專利名稱：一種微藻油脂膜基原位萃取的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程和生物能源領域，尤其涉及一種將微藻培養(yǎng)、膜技術和微藻油脂萃取技術整合而成的微藻油脂提取方法。
背景技術：
生物柴油是生物能源的重要產品，但因原料不足使產業(yè)發(fā)展受到嚴重制約。在制備生物柴油的原料中(油料作物、林木及產油微藻)，微藻生長快，油脂含量高，是一種極具前景的生物柴油大宗原料。目前微藻生產生物柴油的瓶頸問題在于成本過高，導致其經濟性得不到保障，特別是微藻油脂提取約占生物柴油成本的50%。常規(guī)微藻油脂提取技術包括有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取、熱裂解等，這些方法要求藻體為干燥粉末，而藻液中干物質含量通常低于1 %，濃縮干燥的預處理不僅延長生物柴油生產周期，還影響油脂提取效率。原位萃取法是指建立生物相容性有機溶劑與藻液共混的兩相體系，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相，規(guī)避藻體脫水干燥處理步驟，實現(xiàn)油脂在線提取和提高產量的雙重目標。目前對微藻油脂的提取方法主要有有機溶劑萃取、超臨界和亞臨界流體萃取等方法。例如雙溶劑體系萃取(Mixing co-solvent extraction)是指由一種極性溶劑與一種非極性溶劑組成單相體系提取藻體油脂。Bligh和Dyer于1959年(Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method of total lipid extractionand purification “——禾中總月旨^ !禾口純化方法”.Canadian Journal ofBiochemistry and Physiology《加拿大生物化學與生理學雜志》，1959，37 (8) :911-917)提出的甲醇/氯仿體系仍是最常用的微藻油脂提取方法?；凇跋嗨葡嗳堋痹恚弩w與甲醇/氯仿混合溶劑充分接觸，極性溶劑甲醇與細胞膜的極性脂結合，從而破壞脂質與蛋白質分子間的氫鍵和靜電作用，使非極性溶劑氯仿進入細胞并溶解胞內疏水的中性脂成分，充分萃取后在體系中加入水，甲醇即溶于水相而與含油脂的氯仿相分層，氯仿?lián)]發(fā)后得到粗脂提取物。然而因氯仿有神經致毒作用，一些低毒雙溶劑體系也嘗試用于油脂提取，例如正己烷/異丙醇，DMSO/石油醚，正己烷/乙醇等。1996 ip,Richter ^ (Richter BE,Jones ΒΑ,Ezzell JL,Porter NL. Accelerated solvent extraction :a technique for sample preparation "力口速溶劑萃取——禾中樣品制備技術”.Analytical Chemistry《分析化學》，1996，68 (6) :1033-1039)提出快速溶劑提取法(Accelerated solvent extraction, ASE)，這是一種在較高溫度(50 200°C )和較大壓力(10. 3 20. 6MPa)條件下用溶劑萃取固體或半固體樣品的處理方法。該方法用于萃取微藻油脂的原理是，高溫高壓有助于增加傳質速率使溶劑快速滲入藻細胞，同時降低溶劑介電常數(shù)使其極性接近油脂，從而提高溶劑的萃取效率，常用溶劑體系有甲醇/氯仿， 異丙醇/正己烷等。與雙溶劑萃取法相比，ASE法具有作用時間短(5 IOmin)，溶劑消耗量少，油脂提取率高的優(yōu)點。例如，傳統(tǒng)的i^olch方法(氯仿/甲醇，2 lv/v))對綠藻 Rhizoclonium hieroglyphicum的油脂提取率為44 55%，而用等量溶劑在壓力10. 3MPa, 120°C時僅提取5min即可達到85 95%的油脂提取率。
超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction)是一種新興的提取技術， 它是指超出臨界溫度和壓力時，流體介于氣態(tài)和液態(tài)之間，同時具有氣體的擴散傳質性能和液體的溶解性能，對藻體油脂的提取效率遠高于普通的有機溶劑。(X)2由于臨界條件溫和(壓力7. 4MPa,溫度31. 1 V )、無毒、化學惰性等優(yōu)勢，使用最為廣泛，此外甲醇、乙醇、水、二氧化氮、六氟化硫等使用也有所報道。超臨界CO2萃取(Supercritical carbon dioxideextraction, SCCO2)微藻油脂的作用條件為40 50°C，24. 1 37. 9MPa，提取后油脂溶解在超臨界液態(tài)(X)2中，回收時只需控制溫度和壓力使(X)2恢復氣態(tài)即可分離油脂。超臨界萃取是環(huán)境友好的綠色提取技術，但是因涉及到溫度和壓力控制，使得處理工藝能耗高，經濟性較差，不適于大宗化學品的提取。亞臨界水萃取(Subcritical water extraction, SffE)是指水在略低于臨界溫度時其極性降低，因此具有類似有機溶劑的性質，對油脂的溶解性也大大提高，同時利用高壓使水維持在液態(tài)，高溫促使水快速進入細胞，使胞內脂質萃取至水相，當體系冷卻至室溫時，水的極性升高，溶解在水相的油脂與水迅速分層便于收集。此外，亞臨界乙醇也可用來于萃取色素，如Haematococcus pluvialis禾口 Dunaliella salina中的古月蘿卜素。該方法的優(yōu)勢在于可以對藻液直接處理，在體系中無需加入有機溶劑，但是因溫度壓力等高能耗步驟的存在，此法工業(yè)應用也有所限制。上述微藻油脂不同提取方法包括藻體干燥、高溫高壓控制等高能耗處理步驟。目前藻體干燥主要方法有日光晾曬法、噴霧干燥和冷凍干燥等，處理大量藻體時，以晾曬法最具經濟性，但對攤曬面積和時間有一定要求，因此在干燥，溫度壓力控制等環(huán)節(jié)的技術改進能有效降低油脂提取能耗。膜技術的研究自80年代初開展以來，己經成為新型分離技術研究領域的重要組成部分?；谖⒖啄さ姆稚⑤腿∵^程兼具膜技術與萃取過程的優(yōu)點，膜介質本身對待處理的混合物無分離作用，主要利用膜的多孔性，親水性或疏水性，為兩相傳遞提供較大而穩(wěn)定的相接觸面，可克服常規(guī)分離中的液泛、返混等影響，近十年來深受關注。利用中空纖維膜促進有機溶劑在藻液中的分散效果，同時使微藻培養(yǎng)和油脂提取過程偶聯(lián)，是實現(xiàn)微藻油脂連續(xù)合成及在線萃取的新方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明結合微孔膜技術，使生物相容性萃取溶劑均勻分散至藻液，促進溶劑對微藻油脂的萃取效率，提出了一種全新的微藻連續(xù)培養(yǎng)及油脂原位萃取的集成技術。一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步驟(1)微藻連續(xù)培養(yǎng)將產油藻種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期，產油藻種的細胞內逐漸積累油脂；(2)原位萃取油脂將積累油脂后的藻液輸入萃取體系，同時輸入萃取溶劑，利用原位萃取法建立萃取溶劑與藻液共混的兩相體系，藻體油脂不斷萃取至溶劑相；萃取溶劑與藻液逐漸分層，上層萃取溶劑循環(huán)使用，下層藻液循環(huán)至連續(xù)培養(yǎng)步驟；通過調節(jié)萃取溶劑與藻液泵入泵出萃取模塊的流速，保持萃取體系內萃取溶劑的體積比例不超過總體積的 10%。(3)實時檢測萃取溶劑中的油脂含量，若油脂濃度無顯著增加，則油脂萃取趨于飽和，移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑。作為一種優(yōu)選方案，在所述的萃取體系內設置一中空纖維膜組件，藻液沿中空纖維膜組件的殼層流動，萃取溶劑進入末端封死的中空纖維膜管內，再通過中空纖維膜管壁的微孔分散成微小液滴進入殼程的藻液，并與藻液充分混合，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相。所述的萃取溶劑為生物相容性有機溶劑，一般為log P >5. 5的疏水性有機溶劑， 其中特別以碳鏈長度為C12 C16的烷烴類溶劑生物相容性良好。本發(fā)明中膜分散原位萃取微藻油脂的方法兼具膜技術與萃取過程的優(yōu)點，是新的高效傳質過程，具有以下主要特點及優(yōu)點(1)萃取溶劑通過膜微孔以極微小的液滴形態(tài)分散進入藻液中，萃取溶劑與藻液充分混合，顯著提高萃取效率。( 該方法無需破碎微藻細胞，微藻培養(yǎng)可以連續(xù)進行。產油藻種選用耐有機溶劑的藻種時，由于微藻細胞和有機溶劑具有較好的親和性，則有機溶劑在用膜分散進行油脂原位萃取的過程中，微藻活性幾乎不受影響。(3)當控制微藻培養(yǎng)處于穩(wěn)定期內，此時微藻油脂合成旺盛，可以實現(xiàn)微藻生長和油脂提取的同時進行，油脂進行在線原位提取。該方法可以突破微藻采收、干燥、破碎和提取的冗長工藝，從而顯著降低生產成本。


圖1為用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的實施例1使用的膜分散有機溶劑萃取裝置的示意圖，圖示說明①萃取溶劑儲液罐②萃取層③死端中空纖維膜組件④藻液儲瓶⑤氣升式光生物反應器⑥蠕動泵⑦空氣壓縮泵。圖2為本發(fā)明實施例1中藻液及萃取劑中油脂含量隨時間變化結果。圖3為本發(fā)明實施例1中膜分散有機溶劑萃取Botryococcus braunii油脂的細胞活性變化趨勢。
具體實施例方式實施例1 (1)在容積為7L的氣升式光生物反應器⑤中培養(yǎng)產油藻Botryococcus braunii, BGll培養(yǎng)基(淡水藻通用培養(yǎng)基)，在25士 1°C，連續(xù)光照(光強池lux)條件下培養(yǎng)3周
至穩(wěn)定期。(2)氣升式光生物反應器⑤內藻液經蠕動泵通入死端PES中空纖維膜組件③的殼層，藻液體積控制為400ml。Botryococcus braunii生物相容性溶劑十四烷以10ml mirT1 的流量通入死端(膜纖維一端封死的組件)PES中空纖維膜組件③的管層，十四烷通過PES 膜孔分散成微小液滴進入藻液，密集的溶劑液滴因密度較小逐漸上浮，在上升過程中與藻細胞充分接觸并萃取藻體油脂。萃取層中的十四烷溶劑與藻液分層，上層的溶劑相通過蠕動泵以10ml mirT1的流量抽回入有機溶劑儲液罐①進行循環(huán)使用，為降低溶劑的細胞毒性，保持萃取層內的溶劑體積比不超過總體積的10%。
(3)萃取過程中檢測溶劑相的油脂含量，若油脂濃度無顯著增加，則油脂萃取趨于飽和，移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑維持一定的油脂提取率。對比例除步驟O)中的萃取劑十四烷是直接泵入藻液當中、不通過膜組件外，其余與實施例1相同。油脂含量測定部分的具體的操作方式為胞內油脂含量的測定藻液按比例稀釋并用紫外分光光度計(GS-54，上海棱光)測定其在680nm處吸光度，0D680保持在0. 5左右，取稀釋藻液3ml加入3 μ 1的尼羅紅染液(濃度Img πιΓ1，溶劑丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，熒光分光光度計(F96-PR0，上海棱光)測定其熒光強度，激發(fā)波長480nm，發(fā)散波長580nm，增益10檔。熒光強度/0D680代入下式計算藻體油
脂含量。Y = O. 16X+12. 49 (X 熒光強度，Y 油脂含量％ )有機溶劑(十四烷)中油脂含量測定以十四烷(Aladdin，USA)為溶劑，三油精triolein (Aladdin，USA)為標準品配制不同濃度溶液，各取3!111分別加入5 4 1的尼羅紅染液(lmgml-1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用熒光分光光度計測定其熒光強度，激發(fā)波長480nm，發(fā)散波長570nm，增益1檔，得到標準曲線對應方程如下Y = O. 06X+30. 07 (Y 熒光強度，X 油脂濃度 mg L-1)測定萃取后十四烷中的油脂含量時，取3ml十四烷加入5μ1的尼羅紅染液(Img πιΓ1，溶于丙酮)，于37°C水浴中避光染色lOmin，用熒光分光光度計測定其熒光強度，激發(fā)波長480nm，發(fā)散波長570nm，增益1檔。將測得的數(shù)據(jù)代入標準曲線方程，即可求得其油脂濃度。流式細胞儀測定細胞存活率雙醋酸熒光素(FDA)作為活細胞熒光染料用于表征油脂萃取過程中的細胞存活率。當活性細胞具有完整細胞膜時，F(xiàn)DA水解的熒光素會不斷在細胞內積累，使細胞在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。當細胞膜受損，細胞失去活性時，F(xiàn)DA水解的熒光素無法在細胞內累積，而使細胞無法發(fā)出熒光?；钚愿叩募毎l(fā)出強烈的綠色熒光，活性弱的細胞發(fā)光較弱。當熒光物質充滿整個細胞時，會使細胞發(fā)出亮綠色。Botryococcus braunii藻液經300目細胞篩去除雜質和細胞團塊，取Iml藻液離心棄上清，PBS緩沖液(phosphate buffered saline)清洗藻體三次，取適量PBS緩沖液懸浮藻體使藻細胞密度不小于IO6個πιΓ1，加入FDA (Sigma，USA)終濃度為IOOyg πιΓ1室溫下避光染色7min，流式細胞儀分析(Beckman FC 500MCL，USA)，流速100-400細胞sec—1，數(shù)據(jù)采集時總細胞數(shù)大于1000，或者時間大于2min，測試完成后，保存分析結果并作圖。如圖2所示為萃取過程中有機溶劑相與Botryococcus braunii胞內油脂含量的變化(藻液400ml，十四烷40ml，藻液和有機溶劑循環(huán)速度均為10ml mirT1)，實驗結果顯示， 實施例1萃取進行2天后萃取劑十四烷中油脂濃度已經達到最大值520mg L—1，對油脂的提取率達到了 50. 15%,而對照組提取率為38. 05%。2天之后十四烷中油脂含量變化不大，而藻液中油脂含量逐漸恢復。從實驗結果分析可以得出，膜孔分散能有效促進溶劑與藻液的混合，增加了藻體與溶劑的接觸面積，提高了油脂提取率。 如圖3所示為膜鼓泡有機溶劑萃取葡萄藻油脂細胞活性檢測(IOOugmr1FDA染色 IOmin, C2象限為FDA染色的活細胞區(qū)。實施例1中流式細胞儀檢測原位萃取過程中， 細胞存活率保持在90%以上，結果說明在體系中引入PES有機膜對細胞活性無影響，適用于油脂的連續(xù)萃取過程。
權利要求
1.一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，包括以下步驟(1)微藻連續(xù)培養(yǎng)將產油藻種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期，產油藻種的細胞內逐漸積累油脂；(2)原位萃取油脂將經連續(xù)培養(yǎng)積累油脂后的藻液輸入萃取體系，同時輸入萃取溶劑與藻液共混形成兩相體系，藻體油脂不斷萃取至溶劑相；萃取溶劑與藻液逐漸分層，上層萃取溶劑循環(huán)使用，下層藻液循環(huán)至連續(xù)培養(yǎng)步驟；(3)實時檢測萃取溶劑中的油脂含量，若油脂濃度無顯著增加，則油脂萃取趨于飽和， 移除油脂飽和的萃取溶劑，加入新的萃取溶劑。
2.如權利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的產油藻種為耐有機溶劑的藻種。
3.如權利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的溶劑為生物相容性有機溶劑。
4.如權利要求3所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的生物相容性有機溶劑為疏水值IogP > 5. 5的烷烴類。
5.如權利要求4所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于其所述的生物相容性有機溶劑為C12 C16的烷烴類溶劑。
6.如權利要求1所述的微藻油脂膜原位萃取的方法，其特征在于所述的萃取體系內含有的溶劑體積不超過總體積的10%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微藻油脂膜基原位萃取的方法，將產油藻種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期，積累油脂后的藻液輸入萃取層，利用原位萃取法建立萃取溶劑與藻液共混的兩相體系，使藻體油脂不斷萃取至溶劑相，萃取溶劑與藻液逐漸分層澄清，上層有機溶劑循環(huán)使用，萃取層內的藻液循環(huán)回連續(xù)培養(yǎng)步驟。本發(fā)明將微藻連續(xù)培養(yǎng)技術、膜技術與微藻油脂提取技術相結合，提出了一種微藻油脂原位萃取的集成化方法，規(guī)避了收集、干燥和破碎微藻細胞等流程，與常規(guī)的微藻油脂提取技術相比，本發(fā)明工藝具有程簡單、油脂提取率高、過程成本低、環(huán)境友好等特點。
文檔編號C11B1/10GK102505026SQ201110350428
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者周成, 張芳, 徐新華, 程麗華, 陳歡林 申請人:浙江大學