細(xì)菌包括但不局限于芽孢桿菌、梭菌、腸球菌、土芽孢桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、海洋芽胞桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、以及鏈霉菌。格蘭氏陰性細(xì)菌包括但不局限于彎曲桿菌、大腸桿菌、黃質(zhì)菌、梭桿菌、螺桿菌、泥桿菌、奈瑟菌、假單胞菌、沙門氏菌、以及尿素原體。
[0147]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌。 [0148]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不局限于似馬鏈球菌、化膿鏈球菌、乳房鏈球菌、以及馬鏈球菌獸疫亞種細(xì)胞。
[0149]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不局限于不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰鏈絲菌、以及變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。
[0150]通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Chang(常)和Cohen(科恩)，1979, Mol.Gen.Genet.(分子和普通遺傳學(xué))168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young(楊格)和 Spizizen(斯皮宰曾),1961, J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志)81:823-829 ；或者Dubnau(杜博楠)和 Davidoff-Abelson(大衛(wèi)多夫-阿貝爾森)，1971，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)56:209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa(茂川)和Dower(道爾)，1988，Biotechniques (生物技術(shù))6:742-751)、或者軛合(參見，例如Koehler (凱勒)和 Thorne (索恩)，1987，J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志)169:5271-5278)可以實現(xiàn)將 DNA引入到芽孢桿菌細(xì)胞中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Hanahan(哈那汗)，1983，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)166:557-580)或電穿孔(參見例如，Dower (道爾)等人，1988，Nucleic Acids Res.(核酸研究)16:6127-6145)可以實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見例如Gong(襲)等人,2004，F(xiàn)olia Microbiol.(Praha) (FOLIA微生物(布拉格))49:399-405)，軛合(參見例如，Mazodier (馬佐迪耶)等人，1989，J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志)171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見例如，Burke (伯克)等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國國家科學(xué)院院刊)98:6289-6294)可以實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌細(xì)胞中。通過電穿孔(參見例如，Choi (崔)等人，2006，J.Microbiol.Methods (微生物學(xué)方法雜志)64:391-397)或軛合(參見例如，Pinedo(皮內(nèi)多)和Smets (斯梅茨)，2005, Appl.Environ.Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))71:51-57)可以實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌細(xì)胞中。通過天然感受態(tài)(參見例如，Perry(佩里)和Kuramitsu (倉光)，1981, Infect.1mmun.(感染與免疫)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt (卡特)和 Jollick(朱力克)，1991，Microbios (微生物)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，Buckley (巴克利)等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))65:3800-3804)或者軛合(參見，例如，Clewell (克拉維爾)，1981，Microbiol.Rev.(微生物學(xué)評論)45:409-436)可以實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌細(xì)胞中。然而，可以使用在本領(lǐng)域已知的任何方法將DNA引入到宿主細(xì)胞中。
[0151]該宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，例如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。
[0152]該宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門、以及接合菌門(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人在Ainsworth and Bisbyj sDictionary of The Fungi (真菌的Ainsworth (安斯沃斯)和Bisby (比斯比)詞典,第8版，CAB International, University Press (CAB國際大學(xué)出版社)，劍橋，英國中定義)連同卵菌門(如在Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995，同上，第171頁中引用)以及所有有絲分裂真菌((霍克斯沃思)等人，1995，同上)。
[0153]該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用，“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母，以及屬于半知菌(芽生菌)的酵母。因為酵母的分類在將來可能改變，所以對于本發(fā)明的目標(biāo)，酵母酵母應(yīng)如在Biology and Activities of Yeast(酵母生物學(xué)和活性)(Skinner (斯金納)，F(xiàn).A.，Passmore (帕斯莫爾)，S.M.，以及Davenport (達(dá)文波特)，R.R.，編輯，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series (應(yīng)用細(xì)菌學(xué)研討會系列)第9期，1980)中所述進(jìn)行定義。
[0154]酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母、漢遜酵母、克魯維酵母菌、畢赤酵母、酵母菌屬酵母、裂殖酵母、或亞羅酵母細(xì)胞，例如產(chǎn)乳糖酶酵母、卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯費酵母、諾地酶母、卵形酵母、或亞羅解脂酵母細(xì)胞。
[0155]真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括所有絲狀形式的細(xì)分真菌門和卵菌門(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995,同上所定義)。絲狀真菌的特征一般在于由甲殼素、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)合多糖組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長來進(jìn)行的并且碳分解代謝是專性需氧的。相比之下，酵母(例如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽而進(jìn)行的，并且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
[0156]絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是支頂孢屬真菌、曲霉、短梗霉、煙管菌屬真菌、擬蠟菌、金孢子菌、鬼傘菌、革蓋菌、隱球酵母、一種真菌(Filibasidium)、鐮刀菌、腐質(zhì)霉、大毀殼屬真菌、毛霉菌、蝕絲霉、新美鞭菌、脈孢菌、擬青霉、青霉菌、平革菌、白腐菌、梨囊鞭菌屬、側(cè)耳屬真菌、裂褶菌、踝節(jié)菌、嗜熱子囊菌、梭孢殼菌屬真菌、彎頸霉、栓菌、或木霉細(xì)胞。
[0157]例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬臘菌、一種真菌(Ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬臘孔菌、一種真菌(Ceriporiopsispannoc`inta)、一種真菌(Ceriporiopsisrivulosa)、一種真菌(Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬臘菌、一種真菌(Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金抱子菌、一種真菌(Chrysosporiumlucknowense)、一種真菌(Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、一種真菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋鬼傘、毛云芝菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、射紋革菌、杏鮑菇、太瑞斯梭孢殼霉、長絨毛栓菌、韓國白腐菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木細(xì)胞。
[0158]可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及本身已知的一種方式進(jìn)行細(xì)胞壁再生的一個過程來轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化曲霉和木霉宿主細(xì)胞的合適程序描述于EP238023, Yelton(約爾頓)等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院院刊)81:1470-1474,以及 Christensen(克里斯滕森)等人，1988, Bio/Technology (生物/ 技術(shù))6:1419-1422 中。Malardier (馬拉迪耶)等人，1989，Gene (基因)78:147-156和TO96/00787描述了用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌物種的合適方法?？梢允褂肂ecker (貝克爾)和Guarente (瓜倫特)在 Abelson, J.N.(阿貝爾森)和 Simon, M.1.(西蒙)編輯，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology (對酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的指導(dǎo))，Methodsin Enzymology (酶學(xué)方法)，194 卷，ppl82_187，Academic Press, Inc.(學(xué)院出版社有限公司)，紐約；Ito (伊藤)等人，1983, J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志)153:163 ；以及Hinnen (希南)等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國國家科學(xué)院院刊)75:1920中描述的程序來轉(zhuǎn)化酵母。
[0159]產(chǎn)生方法
[0160]基于鑒定為SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以從多種載體，例如Gene Art公司(GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str.11 (約瑟夫-恩哥特街 11 號)，93O53,Regensburg (雷根斯堡)，德國)或 DNA2.0 (DNA2.0, 14300，Brien Drive (奧布賴恩驅(qū)動)，Suite E (套裝E)，Menlo Park (門洛帕克)，加利福尼亞州94025，美國，獲得合成基因。合成基因可以被設(shè)計成結(jié)合額外的DNA序列，例如限制酶切位點或同源重組區(qū)，以促進(jìn)指導(dǎo)克隆到表達(dá)載體中。
[0161]可替代地，使用合成的寡核苷酸引物，例如(SEQ ID NO:3)和(SEQ ID N0:4)，可以使用一個簡單的PCR反應(yīng)來擴(kuò)增來自SEQ ID NO:1基因的全長開放讀碼框。然后可以將該基因克隆到表達(dá)載體中，例如，如以上所述，并且在宿主細(xì)胞，例如在米曲霉中表達(dá)。
[0162]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括:(a)培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞處于其野生型形式，在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下產(chǎn)生該多肽；以及(b)回收該多肽。在一個優(yōu)選的方面，該細(xì)胞是蟄龍介細(xì)胞。在一個更優(yōu)選的方面，該細(xì)胞是蟄龍介屬魔玉蟲(TerebellaIapidaria)細(xì)胞。
[0163]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括:(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
[0164]使用本領(lǐng)域熟知的方法，在適合產(chǎn)生該多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，可以通過在合適的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、以及小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，補(bǔ)料分批，或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的程序，在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基從商業(yè)供應(yīng)商處可獲得，或者可根據(jù)公開的組成(例如，在美國模式培養(yǎng)物保藏所目錄中)來制備。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。
[0165]可以使用特異性針對該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法可包括使用特異抗體、形成酶產(chǎn)物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的活性。
[0166]可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，可以通過常規(guī)程序，包括，但不局限于離心，過濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)，或沉淀，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該多肽。
[0167]可以通過本領(lǐng)域已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不局限于色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及大小排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、溶解度差(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(參見，例如 Protein Purification (蛋白純化),J.-C.Janson (詹森)和Lars Ryden (拉爾斯賴登)編輯，VCH Publisher (VCH出版社)，紐約，1989)。[0168]在一個替代方面，沒有回收該多肽，而是將表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作該多肽的來源。
[0169]植物
[0170]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，該分離的植物包含本發(fā)明的多核苷酸，以用來按可回收的量表達(dá)并且產(chǎn)生多肽或結(jié)構(gòu)域。多肽或結(jié)構(gòu)域可從植物或植物部分回收?？商娲?，可以像這樣使用含有多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分，以改善食品或飼料的質(zhì)量，例如改善營養(yǎng)價值，適口性和流變性質(zhì)，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0171]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草，例如草甸草(藍(lán)草，早熟禾屬)；飼草例如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);溫帶草例如剪股穎屬(Agrostis)和谷物例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
[0172]雙子葉植物的實例是煙草，豆類，例如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及緊密相關(guān)的模式生物擬南芥。
[0173]植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、以及塊莖連同包含這些部分的單個組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。特定的植物細(xì)胞區(qū)室，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外,任何植物細(xì)胞，無論組織來源，也被認(rèn)為是植物部分。同樣，植物部分，例如分離以促進(jìn)本發(fā)明的利用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和種皮。
[0174]還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分、和植物細(xì)胞的后代。
[0175]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡而言之，通過將編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的一個或多個表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合到植物宿主基因組或葉綠體基因組中并且將所得 改性植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞構(gòu)建植物或植物細(xì)胞。
[0176]表達(dá)構(gòu)建體方便的是核酸構(gòu)建體，它包含編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對于鑒定其中已經(jīng)整合了此表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記和將此構(gòu)建體引入到所討論的植物中所必需的DNA序列(后者取決于要使用的DNA引入方法)。
[0177]例如基于希望在何時、何處、和怎樣表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域來確定調(diào)節(jié)序列，例如啟動子和終止子序列以及任選的信號序列或轉(zhuǎn)運序列的選擇。例如編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的基因的表達(dá)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的，或者可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以被靶向至特定組織或植物部分，例如種子或葉。例如，由Tague(塔格)等人，1988, Plant Physiology (植物生理學(xué))86:506描述的調(diào)節(jié)序列。
[0178]對于組成性表達(dá)，可以使用玉蜀黍泛素1、或水稻肌動蛋白I啟動子(Franck(弗蘭克)等人，1980，Cell (細(xì)胞)21:285-294 ;Christensen (克里斯滕森)等人，1992，PlantMol.Biol.(植物分子生物學(xué))18:675-689 ;Zhang(張)等人，1991，Plant Cell (植物細(xì)胞)3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是以下各項的啟動子，例如來自貯藏庫組織(例如種子、馬鈴薯塊莖、和果實)(Edwards (愛德華茲)和Coruzzi (科魯茲)，1990, Ann.Rev.Genet.(遺傳學(xué)年鑒)24:275-303)，或來自代謝庫組織(例如分生組織)(Ito (伊藤)等人，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物學(xué))24:863-878)，種子特異性啟動子，例如來自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白啟動子(Wu(吳)等人，1998，PlantCell Physiol.(植物與細(xì)胞生理學(xué))39:885-889)，來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動子和來自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998，J.Plant Physiol.(植物生理學(xué)雜志)152:708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen(陳)等人，1998，Plant CellPhysiol.(植物與細(xì)胞生理學(xué))39:935-941),來自歐洲油菜的忙藏蛋白napA啟動子，或本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如，如在W091/14772中所述的。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka(京冢)等人，1993，Plant Physiol.(植物生理學(xué)))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra (密特拉)和Higgins (希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物學(xué))26:85-93)，來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya (加賀)等人，1995, Mol.Gen.Genet.(分子和普通遺傳學(xué))248:668-674)，或傷口可誘導(dǎo)的啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu(徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(植物分子生物學(xué))22:573-588)。同樣，啟動子可通過非生物處理，例如溫度、干旱、或鹽度變化來誘導(dǎo)，或通過外源施加激活啟動子的物質(zhì)，例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脫落酸、和赤霉酸、以及重金屬來誘導(dǎo)。
[0179]還可使用啟動子增強(qiáng)子元件，從而在植物中達(dá)到多肽或結(jié)構(gòu)域的更高表達(dá)。例如，啟動于增強(qiáng)子元件可以是位于啟動子和編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如Xu (徐)等人，1993，同上，披露了使用水稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。
[0180]選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可選自本領(lǐng)域可用的那些。
[0181]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，這些常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及電穿孔(Gasser (加塞爾)等人，1990, Science (科學(xué))244:1293 ；Potrykus (波特里庫斯)，1990, Bio/Technology (生物 / 技術(shù))8:535; Shimamoto (島本)等人，1989, Nature (自然)338:274)。
[0182]當(dāng)前，根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的所選方法(對于綜述,參見 Hooykas (霍伊卡)和 `Schilperoort (舍勒博特),1992, Plant MolecularBiology (植物分子生物學(xué))19:15-38)并且可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管對于這些植物而言通常使用其他轉(zhuǎn)化方法。當(dāng)前，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的所選方法是胚性愈傷組織或發(fā)育的胚的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA包被的微觀金或鎢顆粒)(Christou (克里斯托)，1992，Plant J.(植物雜志)2:275-281 ;Shimamoto (島本)，1994，Curr.0pin.Biotechnol.(生物技術(shù)新見)5:158-162 ; Vasil(瓦西爾)等人，1992，Bio/Technology (生物/技術(shù))10:667-674)。如 Omirulleh (奧米如列)等人，1993，Plant Molecular Biology (植物分子生物學(xué))21:415-428中所述，單子葉植物轉(zhuǎn)化的替代方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。根據(jù)本披露使用的額外的轉(zhuǎn)化方法包括美國專利號6，395，966和7，151，204中所述的那些(這二者都通過引用以其全文結(jié)合在此)。
[0183]轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，選出已結(jié)合了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再生成為完整植物。通常轉(zhuǎn)化程序被設(shè)計成通過使用例如用兩種分開的T-DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶進(jìn)行的選擇基因的位點特異性切除，在再生期間亦或在后代中選擇性清除選擇基因。[0184]除了用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體的植物基因型之外，可以通過將具有構(gòu)建體的植物與缺乏構(gòu)建體的第二植物雜交來制成轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過雜交，而不需要曾經(jīng)直接轉(zhuǎn)化給定品種的植物，將編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體引入到具體的那一植物品種中。因此，本發(fā)明不僅涵蓋了從根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何代的后代。此類后代可以包含根據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致通過用供體植物系給起始系異體授粉，將轉(zhuǎn)基因引入植物系。此類步驟的非限制性實例描述于美國專利號7，151，204中。
[0185]可以通過回交轉(zhuǎn)換的過程產(chǎn)生植物。例如，植物包括被稱為回交轉(zhuǎn)換的基因型、系、近交種、或雜種的植物。
[0186]遺傳標(biāo)記可以用于協(xié)助將本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一種遺傳背景滲入到另一種遺傳背景中。相對于常規(guī)育種，標(biāo)記輔助選擇提供了很多優(yōu)點，其中它可以用于避免由表型變異引起的錯誤。此外，遺傳標(biāo)記可以提供關(guān)于具體雜交的個體后代中的精英種質(zhì)的相對程度的數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)具有希望的性狀(否則會具有非農(nóng)藝學(xué)上希望的遺傳背景)的植物與精英親本雜交時，遺傳標(biāo)記可以用于選擇不僅擁有感興趣的性狀、而且還具有較大比例的希望的種質(zhì)的后代。以此方式，將一個或多個性狀滲入具體的遺傳背景所需的世代數(shù)被最小化。
[0187]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括:(a)在有益于產(chǎn)生多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下，培養(yǎng)包含編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，以及(b)回收該多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0188]洗滌劑組合物
[0189]在一個實施例中，本發(fā)明針對洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包含結(jié)合一種或多種額外的清潔組合物組分的本發(fā)明的酶。額外的組分的選擇在普通技術(shù)人員技術(shù)內(nèi)并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。
[0190]組分的選擇可以包括(用于紡織品保養(yǎng))有待清潔的紡織品的類型、污物的類型和/或程度、進(jìn)行清潔時的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制的考慮。盡管根據(jù)一種具體的功能性對以下提及的組分由通用標(biāo)題進(jìn)行分類，但是這并不被解釋為限制，因為如將被普通技術(shù)人員所理解，一種組分可以包括額外的功能性。
[0191]本發(fā)明的酶
[0192]在本發(fā)明的一個實施例中，可以將本發(fā)明的多肽以對應(yīng)于以下的量添加至一種洗滌劑組合物中:每升的洗滌液體0.0Ol-1OOmg的蛋白，例如0.01-1OOmg的蛋白，優(yōu)選是0.005-50mg的蛋白，更優(yōu)選是0.01_25mg的蛋白，甚至更優(yōu)選是0.05-10mg的蛋白，最優(yōu)選是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最優(yōu)選是0.01-1mg的蛋白。
[0193]可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明的清潔劑組合物的一種或多種酶，這些常規(guī)穩(wěn)定劑例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如W092/19709和W092/19708中所述配置該組合物。
[0194]本發(fā)明的多肽還可以結(jié)合到W097/07202中所披露的洗滌劑配制品中，通過引用
將其結(jié)合在此。[0195]表面活性劑[0196]洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的，或其混合物。在一個具體實施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。這種或這些表面活性劑典型地以按重量計從約0.1%至60%的水平存在，例如約1%至約40%、或約3%至約20%、或約3%至約10%?；谒Ｍ那鍧崙?yīng)用來選擇這種或這些表面活性劑，并且這種或這些表面活性劑包括本領(lǐng)域中已知的任何一種或多種常規(guī)表面活性劑。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何表面活性劑。
[0197]當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1%至約40%，例如從約5%至約30% (包括從約5%至約15%)、或從約20%至約25%的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地，直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)，LAS的異構(gòu)體，支鏈烷基苯磺酸鹽(BABS)，苯基鏈烷磺酸鹽，a-烯烴磺酸鹽(AOS)，烯烴磺酸鹽，鏈烯烴磺酸鹽，鏈烷_2，3- 二基雙(硫酸鹽)，羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽，烷基硫酸鹽(AS)(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))，脂肪醇硫酸鹽(FAS)，伯醇硫酸鹽(PAS)，醇醚硫酸鹽(AES或AEOS或FES，也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)，仲鏈烷磺酸鹽(SAS)，石蠟烴磺酸鹽(PS)，酯磺酸鹽，磺化的脂肪酸甘油酯，a-磺酸基脂肪酸甲酯(a-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸鹽(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯，及其組合。
[0198]當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1%至約40%的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)、二甲基雙十八烷基氯化銨(DSDMAC)、和烷基芐基二甲基銨，及其組合，烷基季銨化合物，烷氧基化的季銨(AQA)。
[0199]當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0.2%至約40%的非離子型表面活性劑，例如從約0.5%至約30%，特別是從約1%至約20%、從約3%至約10%，例如從約3%至約5%、或從約8%至約12%。非離子型表面活性劑的非限制性實例包括醇乙氧基化物(AE或AE0)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酷)，烷基酌'乙氧基化物(APE),壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(PFAM)，多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，連同在SPAN和TWEEN商品名下可獲得的產(chǎn)品，及其組合。
[0200]當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1%至約40%的半極化表面活性劑。半極化表面活性劑的非限制性實例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N，N- 二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)_N，N-雙(2-羥乙基)胺氧化物、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺，及其組合。
[0201 ] 當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1%至約40%的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、和磺基甜菜堿，及其組合。
[0202]助水溶劑[0203]助水溶劑是一種化合物，該化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環(huán)境中的極性物質(zhì))。典型地，助水溶劑同時具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)，然而助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集，參見例如 Hodgdon (霍奇登)和 Kaler (卡勒)的綜述，Current Opinion in Colloid&InterfaceScience (膠體&界面科學(xué)新見)，12:121-128。助水溶劑并不顯示一個臨界濃度,高于該濃度就會發(fā)生如對表面活性劑而言所發(fā)現(xiàn)的自聚集并且脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。很多助水溶劑反而示出一個連續(xù)型聚集過程，其中聚集的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包含極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相狀態(tài)、穩(wěn)定性、和膠體特性。經(jīng)典地從制藥、個人護(hù)理、食品跨行業(yè)至技術(shù)應(yīng)用使用助水溶劑。洗滌劑組合物中助水溶劑的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過除去水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，例如相分離或高黏度。
[0204]洗滌劑可以包含按重量計0-5%，例如約0.5%至約5%、或約3%至約5%的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(STS)、二甲苯磺酸鈉(SXS)、枯烯磺酸鈉(SCS)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉、及其組合。
[0205]增效劑和助增效劑
[0206]洗滌劑組合物可以包含按重量計約0-65%，例如約5%至約50%的洗滌劑增效劑或助增效劑、或其混合物。在洗滌餐具洗滌劑中，增效劑的水平典型地是40%-65%，特別是50%-65%。增效劑劑和/或助增效劑可以具體是形成具有Ca和Mg的水溶性復(fù)合物的螫合劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何增效劑和/或助增效劑。增效劑的非限制性實例包括沸石、 二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸三磷酸鹽例如三磷酸鈉(STP或STPP)、碳酸鹽例如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽例如硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如來自Hoechst (赫斯特公司)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亞胺基二乙醇(DEA)和2，2’，2”-次氨基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其組合。
[0207]洗滌劑組合物還可以包含按重量計0-50%，例如約5%至約40%的洗滌劑助增效劑、或其混合物。洗滌劑組合物可以只包括助增效劑，或結(jié)合一種增效劑，例如沸石增效劑。助增效劑的非限制性實例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性實例包括檸檬酸鹽，螯合劑，例如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽，以及烷基-或鏈烯基琥珀酸。額外的特定實例包括2，2’，2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、亞氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N，N’- 二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N，N-二乙酸(GLDA)、1-羥乙烷-1，1-二基雙(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亞甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亞乙基三胺五(亞甲基)五(膦酸)(DTPMPA) ,N-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-單乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N，N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-單丙酸(ASMP)、亞氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亞氨基二乙酸(MIDA)、a-丙氨酸-N，N-二乙酸(a-ALDA)、絲氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)、異絲氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)、鄰氨基苯甲酸-N，N-二乙酸(ANDA)、對氨基苯磺酸-N、N- 二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N- 二乙酸(TUDA)和磺甲基-N，N-二乙酸(SMDA)、N-(羥乙基)-亞乙基二胺三乙酸鹽(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亞甲基膦酸)(ATMP)，及其組合和鹽。另外的示例性增效劑和/或助增效劑描述于例如W009/102854、US5977053中
[0208]漂白系統(tǒng)
[0209] 洗滌劑可以包括一個漂白系統(tǒng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何漂白系統(tǒng)。合適的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑，光漂白劑(photobleach)，漂白活化劑，過氧化氫源(例如過碳酸鈉和過硼酸鈉)，預(yù)成型的過酸及其混合物。合適的預(yù)成型過酸包括，但不局限于:過氧羧酸及鹽、過碳酸及鹽、過亞氨酸及鹽、過氧單硫酸及鹽，例如過硫酸氫鉀制劑(R)、及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性實例包括基于過氧化物的漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以包括例如無機(jī)鹽，包括堿金屬鹽，例如過硼酸鹽(通常是單-或四-水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽的鈉鹽,結(jié)合形成漂白活化劑的過酸。漂白活化劑在此指一種與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應(yīng)以形成過酸的化合物。以此方式形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待于在此使用的合適的漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些，合適的實例是四乙酰乙二胺(TAED)、3，5，5三甲基己酰氧基苯磺酸鈉、雙過氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸鹽(LOBS)、4-(癸?；趸?苯磺酸鹽、
4-(癸?；趸?苯甲酸鹽(DOBS)、4_(3，5，5-三甲基己酰氧基)苯磺酸鹽(IS0N0BS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸鹽(NOBS)，和/或W098/17767中披露的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于EP624154中，并且在那個家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短鏈甘油三酸酯(像Triacin (特雷森))具有以下優(yōu)點，它是環(huán)境友好的，因為它最終降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存儲時在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且它是一種有效的漂白活化劑。最后，ATC為洗衣添加劑提供一種良好的增效能力。可替代地，漂白系統(tǒng)可以包括例如酰胺、亞胺、或砜型的過氧酸。漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，例如6-(鄰苯二甲酰基氨基)過己酸(PAP)。漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。在一些實施例中，漂白組分可以是選自下組的有機(jī)催化劑，該組由以下各項組成:具有下式的有機(jī)催化劑:
[0210]
【權(quán)利要求】
1.具有纖維素酶活性的一種分離多肽，該分離多肽選自下組，該組由以下各項構(gòu)成: (a)一種多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性； (b)一種多肽，該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件下、中等嚴(yán)格條件下、中-高嚴(yán)格條件下、高嚴(yán)格條件下或非常高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:l的成熟多肽編碼序列、或其全長補(bǔ)體雜交； (c)一種多肽,該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸與SEQ ID NO:l的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；或 (d)在一個或多個(例如若干個)位置處包含一個取代、刪除、和/或插入的SEQIDNO: 2的成熟多肽的一種變體；以及 (e)具有纖維素酶活性的(a)、(b)或(c)的多肽的一個片段。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，該多肽與SEQID NO:2的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件下、低-中嚴(yán)格條件下、中等嚴(yán)格條件下、中-高嚴(yán)格條件下、高嚴(yán)格條件下或非常高嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)或其基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多肽，該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，包含SEQID NO:2或由其構(gòu)成。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，包含SEQID NO:2的成熟多肽或由其構(gòu)成。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸I至428。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，該多肽是SEQID NO: 2的一個片段，其中該片段具有纖維素酶活性。
9.一種組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，是一種洗滌劑組合物。
11.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽。
12.—種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽在一個表達(dá)宿主內(nèi)產(chǎn)生的一個或多個控制序列上。
13.—種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸,該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生的一個或多個控制序列上。
14.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽的方法，該方法包括:(a)培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞在其野生型形式中在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下產(chǎn)生該多肽；并且 (b)回收該多肽。
15.一種產(chǎn)生具有纖維素酶活性的多肽的方法，該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞；并且 (b)回收該多肽。
【文檔編號】C11D3/386GK103748219SQ201280040146
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月15日
【發(fā)明者】K.M.施努爾, L.安德森, M.L.昆泰斯坎塞拉達(dá)方塞卡, R.萊特 申請人:諾維信公司