專利名稱：：一種抗凍多肽、其合成及含有這種多肽的組合物和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物領域，具體的說涉及一種多肽。特別涉及一種抗凍多肽、其合成及含有這種多肽的組合物和應用。
背景技術：
：抗凍蛋白(antifreezeproteinsAFPs)是一類能夠抑制冰晶生長、改變冰晶形態(tài)、抑制冰的重結晶的蛋白質。亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(thermalhysteresisproteinsTHPs)。自1969年Devries在南極Mcmurdo海峽的一禾中Nototheneniid魚的血液中首先發(fā)現(xiàn)，至今，已先后從魚類、昆蟲、植物及真菌和細菌中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白，并對其作用機制、分子結構作了深入的研究。目前，抗凍蛋白在農業(yè)領域的研究非常廣泛，在食品和醫(yī)藥應用方面也越來越引起人們的重視。迄今為止在魚類中共發(fā)現(xiàn)了5種抗凍蛋白，分別是抗凍糖蛋白(AFGPs)、I型抗凍蛋白(AFPI)、II型抗凍蛋白(AFPII)、III型抗凍蛋白(AFPIII)和IV型抗凍蛋白(AFPIV)。抗凍糖蛋白(AFGPs)于1969年首先由Devries在北極魚Trematomusborohgrevinki的血液中發(fā)現(xiàn)。其結構為的重復的含有糖基化的三肽單位組成，分子量從2.5kD到33.7kD不等。它們的活性隨其分子量的增加及重復數(shù)的增多而提高。通過化學修飾(乙?；瓦^氧化)糖基后會導致其抗凍活性的喪失，因此糖基是決定其抗凍性的主要基團。AFGPs在溶液中以左手一折疊螺旋存在，這種構象能使雙糖疏水基團面向碳骨架，而親水基團面向溶液，有利于親水基團和小分子之間形成氫鍵，阻止冰核的形成。最近由ProtoKinetix公司人工合成的抗冷凍糖蛋白AAGP已被證明可以保持與天然的抗凍蛋白有相同的生物學活性,并巳申請了專利保護。由于抗凍蛋白的特殊作用，在食品科學、農業(yè)科學方面的應用性研究長足發(fā)展，并且申請了諸多應用性專利。目前，抗凍蛋白在醫(yī)學、美容產品方面的研究也引起了人們的廣泛興趣，其主要的應用范圍主要包括以下方面1、應用于保護皮膚，在化妝品中作為抗衰老和抗氧化添加劑，可以減緩細胞的衰老，具有抗皺、修復、保濕、增加皮膚彈性等作用。2、抗日光照射劑一保護和修復，可以有效減少日光照時所引起的紅斑。3、細胞和組織的低溫貯藏，可以有效抑制低溫環(huán)境下冰晶的形成，能夠顯著提高細胞和組織等活體的存活率，如菌株保存、胚胎保存、器官保存等，如可以用在器官移植中。目前多肽合成通常采用生物方法，但生物方法費時費力，不利于工業(yè)化大規(guī)模生產。此外，文獻"o-乙酰氨基半乳糖基化氨基酸的化學合成"，《第三軍醫(yī)大學學報》22巻第10期958-960頁報道了一種多肽合成方法，該路線簡短，但按照該文獻方法無法重復試驗。針對于此，本發(fā)明根據(jù)幾種天然抗凍蛋白的結構，采用改進的化學合成方式制備抗凍肽，所合成的小分子抗凍肽具有與天然抗凍蛋白相同的抗凍功能，與大腸桿菌及酵母表達的抗凍蛋白相比，具有顯著的優(yōu)勢，既避免了費時的細菌培養(yǎng)及產品純化過程，又杜絕了產品中含有的宿主菌的有害成分，產品安全性進一步提高，同時，有效解決了成本問題及穩(wěn)定性，可以大規(guī)模工業(yè)化生產，與配方組分相容性好，可以作為主成分之一制成凍干劑、水劑、凝膠劑等，可廣泛用于活體組織的低溫貯藏、可以有效保護皮膚因低溫及紫外線而造成的傷害、也可用于創(chuàng)傷修復領域。
發(fā)明內容本發(fā)明目的之一在于提供一種抗凍多肽；本發(fā)明目的之二在于提供一種所述抗凍多肽的合成方法；本發(fā)明目的之三在于提供所述抗凍多肽的用途；本發(fā)明目的之四在于提供含有所述抗凍多肽的組合物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術方案一種抗凍多肽，所述多肽序列為(NATA)n，所述多肽在每個Thr的羥基上修飾有乙酰氨基半乳糖，其中n二216。所述的修飾有為本領域通常習慣用語。根據(jù)前面所述的抗凍多肽，所述多肽序列優(yōu)選n二2或3，更優(yōu)選為2。根據(jù)前面所述的抗凍多肽，當『2時所述多肽分子量理論值為1138。為了更清楚的說明這種抗凍多肽的結構，當n優(yōu)選為2時，其NATANATA分子式結構為如下一種前面所述多肽的合成方法，合成包括如下步驟乙?；瘜⒁阴０被肴樘窃诙燃淄橹性诼然a催化下同乙酸酐回流反應，反應結束后用正相硅膠柱分離，經過處理得到產物；糖基化將上步反應產物和物質量為上步反應產物0.30.5倍的分別溶于無水二氯甲烷和無水乙腈中，其中優(yōu)選0.4倍物質量的Fmoc-Thr-OH，然后加入到BF3-Et20中攪拌反應，反應完畢經過后處理后，進行反相HPLC純化；固定相多肽合成；將氨基酸單體，以HBTU/H0Bt為縮合劑進行多肽合成，然后用三氟乙酸為切肽試劑，得到產物，其中氨基酸投料量優(yōu)選為樹脂取代值的24倍，最優(yōu)選3倍。按照文獻"O-乙酰氨基半乳糖基化氨基酸的化學合成"進行乙?；铣?，卻發(fā)現(xiàn)有較大雜質產生。關于該反應，現(xiàn)有技術中均采用了較低的溫度，且通常認為較緩和的反應條件可以降低副反應，遂降低反應溫度并嘗試多種催化劑，反復試驗仍然不能滿意。后將反應進行回流，卻意外發(fā)現(xiàn)雜質非常少，且縮短了反應時間，收率較文獻報道高了近十個百分點。而在第二步糖基化修飾反應中，通過優(yōu)化實驗，我們發(fā)現(xiàn)，采用Fmoc-Thr-0H為乙?；肴樘峭读狭?.30.5倍時，有利于最終糖基化修飾產物的提高。根據(jù)前面所述的抗凍多肽的用途，所述抗凍多肽用于制備治療凍傷或幫助傷口愈合的藥物；或者用于制備細菌、細胞、組織或器官冷凍保存的藥物；或者用于制備護膚品或防曬品o一種含有前面所述多肽的組合物，所述組合物含有如下質量百分比的成份前面所述多肽0.025%、其他輔料0.599.95%、其余為無菌多重蒸餾水。所述的其他輔料可以是適合藥用或護膚品、防曬品制備用的輔料，或者是適合冷凍保存細菌、細胞、組織、器官等的藥物的輔料。本領域技術人員通常知曉在制備前面所述的制備治療凍傷或幫助傷口愈合的藥物，或者細菌、細胞、組織或器官冷凍保存的藥物，或者護膚品、防曬品時應該，或者適合使用的輔料種類。6根據(jù)前面所述的組合物，所述其他輔料包括保水劑，含量為0.560%，所述保水劑優(yōu)選為甘油、透明質酸、油酸或凡士林的一種或兩種組合?？梢詢?yōu)選的是，所述的其他輔料還包括如下成份的一種或幾種滲透壓調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、基質、防腐劑、PH調節(jié)劑、促滲劑，所述滲透壓調節(jié)劑優(yōu)選為甘露醇，所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為羥丙基甲基纖維素，所述基質優(yōu)選為卡波姆-940或蜂蠟的一種或兩種組合，所述防腐劑優(yōu)選為尼泊金乙酯，所述pH調節(jié)劑優(yōu)選為三乙醇胺，所述促滲劑優(yōu)選為氮酮。還可進一步優(yōu)選所述滲透壓調節(jié)劑在所述組合物中質量百分比含量為530%，所述穩(wěn)定劑含量為210%，所述基質含量為0.515%，所述防腐劑含量為0.00050.1%，所述pH調節(jié)劑用量為制備時配制溶液pH值為69，所述促滲劑含量為15%。根據(jù)前面所述的組合物，所述其他輔料包括防曬劑，含量為0.55%，所述防曬劑優(yōu)選為氧化鋅或二氧化鈦的一種或兩種組合。可以進一步優(yōu)選的是，所述輔料還包括如下成份的一種或幾種基質或其他活性成分，所述基質優(yōu)選為環(huán)甲基硅酮，所述其他活性成分優(yōu)選為VitalET或a-紅沒藥醇的一種或兩種組合。所述基質含量在組合物中質量百分比含量可以優(yōu)選為5065%，所述其它活性成分含量優(yōu)選為0.56%。根據(jù)前面所述的組合物，所述其他輔料包括防凍劑，含量為520%，所述防凍劑優(yōu)選為二甲基亞砜。其中優(yōu)選的是，所述輔料還包括培養(yǎng)基質，所述培養(yǎng)基質優(yōu)選為胎牛血清或PMI-1640培養(yǎng)液的一種或兩種組合。所述培養(yǎng)基質含量在組合物中質量百分比含量可以優(yōu)選為8090%。此外，本發(fā)明還可進一步更具體為根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.050.1%抗凍肽，510%甘油、510%甘露醇、2%羥丙基甲基纖維素，剩余成份為無菌多重蒸餾水；所述多肽組合物優(yōu)選制成水凝膠劑。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成抗凍肽0.020.15%、卡波姆O.51%、甘油510%、尼泊金乙酯O.1%、調節(jié)pH至69的三乙醇胺，剩余成份為無菌多重蒸餾水；所述多肽組合物優(yōu)選制成水凝膠劑。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.052%抗凍肽、10%二甲基亞砜、510%胎牛血清、7884.95%PMI1640培養(yǎng)基。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.050.5%抗凍肽、0.5%透明質酸、2%氮酮、1%油酸、0.00010.5%肝素、0.00050.1%rhKGF2、5%甘油、0.0005%尼泊金乙酯，剩余成份為無菌多重蒸餾水；所述多肽組合物優(yōu)選制成水劑。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.050.1%抗凍肽、0.5%透明質酸、12%氮酮、0.51%油酸、0.00050.1%胸腺素beta4、0.0005%尼泊金乙酯，剩余成份為無菌多重蒸餾水；所述多肽組合物劑型優(yōu)選水劑。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.10.5%抗凍肽、0.52%氧化鋅、23%二氧化鈦、25XVE磷酸酯絡合月桂基亞胺二丙酸二鈉、0.51%a紅沒藥醇、5060%環(huán)甲基硅酮，剩余成份為無菌多重蒸餾水。根據(jù)前面所述的多肽組合物，所述多肽組合物由下列組成0.10.5%抗凍肽、4060%凡士林、2030%白油、515%蜂蠟，剩余成份為無菌多重蒸餾水、香料和防腐劑；所述多肽組合物優(yōu)選制成膏劑。本發(fā)明所提供的技術方案具有如下優(yōu)勢(1)本發(fā)明提供的多肽具有優(yōu)良的抗凍效果，甚至可以達到天然抗凍蛋白的生物活性。(2)本發(fā)明提供的多肽合成方法具有收率高、簡單易行的優(yōu)點。(3)本發(fā)明提供的多肽可以制備成多種組合物，并應用于醫(yī)學、美容等多種領域，應用范圍廣，效果優(yōu)良。圖1.NAT(GalNAc-D)ANAT(GalNAc-D)A質譜圖2.NAT(GalNAc-D)ANAT(GalNAc-D)A核磁共振氫譜圖3、NAT(GalNAc-D)ANAT(GalNAc-D)A核磁共振碳譜圖4、NAT(GalNAc-D)ANAT(GalNAc-D)A圓二色譜圖，其中數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)如上檢測數(shù)據(jù)，可以判定制備的多肽結構為正確。圖5、為當n優(yōu)選為2時，即多肽為NATANATA時的分子結構。具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明作更具體的解釋，但本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，同樣這些實施例也不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1、抗凍肽的制備1、主要試劑分析純乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、BF3.Et20，SnCl4，CH2C12.乙酸酐和色譜純CH3CN購自Sigma公司；Fmoc陽Thr-OH、Fmoc陽Ala陽OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH單體購自AdvancedChemTech公司；RinkAmide樹脂購自天津南開和成科技有限公司。2、實驗方法2.1乙酰氨基半乳糖過乙?；疓a纖cAc4AcNH-a-GalaSnCl4,Ac20,CH2C12Yield:52%三角燒瓶中分別加入1.5gGalNAc、15mlCH2C12、15ml乙酸酑及120mgSnCl4,5(TC回流反應12小時后，用正相硅膠柱分離，洗脫液為CH2Cl2。收集CH2Cb洗脫液，旋轉蒸發(fā)儀抽干，加入乙醚后攪拌至結晶析出，抽干，得0.782g產物，取適量產物進行表征分析，其余樣品于-20'C保存?zhèn)溆茫朔磻寐蕿?2%。產物表征MS:412.2[M+Na+]，801.3[2M+Na+]iH-NMR(d6隱DMSO,300MHz):7.905(lH,d),5.640(1H，d)，5.266(1H,d)，5.080(1H,d)，5國041(lH,d)，4.226(1H,t)，4.1453.981(3H，m)，2.119(3H，s)，2.037(3H,s)，1.991(3H,s)，1.卯7(3H,s)，1.779(3H,s)2.2Fmoc-Thr-OH氨基酸糖基化三角燒瓶中加入過乙酰化GalNAc148mg和Fmoc-Thr-OH61mg分別溶于2ml無水CH2CUB1.5ml無水CH3CN中，加入BF3Et200.3ml(48%)，攪拌。反應過程中，硅膠板薄層色譜TLC監(jiān)測反應(每隔10min監(jiān)測l次)，擴展劑為乙酸乙酯石油醚醋酸(40:20:0.5),顯色劑為6%的磷鉬酸，反應約90min，當游離Fmoc-Thr-OH被消耗完后，用25mlCH2Cl2稀釋，移入分液漏斗，用lmol/HCl100ml洗滌3次,分離CH2C12相，無水硫酸鈉干燥4h;過濾后抽干至約10ml。反相HPLC純化使用Waters600HPLC儀,使用SymmetryC18(150x4.6mm)柱，流動相為0.1XTFA(三氟乙酸)水溶液，0.1XTFA的CH3CN溶液(55:45)，收集主峰，旋轉蒸發(fā)儀抽干，收集結晶物，電子天平稱量，-20〔保存?zhèn)溆?。此反應的最終得率為48%。上述實驗方法，可根據(jù)需求進行比例放大后規(guī)?；a，以滿足目標多肽的合成。2.3NATANATA多肽的合成運用全自動固相多肽合成儀(型號433A，美國應用生物系統(tǒng)公司)合成目標多肽。包括如下步驟以RinkAmide樹脂為起始原料，以Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、及上述糖基化的Fmoc-Thr(GalNAc(Ac)3-a-D)-OH為單體，氨基酸投料量按照樹脂取代值的2-4倍進行，以HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個接上氨基酸，然后加入三氟乙酸切肽試劑進行切肽，加入乙醚沉淀，獲得粗品，最后采用SymmetryC18(150X3.9mm，5Wn)柱進行分離純化，獲得目標產物，RP-HPLC純度為95%。此反應的最終得率為32%。此外，(NATA)n，其中n為316的多肽也可以參考本合成方法進行制備，區(qū)別僅僅為使用全自動固相多肽合成儀制備多肽時參數(shù)的略微調整。而如何調整為本領域技術人員在本發(fā)明說明書公開內容基礎上結合其自身知識，或經簡單試驗即可得出，無需再付出創(chuàng)造性勞動。實施例2、抗凍肽復合組方，由抗凍肽，甘油、甘露醇、羥丙基甲基纖維素和無菌多重蒸餾水組成時，可用于低溫環(huán)境下皮膚的防護。組分配比(％)抗凍肽0.050.080.10.1甘油1010530甘露醇58100羥丙基甲基纖維素2220無菌多重蒸餾水余量余量余量余量10先將上述配方中羥丙基甲基纖維素浸泡于無菌多重蒸餾水中，待完全漲溶后分別加入預先溶解于無菌多重蒸餾水中的抗凍肽及甘露醇，隨后加入甘油，攪拌均勻后即可。實施例3、抗凍肽復合組方，由抗凍肽、卡波姆，甘油，尼泊金乙酯，三乙醇胺適量(調節(jié)pH至69)，無菌多重蒸餾水制成水凝膠劑，可用于暴露皮膚在低溫環(huán)境下的防護。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>先將卡波姆樹脂溶于水中，待完全溶脹后，加入甘油混勻，或過膠體磨，均勻后加入三乙醇胺中和至pH至69，得透明的凝膠。加三乙醇胺時，盡量減少氣泡生成。然后將抗凍肽水溶液加入上述凝膠中，攪拌均勻分裝即可。此凝膠具有水溶性，外觀透明美觀，搽于皮膚上有特別的細膩滑爽感，與皮膚藕合效果極佳，可防止皮膚由于低溫環(huán)境而造成的凍傷。實施例4、抗凍肽復合組方，由抗凍肽、二甲基亞砜、胎牛血清、PMI-1640培養(yǎng)基組成，可用于組織、器官、細菌、細胞等活體材料的低溫冷凍保存。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>先將抗凍肽溶于無菌多重蒸餾水中，制成10mg/ml的母液，將二甲基亞砜、胎牛血清、PMI-1640培養(yǎng)基按照上述表中百分比混合后加入抗凍肽母液，使其最終濃度為配方中濃度，除菌過濾后即可。實施例5、當所述的抗凍肽復合組方，由抗凍肽、透明質酸、氮酮、油酸、肝素、rhKGF-2(重組人角質細胞生長因子2)、甘油、尼泊金乙酯及無菌多重蒸餾水制成，可當作護膚品使用，具有細胞修復、保持皮膚彈性、減少皺紋的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>將抗凍肽、rhKGF-2、肝素分別用無菌多重蒸餾水配制成10mg/ml的母液，將透明質酸、甘油、油酸、氮酮、尼泊金乙酯按照配方要求用無菌多重蒸餾水混合均勻后，加入抗凍肽、rhKGF-2、肝素母液稀釋至所需濃度，除菌過濾即可。實施例6、當所述的抗凍肽復合組方，由抗凍肽、甘油、甘露醇、胸腺素beta-4、尼泊金乙酯及無菌多重蒸餾水制成，可用于燒傷、燙傷、各類手術切口、潰瘍的治療。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>將抗凍肽、胸腺素beta-4分別用無菌多重蒸餾水配制成10mg/ml的母液，將甘露醇、甘油、尼泊金乙酯按照配方組分要求用無菌多重蒸餾水混合均勻后，加入抗凍肽、胸腺素beta-4母液稀釋至所需濃度，除菌過濾即可。實施例7、當所述的抗凍肽復合組方，由抗凍肽、透明質酸、氮酮、油酸、胸腺素beta-4、尼泊金乙酯及無菌多重蒸餾水制成，可用于燒傷、燙傷、各類手術切口、潰瘍的治療。組分含量(％)抗凍肽0.050.050.1透明質酸0.50.50.5氮酮122油酸0.511胸腺素beta-40.050.00050.1尼泊金乙酯0.00050.00050.0005無菌多重蒸鎦水余量余量余量將抗凍肽、胸腺素beta-4分別用無菌多重蒸餾水配制成10mg/ml的母液，將透明質酸、油酸、氮酮、尼泊金乙酯按照配方組分要求用無菌多重蒸餾水混合均勻后，加入抗凍肽、胸腺素beta-4母液稀釋至所需濃度，除菌過濾即可。實施例8、當所述的抗凍肽復合組方，由抗凍肽、氧化鋅、二氧化鈦、VitalET(VE磷酸酯絡合月桂基亞胺二丙酸二鈉)、a-紅沒藥醇、環(huán)甲基硅酮及無菌多重蒸餾水制成，可用與防曬護膚品。組分含量(％)抗凍肽0.10.30.50.20.4氧化鋅0.50.8250二氧化鈦22305VitalET23506a-紅沒藥醇0.50.5100環(huán)甲基硅酮50606500無菌多重蒸餾水余量余量余量余量余量13配方中，將抗凍肽用無菌多重蒸餾水配制成10mg/ml的母液，將VitalET、a-紅沒藥醇、環(huán)甲基硅酮混合攪拌均勻，然后加入少量無菌多重蒸餾水再次攪拌均勻，放置1小時后，分別加入氧化鋅、二氧化鈦及抗凍肽母液稀釋至所需濃度，除菌過濾即可。實施例9、當所述的抗凍肽復合組方，由抗凍肽、凡士林、蜂蠟、白油及其他成份組成膏霜劑?？捎米髌つw防凍、防皸裂膏。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>配方中各原料加入容器中(抗凍肽、香料和防腐劑除外)，加熱至8(TC使其融化，攪拌均勻，冷至58'C以下，加入香料和防腐劑，冷卻至4CTC時加入抗凍肽，攪拌均勻。上述所列舉的實例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明的限制，有關
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，所作出的各種變化，等同的技術方案也應屬于本發(fā)明保護的范疇。此外，本發(fā)明提供參考實例如下試驗例1、反應溫度對于乙酰氨基半乳糖過乙?；挠绊?<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4回流52%產物峰單一，分離純化容易試驗例2、乙?；肴樘桥cFmoc-Thr-OH投料比對于糖基化修飾反應的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表格中投料比為反應物之間的物料摩爾數(shù)之比。試驗例3、本發(fā)明抗凍多肽在治療凍傷中的效果以下參加試驗人員均為志愿者，并能夠按照要求正確使用供試產品。使用后無任何不良生理反應。表一、含抗凍肽組合制劑對凍傷、皸裂皮膚的效果項目皮膚凍傷、皮膚皸裂人數(shù)60(30成年人，30兒童)效果在凍瘡部位及皸裂部位使用3天后，具有明顯的改善局部血液循環(huán)及皮膚愈合效果；7天后，凍瘡部位顏色恢復正常，發(fā)癢情況完全消失。分別采用實施例9三種規(guī)格組合制劑，一天34次涂于凍瘡或皸裂部位，連續(xù)7天，觀察使用效果。試驗例4、本發(fā)明抗凍多肽在應用于護膚品中的效果表二、含抗凍肽組合制劑對皮膚美容效果項目細胞修復、維持皮膚彈性、減少皺紋人數(shù)105G550歲女性)效果使用21天后，面部皮膚具有明顯光澤，細膩、毛孔縮小；原有色斑淡化甚至消失；面部皺紋減少，具有明顯的抗衰老及美容效果。分別采用實施例5三種規(guī)格的復合組方，試驗者正常潔面后于早、晚時間各用一次本產品，連續(xù)使用2130天，觀察受試者皮膚狀況，采用使用本產品前后對照及使用者本人感覺評判產品使用效果。試驗例5、本發(fā)明抗凍多肽在幫助傷口恢復中的效果表三、含抗凍肽組合制劑對燒傷，燙傷、潰瘍等傷口的作用項目輕度燒傷潰瘍輕度燙傷人數(shù)408030效果使用復合組方35天后，創(chuàng)傷面愈合，無色素沉著，疤痕輕微使用復合組方4小時后，潰瘍面分泌物顯著減少，3天后潰瘍創(chuàng)面肉芽組織開始生長，2周左右創(chuàng)面愈合，皮膚恢復原來膚色。使用復合組方，能夠有效減少傷口滲出液，35天后，創(chuàng)傷面愈合，無色素沉著，疤痕輕微。采用實例6三種復合組方，通過對輕度燒傷、輕度燙傷及潰瘍志愿者的試用，具有良好的促進皮膚愈合作用，同時皮膚愈合質量好，無色素沉著現(xiàn)象，瘢痕輕微。試驗例6、本發(fā)明抗凍多肽在應用于皮膚防曬中的效果表四、含抗凍肽組合制劑對皮膚的防曬效果項目對皮膚的抗紫外線及防曬效果人數(shù)110(2545成年女性)效果能夠減少因紫外照射而產生的紅斑及色素沉著可以有效防止紫外線對皮膚造成的傷害。具有良好的防曬效果。分別采用實施例8五種規(guī)格復合組方，使用者于戶外活動時，均勻涂抹本產品于皮膚暴露部位，按照防曬要求，每隔23小時左右，重復涂抹本品一次。試驗例7、本發(fā)明抗凍多肽在應用于細胞冷凍保存中的效果表五、含抗凍肽組合制劑對3T3小鼠成纖維細胞的冷凍保護效果項目細胞活力(％)備注處理l處理2處理3平均(Mean土SD對照保存液35374137.7±3.05%P《16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>采用實施例4中抗凍肽含量為0.5%的復合組方，試驗對3T3小鼠成纖維細胞的冷凍保護效果。同時用92XFBS(胎牛血清)+8XDMSO(二甲基亞砜)低溫保存液為對照。先將傳代23次的生長狀況良好的上述細胞用胰酶消化后離心收集，以50ml細胞培養(yǎng)瓶(生長面積25cm2)加入2ml凍存液，按照相同程序凍存細胞。凍存細胞于液氮中保存12小時后取出在37。C水浴解凍后用PR1640+10%FBS培養(yǎng)基稀釋后按照下列步驟檢査細胞活力1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2—3分鐘。3、吸取少許懸液涂于血球計數(shù)板上，加上蓋片，鏡下觀察計數(shù)。，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml^4大格細胞總數(shù)/4X10000注意鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。細胞活力(％)=無染色細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)(染色細胞數(shù)+無染色細胞數(shù))X100%死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。序列表SEQUENCELISTING<110>北京金迪克生物技術研究所<120>—種抗凍多肽、其合成及含有這種多肽的組合物和應用<130>5633-105<160>16<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>8<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>1AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla15<210>2<211>12<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISCFEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>2AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla1510<210>3<211>12<212>PRT18<213〉人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>3AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla1510<210>4<211>16<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC一FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>4AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015<210>5<211>20<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>5AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAla2019<210>6<211>24<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>6AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla20<210>7<211>28<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>7AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla2025<210>8<211>32<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>8AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530<210>9<211>36<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>9AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAla35<210>10<211>40<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>10AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla3540<210>11<211>44<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>11AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla3540<210>12<211>48<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>12AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla15101522AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla354045<210>13<211>52<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC一FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>13AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla354045AsnAlaThrAla50<210>14<211>56<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400〉14AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla15101523AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAla'ThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla354045AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla5055<210>15<211>60<212>PRT<213>人工多肽<220>-<221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>15AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla354045AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla505560<210>16<211>64<212>PRT<213>人工多肽<220><221>MISC—FEATURE<223>每個Thr的羥基被乙酰氨基半乳糖修飾<400>16AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla151015AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla202530AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla354045AsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAlaAsnAlaThrAla505560權利要求1、一種抗凍多肽，其特征在于，所述多肽序列為(NATA)n，所述多肽在每個Thr的羥基上修飾有乙酰氨基半乳糖，其中n＝2～16；所述多肽序列優(yōu)選n＝2或3；最優(yōu)選n＝2，且當n＝2時所述多肽分子量理論值為1138。2、權利要求1所述多肽的合成方法，其特征在于，包括如下步驟(1)乙酰化將乙酰氨基半乳糖在二氯甲垸中在氯化錫催化下同乙酸酐回流反應，反應結束后用正相硅膠柱分離，經過處理得到產物；(2)糖基化將上步反應產物和物質量為上步反應產物0.30.5倍的Fmoc-Thr-OH分別溶于無水二氯甲烷和無水乙腈中，其中優(yōu)選0.4倍物質量的Fmoc-Thr-OH，然后加入到BF3-Et20中攪拌反應，反應完畢經過后處理后，進行反相HPLC純化；(3)固定相多肽合成；將氨基酸單體，以HBTU/HOBt為縮合劑進行多肽合成，然后用三氟乙酸為切肽試劑，得到產物，其中氨基酸投料量優(yōu)選為樹脂取代值的24倍，最優(yōu)選3倍。3、根據(jù)權利要求1所述的抗凍多肽的用途，所述抗凍多肽用于制備幫助傷口愈合的藥物；或者用于制備用于細菌、細胞、組織或器官冷凍保存的藥物；或者用于制備護膚品；或者制備防曬品。4、一種含有權利要求1所述多肽的組合物，其特征在于，所述組合物含有如下質量百分比的成份權利要求1所述多肽0.025%、其他輔料0.599.95%、其余為無菌多重蒸熘水。5、根據(jù)權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述其他輔料包括保水劑，含量為0.560%，所述保水劑優(yōu)選為甘油、透明質酸、油酸或凡士林的一種或兩種組合。6、根據(jù)權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述其他輔料包括防曬劑，含量為0.55%，所述防曬劑優(yōu)選為氧化鋅或二氧化鈦的一種或兩種組合。7、根據(jù)權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述其他輔料包括防凍劑，含量為520%，所述防凍劑優(yōu)選為二甲基亞砜。8、根據(jù)權利要求5所述的多肽組合物，其特征在于，所述的其他輔料還包括如下成份的一種或幾種滲透壓調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、基質、防腐劑、pH調節(jié)劑、促滲劑，所述滲透壓調節(jié)劑優(yōu)選為甘露醇，所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為羥丙基甲基纖維素，所述基質優(yōu)選為卡波姆-940或蜂蠟，所述防腐劑優(yōu)選為尼泊金乙酯，所述pH調節(jié)劑優(yōu)選為三乙醇胺，所述促滲劑優(yōu)選為氮酮。9、根據(jù)權利要求6所述的組合物，其特征在于，所述輔料還包括如下成份的一種或幾種基質或其他活性成分，所述基質優(yōu)選為環(huán)甲基硅酮，所述其他活性成分優(yōu)選為VitalET或a-紅沒藥醇的一種或兩種組合。10、根據(jù)權利要求7所述的多肽組合物，其特征在于，所述所述輔料還包括培養(yǎng)基質，所述培養(yǎng)基質優(yōu)選為胎牛血清或PMI-1640培養(yǎng)液的一種或兩種組合。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗凍肽、其合成及含有這種肽的組合物和應用，本發(fā)明通過改進的對蘇氨酸進行糖基化修飾后，經過固定相多肽合成，得到所述的抗凍肽。本發(fā)明提供的抗凍肽組合物，同多種組份配制成水劑、水凝膠劑、霜劑、乳劑、面膜、貼劑等。本制劑可用于細胞、細菌、組織、器官的低溫保存，也可用在創(chuàng)傷、潰瘍、燒傷的治療中，具有抗炎癥作用，可以促進傷口愈合、提高傷口的愈合質量，有效減少瘢痕的形成；本發(fā)明的抗凍肽復合組方制劑用在護膚品中，可以減少因紫外線照射皮膚而引起的紅斑及皮膚灼傷、可以預防低溫環(huán)境中暴露皮膚的凍瘡、皴裂以及紅血絲形成。文檔編號A61Q17/04GK101519439SQ200910081128公開日2009年9月2日申請日期2009年4月3日優(yōu)先權日2009年4月3日發(fā)明者候云德,唐旭東申請人:北京金迪克生物技術研究所