專利名稱：屬于細(xì)胞信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)生物標(biāo)記物的全血含量及其測量確定細(xì)胞群的活化的用途的制作方法
屬于細(xì)胞信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)生物標(biāo)記物的全血含量及其測量確定細(xì)胞群的活化的用途本發(fā)明涉及對全血樣品進(jìn)行的、與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)生物標(biāo)記物的體外檢測方法。本發(fā)明還涉及所述方法在測量血液樣品中所含的預(yù)先確定細(xì)胞群的細(xì)胞活化中的應(yīng)用。本申請涉及探討由于血液中存在的細(xì)胞的活化而可以發(fā)生的生理過程。這種細(xì)胞可以是血液中天然存在的細(xì)胞，或者是由于特定生理狀態(tài)，特別是病理狀態(tài)而在血液循環(huán)中存在的細(xì)胞。已觀測到細(xì)胞活化伴隨著對某些細(xì)胞內(nèi)蛋白狀態(tài)的修飾，特別是屬于細(xì)胞信號(hào)通路的蛋白的磷酸化狀態(tài)的修飾。本發(fā)明涉及分析該蛋白及其磷酸化狀態(tài)，以作為細(xì)胞群活化的生物標(biāo)記物。
因此，本申請以檢測方法為目的，在所述檢測方法中，與細(xì)胞信號(hào)通路，特別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白，是表達(dá)受到磷酸化調(diào)節(jié)的蛋白。因而予以磷酸化狀態(tài)觀測的蛋白是用于細(xì)胞活化的生物標(biāo)記物，并且是細(xì)胞活動(dòng)的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，用于檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)的方法的具體應(yīng)用，涉及監(jiān)測用于全血樣品中存在的細(xì)胞群的細(xì)胞活化的激動(dòng)劑或拮抗劑。這種應(yīng)用可特別有助于患者的治療監(jiān)測，或者其可用于藥物篩選。特別是，本申請的上下文是通過觀測全血樣品中所含的細(xì)胞群的活化來探討止血，特別是血液凝固。細(xì)胞活化實(shí)際上是導(dǎo)致血液凝固的反應(yīng)受到引發(fā)時(shí)發(fā)生的過程。特別是，在它們體內(nèi)粘附至內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)或外部體外刺激物(ADP、凝血酶、膠原蛋白等)作用之后觀測到的血液血小板活化可能致使它們凝集，并且在這些條件下，允許適當(dāng)發(fā)生凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而允許通過原纖維網(wǎng)絡(luò)方式穩(wěn)定的血小板凝集物使得血栓形成。因此，本發(fā)明更特別地應(yīng)用于分析全血樣品中所含的血小板(凝血細(xì)胞)中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)，以確定所述血小板的活化狀態(tài)，并且更主要地，有助于探討血小板活性。本發(fā)明特別應(yīng)用于與血管系統(tǒng)疾病相關(guān)聯(lián)的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是用于研究活性物質(zhì)，或者監(jiān)測在預(yù)防或治療血管系統(tǒng)疾病中有效的物質(zhì)。因而本發(fā)明方法的具體應(yīng)用由監(jiān)測血小板對已知或潛在的抗血小板凝集劑的響應(yīng)組成。因此，本發(fā)明的方法可以，例如，用于篩選抗血小板凝集劑的生物學(xué)或其他抗性，用于調(diào)節(jié)給予患者的抗血小板凝集劑的劑量，或者用于有助于確定治療處理是否應(yīng)當(dāng)被中斷或繼續(xù)。在檢測血小板中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)的背景下，在關(guān)于它們的診斷或監(jiān)測，包括用于鑒別它們治療或控制的化合物方面可能受益于本發(fā)明方法的病理的具體實(shí)例，是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化癥而導(dǎo)致的急性冠脈綜合征，如心肌梗死、冠狀動(dòng)脈血栓癥、冠狀動(dòng)脈閉塞、起源缺血的腦血管意外、II型糖尿病、鐮狀細(xì)胞病等。血小板活化是由于例如血管損傷或動(dòng)脈斑塊破裂之后引發(fā)血栓形成過程的結(jié)果。所活化的血小板粘附于血管壁，然后先可逆接著不可逆地凝集，這導(dǎo)致生理修復(fù)血管內(nèi)皮或病理位置中的損傷，以阻塞血管。
在血小板活化過程中所鑒別的和在實(shí)施本發(fā)明背景下關(guān)注的分子伴侶之中，已觀測到由血小板的密集顆粒釋放的核苷酸ADP (腺苷二磷酸)的作用，所述血小板是在損傷細(xì)胞中分泌的，或者是響應(yīng)諸如凝血酶的凝固因子而分泌的。由ADP刺激血小板導(dǎo)致形成不穩(wěn)定的血小板凝集物。血小板ADP受體中的一個(gè)是被命名為P2Y12的嘌呤能型P2受體(Hollopeter G et al,Nature 2001 :409 :202-7)，其負(fù)責(zé)用于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的某些通路(級(jí)聯(lián))的選擇性活化。P2Y12受體負(fù)責(zé)所形成的血小板凝集物的穩(wěn)定性。血小板活化可以由生理激動(dòng)劑如前列腺素(PGE)，特別是前列腺素PGEl或PGE2，PGI前列腺素如PGI2或P⑶s如P⑶2刺激。利用PGEl的血小板活化，活化蛋白VASP (血管擴(kuò)張刺激磷蛋白)的磷酸化。VASP的磷酸化發(fā)生在絲氨酸239 (由NCBI公開的序列，登錄號(hào)|NP003361. 1，2009年5月10日的版本)處，例如當(dāng)活化由PGEl啟動(dòng)時(shí)，以與細(xì)胞內(nèi)cAMP(單磷酸環(huán)化腺苷)的濃度成比例的量，和/或例如當(dāng)活化由(一氧化氮)_供給化合物啟動(dòng)時(shí)，以與細(xì)胞內(nèi)cGMP (單磷酸環(huán)化鳥苷)的濃度成比例的量。cAMP或cGMP的細(xì)胞內(nèi)濃度分別由腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶與磷酸二酯酶 的協(xié)同作用調(diào)節(jié)。激酶在細(xì)胞活化調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵酶。所述激酶有許多，并且通過將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白底物的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基而負(fù)責(zé)膜或細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化。這種翻譯后修飾調(diào)節(jié)大量細(xì)胞周期的活動(dòng)，并且非正常的磷酸化可能與許多病理狀態(tài)相關(guān)。某些激酶是生物活性分子的直接或間接靶，特別是形成藥物的組成部分的活性物質(zhì)，或限定治療活性原理的備選分子，或診斷關(guān)注的分子。這些包括激酶AKT (有時(shí)稱為PKB)、ERK、JAK2、BCR-ABL(主要存在于某些白血病腫瘤細(xì)胞中)、PKA、PKG。結(jié)果是，在本發(fā)明的背景中，激酶或形成所述激酶底物的細(xì)胞內(nèi)蛋白可能在改變激酶活性之后被顯示為所關(guān)注的生物標(biāo)記物。血小板的VASP蛋白是某些所述激酶特別是PKA(cAMP-依賴性蛋白激酶)和PKG(cGMP-依賴性蛋白激酶)的底物。VASP在調(diào)節(jié)血小板細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在這種明確的情況下被認(rèn)為是用于PKA和/或PGK活性的生物標(biāo)記物，同時(shí)也是用于上游發(fā)生的整個(gè)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)的生物標(biāo)記物。此外，VASP蛋白的磷酸化還由血液循環(huán)中的另一分子即核苷酸ADP控制。當(dāng)ADP與血小板受體P2Y12相互作用時(shí)，后者被占用，并且結(jié)果是由生理激動(dòng)劑誘導(dǎo)的VASP蛋白(血管擴(kuò)張刺激磷蛋白)的磷酸化被抑制或限制。VASP磷酸化的抑制或限制/修飾包括磷酸化激動(dòng)劑以前所誘導(dǎo)的全部或部分VASP蛋白去磷酸化，或者全部或部分防止所述磷酸化。蛋白AKT是這樣的激酶，其酶促表達(dá)直接依賴于氨基酸Ser473 (在NCBI數(shù)據(jù)庫所確定的序列中473位的絲氨酸，所述序列登錄號(hào)NP001014431. I，2009年5月22日的版本)的活性位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)。AKT還被認(rèn)為是細(xì)胞介質(zhì)(mediator)或細(xì)胞信號(hào)蛋白。在血小板中，通過受體PAR-I的凝血酶的活化誘導(dǎo)AKT磷酸化。同樣，通過受體P2Y12的ADP活化似乎同樣誘導(dǎo)氨基酸Ser 473的磷酸化。結(jié)果是，絲氨酸473的磷酸化狀態(tài)被認(rèn)為是凝血酶受體(pari)或ADP受體P2Y12狀態(tài)的生物標(biāo)記物。因此，重要的是測量血液細(xì)胞群的活化狀態(tài)，并且特別是存在血管病理風(fēng)險(xiǎn)的患者，或患有該病理的患者，以及還有治療該病理的患者的血液中的血小板的活化狀態(tài)，特別是來評估所給予的活性物質(zhì)對血小板活化過程的干擾。同樣重要的是測量來自全血樣品中的血小板的活化狀態(tài)，以測試用于設(shè)計(jì)血小板活化的激動(dòng)劑或拮抗劑的備選物質(zhì)，特別是通過與血小板受體的特異性相互作用。為此，本發(fā)明提出基于觀測在血小板中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化的方法。在現(xiàn)有技術(shù)中已描述通過確定對血小板中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)的修飾來分析血小板活化的方法。例如來自Biocytex(Marseille, France)的稱為PLT VASP/P2Y12的試劑盒，提出了對全血樣品進(jìn)行并由通過測量細(xì)胞內(nèi)蛋白VASP(血管擴(kuò)張刺激磷蛋白)的磷酸化狀態(tài)來確定血小板的活化狀態(tài)組成的體外測試。在那種測試背景下，使用雙色流式細(xì)胞術(shù)測量蛋白VASP的磷酸化，以比較兩種測試條件(一部分樣品使用前列腺素PGEl進(jìn)行VASP活化，另一部分樣品使用PGEl和ADP進(jìn)行活化)。通過檢測熒光和計(jì)算血小板反應(yīng)指數(shù)進(jìn)行分析。流式細(xì)胞分析需要在細(xì)胞直方圖上隔離包含血小板的細(xì)胞云(cell cloud)，以防止血液的其他細(xì)胞群或細(xì)胞碎片干擾測量。然而，確定用于完成細(xì)胞分析(cytometric analysis)的條件并且進(jìn)行所述分析可能代表了困難重重。 本發(fā)明提出在全血中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白，特別是血小板VASP蛋白的磷酸化狀態(tài)的 細(xì)胞分析的可選方案。根據(jù)這種可選方案，利用ELISA型免疫酶測試進(jìn)行分析。為此，本發(fā)明人已確定了活化并且同時(shí)抑制全血中的血小板的條件，其意指可以實(shí)現(xiàn)由預(yù)先確定的血小板受體介導(dǎo)的血小板活化的具體測量。因此，在本發(fā)明的背景中，本發(fā)明人定義了與生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)原理不同的測試，其中，在已與樣品的其他組分和細(xì)胞分離或者被證實(shí)作為分析的唯一目標(biāo)(例如培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系或純化的淋巴細(xì)胞或從血液中分離的淋巴細(xì)胞)的均一的細(xì)胞群的受體活化之后，通常測量ELISA分析中的信號(hào)。因而，通過免除這種必要性，本發(fā)明人因此證明可以克服在制備PRP(plasmariche en plaquettes,富血小板血衆(zhòng))中限制使用監(jiān)測血小板活性的測試的原因。本發(fā)明涉及通過對全血樣品進(jìn)行的ELISA檢測樣品中預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活化狀態(tài)的方法，其包括確定與細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白(生物標(biāo)記物)的磷酸化狀態(tài)。因此，本發(fā)明提出用于在ELISA分析中確定在全血樣品中預(yù)先確定的細(xì)胞群特別是血小板中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)的方法。因而用作血小板活化狀態(tài)標(biāo)記物的一種細(xì)胞內(nèi)蛋白是蛋白VASP。另一種所述蛋白是蛋白AKT。在本申請的上下文中，術(shù)語“全血樣品”適用于從人或動(dòng)物個(gè)體采集的血液樣品，所述樣品在進(jìn)行本發(fā)明方法之前并未分級(jí)。有利地，用于進(jìn)行本發(fā)明的檢測的血液樣品的體積限于，例如80y L的級(jí)別，被分為兩個(gè)等分試樣。當(dāng)從個(gè)體采集血液樣品時(shí)，重要的是選擇可以保持要予以活化狀態(tài)確定的細(xì)胞群完整性的條件，例如通過避免攪動(dòng)樣品和熱沖擊。特別地，必須保存血小板的完整性。本發(fā)明的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)測試采用在下文段落中描述和實(shí)例中更深入詳述的操作條件。它遵循眾所周知的ELISA原理，并且可以手動(dòng)或自動(dòng)進(jìn)行。它可以是用于確定蛋白磷酸化狀態(tài)的定性測試，或當(dāng)確定血小板反應(yīng)指數(shù)時(shí)可以是半定量測試，或當(dāng)它包括測量校正標(biāo)準(zhǔn)時(shí)可以是定量測試。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，予以活性測量的細(xì)胞群是血小板群。 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，予以磷酸化狀態(tài)測試的細(xì)胞內(nèi)蛋白是激酶家族的蛋白，或者是激酶底物蛋白。因此，要利用本發(fā)明的方法予以磷酸化狀態(tài)確定的細(xì)胞內(nèi)蛋白是，例如選自激酶底物蛋白或激酶本身，選自激酶PKA、PKG、AKT、ERK、JAK2、BCR-ABL。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，予以磷酸化狀態(tài)測試的細(xì)胞內(nèi)蛋白是蛋白VASP或STAT5。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，要予以磷酸化狀態(tài)測試的細(xì)胞內(nèi)蛋白選自AKT、p38和 ERK。本發(fā)明的ELISA檢測要求在靶向確定其磷酸化狀態(tài)的生物標(biāo)記物蛋白與特異性識(shí)別所述蛋白的這種磷酸化狀態(tài)的抗體之間形成免疫復(fù)合物。當(dāng)所考慮的抗體識(shí)別處于所考慮的磷酸化狀態(tài)的所討論蛋白，并且未明顯識(shí)別非磷酸化狀態(tài)的相同蛋白時(shí)，識(shí)別被稱為是特異性的?？贵w還基本上識(shí)別處于所討論磷酸化狀態(tài)的所討論蛋白，并且不明顯識(shí)別處理樣品中所含的其他蛋白。 本發(fā)明的ELISA測試可以以一步或二步進(jìn)行。當(dāng)以二步進(jìn)行時(shí)(利用已知的標(biāo)準(zhǔn)模式)，最初將所處理的血液樣品與特異性識(shí)別測試細(xì)胞內(nèi)蛋白而與其磷酸化狀態(tài)無關(guān)的抗體(捕獲抗體)接觸。接著，通過將捕獲的抗原與一旦測試細(xì)胞內(nèi)蛋白處于磷酸化形式就特異性識(shí)別所述測試細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體(顯示抗體)接觸，來顯示所捕獲的抗原。當(dāng)以一步進(jìn)行時(shí)，將測試細(xì)胞內(nèi)蛋白與孔內(nèi)的顯示抗體接觸，同時(shí)與捕獲抗體接觸。已獲得用于各種蛋白的磷酸化-狀態(tài)依賴性抗體或?qū)@種磷酸化狀態(tài)具有特異性的抗體，例如利用Czernik A J et al (1991), Methods Enzymol 201 :264中所描述的技術(shù)。為此，可以用呈遞構(gòu)成靶蛋白中所考慮的磷酸化位點(diǎn)的氨基酸序列的磷酸化蛋白或合成磷酸肽免疫動(dòng)物，例如兔。所述肽必須足夠組成抗原決定簇。例如，所述肽可以包含6-20、
6-15、優(yōu)選6-10個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，所產(chǎn)生的抗體選自對由磷酸化蛋白組成的抗原具有高親和力和良好特異性的那些抗體。為檢測磷酸化的VASP蛋白，抗體特別是單克隆抗體的制備描述于歐洲專利EP I042 368中，在此通過援引將其并入。特別是在該專利中，有效的單克隆抗體是由保藏于DSM保藏中心(DSM Collection)、保藏編號(hào)為ACC2330的雜交瘤細(xì)胞16C2(克隆16C2)所產(chǎn)生的抗體。專利EP I 042 368的實(shí)施例I描述了磷酸化的抗P-VASP抗體(P-VASP)的還原。在本發(fā)明的上下文中，利用肽序列KLRKVS239Kq或序列RKVS239KQE可以生成其他抗P-VASP抗體。抗P-VASP抗體還可以通過商購獲得。除了以上所述抗體之外，可以引用由US Biological銷售的鼠單克隆抗體(克隆4i67)或由提供的羊多克隆抗P-VASP抗體、Ser239> Santa Cruz、sc-23507 等。若必要的話，利用識(shí)別一抗的二抗進(jìn)行ELISA，以提高特異性。術(shù)語“抗體”指包含若適當(dāng)?shù)脑捤兄劓満洼p鏈的抗體，或者含有靶抗原的識(shí)別位點(diǎn)或由靶抗原識(shí)別位點(diǎn)組成的抗體片段，例如由重鏈組成的片段，或由重鏈結(jié)合組成的片段，例如(Fab’)2片段或Fab片段。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，免疫復(fù)合物的形成用抗體標(biāo)記物的底物顯示，例如有色底物或熒光標(biāo)記物，并且包括測量光密度的步驟。可以使用諸如過氧化物酶的標(biāo)記物。光密度例如于450nm測量，特別是當(dāng)抗體的標(biāo)記物是過氧化物酶時(shí)。
特別是，本發(fā)明可以用于確定細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)，所述細(xì)胞內(nèi)蛋白是激酶血小板底物，如在239位絲氨酸處磷酸化的VASP蛋白，或是激酶，如在473位絲氨酸處磷酸化的AKT蛋白，在694位酪氨酸處磷酸化的STAT5，在180位蘇氨酸處或182位酪氨酸處磷酸化的P38，或在202位蘇氨酸處或204位酪氨酸處磷酸化的ERK。這些磷酸化形式的蛋白的特異性抗體可以通過商購獲得，或可以通過本申請所引用的方法制備。作為示例，可以利用以下抗體來自兔的抗-p_STAT5(Tyr694)抗體，銷售編號(hào)9351L PAb, Cell Signaling,克隆 C71E5 MAb, Cell Signaling，克隆 C11C5 MAb, Cell Signaling，或編號(hào)克隆 47BD、克隆 5G4-MCF-7，Nanotools，克隆 14H2，Cell Signaling，克隆 ST5P-4A9，Zymed，或用于兔抗-P-AKT 抗體，克隆 193H12，由 Cell Signaling 出售。
同樣可以商購獲得識(shí)別非磷酸化形式的所述蛋白的抗體(以組成捕獲抗體)對于STAT5，可以引用兔抗體(克隆C-17，Pab Santa Cruz)或鼠抗體(克隆89BD、克隆ST5-8F7, Invitrogen,克隆 A_9, Santa Cruz),對于 AKT,由 Cell Signaling 出售的兔抗體(克隆193H12)，對于磷酸化的ERK，特異性抗體是如由Cell Signaling(編號(hào)克隆197G2)、由 Calbiochem (克隆 12D4)或由 Lifespan Biosciences (編號(hào) LS-C16383)出售。對于 p38，Cell Signaling同樣提供編號(hào)為9228、9212、9215等的抗體，以及Santa Cruz提供編號(hào)為sc-7972 的抗體(p38 克隆 A-12 鼠 Mab)。為進(jìn)行本發(fā)明的ELISA，處理從患者采集的血液樣品，以防止其凝固。特別是，向其添加普通抗凝固劑以實(shí)現(xiàn)對血液進(jìn)行的體外檢測，所述抗凝固劑例如肝素或檸檬酸鈉如檸檬酸三鈉，例如0. 109M或0. 129M的檸檬酸三鈉，以9體積血液比I體積抗凝固劑的比例添加。特別是，本發(fā)明的ELISA檢測方法包括進(jìn)行以下步驟a)用第一化合物活化全血樣品的等分試樣，所述第一化合物通過活化預(yù)先確定的 細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化而作用于所述樣品的預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性，有利地是生理化合物，以及用所述第一化合物和第二化合物活化另一等分試樣，所述第二化合物通過與細(xì)胞受體相互作用的通路或通過與細(xì)胞信號(hào)酶相互作用的通路抑制或修飾所述磷酸化；b)于能夠在非磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白和磷酸化狀態(tài)的所述蛋白之間保持平衡的條件下，裂解所活化的樣品的細(xì)胞，所述平衡提供了所述樣品的所述預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性的證據(jù)；c)清洗以除去裂解產(chǎn)物；d)將所處理的樣品與捕獲探針一起孵育，所述捕獲探針包含特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)蛋白而與其磷酸化狀態(tài)無關(guān)的抗體，所述抗體是IgG型免疫球蛋白或F(ab’)2或Fab片段；e)顯示磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白之間形成的免疫復(fù)合物，以及顯示特異性識(shí)別磷酸化狀態(tài)的所述細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體。有利的是，將試劑和樣品放置于微量培養(yǎng)板的孔內(nèi)。將試劑和樣品放置于單個(gè)的孔內(nèi)而無需轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，以上步驟的變化在于，第二化合物是關(guān)于抑制或修飾磷酸化狀態(tài)而研究的物質(zhì)，在采集樣品之前，將所述物質(zhì)專門給予患者，或者將所述物質(zhì)與在用上所述第一生理化合物活化之前采集的全血樣品接觸。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，顯示免疫復(fù)合物形成的步驟之后是確定血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)的步驟，特別是，所述血小板反應(yīng)指數(shù)是通過讀取與顯示標(biāo)記物的抗體相關(guān)聯(lián)的光密度而檢測免疫復(fù)合物時(shí)獲得的
PRi = ODrcn-oprci+c2i
OD[Cl]_OD[空白]其中Cl =第一化合物，例如磷酸化活化劑；C2 =第二化合物，例如磷酸化抑制劑。
在檢測方法的具體實(shí)施方案中，要予以磷酸化狀態(tài)確定的細(xì)胞內(nèi)蛋白是VASP蛋白，并且要予以活化確定的細(xì)胞群是血小板群，用第一 VASP磷酸化激動(dòng)劑活化的樣品的等分試樣，用相同的第一化合物和第二化合物活化的樣品的另一等分試樣，所述第二化合物與用于測試生物或治療活性的物質(zhì)的靶血小板受體相互作用。在檢測方法的另一具體實(shí)施方案中，用于VASP磷酸化的生理激動(dòng)劑選自活化腺苷酸環(huán)化酶的前列腺素如PGE1、PGI2、PDG2，以及活化鳥苷酸環(huán)化酶的物質(zhì)如NO-供給物質(zhì)(例如SNP :硝普鈉)，或利鈉肽(例如ANP :心房利鈉肽；BNP B-型利鈉肽)。在具體實(shí)施方案中，抑制或修飾磷酸化的化合物，是與血小板受體如由ADP刺激的受體P2Y12相互作用的物質(zhì)，例如噻吩并吡啶如氯吡格雷(clopidrogel)或噻氯吡啶(ticlopidine)，和/或與細(xì)胞信號(hào)酶如腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶，磷酸二酯酶如TOE2、PDE3或TOE5，或激酶蛋白如PKA或PKG相互作用的物質(zhì)。以下實(shí)施例示出用對細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化具有活性的物質(zhì)獲得的結(jié)果。當(dāng)它們單獨(dú)使用或者與其他生理化合物聯(lián)合使用時(shí)(例如當(dāng)所觀測的信號(hào)通路與P2Y12相關(guān)時(shí)與ADP聯(lián)合使用)，這些物質(zhì)代表所述第二化合物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，除上文所限定的步驟外，檢測方法可以包括例如于-20°C或_80°C冷凍的步驟，其在清洗步驟之后進(jìn)行，以保存樣品。本發(fā)明人觀測到，在以這種方式保存樣品之后可以測試該樣品，而不會(huì)改變樣品的穩(wěn)定性，因而意味著采集之后通過冷凍保存兩個(gè)月以上，仍可以獲得可靠的結(jié)果。本發(fā)明人還觀測到，在未冷凍的情況下，采樣之后多達(dá)48小時(shí)之內(nèi)可以檢測樣品，因?yàn)檠“灞３址€(wěn)定。根據(jù)測試，如在關(guān)于“第二化合物”的以上步驟中所表明的，不必在采集血液樣品之后添加要予以觀測與血小板活化相互作用的化合物(測試化合物)，但是可以在采集樣品之前將其給予患者。在這種情況下，若測試化合物直接通過與磷酸化相關(guān)的通路相互作用，則給予所述第二化合物可能不對采集的全血樣品進(jìn)行，或者給予所述第二化合物由給予調(diào)節(jié)磷酸化的細(xì)胞信號(hào)通路的生理化合物組成，尤其是必須證實(shí)給予患者的化合物活性時(shí)。當(dāng)測試化合物是已給予患者的化合物時(shí)，本發(fā)明的分析可以用于確定所述化合物的效率程度，或者患者對治療的抗性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測所用的裂解緩沖液包含以下混合物或同等功能混合物，或者由以下混合物或同等功能混合物組成
終濃度為2% 0. 02%，優(yōu)選0. 2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)； 終濃度為5% 0.2%，優(yōu)選2%的曲拉通X-100 (Triton X-100，辛基苯氧基聚乙氧基苯酹); 終濃度為1% 0.004%，優(yōu)選0.04%的殺微生物型廣譜殺微生物劑，其包含
5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮作為活性成分。同等功能混合物可以通過用另一種陰離子去污劑替代SDS，如膽酸鹽或脫氧膽酸鹽，和/或用另一種非離子去污劑替代曲拉通X-100，如潤濕劑P-40 (Nonidet P-40)或吐溫80 (Tween 80)來制備。離子和非離子去污劑可以以5% 0. 005%的濃度使用。用于制備本發(fā)明裂解緩沖液的合適的殺微生物劑是ProClin (Rohm andHaas)、ProClin 150或ProClin 300。它可以被能夠抑制微生物生長和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的另 一廣譜試劑替代。有利的是，當(dāng)進(jìn)行ELISA時(shí)，所有孵育步驟都在環(huán)境溫度或37°C的溫度下進(jìn)行，并且裂解步驟在環(huán)境溫度或37°C的溫度下進(jìn)行的時(shí)間是I 30分鐘，優(yōu)選10分鐘。根據(jù)附圖和實(shí)施例，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得顯而易見。圖I為VASP磷酸化調(diào)節(jié)通路(級(jí)聯(lián))的簡化圖；圖2-圖8為各種活性物質(zhì)通過與細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化通路相互作用對血小板活化的影響；圖9和

圖10是在處理之前或處理、裂解和冷凍之后對血小板穩(wěn)定性的研究。圖11是以一步或二步進(jìn)行ELISA的結(jié)果。
實(shí)施例I.在全血ELISA測試中通過VASP蛋白的磷酸化分析血小板活化，以證實(shí)P2Y12受體的活化對VASP磷酸化狀態(tài)的影響雖然已經(jīng)公認(rèn)的是，在血小板中，VASP(P-VASP)的磷酸化可以反映出功能性ADP受體(P2Y12)的活化狀態(tài),但到目前為止并未報(bào)道過全血中所含的全部血液細(xì)胞(紅細(xì)胞+白細(xì)胞)的裂解對由P2Y12介導(dǎo)的血小板活化的后果。特別是，與受體(例如P2Y12)和底物之間所包括的所有級(jí)別的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的酶釋放到釋放到介質(zhì)中，可以潛在地干擾生物標(biāo)記物G磷酸化生物標(biāo)記物平衡(例如VASP O P-VASP或任何其他信號(hào)生物標(biāo)記物如AKT、STAT5、p38、ERK等)，所述底物易被磷酸化，組成生物標(biāo)記物(例如VASP)。在通過細(xì)胞裂解作用釋放到介質(zhì)中的普遍存在的酶中，蛋白激酶(PKA、PKG)和磷酸酶負(fù)責(zé)VASP的磷酸化或它的去磷酸化。因此，可以直接預(yù)期的是，這些酶的作用在細(xì)胞裂解步驟期間可以直接改變平衡(P-VASP O VASP)，由此改變測量結(jié)果的相關(guān)性。因此，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了 ELISA分析，以便I/確定隨著細(xì)胞裂解釋放到介質(zhì)的細(xì)胞酶的活性；2/使通過細(xì)胞裂解作用釋放的核苷酸(ADP、ATP、AMP、cAMP、GMP, cGMP等)的作用無效。例如，已知紅細(xì)胞是ADP庫,其可以直接影響細(xì)胞特別是血小板的活化。本發(fā)明人已觀測到克服這些干擾分析的風(fēng)險(xiǎn)是可能的，如通過本申請上下文中、特別是以下實(shí)施例中設(shè)計(jì)的ELISA分析所說明的。
微孔板操作方案對于在活化劑PGEl和由ADP活化的等體P2Y12控制下的VASP磷酸化狀杰的ELISA分析，采用以下步驟和條件I.將血液采集到包含抗凝固劑如檸檬酸鈉(0. 109M或0. 129M)的樣品管中；2. a)若必要，將要予以測試與血小板活性相互作用的化合物放置于包含全血樣品的部分孔內(nèi)；2. b)將PGEl或PGE1+ADP活化劑(40 U L)放置于微量培養(yǎng)板的相應(yīng)孔內(nèi)；3.添加血液(40 u L)，然后利用連續(xù)吸入和放出的方式攪動(dòng)；4.將混合物于環(huán)境溫度下孵育10分鐘；
5.將裂解緩沖液(IOOiiL)添加到包含活化的血液的孔內(nèi)，并且將其通過連續(xù)吸入和放出的方式完全攪動(dòng)。同樣將裂解緩沖液(ISOiiL)放置于“空白”孔內(nèi)；6.將反應(yīng)介質(zhì)于環(huán)境溫度下孵育30分鐘；7.用稀釋的清洗溶液(3 X 300 U L，以濃縮20倍供給)清洗平板三次；8.于稀釋緩沖液中稀釋包含濃縮20倍的抗-P-VASP抗體的過氧化物酶探針；9.將所稀釋的過氧化物酶探針放置到所有孔內(nèi)(200 UL)；10將其于環(huán)境溫度下孵育30分鐘；11.用稀釋的清洗溶液(3X300 u L，以濃縮20倍供給)清洗平板三次；12.將TMB顯示底物放置到所有孔內(nèi)(200 U L)；13將其于環(huán)境溫度下孵育5分鐘；14接著，將終止溶液添加到所有孔內(nèi)(IOOiiL)；15.將靜置平板幾分鐘；16.使用酶標(biāo)儀測量OD45tlnm ；17.利用下式計(jì)算血小板反應(yīng)指數(shù)
權(quán)利要求
1.利用ELISA檢測全血樣品中預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活化狀態(tài)的方法，包括確定與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白(生物標(biāo)記物)的磷酸化狀態(tài)，所述檢測對所述全血樣品進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用ELISA的檢測方法，其中所檢測的細(xì)胞活化狀態(tài)是血小板的細(xì)胞活化狀態(tài)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利用ELISA的檢測方法，其中予以磷酸化狀態(tài)測試的細(xì)胞內(nèi)蛋白是激酶家族的蛋白或者其是激酶底物蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用ELISA的檢測方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)蛋白是激酶的底物 蛋白，或者選自激酶PKA、PKG、AKT、ERK、JAK2、BCR-ABL的激酶本身。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的利用ELISA的檢測方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)蛋白是諸如蛋白VASP或STAT5的血小板激酶底物，或者其是諸如蛋白AKT、p38或ERK的激酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的利用ELISA的檢測方法，包括對全血樣品進(jìn)行的以下步驟 a)用第一化合物活化所述全血樣品的等分試樣，所述第一化合物通過活化預(yù)先確定的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化而作用于所述樣品的預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性，有利地是生理化合物，以及用所述第一化合物和第二化合物活化另一等分試樣，所述第二化合物通過與細(xì)胞受體相互作用的通路或通過與細(xì)胞信號(hào)酶相互作用的通路抑制或修飾所述磷酸化； b)于能夠在非磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白和磷酸化狀態(tài)的所述蛋白之間保持平衡的條件下裂解所活化的樣品的細(xì)胞，所述平衡提供了所述樣品的所述預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性的證據(jù)； c)清洗以除去裂解產(chǎn)物； d)將所處理的樣品與捕獲探針一起孵育，所述捕獲探針包含特異性識(shí)別所述細(xì)胞內(nèi)蛋白而與其磷酸化狀態(tài)無關(guān)的抗體； e)顯示所述磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白之間形成的免疫復(fù)合物，以及顯示特異性識(shí)別磷酸化狀態(tài)的所述細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體； 若適當(dāng)?shù)脑?，?biāo)記所述抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的利用ELISA的檢測方法，包括在對采集自患者的全血樣品進(jìn)行的以下步驟，已給予所述患者通過修飾預(yù)先確定的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化而與血小板活化相互作用的化合物(稱為第二化合物) a)用第一化合物活化所述全血樣品的等分試樣，所述第一化合物通過活化預(yù)先確定的細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化而作用于所述樣品的預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性； b)于能夠在非磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白和磷酸化狀態(tài)的所述蛋白之間保持平衡的條件下裂解所活化的樣品的細(xì)胞，所述平衡提供了所述樣品的所述預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活性的證據(jù)； c)清洗以除去裂解產(chǎn)物； d)將所處理的樣品與捕獲探針一起孵育，所述捕獲探針包含特異性識(shí)別所述細(xì)胞內(nèi)蛋白而與其磷酸化狀態(tài)無關(guān)的抗體； e)顯示所述磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白之間形成的免疫復(fù)合物，以及顯示特異性識(shí)別磷酸化狀態(tài)的所述細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體；若適當(dāng)?shù)脑?，?biāo)記所述抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用所述第二化合物活化先于用所述第一化合物活化。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，在步驟a)中，用抑制或修飾磷酸化的所述第二化合物活化，是要測試其對細(xì)胞活性的影響的物質(zhì)，例如具有生物學(xué)活性或治療活性的物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的利用ELISA的檢測方法，其中所述清洗步驟之后是冷凍步驟，以保存樣品。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的利用ELISA的檢測方法，其中顯示所述形成的免疫復(fù)合物是用抗體標(biāo)記物的底物進(jìn)行的，并且包括測量所處理樣品的兩個(gè)等分試樣的光密度的步驟，之后若適當(dāng)?shù)脑?，確定PRI。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中予以磷酸化狀態(tài)確定的所述細(xì)胞內(nèi)蛋白是VASP蛋白，并且予以活化確定的所述細(xì)胞群是血小板群，用第一化合物活化的樣品的等分試樣，所述第一化合物是VASP磷酸化的激動(dòng)劑，用相同的第一化合物以及進(jìn)一步用第二化合物活化的樣品的另一等分試樣，所述第二化合物與予以生物學(xué)活性或治療活性測試的物質(zhì)的靶血小板受體相互作用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的檢測方法，其中所述VASP磷酸化的生理激動(dòng)劑選自活化腺苷酸環(huán)化酶的酶如前列腺素PGE1、PGI2，以及活化鳥苷酸環(huán)化酶的物質(zhì)如NO-供給物質(zhì)或利鈉肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的檢測方法，其中所述抑制或修飾磷酸化的化合物是與血小板受體和/或與細(xì)胞信號(hào)酶相互作用的物質(zhì)，所述血小板受體如由ADP刺激的受體P2Y12，所述細(xì)胞信號(hào)酶如腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶如H)E2、PDE3或TOE5，或激酶蛋白如PKA或PKG。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中予以磷酸化狀態(tài)確定的所述細(xì)胞內(nèi)蛋白是VASP蛋白，并且予以活性確定的所述細(xì)胞群是血小板群，用諸如PGEI、PDG2或PGI2的VASP磷酸化的第一生理激動(dòng)劑活化的樣品的等分試樣，用相同的第一激動(dòng)劑并且還用第二化合物活化的另一等分試樣，所述第二化合物與細(xì)胞受體相互作用，例如與由核苷酸ADP刺激的受體P2相互作用，所述第二化合物抑制VASP磷酸化或測試所述第二化合物以研究它的抑制特性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中所述特異性識(shí)別所述磷酸化狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體是單克隆抗體，例如特異性識(shí)別在239位絲氨酸處磷酸化的VASP蛋白的單克隆抗體，或者特異性識(shí)別在473位絲氨酸處磷酸化的AKT蛋白的單克隆抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中所述裂解緩沖液包含以下混合物或由以下混合物組成終濃度為O. 0002%-10%，優(yōu)選2%-O. 02%，優(yōu)選O. 2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)；終濃度為O. 002% -10%,優(yōu)選5% -O. 2%，優(yōu)選2%的曲拉通X-100 (辛基苯氧基聚乙氧基苯酹);終濃度為O. 000002 %-10%,優(yōu)選O. 004 %~1%,優(yōu)選O. 04 %的殺微生物型廣譜殺微生物劑，其包含5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮作為活性成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中所有的所述孵育步驟都在環(huán)境溫度或大約37°C的溫度下進(jìn)行，并且所述裂解步驟在環(huán)境溫度或大約37°C的溫度下進(jìn)行的時(shí)間是10-30分鐘，優(yōu)選10分鐘。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其中所述血液樣品在保存要測試活性的細(xì)胞群的完整性的條件下，特別是防止所述細(xì)胞群在采集時(shí)活化的條件下采集，并且接著以9體積血液對I體積抗凝固劑的比例，將所采集的樣品用抗凝固劑如檸檬酸鈉處理，優(yōu)選O. 109M或O. 129M的檸檬酸三鈉。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的檢測方法，應(yīng)用于已從用激動(dòng)劑或拮抗劑治療的患者采集的全血樣品，用于所述樣品中所含的預(yù)先確定的細(xì)胞群的活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的檢測方法，其中所述激動(dòng)劑或所述拮抗劑作用于血小板凝 集。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的檢測方法，其中所述血小板活化的拮抗劑是ADP的P2Y12受體的拮抗劑，例如噻吩并吡啶如氯吡格雷或噻氯吡啶，或者其是與細(xì)胞信號(hào)酶如腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶，磷酸二酯酶如H)E2、PDE3或TOE5，或激酶蛋白如PKA或PKG相互作用的物質(zhì)。
23.在用血小板活化的拮抗劑治療的患者中監(jiān)測凝固問題的體外方法，其特征在于，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述進(jìn)行檢測，確定血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)，以及解釋PRI,例如以便確定患者對所述拮抗劑是否反應(yīng)良好或反應(yīng)不良。
24.用于實(shí)施任一項(xiàng)上述權(quán)利要求所述方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含 權(quán)利要求17所限定的裂解緩沖液； 籲清洗溶液； 籲特異性識(shí)別磷酸化狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的抗體，如有必要，標(biāo)記所述抗體。
全文摘要
本申請涉及利用ELISA檢測全血樣品中預(yù)先確定的細(xì)胞群的細(xì)胞活化狀態(tài)的方法，所述方法包括確定與細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白(生物標(biāo)記物)的磷酸化狀態(tài)，所述檢測對所述全血樣品進(jìn)行。本發(fā)明的用于檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化狀態(tài)的方法的具體應(yīng)用，包括監(jiān)測全血樣品中存在的細(xì)胞群的細(xì)胞活化的激動(dòng)劑或拮抗劑。這種應(yīng)用可特別有助于患者的治療監(jiān)測，或者其可用于藥物篩選。特別是，本申請涉及由觀測全血樣品中所含的血小板活化來探討止血，特別是血液凝固。
文檔編號(hào)G01N33/86GK102803505SQ201080024940
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者馬克西姆·牟拉德, 戴尼爾勒·布雷毛恩 申請人:賽泰克斯生物公司