專利名稱：誘導(dǎo)異型交叉保護(hù)的輪狀病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明涉及來自一個輪狀病毒型的減毒輪狀病毒群在預(yù)防疾病中的用途，其中所述的疾病與來自另一個輪狀病毒型的輪狀病毒感染有關(guān)。

背景技術(shù)：
急性傳染性腹瀉是世界眾多地區(qū)中疾病及死亡的主導(dǎo)原因。在發(fā)展中國家，腹瀉性疾病的影響是嚴(yán)重的。就亞洲、非洲及拉丁美洲而言，據(jù)估計(jì)每年有30-40億個腹瀉病例并且這些病例中約五百萬至一千萬病例導(dǎo)致死亡(Walsh，J.A.等N.Engl.J.Med.，301967-974(1979))。
輪狀病毒已經(jīng)被視為嬰兒及幼童中嚴(yán)重腹瀉的最重要原因之一(Estes，M.K.Rotavirus and Their Replication in Fields Virology，第三版，F(xiàn)ields等編輯，Raven Publishers，Philadelphia，1996)。據(jù)估計(jì)輪狀病毒病每年導(dǎo)致超過一百萬人死亡。輪狀病毒誘導(dǎo)的疾病最常見地影響6-24月齡兒童，并且疾病的高峰發(fā)病率通常在溫帶氣候出現(xiàn)于較冷月份期間，而在熱帶地區(qū)終年出現(xiàn)。輪狀病毒通常經(jīng)糞口途徑從人傳播至人，潛伏期約1日-約3日。與6月齡-24月齡的感染不同，新生兒通常是無癥狀的或僅具有輕微疾病。與幼童中通常遭遇的嚴(yán)重疾病不同，大部分成年人因以前的輪狀病毒感染而受到保護(hù)，以致于大部分成人感染是溫和的或無癥狀的(Offit，P.A.等Comp.Ther.，8(8)21-26，1982)。
輪狀病毒通常呈球狀，它們的名字來源于其獨(dú)特的外層和內(nèi)層結(jié)構(gòu)或雙層衣殼結(jié)構(gòu)。通常，輪狀病毒的雙層衣殼結(jié)構(gòu)包圍含有基因組的內(nèi)部蛋白質(zhì)殼或核。輪狀病毒的基因組由編碼至少11種不同病毒蛋白質(zhì)的11節(jié)雙鏈RNA組成。這些病毒蛋白質(zhì)中命名為VP4和VP7的兩種病毒蛋白質(zhì)在雙層衣殼結(jié)構(gòu)的外部排列。輪狀病毒的內(nèi)部衣殼存在一種蛋白質(zhì)，即命名為VP6的輪狀病毒蛋白質(zhì)。這三種特定輪狀病毒蛋白質(zhì)在輪狀病毒感染后激發(fā)免疫應(yīng)答方面的相對重要性仍是不清楚的。不過，VP6蛋白質(zhì)決定組抗原及亞組抗原，而VP4蛋白質(zhì)和VP7蛋白質(zhì)是血清型(由中和測定法確定的型)特異性和基因型(通過非血清學(xué)測定法確定的型)特異性的決定因素。對G血清型和G基因型的命名是相同的。而對P血清型和P基因型指定的編號是不同的(Santos N.et HoshinoY.，2005，Reviews in Medical Virology，15，29-56)。因此，將P血清型命名為P，后面帶指定的編號，而將P基因型命名為P，后面括號內(nèi)帶指定的編號。
迄今，已經(jīng)鑒定至少14個輪狀病毒G血清型和14個輪狀病毒P血清型(Santos N.et Hoshino Y.，2005，Reviews in Medical Virology，15，29-56)。在這些血清型中，10個G(G1-6、G8-10和G12)血清型和9個P(P1、P2A、P3、P4、P5A、P7、P8、P11和P12)血清型已經(jīng)在人輪狀病毒內(nèi)得到鑒定。已經(jīng)描述23個P基因型，其中10個P基因型已經(jīng)從人中獲得(P[3]-[6]、P[8]-[11]、P[14]和P[19])。
VP7蛋白質(zhì)是作為基因組節(jié)段7、8或9的翻譯產(chǎn)物的分子量38,000的糖蛋白(當(dāng)非糖基化時分子量34,000)，這取決于病毒株。該蛋白質(zhì)刺激輪狀病毒感染后的中和抗體形成。VP4蛋白質(zhì)是大約分子量88,000的非糖基化蛋白質(zhì)，它是基因組節(jié)段4的翻譯產(chǎn)物。該蛋白質(zhì)也在輪狀病毒感染后刺激中和抗體產(chǎn)生。
由于VP4和VP7蛋白質(zhì)是中和抗體所針對的病毒蛋白質(zhì)，故據(jù)信它們是開發(fā)輪狀病毒疫苗的主要候選者，產(chǎn)生抗輪狀病毒病保護(hù)作用。
已知在兒童早期的天然輪狀病毒感染激發(fā)保護(hù)性免疫。因此迫切需要輪狀病毒減毒活疫苗。合適地，該疫苗應(yīng)當(dāng)是口服疫苗，因?yàn)檫@是輪狀病毒感染的天然途徑。
預(yù)防輪狀病毒感染的早期疫苗開發(fā)始于本病毒發(fā)現(xiàn)后的上世紀(jì)70年代。最初，來自動物和人的減毒株受到研究，但獲得含混不清的或令人失望的結(jié)果。最近的工作集中在已經(jīng)更為成功的人-動物重配體(reassortant)上。
稱作89-12的輪狀病毒毒株已經(jīng)由Ward描述；見美國專利號5,474,773和Bernstein，D.L.等，Vaccine，16(4)，381-387，1998。89-12株從1988年一位患天然輪狀病毒病的14月齡兒童中收集的糞便標(biāo)本內(nèi)分離。根據(jù)美國專利號5,474,773，隨后HRV 89-12人輪狀病毒如Ward在J.Clin.Microbiol.，19，748-753，1984內(nèi)所述通過在原代非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞中傳代2次并在MA-104細(xì)胞中傳代4次而得以適應(yīng)培養(yǎng)。該病毒隨后在MA-104細(xì)胞內(nèi)接受3次蝕斑純化(至第9代)并在這些細(xì)胞中再培養(yǎng)傳代2次。再進(jìn)行一次傳代(第12代)，用于ATCC保藏，登錄號ATCC VR 2272。保藏的毒株稱作89-12C2。
下文中將《Vaccine》中Bernstein等的1998論文稱作《Vaccine(1998)》論文。該論文描述口服施用的人輪狀病毒候選活疫苗的安全性和免疫原性。該疫苗從89-12株中得到，通過如此方式得到減毒，即于原代AGMK細(xì)胞中不進(jìn)行蝕斑純化而傳代26次并且隨后在已建立的AGMK細(xì)胞系中再傳代7次(總共33代)。
本文此后將已經(jīng)連續(xù)傳代26次的所述材料稱作P26并且將已經(jīng)連續(xù)傳代33次的材料稱作P33。一般地，將89-12通過n次傳代而衍生的輪狀病毒稱作Pn。
在后續(xù)的實(shí)施例中，P33材料在Vero細(xì)胞上進(jìn)一步傳代5次。此材料稱作P38。
在《Vaccine(1998)》論文中描述的P26及P33分離株沒有保藏于培養(yǎng)物保藏中心，也沒有對它們進(jìn)行分析而建立其遺傳表征。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中描述的P26群由變體混合物組成。這通過如下文所述的遺傳表征得到確認(rèn)(見實(shí)施例)。P26因此不是用于進(jìn)一步傳代的可靠均一性群，尤其對于生產(chǎn)批量疫苗而言是這樣。類似地，P33包含變體混合物并且對生產(chǎn)批量疫苗而言不具有可靠的均一性。
已發(fā)現(xiàn)P26材料是至少三種VP4基因變體的混合物。P33和P38類似地是兩種變體的混合物。當(dāng)評估接種了P33的嬰兒的血清中抗這些變體的中和抗體的滴度時，就中和表位而言，這些變體顯示與保藏在ATCC的89-12C2株抗原性不同。
此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)P33材料施用至嬰兒時，兩種已鑒定的變體得以復(fù)制并排出。100名接種嬰兒中，僅2名嬰兒顯示因輪狀病毒感染所致的胃腸炎病征，而20％的安慰劑組嬰兒感染。這些發(fā)現(xiàn)表明已鑒定的變體與免于輪狀病毒病相關(guān)。
WO 01/12797公開了分離輪狀病毒變體的方法和從克隆(均一)的人輪狀病毒毒株中衍生的改良輪狀病毒減毒活疫苗。還公開了減毒輪狀病毒群(分離株)，其特征在于該群包含單一變體或基本上單一變體，其中所述的突體由編碼至少一種命名為VP4和VP7的主要病毒蛋白質(zhì)的核苷酸序列定義。這種抗G9異源毒株的人輪狀病毒口服減毒疫苗的保護(hù)效力已經(jīng)在拉丁美洲嬰兒中得以報道(Perez等42nd InterscienceConference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy(ICAAC 2002)27-302002年9月27日-30日，San Diego)。WO 05/021033公開了可以使用一種輪狀病毒血清型保護(hù)免受由另一種血清型所致疾病的影響。尤其是WO 05/021033公開了G1輪狀病毒群[例如按照布達(dá)佩斯條約條款在1999年8月13日以保藏號99081301保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)，疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)機(jī)構(gòu)，應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，聯(lián)合王國，又名P43或RIX4414]預(yù)防由G1及至少一個非G1輪狀病毒血清型所致疾病的用途，其中所述的非G1輪狀病毒血清型例如是但不限于G2、G3、G4和G9輪狀病毒血清型。
WO 01/12797和WO 05/021033的完整內(nèi)容在本文中通過引用作為參考。
附圖簡述

圖1A(SEQ ID NO1)是P43(RIX4414)VP4基因的核苷酸序列，包括編碼P43的VP4蛋白質(zhì)的序列。
圖1B(SEQ ID NO2)具有從VP4基因的兩個末端起的額外核苷酸以及測序技術(shù)確定的核苷酸置換(大寫-G在位置18替代C，導(dǎo)致TCG替代TCA，然而對產(chǎn)生的編碼蛋白質(zhì)無影響)。非編碼序列以小寫顯示。圖1B顯示P43保藏物的正確序列。
圖2A(SEQ ID NO3)是P43(RIX4414)VP7基因的核苷酸序列，包括編碼P43的VP7蛋白質(zhì)的序列。
圖2B(SEQ ID NO4)具有從VP7基因的兩個末端起的額外核苷酸以及測序技術(shù)確定的核苷酸置換(大寫-A在位置58替代C，導(dǎo)致編碼亮氨酸的ATT替代編碼異亮氨酸的CTT)。非編碼序列以小寫顯示。圖2B顯示P43保藏物的正確序列。
圖3(SEQ ID NO5)是RIX4414VP4的多肽序列。
圖4(SEQ ID NO6)是RIX4414VP7的多肽序列。
圖5(SEQ ID NO7)顯示RIX4414的NSP4蛋白質(zhì)的多肽序列。
圖6(SEQ ID NO8)顯示編碼RIX4414的NSP4蛋白質(zhì)的核苷酸序列。非編碼序列以小寫顯示。
圖7(SEQ ID NO9)顯示RIX4414的VP6蛋白質(zhì)的多肽序列。
圖8(SEQ ID NO10)顯示編碼RIX4414的VP6蛋白質(zhì)的核苷酸序列。非編碼序列以小寫顯示。
發(fā)明詳述 在本發(fā)明中，我們已經(jīng)確定，減毒輪狀病毒群，例如在WO 01/12797中所表征的一個減毒輪狀病毒群，可以用作疫苗以提供抗疾病的交叉保護(hù)，其中所述疾病由與疫苗中所用的輪狀病毒的不同型(血清型和/或基因型)的輪狀病毒感染所致。VP7蛋白質(zhì)規(guī)定G型(血清型)，并且VP4蛋白質(zhì)規(guī)定病毒株的P型(血清型或基因型)。
尤其是，本發(fā)明涉及來自一個P型的減毒輪狀病毒群在預(yù)防疾病中的用途，其中所述疾病與來自不同P型的輪狀病毒感染相關(guān)，并且具體涉及來自GxPy型的減毒輪狀病毒群或減毒在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或預(yù)防疾病中的用途，其中所述疾病與由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒株引起的輪狀病毒感染相關(guān)。
免疫性可以通過針對疫苗的中和抗體應(yīng)答或通過血清輪狀病毒IgA抗體應(yīng)答如血清轉(zhuǎn)變系數(shù)(即接種后血清抗體IgA水平≥3倍增加，如Ward等，1990，J.Infect.Disease，161，440-445內(nèi)描述)加以衡量。
在本發(fā)明上下文中并且與本領(lǐng)域的常識相一致(Santos N.etHoshino Y.，2005，Reviews in Medical Virology，15，29-56)，Gx指特定的G型，即G基因型或G血清型(兩個術(shù)語是相同的)，而術(shù)語Py一般指特定的P型，或是P血清型(例如P8、P4)或是P基因型(例如P[4]、P[8])。當(dāng)指示特定的P基因型時，使用其后括號內(nèi)有指定編號的P；否則P型指血清型或基因型。
在本說明書通篇范圍內(nèi)，諸如本發(fā)明的疫苗組合物在制備用來預(yù)防輪狀病毒病的疫苗組合物中的用途，或諸如包括使用所述疫苗組合物的治療方法的用語將可互換地使用。
我們現(xiàn)在已經(jīng)確定GxP[8]輪狀病毒群[例如G1P[8]，其按照布達(dá)佩斯條約條款在1999年8月13日以保藏號99081301保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)，疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)機(jī)構(gòu)，應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，聯(lián)合王國]可以用來預(yù)防由GxP[8](例如G1P[8])和至少一種既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株引起的疾病。尤其是，我們已經(jīng)確定G1P[8]輪狀病毒群可以用來預(yù)防由一個G1P[8]基因型和至少一個非G1P[8]基因型(如G2P[4]輪狀病毒基因型)所引起的疾病。
因此，本發(fā)明涉及來自一個輪狀病毒型的減毒輪狀病毒群在預(yù)防疾病中的用途，其中所述疾病與來自另一個輪狀病毒型的輪狀病毒感染相關(guān)，其中所述的型合適地通過參考輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)(P型)的序列進(jìn)行定義。
本發(fā)明還涉及來自一個輪狀病毒株(由特定的G型和P型同時定義)的減毒輪狀病毒群在預(yù)防疾病中的用途，其中所述疾病與來自另一個輪狀病毒株的輪狀病毒感染相關(guān)，其中所述的型合適地通過同時參考輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)(P型)和VP7蛋白質(zhì)(G型)的序列進(jìn)行定義。具體地，本發(fā)明涉及來自GxPy型的輪狀病毒減毒株在制備用來誘導(dǎo)抗輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述的輪狀病毒感染由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株引起。換言之，本發(fā)明的輪狀病毒毒株可以用來預(yù)防由不同于G型和P型的另一輪狀病毒的感染所引起的疾病。
尤其是，在要求保護(hù)的本發(fā)明的所有方面中，所述的免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，合適地，輪狀病毒群包含適于提供交叉保護(hù)作用的來自ECACC保藏物99081301的VP4病毒蛋白質(zhì)和/或VP7病毒蛋白質(zhì)。
在本文件通篇范圍內(nèi)，交叉保護(hù)意指由一個輪狀病毒型所提供的針對由不同型輪狀病毒引起的感染的保護(hù)作用。交叉保護(hù)可以是同型的或異型的。同型交叉保護(hù)是由一個輪狀病毒型提供針對G型株或P型株的保護(hù)作用，例如G1P[8]株通過P[8]型給予針對非G1，P[8]株的交叉保護(hù)(例如G2P[8])。同型交叉保護(hù)的另一個實(shí)例是由G1P[8]株通過G1型提供針對G1非P[8]株(例如G1P[4])的交叉保護(hù)。異型交叉保護(hù)是由一個輪狀病毒毒株提供針對不同P型和G型輪狀病毒毒株的保護(hù)作用，例如由G1P[8]提供針對非G1非P[8]株(例如G2P[4])的保護(hù)作用(同時通過G型和P型所提供的異型保護(hù))。
合適地，減毒的輪狀病毒血清型是G1并且它能夠提供對由輪狀病毒G1血清型和非G1血清型(如選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14的血清型)所引起疾病的交叉保護(hù)。
尤其，G1減毒輪狀病毒群[例如按照布達(dá)佩斯條約條款在1999年8月13日以保藏號99081301保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)，疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)機(jī)構(gòu)，應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，聯(lián)合王國1的用途可以用來預(yù)防由輪狀病毒G1血清型和選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14中至少1個、合適至少2個、合適至少3個、合適至少4個輪狀病毒非G1血清型所引起的疾病。因此，提供了來自G1型的輪狀病毒減毒株在制備用于誘導(dǎo)抗輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途，其中所述的輪狀病毒感染由并非來自G1型的輪狀病毒毒株引起。在特定方面，所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答針對至少1個、至少2個或更多個輪狀病毒非G1血清型，一般針對選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14的任意血清型。除同型(G1)保護(hù)之外，所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答一般還針對如下非G1型即G2、G3、G4和G9中至少1個、合適地至少2個、合適地至少3個。合適地，組合物包含G1輪狀病毒株并且該組合物用來誘導(dǎo)針對G1型和G2型的免疫應(yīng)答。
合適地，輪狀病毒減毒株型是P[8]并且它能夠提供對由輪狀病毒P[8]型和由輪狀病毒非P[8]型(如選自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[6]、P[7]、P[9]、P[10]、P[11]、P[12]、P[14]及P[19]的任何型)所引起疾病的交叉保護(hù)。
尤其是，P[8]減毒輪狀病毒群，[例如按照布達(dá)佩斯條約條款在1999年8月13日以保藏號99081301保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)，疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)機(jī)構(gòu)，應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP40JG，聯(lián)合王國]的用途可以用來預(yù)防由P[8]和至少一種選自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[6]、P[7]、P[9]、P[10]、P[11]、P[12]、P[14]和P[19]的輪狀病毒非P[8]型所引起的疾病。尤其是，除針對輪狀病毒P[8]型之外，抗至少P[4]型的免疫應(yīng)答也合適地得以誘導(dǎo)。
合適地，根據(jù)本發(fā)明所用的疫苗組合物包含G1P[8]輪狀病毒株并且該組合物能夠誘導(dǎo)針對G2P[4]輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
在特定方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)抗輪狀病毒株的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含輪狀病毒GxPy型減毒株的組合物，該組合物產(chǎn)生抗既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株的免疫應(yīng)答。
尤其，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)抗輪狀病毒G1和非G1血清型的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含輪狀病毒G1血清型疫苗的組合物。合適地，非G1輪狀病毒血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。合適地，該組合物包含G1輪狀病毒毒株并且該組合物用來誘導(dǎo)抗G1型和G2型的免疫應(yīng)答。
合適地，根據(jù)本發(fā)明所用的疫苗組合物包含G1P[8]輪狀病毒株并且該組合物能夠誘導(dǎo)抗G2P[4]輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
合適地，疫苗組合物中的輪狀病毒群具有G1P1A(根據(jù)目前命名即G1P[8])株特異性。合適地，該輪狀病毒群體包含適于激發(fā)免疫應(yīng)答并且通常提供交叉保護(hù)作用的來自ECACC保藏物99081301的VP4病毒蛋白質(zhì)和/或VP7病毒蛋白質(zhì)。合適地，本發(fā)明涉及在如上所述方法或用途中的G1P[8]輪狀病毒株。通常該所用的輪狀病毒疫苗是ECACC保藏物99081301，或衍生自該保藏物。
在具體方面，與(來自安慰劑組的)未接種個體相比，該疫苗在接種個體內(nèi)誘導(dǎo)抗胃腸炎的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答或交叉保護(hù)。合適地，疫苗提供抗輪狀病毒感染癥狀如腹瀉或胃腸炎的交叉保護(hù)。例如，胃腸炎可以定義為特征如下的腹瀉，即一日內(nèi)三次或多次的水樣或比正常更松散的糞便或劇烈嘔吐，同時在受檢驗(yàn)糞便標(biāo)本中檢測到輪狀病毒。
如技術(shù)人員所了解的，疾病嚴(yán)重性和在接種的個體或接種的群體中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的接種效力可以通過幾種方法進(jìn)行評估。保護(hù)性免疫應(yīng)答意指如此免疫應(yīng)答，其引起與輪狀病毒感染有關(guān)的臨床癥狀的嚴(yán)重性減少或?qū)е聦啝畈《靖腥镜囊赘行越档汀Ｔ谖唇臃N個體或接種個體中的疾病嚴(yán)重性可以根據(jù)已公開的評分系統(tǒng)進(jìn)行分級，如20點(diǎn)Vesikari量表或此方法的略微改良形式(Ruuska T等Scand.J.Infect.Dis.1990，22，259-267)，或根據(jù)報告并分級輪狀病毒感染特異性癥狀的任何其它合適系統(tǒng)(如在Clark HF，Borian EF，Bell LM.WC3疫苗在優(yōu)勢血清型1輪狀病毒季期間抗嬰兒中輪狀病毒腹瀉的保護(hù)性作用(Protective effect of WC3 vaccine against rotavirus diarrhea in infantsduring a predominantly serotype 1 rotavirus season.)J Infect Dis.1988570-86內(nèi)報道的方法學(xué))。根據(jù)Vesikari方法，通常將嚴(yán)重RVGE定義為評分≥11。
保護(hù)可以在群體水平或組水平通過疫苗效力(VE)加以評估。疫苗效力用下式計(jì)算 VE(％)＝1-RR＝1-(ARV/ARU)，其中 RR＝相對風(fēng)險＝ARV/ARU ARU＝未接種群體中的疾病侵襲率(從安慰劑組中估計(jì))＝報告至少一次RV GE發(fā)作的受試者人數(shù)/對照組內(nèi)的受試者總?cè)藬?shù) ARV＝接種組內(nèi)的疾病侵襲率＝報告至少一次RV GE發(fā)作的受試者數(shù)/HRV疫苗組內(nèi)的受試者總?cè)藬?shù) 因此，在本發(fā)明的一個方面，提供如上詳述的方法或用途，其中包含輪狀病毒GxPy型減毒株的組合物誘導(dǎo)抗輪狀病毒誘導(dǎo)的胃腸炎、合適地抗輪狀病毒誘導(dǎo)的嚴(yán)重胃腸炎的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答和/或保護(hù)，其中所述(嚴(yán)重)胃腸炎由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株感染引起。在具體實(shí)施方案中，如根據(jù)任何合適的評分系統(tǒng)測量，所述的保護(hù)性免疫應(yīng)答能夠降低疾病的嚴(yán)重性或消除輪狀病毒誘導(dǎo)的疾病。
在又一個實(shí)施方案中，提供本發(fā)明組合物的方法或用途，旨在降低疾病(例如胃腸炎)的嚴(yán)重性或消除輪狀病毒誘導(dǎo)的疾病，所述的疾病嚴(yán)重性或疾病根據(jù)如上所述任何合適的評分系統(tǒng)進(jìn)行記錄。
在具體實(shí)施方案中，所述的組合物在接種個體群中具有多達(dá)60％抗腹瀉保護(hù)作用、合適地多達(dá)81％抗腹瀉保護(hù)作用，其中所述的腹瀉由與組合物中存在的減毒輪狀病毒型不同的輪狀病毒型感染引起。在另一個具體實(shí)施方案中，所述組合物在接種個體群中具有的至少40％抗腹瀉保護(hù)作用、合適地至少45％抗腹瀉保護(hù)作用、合適地至少50％抗腹瀉保護(hù)作用、合適地至少60％抗腹瀉保護(hù)作用，其中所述的腹瀉由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株感染引起。在具體方面，所述組合物具有40％-80％的抗腹瀉保護(hù)作用、合適地50％-70％的抗腹瀉保護(hù)作用，其中所述的腹瀉由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株感染引起。在具體方面，所述組合物包含G1P[8]輪狀病毒株，其提供對由G2P[4]型輪狀病毒株感染所致的胃腸炎的如前所述水平的保護(hù)作用。
合適地，在接種個體的群體中實(shí)現(xiàn)的抗腹瀉和/或胃腸炎和/或嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)率是10-90％、合適地20-80％、合適地40％-80％、合適地45％-75％保護(hù)作用，其中所述的接種個體由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株感染。通常，抗嚴(yán)重胃腸炎保護(hù)的水平是至少40％，合適地至少50％。
在具體的方面，所述的組合物包含G1P[8]輪狀病毒毒株，其中如根據(jù)Vesikari量表所測量，所述毒株在接種個體群內(nèi)具有針對由輪狀病毒G2P[4]血清型感染引起的嚴(yán)重胃腸炎的40％-80％保護(hù)，合適地45％-75％保護(hù)。
合適地，疫苗用于2劑量或3劑量方案中。
用來產(chǎn)生交叉保護(hù)的輪狀病毒疫苗具有如下合適的特征。
在一個方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒具有包含如此核苷酸序列的VP4基因，其中所述的核苷酸序列包含如下堿基的至少一種距離起始密碼子在位置788的腺嘌呤堿基(A)、在位置802的腺嘌呤堿基(A)以及在位置501的胸腺嘧啶堿基(T)。
在又一個方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒具有包含如此核苷酸序列的VP7基因，其中所述的核苷酸序列包含如下堿基的至少一種從起始密碼子起位置605的胸腺嘧啶(T)、位置897的腺嘌呤(A)或位置897的鳥嘌呤(G)。合適地在位置897存在腺嘌呤(A)。
在具體的方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒在VP4基因序列內(nèi)的從起始密碼子起在位置788和802具有腺嘌呤(A)和在位置501具有胸腺嘧啶(T)。
在另一具體方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒在VP7基因序列內(nèi)的從起始密碼子起在位置605具有的胸腺嘧啶(T)和在位置897具有的腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)。最合適地在VP7序列內(nèi)在位置897存在腺嘌呤(A)。
在特別合適的方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒在VP4基因序列內(nèi)的從起始密碼子起在位置788和802具有腺嘌呤(A)和在位置具有5的胸腺嘧啶(T)，并且在VP7序列內(nèi)的從起始密碼子起在位置605具有胸腺嘧啶(T)和在位置897具有腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)，合適地在VP7序列內(nèi)在位置897存在腺嘌呤(A)。
在另一個方面，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒包含編碼VP4蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該核苷酸序列是如1A圖(SEQ IDNO1)或圖1B(SEQ ID NO2)內(nèi)所示那樣，和/或包含編碼VP7蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列是如2A(SEQ ID NO3)或圖2B(SEQ ID NO4)圖內(nèi)所示那樣。在備選實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中的輪狀病毒包含如圖3(SEQ ID NO5)所述的VP4蛋白質(zhì)和/或如圖4(SEQ ID NO6)所述的VP7蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的所述輪狀病毒群體還包含如圖5(SEQ ID NO7)內(nèi)所述的或由如圖6(SEQ ID NO8)內(nèi)所述的核苷酸序列編碼的NSP4蛋白質(zhì)，和/或還包含如圖7(SEQ ID NO9)內(nèi)所述的或由如圖8(SEQ ID NO10)內(nèi)所述的核苷酸序列編碼的VP6蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中使用的合適輪狀病毒群可以通過如此方法得到，該方法包括 在合適的細(xì)胞類型上傳代輪狀病毒制備物； 任選使用如下兩者之一的步驟選擇均一培養(yǎng)物 a)有限稀釋；或 b)單個蝕斑分離；并且 通過對VP4基因序列和/或VP7基因序列的適宜區(qū)域進(jìn)行序列測定而檢驗(yàn)是否存在基本上單一的變體。
合適地，輪狀病毒群衍生自如上所述的P43(RIX4414)、P33或P26株。
序列測定可以通過定量或半定量雜交技術(shù)如窄縫印跡雜交或蝕斑雜交合適地得以實(shí)施。
產(chǎn)生自本發(fā)明方法的克隆病毒群可以通過在合適細(xì)胞系上的進(jìn)一步傳代得到擴(kuò)增。
用于在以上方法中傳代輪狀病毒群的合適細(xì)胞類型包括可以是建立的細(xì)胞系或原代AGMK細(xì)胞的非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞。合適的AGMK細(xì)胞系包括例如Vero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCCCL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)和CV-1(ATCC CCL-70)。MA-104(獼猴(rhesus monkey))和MRC-5(人-ATCC CCL-171)細(xì)胞系也是合適的。Vero細(xì)胞特別適于擴(kuò)增目的。在Vero細(xì)胞上的傳代產(chǎn)生高的病毒產(chǎn)量。
用于檢驗(yàn)本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒群內(nèi)是否存在單一變體的技術(shù)和用于確定這種單一變體的性質(zhì)的技術(shù)涉及本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測序或雜交方法并且在下文得到描述。
在具體的方面，本發(fā)明方法使用適宜的輪狀病毒，尤其具有89-12株特征或其傳代衍生物的特征的輪狀病毒加以實(shí)施。
特別合適的單一變體群是P43，其中P43從P33(分離的人輪狀病毒在適宜的細(xì)胞類型上培養(yǎng)傳代P33次)中通過連續(xù)終點(diǎn)稀釋克隆步驟，隨后通過將克隆性材料在Vero細(xì)胞上傳代擴(kuò)增而得到。
P43群按照布達(dá)佩斯條約條款在1999年8月13日以保藏號99081301保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)，疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)機(jī)構(gòu)，應(yīng)用微生物學(xué)與研究中心，PortonDown，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，聯(lián)合王國，并在WO 01/12797內(nèi)得到公開。
雖然這種所述的公眾可獲得性是得到人輪狀病毒P43最簡單的方法，然而相似的和在功能上基本相同的輪狀病毒可以在閱讀本發(fā)明教授內(nèi)容下，通過這些方法或其它方法而得到。此類在功能上基本相同的輪狀病毒被認(rèn)為在生物學(xué)上是與本發(fā)明的人輪狀病毒P43等同的并且因此屬于本發(fā)明的一般范圍。因此應(yīng)理解，本發(fā)明包含具有如本文中所述的P43變體的特征的輪狀病毒群。
應(yīng)理解的是，本發(fā)明包含通過如此方式從保藏的P43 ECACC99081301衍生的材料，其中所述方法例如是進(jìn)一步處理P43 ECACC99081301，如通過使用活病毒進(jìn)一步傳代、克隆或其它方法使P43ECACC 99081301增殖，或是以任何方式修飾P43，包括通過遺傳工程技術(shù)或重配技術(shù)。此類步驟和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
由本發(fā)明包含的從保藏的P43中衍生的材料包括蛋白質(zhì)和遺傳材料。特別有意義的是包含P43的至少一種抗原或至少一個節(jié)段的重配輪狀病毒，例如包含輪狀病毒毒力株的重配體，其中在輪狀病毒毒力株中的11個基因組節(jié)段之一或其部分已經(jīng)由P43的基因組節(jié)段或部分替換。具體而言，在其中編碼NSP4的節(jié)段或部分節(jié)段是P43的節(jié)段或部分節(jié)段的輪狀病毒重配體具備有用的特性。重配輪狀病毒和用于制備它們的技術(shù)是眾所周知的(Foster，R.H.和Wagstaff，A.J.綜述，四價輪狀病毒疫苗(Tetravalent Rotavirus Vaccine，a review).ADIS drug evaluation，BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。
特別有意義的材料是P43的子代和P43的免疫活性衍生物。免疫活性衍生物意指從P43病毒、尤其該病毒的抗原中得到或用它們得到的材料，其中所述材料能夠在注射至宿主動物中時激發(fā)對輪狀病毒有反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
在使輪狀病毒適應(yīng)適宜細(xì)胞系(例如Vero細(xì)胞)中，可能必需處理病毒以便除去任何潛在污染物，如可能存在并且還會造成污染的任何外來因子。在醚敏感的外來病毒的例子中，這可以如下文所述通過醚處理完成。本發(fā)明還涉及將這種醚處理作為任選步驟包括進(jìn)得到減毒活輪狀病毒或用這種減毒活輪狀病毒所配制的疫苗的整體方法中。
本發(fā)明的交叉保護(hù)性輪狀病毒毒株可以與其它輪狀病毒株組合，以提供抗輪狀病毒感染或疾病的額外保護(hù)或交叉保護(hù)。
本發(fā)明還提供與合適佐劑或藥物載體混合的輪狀病毒減毒活疫苗，其能夠提供如本文以上所定義的交叉保護(hù)。
在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的輪狀病毒疫苗是含有單一輪狀病毒株如G1P[8]株的單價輪狀病毒疫苗。
本發(fā)明尤其有利于提供活輪狀病毒活疫苗，其中該減毒輪狀病毒是人輪狀病毒并且不引起腸套疊。
適合于與本發(fā)明的輪狀病毒減毒株一起使用的藥物載體包括本領(lǐng)域已知的如適于口服施用，尤其適用于嬰兒的那些藥物載體。此類載體包括并且不限于糖類、多元醇、氨基酸、氫氧化鋁、氫氧化鎂、羥基磷灰石、滑石、氧化鈦、氧化鐵、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、植物蛋白胨、蒼耳烷、caraghenane、阿拉伯樹膠、β-環(huán)糊精。
本發(fā)明還提供用于制備輪狀病毒疫苗的工藝，例如通過在合適穩(wěn)定劑存在下凍干病毒或?qū)⒈景l(fā)明的病毒與合適的佐劑或藥物載體混合。
可以有利地將本發(fā)明的病毒在基于脂質(zhì)的載體如病毒質(zhì)體或脂質(zhì)體、在水包油乳劑中配制或與載體粒子配制。備選地或額外地，可以在制劑內(nèi)包括免疫促進(jìn)劑(如本領(lǐng)域已知用于口服疫苗的那些免疫促進(jìn)劑)。此類免疫促進(jìn)劑包括細(xì)菌毒素，尤其處于全毒素(完整分子)形式或僅B鏈(CTB)形式的霍亂毒素(CT)和大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。比天然LT更不可能轉(zhuǎn)變成其活性形式的突變LT(mLT)在WO96/06627\WO 93/13202和US 5,182,109中有描述。
可以有利地包括進(jìn)的其它免疫促進(jìn)劑是皂苷衍生物如QS21和單磷酰脂A，尤其3-脫氧-O-乙酰化單磷酰脂A(3D-MPL)。作為口服佐劑的純化皂苷描述于WO 98/56415。皂苷和單磷酰脂A可以分別或組合地使用(例如WO 94/00153)并且可以在佐劑系統(tǒng)中與其它藥劑配制在一起。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的眾所周知的佐劑，其制造描述于GB 2122204。
對用于口服免疫的載體和佐劑的一般討論可以在Powell和Newman編輯的Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，PlenumPress，New York，1995中找到。
本發(fā)明還提供用于通過向有需要的受試者施用有效量的本發(fā)明疫苗組合物而接種人受試者尤其是嬰兒的方法。合適地，減毒活疫苗通過口服施用。
在具體的方面，將本發(fā)明的輪狀病毒減毒株與抗酸劑配制以便使胃中的酸對疫苗的失活最小化。合適的抗酸劑成分包括無機(jī)抗酸劑，例如氫氧化鋁Al(OH)3和氫氧化鎂Mg(OH)2。適合用于本發(fā)明中的可商業(yè)獲得的抗酸劑包括含有氫氧化鋁和氫氧化鎂的Mylanta(商標(biāo))。這些抗酸劑不溶于水，以混懸劑液形式給予。
氫氧化鋁是本發(fā)明疫苗組合物中特別適合的成分，因?yàn)樗粌H可以提供抗酸劑作用，還可以提供佐劑作用。
還適于作為本發(fā)明疫苗中抗酸劑使用的是有機(jī)抗酸劑如有機(jī)酸羧酸鹽。在本發(fā)明疫苗組合物中的合適抗酸劑含有有機(jī)酸羧酸鹽，具體是檸檬酸鹽，如檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
可以在本發(fā)明的疫苗組合物中使用的特別合適的抗酸劑是不溶性無機(jī)鹽即碳酸鈣(CaCO3)。碳酸鈣也與輪狀病毒結(jié)合并且輪狀病毒活性在與碳酸鈣結(jié)合期間得以維持。
為預(yù)防在填充步驟期間碳酸鈣的沉降，增稠劑合適地存在于制劑內(nèi)。
可以使用的可能增稠劑包括假塑性賦形劑。假塑性溶液溶液倍定義為與其攪拌下的黏度相比，在靜置時具有更高黏度的溶液。此類型的賦形劑是天然聚合物，如阿拉伯樹膠、黃蓍樹膠、瓊脂、藻酸鹽、果膠或半合成性聚合物例如羧甲基纖維素(Tyloses

)、甲基纖維素(Methocels

Viscotrans

Tylose

和

)、羥丙基纖維素

和羥丙基甲基纖維素(Methocels

和

Viscontrans

)。通常，將這些假塑性賦形劑與觸變劑一起使用?？梢允褂玫膫溥x增稠劑是具有低流動能力的假塑性賦形劑。這些聚合物在足夠高的濃度時產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性流體排列(structural fluid arrangement)，形成在靜置時具有低流動能力的高黏度溶液。需要向該系統(tǒng)給予一定量的能量以允許流動和傳輸(transfer)。需要外來能量(攪拌)臨時破壞結(jié)構(gòu)性流體排列以便得到流體溶液。
此類聚合物的實(shí)例是

和蒼耳烷樹膠。
觸變賦形劑在靜置時變成凝膠結(jié)構(gòu)，而在攪拌下則形成流體溶液。
觸變賦形劑的實(shí)例是

(鎂鋁硅酸鹽)和Avicel

(約89％微晶纖維素和11％羧甲基纖維素鈉)。
本發(fā)明的疫苗組合物合適地包含選自蒼耳烷樹膠或淀粉的增稠劑。
因此，本發(fā)明的疫苗組合物通常用碳酸鈣和蒼耳烷樹膠的組合加以配制。
在本發(fā)明中使用的組合物的其它成分合適地包括糖例如蔗糖和/或乳糖。
本發(fā)明的疫苗組合物可以含有額外成分，包括例如增香劑(尤其對于口服疫苗)和抑菌劑。
預(yù)期本發(fā)明疫苗組合物有不同表現(xiàn)形式。
在一個合適的實(shí)施方案中，疫苗作為液體制劑施用。合適地，該液體制劑在施用前從至少下列兩種成分中得到重構(gòu) i)病毒成分 ii)液體成分 在這個實(shí)施方案中，病毒成分和液體成分通常存在于分開的容器內(nèi)，其中所述分開的容器可以便利地是單一器皿中分開的區(qū)室，或在分開的器皿內(nèi)存在，其中所述分開的器皿可以按照如此方式連接以至最終的疫苗組合物不接觸空氣即得以重構(gòu)。
在重構(gòu)之前，病毒可以為干燥形式或液體形式。合適地，病毒成分被凍干。凍干的病毒比水溶液中的病毒更穩(wěn)定。凍干的病毒可以使用液體抗酸劑組合物合適地加以重構(gòu)以產(chǎn)生液體疫苗制劑。備選地，凍干的病毒可以用水或水溶液進(jìn)行重構(gòu)，這種情況下凍干的病毒組合物合適地含有抗酸劑成分。
合適地，疫苗制劑包含在一個區(qū)室或器皿中與碳酸鈣和蒼耳烷樹膠配制的病毒成分并且該疫苗制劑以存在于第二區(qū)室或器皿中的水或水溶液進(jìn)行重構(gòu)。
在另一個實(shí)施方案中，疫苗組合物是固體制劑，合適地是適用于放置在嘴中時立即溶解的凍干塊狀物。凍干制劑可以便利地以藥用水泡眼包裝中的片劑形式提供。
在另一個方面，本發(fā)明提供處于用于口服施用的速溶片劑形式的輪狀病毒疫苗。
在另一個方面，本發(fā)明提供包含活的減毒輪狀病毒株、尤其是活的減毒人輪狀病毒株的組合物，其中所述的組合物是能夠放置在嘴中時立即溶解的凍干固體。
合適地，本發(fā)明的速溶片劑足夠迅速地在受試者嘴中溶解以防止吞咽未溶解的片劑。這種方法尤其對兒科用輪狀病毒疫苗是有利的。
合適地，病毒是與無機(jī)抗酸劑如碳酸鈣和增稠劑如蒼耳烷樹膠配制的活的減毒人輪狀病毒。
本發(fā)明又一個方面是提供這樣的凍干制劑，其中病毒成分是與碳酸鈣和蒼耳烷樹膠配制的任何輪狀病毒株。
本發(fā)明的疫苗可以使用合適量的活病毒通過已知技術(shù)配制并施用，以提供抗輪狀病毒感染的有效保護(hù)，而沒有一般疫苗中明顯有害的副作用?；畈《镜暮线m量通常是每劑量104-107個病灶形成單位(focus formingunits，ffu)。疫苗的一般劑量可以包含每劑量105-106個ffu并且可在一段時間范圍內(nèi)給予數(shù)個劑量，例如間隔兩個月給予兩個劑量。然而，可以通過給予超過2個劑量，例如3個劑量或4個劑量方案而得到益處，尤其在發(fā)展中國家。給予劑量之間的間隔期可以是多于或少于兩個月。用于單個劑量方案或用于多個劑量方案的最佳活病毒量以及用于給予劑量的最佳時間可以通過包括觀察受試者中的抗體滴度及其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究予以確定。
本發(fā)明疫苗也可以包含用于抗其它疾病的其它合適的活病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒。備選地，口服施用的其它合適活病毒疫苗可以分開給藥，但與本發(fā)明輪狀病毒疫苗組合物同時。
測試來自4-6月齡嬰兒(經(jīng)如《Vaccine(1998)》論文內(nèi)所述P33材料接種)的血清對P33、P38、P43和89-12C2的中和作用。
全部檢驗(yàn)的血清的中和滴度范圍對于P33、P38和P43而言是相似的。統(tǒng)計(jì)分析在針對全部3種病毒的整體中和滴度上未顯示顯著差異。這表明P33、P38和P43的構(gòu)象中和表位及非構(gòu)象中和表位同等充分地由被P33接種的嬰兒的抗P33血清識別。該觀察間接地表明在這種體外分析法中揭示的中和表位在P33、P38和P43之間沒有變化。
然而，P89-12C2的中和滴度范圍明顯不同于P33、P38和P43。該項(xiàng)觀察表明P33、P38和P43的構(gòu)象中和表位和非構(gòu)象中和表位沒有同等充分地由被P33接種的嬰兒的抗P33血清識別。該項(xiàng)觀察間接地表明在這種體外分析法內(nèi)揭示的中和表位在89-12C2與P33、P38及P43之間有變化。
本發(fā)明特別合適的實(shí)施方案包括 1.來自P型的輪狀病毒減毒株在制備用于誘導(dǎo)抗輪狀病毒的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途，其中所述的輪狀病毒為與所述疫苗組合物內(nèi)的輪狀病毒不同的P型。
2.來自P[8]型的輪狀病毒減毒株在制備用于誘導(dǎo)抗非P[8]輪狀病毒的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途。
3.來自G1P[8]型的輪狀病毒減毒株在制備用于誘導(dǎo)抗非G1P[8]輪狀病毒的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的用途。
4.根據(jù)1-3項(xiàng)的用途，其中抗G1P[8]型引起的病毒感染的免疫應(yīng)答還被誘導(dǎo)。
5.根據(jù)1-4項(xiàng)的用途，其中針對兩個或多個輪狀病毒血清型的免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)，這些血清型通過參考G型或P型加以定義。
6.根據(jù)1-5項(xiàng)的用途，其中疫苗株的血清型是G1血清型并且非G1血清型選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14。
7.根據(jù)6項(xiàng)的用途，其中同時針對G1型和G2型的免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)。
8.根據(jù)1-5任意項(xiàng)的用途，其中疫苗株的型是P[8]型并且非P[8]型選自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[6]、P[7]、P[9]和P[11]型。
9.根據(jù)8項(xiàng)的用途，其中同時針對P[8]型和P[4]型的免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)。
10.根據(jù)1-9任意項(xiàng)的用途，其中組合物包含具有如此VP4基因的輪狀病毒，該VP4基因在核苷酸序列內(nèi)包含如下堿基的至少一種從起始密碼子起在位置788的腺嘌呤堿基(A)、在位置802的腺嘌呤堿基(A)和在位置501的胸腺嘧啶堿基(T)。
11.根據(jù)10項(xiàng)的用途，其中VP4基因包含如此核苷酸序列，該核苷酸序列包含從起始密碼子起在位置788和802的腺嘌呤堿基(A)以及在位置501的胸腺嘧啶堿基(T)。
12.根據(jù)11項(xiàng)的用途，其中組合物包含具有如此VP7基因的輪狀病毒，該VP7基因在核苷酸序列內(nèi)包含如下堿基的至少一種從起始密碼子起在位置605的胸腺嘧啶(T)、在位置897的腺嘌呤(A)和在位置897的鳥嘌呤(G)。
13.根據(jù)12項(xiàng)的用途，其中VP7基因包含如此核苷酸序列，該核苷酸序列包含從起始密碼子起在位置605的胸腺嘧啶(T)和在位置897的腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。
14.根據(jù)1-13任意項(xiàng)的用途，其中組合物包含具有如此VP4基因的輪狀病毒，該VP4基因在核苷酸序列內(nèi)包含從起始密碼子起在位置788和802的腺嘌呤(A)和在位置501的胸腺嘧啶(T)；和其中VP7基因在核苷酸序列內(nèi)包含從起始密碼子起在位置605的胸腺嘧啶(T)和在位置897的腺嘌呤(A)。
15.根據(jù)1-14任意項(xiàng)的用途，其中組合物能夠減弱或預(yù)防胃腸炎和/或腹瀉，其中所述的胃腸炎和/或腹瀉由不同型的輪狀病毒的感染引起，其中所述不同型的輪狀病毒通過參考存在于組合物內(nèi)的G型和/或P型減毒輪狀病毒加以定義。
16.根據(jù)15項(xiàng)的用途，其中組合物在接種個體的群體內(nèi)具有抗嚴(yán)重胃腸炎的至少40％保護(hù)，其中所述的嚴(yán)重胃腸炎由通過參考G型和/或P型而得到定義的至少2株輪狀病毒的感染引起，這些型與存在于組合物中的減毒輪狀病毒的G1P[8]型不同。
17.根據(jù)16項(xiàng)的用途，其中嚴(yán)重胃腸炎由至少3個、至少4個非G1血清型的輪狀病毒的感染引起。
18.根據(jù)17項(xiàng)的用途，其中非G1血清型是任意的G2、G3、G4和G9血清型。
19.根據(jù)18項(xiàng)的用途，其中嚴(yán)重胃腸炎由至少2個非P[8]型的輪狀病毒感染引起。
20.根據(jù)9項(xiàng)的用途，其中嚴(yán)重胃腸炎由P[4]型輪狀病毒感染引起。
21.根據(jù)1-20任意項(xiàng)的用途，其中輪狀病毒毒株是ECACC保藏物99081301，或是從ECACC保藏物99081301可得到的或可從其中衍生的。
23.根據(jù)1-20任意項(xiàng)的用途，其中疫苗用于2劑量方案內(nèi)。
在另一個方面，本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)針對來自輪狀病毒株的輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含來自不同株的輪狀病毒減毒疫苗的組合物。具體地，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)針對來自一個P型的輪狀病毒的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)方法和/或用于預(yù)防與來自一個P型的輪狀病毒感染有關(guān)的疾病的方法，該方法包括向有需要的患者施用來自不同P型的減毒輪狀病毒群。
在本發(fā)明的具體方面，提供誘導(dǎo)針對輪狀病毒P[8]型及選自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[6]、P[7]、P[9]、P[11]、P[12]、P[14]和P[19]型中的至少一種非-P[8]型、合適地針對P[4]輪狀病毒型的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含輪狀病毒P[8]型疫苗的組合物。
在本發(fā)明地另一個方面，提供i)分離的具有如圖5(SEQ ID NO7)內(nèi)所述的蛋白質(zhì)序列的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)4(NSP4)或其免疫原性片段；ii)分離的多核苷酸序列，其包含編碼所述NSP4多肽或其免疫原性片段的核酸序列；iii)分離的多核苷酸序列，其包含如圖6(SEQ ID NO8)內(nèi)所述的核酸序列。
在本發(fā)明的又一個方面，提供i)分離的具有如圖7(SEQ ID NO9)內(nèi)所述的蛋白質(zhì)序列的輪狀病毒蛋白質(zhì)6(VP6)或其免疫原性片段；ii)分離的多核苷酸序列，其包含編碼所述VP6多肽或其免疫原性片段的核酸序列；iii)分離的多核苷酸序列，其包含如圖8(SEQ ID NO10)內(nèi)所述的核酸序列。
免疫原性片段可以在本發(fā)明的上下文中定義為當(dāng)以有效劑量(單獨(dú)地或作為與載體連接的半抗原)施用時激發(fā)抗輪狀病毒感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的片段。
如下非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1證實(shí)第26代(P26)的89-12株是變體混合物 對來自不同傳代批號的VP4基因和VP7基因的測序 對來自P26代(原代AGMK細(xì)胞)、P33代(已建立的(相對于原代)AGMK細(xì)胞系)、P41代和P43代的VP4基因和VP7基因進(jìn)行測序?？俁NA提取物在單管/單步驟內(nèi)通過PCR得以逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。
引物Rota5bis和Rota29bis擴(kuò)增完整的VP4基因，引物Rota1和Rota2bis擴(kuò)增完整的VP7基因。PCR材料已經(jīng)使用不同引物進(jìn)行測序(見表1)。
P26代序列與P33代序列在VP4內(nèi)有3個堿基不同(在從起始密碼子起的位置501、788和802bp)并且在VP7內(nèi)有3個堿基不同(從起始密碼子起的位置108、605和897bp)。
VP4和VP7的P26代序列掃描圖顯示了在突變位置存在作為背景的P33代序列。因此，可以見到P26代是至少2種變體的混合物。
P33代序列掃描圖似乎在VP4內(nèi)是均一的并且對于VP7是異質(zhì)的(見表2)。
P38代(衍生自P33代)在Vero細(xì)胞上傳代5次，并顯示如P33代(AGMK細(xì)胞系)那樣相同的VP4序列和VP7序列組。因此在P33和P38群之間不存在重大變化。
表1用于RT-PCR和測序的寡核苷酸

表2雜交中所用的寡核苷酸 表2內(nèi)以大寫顯示的堿基是VP4和VP7中的具體序列變異的位置。
表3VP4基因和VP7基因的序列變異 表3.1
注意在來自發(fā)展至生產(chǎn)批水平的3個克隆的第二克隆中，VP7 897bp位置的核苷酸是G，而不是如所選擇的P43克隆中的A。這導(dǎo)致甲硫氨酸替換氨基酸序列中的異亮氨酸。如此變體被排泄到已經(jīng)用P33材料接種的嬰兒的糞便中，其中所述變體與所選的P43克隆及其中在VP7內(nèi)從起始密碼子起在897bp上存在G的克隆相對應(yīng)。
在表3.1中，其中在特定位置中存在兩個備選堿基的情況下，兩個堿基中的頭一個堿基代表出現(xiàn)于大部分群體中的堿基，而第二個堿基是出現(xiàn)于小部分群體內(nèi)的堿基。主要變異群體和次要變異群體由測序中信號的強(qiáng)度進(jìn)行判斷。
表3.2
表3.2顯示變體間因核苷酸差異所致的氨基酸改變。
表4
窄縫印跡雜交 AGMK細(xì)胞上在P26-P33代間的群體中的變化進(jìn)一步通過窄縫印跡雜交予以證實(shí)。由RT/PCR產(chǎn)生的VP4基因片段和VP7基因片段與對每種變體(見表3.1和3.2)特異的寡核苷酸探針雜交。不同于與Rota16、Rota35及Rota36雜交而不與Rota15雜交的P26，P33材料的VP4 PCR片段在位置788和802僅與Rota16雜交而不與Rota15或Rota35或Rota36雜交。這些結(jié)果確立P26內(nèi)存在至少3種變體(見表4)。
對于P33材料的VP7 PCR片段，位置897與Rota41和Rota42雜交。這些結(jié)果確立P33內(nèi)存在至少2種變體。
實(shí)施例2對P43克隆的分離和表征 為分離作為均一病毒群的P33成分，在Vero細(xì)胞上開展P33/AGMK的3倍終點(diǎn)稀釋并且使用得到的病毒來感染Vero細(xì)胞。
如常規(guī)所做那樣，使用兩個標(biāo)準(zhǔn)選擇陽性孔由孔內(nèi)檢測到的最大數(shù)目的灶斑所展示的生長以及平板上分離最好的陽性孔。在96孔微量滴定板中3倍終點(diǎn)稀釋傳代后，10個陽性孔成功地在Vero細(xì)胞上得以擴(kuò)增并就其產(chǎn)量進(jìn)行評估。
基于產(chǎn)量，將3個克隆發(fā)展至生產(chǎn)批(production lot)的傳代水平。顯示多克隆抗體在這3個克隆間及在所述克隆與P33之間的免疫識別是相似的。克隆的均一性通過窄縫印跡雜交法評估。單個克隆的最終選擇基于產(chǎn)量及序列。
所選的克隆通過在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代得到擴(kuò)增以產(chǎn)生主種子、工作種子和最終的生產(chǎn)批。
所選的克隆在不同傳代水平上通過對VP4及VP7測序(身份)及通過對PCR所擴(kuò)增材料中VP4和VP7的特異性窄縫印跡雜交進(jìn)行遺傳表征。P43材料中VP4基因和VP7基因的序列分別在圖1和圖2中給出并且與P41相同。
所選克隆的均一性通過使用寡核苷酸探針的選擇性雜交予以評估，其中所述的寡核苷酸探針區(qū)分在P26/原代AGMK測序期間所鑒定的每種變體(見表4)的VP4區(qū)和/或VP7區(qū)中的核苷酸變化。
VP4片段與Rota16雜交并且不與Rota15、Rota35或Rota36雜交。VP7片段與Rota41雜交并且不與Rota42雜交。
這些結(jié)果證實(shí)P43是均一群體。
實(shí)施例3除去潛在的外來病毒 向(AGMK生長的)P33內(nèi)添加醚至終濃度20％，持續(xù)1小時。隨后使醚隨吹入的N2排出，持續(xù)35分鐘。未觀察到對P33種子滴度的影響。
實(shí)施例4減毒活疫苗的配制 如上所述的生產(chǎn)批通過下列方法得到配制以便通過下列方法向嬰兒口服施用。
1.凍干的病毒 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備病毒藥劑。將冷凍的純化的病毒原液融化并用適宜的培養(yǎng)基組合物稀釋(在本例中是Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基)直至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，在本例中是106.2ffu/ml。稀釋的病毒隨后進(jìn)一步用凍干穩(wěn)定劑(蔗糖4％、右旋糖酐8％、山梨醇6％、氨基酸4％)稀釋直至目的病毒滴度，在本例中是105.6ffu/劑。將穩(wěn)定化的病毒組合物的0.5ml等分試樣無菌轉(zhuǎn)移至3ml小瓶。每只小瓶隨后用橡皮塞部分密封，樣品隨后在真空下冷凍干燥，隨后將小瓶完全密封并將鋁帽在小瓶周圍翻卷到位以使橡皮塞就位。
對使用而言，病毒用如下之一的抗酸重構(gòu)劑加以重構(gòu) (a)檸檬酸鹽重構(gòu)劑 檸檬酸鈉溶解于水中、進(jìn)行過濾除菌并以1.5ml的量(每1.5ml劑量544mg檸檬酸三鈉·2H2O的濃度)無菌轉(zhuǎn)移至重構(gòu)容器內(nèi)。重構(gòu)容器可以例如是3ml小瓶或4ml小瓶或2ml注射器或用于口服施用的軟塑料可擠壓膠囊。作為維持無菌成分處于無菌條件下的替代，終末容器可以經(jīng)高壓滅菌。
(b)Al(OH)3重構(gòu)劑 無菌氫氧化鋁混懸液(Mylanta-商標(biāo))在無菌水中進(jìn)行無菌稀釋，以2ml的量無菌轉(zhuǎn)移至重構(gòu)劑容器(例如2ml注射器，或軟塑料可擠壓膠囊)，其中所述的每個量含有48mgAl(OH)3。作為無菌條件下使用無菌成分的替代，對氫氧化鋁混懸液(優(yōu)選地在稀釋的階段下)進(jìn)行γ輻射。
包含標(biāo)準(zhǔn)組分以防止該混懸液沉淀。此類標(biāo)準(zhǔn)組分包括例如硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素和硅氧烷聚合物。也可以包括抑菌劑例如羥苯丁酯、羥苯丙酯或其它用于食品中的標(biāo)準(zhǔn)抑菌劑以及增香劑。
2.液體制劑中的含Al(OH)3的凍干病毒 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來來制備病毒藥劑。將冷凍的純化的病毒原液融化并用適宜的培養(yǎng)基組合物稀釋(在本例中是Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基)直至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，在本例中是106.2ffu/ml。添加氫氧化鋁混懸液達(dá)到終末量48mg/劑并且病毒組合物用凍干穩(wěn)定劑(可以為蔗糖、右旋糖酐、或氨基酸4％，或明膠，或植物蛋白胨，或蒼耳烷)稀釋直至目的病毒滴度，在本例中是105.6ffu/劑。將穩(wěn)定化的病毒組合物的0.5ml等分試樣無菌轉(zhuǎn)移至3ml小瓶。隨后如第1部分中所述對小瓶凍干和密封。
3.用于水泡眼包裝的含Al(OH)3的凍干病毒 使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備病毒藥劑。將冷凍的純化的病毒原液融化并用適宜的培養(yǎng)基組合物稀釋(在本例中是Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基)直至所需的標(biāo)準(zhǔn)病毒濃度，在本例中是106.2ffu/ml。添加氫氧化鋁混懸液以達(dá)到終末量48mg/劑并且病毒組合物用可以是蔗糖、右旋糖酐或氨基酸4％，或明膠，或植物蛋白胨，或蒼耳烷的凍干穩(wěn)定劑稀釋直至目的病毒滴度105.6個ffu/劑。采用無菌灌裝操作將0.5ml劑量或優(yōu)選更少劑量轉(zhuǎn)移至水泡眼腔體內(nèi)。凍干該組合物，并且通過熱封法密封水泡眼腔體。
任選地包含標(biāo)準(zhǔn)組分以防止該混懸液沉淀。此類標(biāo)準(zhǔn)組分包括例如硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素，和硅氧烷聚合物。也可以包括增香劑。
實(shí)施例5對多種制劑進(jìn)行輪狀病毒的病毒滴定 5.1基于乳糖及基于蔗糖的制劑間的比較 表5 P43輪狀病毒與蔗糖及與乳糖如上表所示加以配制。
凍干前的病毒滴定是在完成配制的液體(含有蔗糖、右旋糖酐、山梨醇和氨基酸)中并且沒有凍干步驟時的病毒滴度。
優(yōu)良結(jié)果是如此結(jié)果，其中在凍干步驟上實(shí)現(xiàn)＜0.5個對數(shù)下降及在1周于37℃(加速的穩(wěn)定性檢驗(yàn))期間實(shí)現(xiàn)＜0.5個對數(shù)下降。
病毒滴定的精確性是+或-0.2對數(shù)。
該結(jié)果顯示蔗糖可以用于替換乳糖。
5.2精氨酸以及氫化麥芽糖替換山梨醇的效應(yīng) 表6 此結(jié)果證實(shí)精氨酸的添加(已知這改善在凍干期間病毒的穩(wěn)定性并且還提供堿性介質(zhì)以便抵消胃的酸度)維持病毒滴度。
山梨醇總是大幅度地降低凍干塊狀物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。如上所示，這可以通過使用麥芽糖醇替代山梨醇得以克服并且病毒滴度仍得到維持。
5.3多種制劑組合物 本試驗(yàn)證實(shí)多種制劑是可行的。
表7 5.4輪狀病毒與Al(OH)3抗酸劑間的結(jié)合 表8 Al(OH)3被用作抗酸劑。這表明輪狀病毒與不溶性無機(jī)鹽(Al(OH)3)結(jié)合，因?yàn)檩啝畈《倦SAl(OH)3一起得到離心(上清液中的病毒活性降低)。
5.5病毒滴定前由檸檬酸鈉溶解Al(OH)3抗酸劑 表9 當(dāng)輪狀病毒與Al(OH)3結(jié)合時，有可能凍干全部物質(zhì)(包括Al(OH)3)。凍干后，有可能通過在檸檬酸鈉中溶解Al(OH)3而恢復(fù)輪狀病毒。此步驟沒有破壞輪狀病毒并且在這個溶解步驟后保持輪狀病毒活性。
5.6在解除Al(OH)3與輪狀病毒結(jié)合后輪狀病毒的感染性 (通過溶解載體的)病毒釋放機(jī)制可以在體內(nèi)(in vivo)良好地發(fā)生。實(shí)際上在pH6以下，氫氧化鋁是完全可溶解的，因此輪狀病毒在胃內(nèi)被釋放。
Al(OH)3+3H+---→Al+++(水溶性)+3H2O 在胃中，Al+++離子未被吸收(J.J.Powell，R.Jugdaohsingh和R.P.H.Thompson，對胃腸道中礦物質(zhì)吸收的調(diào)節(jié)作用(The regulation of mineraladsorption in the gastrointestinal track)，Proceedings of the NutritionSociety(1999)，58，147-153)。
在小腸中，因pH增加，不溶性形式的鋁(Al(OH)3或AlPO4)析出，并通過天然途徑得到消除。
對于新形成的Al(OH)3(或AlPO4)沉淀物是否能夠與游離的輪狀病毒再結(jié)合是未知的。這提出了Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合體本身的感染性問題。
也有可能通過其它機(jī)制使輪狀病毒從Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合體中釋放。例如，賴氨酸干擾病毒在Al(OH)3上的吸附。
已知其它陰離子如硼酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽特異性地吸附在氫氧化鋁上，因此，理論上，應(yīng)當(dāng)有可能(通過競爭吸附位點(diǎn))從Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合體中置換出輪狀病毒。

因此，輪狀病毒可以從輪狀病毒-Al(OH)3結(jié)合體中得到釋放并且釋放的輪狀病毒保持活性。
這種釋放可以通過在胃內(nèi)由HCl或在體外由檸檬酸三鈉)溶解Al(OH)3或通過由堿性氨基酸(賴氨酸)置換輪狀病毒而完成。
5.7Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合體的感染性 凍干輪狀病毒的單劑量用水進(jìn)行重構(gòu)并分成兩部分。視作參考的第一部分接受額外體積的水。第二部分接受混懸于0.240ml水中的24mgAl(OH)3(臨床前的病毒滴定)。

當(dāng)Al(OH)3存在時，輪狀病毒是有活性的并且病毒滴定值與參考樣品相比較高。
重復(fù)該實(shí)驗(yàn)而不分出凍干的劑量，并添加12mg Al(OH)3或24mgAl(OH)3。
這里，樣品是用檸檬酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液重構(gòu)的樣品。因此，病毒滴度在Al(OH)3存在下仍然較高。
DRVC003A46DRVC003A46 DRVC003A46 + + + 1.5ml WL 在0.120ml 在0.240ml中的 緩沖液中的12mg Al(OH)324mg Al(OH)3 + + 1.380ml H2O 1.260ml H2O 5.34 6.246.05 5.32 5.956.26 如在以上實(shí)施例中那樣，輪狀病毒與Al(OH)3粒子結(jié)合，因?yàn)椴《究梢酝ㄟ^離心得以沉淀。DRVC003A46是凍干配制的輪狀病毒(蔗糖2％；右旋糖酐4％；山梨醇3％；氨基酸2％)。

SDSAA＝蔗糖2％，右旋糖酐4％，山梨醇3％，氨基酸2％。
根據(jù)在上清液上實(shí)施的病毒滴定，吸附輪狀病毒所需要Al(OH)3的量似乎是低的(以一個凍干的劑量5.7對數(shù)開始)按比例放大病毒滴定) 表10 輪狀病毒吸附在Al(OH)3上所需的時間似乎是短暫的 將一個劑量凍干的輪狀病毒在24mg Al(OH)3存在下進(jìn)行重構(gòu)，并在0分鐘、15分鐘、60分鐘和24小時后離心?！癱ulot”在病毒滴定前重懸于SDSAA內(nèi) 表11 5.8使用CaCO3作為抗酸劑 為了避免在疫苗中使用鋁，抗酸劑Al(OH)3用另一不溶性無機(jī)鹽CaCO3(碳酸鈣)替換。
對CaCO3觀察到的現(xiàn)象與對Al(OH)3描述的現(xiàn)象一致 -輪狀病毒與無機(jī)鹽結(jié)合； -與無機(jī)鹽結(jié)合時，輪狀病毒活性得到維持； -有可能通過酸溶解無機(jī)堿而從結(jié)合體中釋放輪狀病毒； -有可能使抗酸劑與輪狀病毒共同凍干。
CaCO3與輪狀病毒結(jié)合 在第一個試驗(yàn)中，凍干的輪狀病毒(病毒滴度5.7)用CaCO3在水中的混懸液(1.5ml中的50mg)重構(gòu)；并且隨后離心，并且將上清液的病毒滴度與沉淀的病毒滴度進(jìn)行比較。

這表明超過90％的輪狀病毒與CaCO3結(jié)合。
當(dāng)病毒結(jié)合時，也有可能釋放這個滴度并恢復(fù)原始的病毒量。
另外，病毒滴度略微高于無CaCO3下所得到的病毒滴度。
CaCO3與輪狀病毒結(jié)合的量
凍干的輪狀病毒用在水(1.5ml)中的CaCO3混懸液重構(gòu) 10mg 50mg 100mg 并且隨后離心，并且將上清液的病毒滴度與culot的病毒滴度進(jìn)行比較。
表12
顯然，更多CaCO3與更多病毒結(jié)合，并且更少的病毒存在于上清液內(nèi)。
然而，全部劑量并沒有徹底得到恢復(fù)(預(yù)期總計(jì)至少5.3或如先前所得到的甚至5.8-見上文)。
在嬰兒Rossett-Rice抗酸劑滴定期間CaCO3對輪狀病毒的保護(hù) 使用10個劑量凍干的輪狀病毒(DRVC003A46)和50mg CaCO3，實(shí)施兩種類型的嬰兒Rossett-Rice滴定 在傳統(tǒng)的Rossett-Rice滴定中，抗酸劑與輪狀病毒混合并將HCl傾倒至此介質(zhì)內(nèi)。
在“反向的”嬰兒Rossett-Rice中，情況正好相反將抗酸劑滴入HCl池中(如在體內(nèi)發(fā)生那樣)。
表13

因此，在這個體外實(shí)驗(yàn)中，碳酸鈣能夠保護(hù)約20％的輪狀病毒免受HCl存在的影響，而氫氧化鋁不能夠做到這點(diǎn)。
5.9在CaCO3抗酸劑存在下輪狀病毒的凍干 表14 這是“整體制劑”即在同一小瓶內(nèi)一起凍干輪狀病毒和抗酸劑(CaCO3)。為防止灌裝步驟期間CaCO3的沉降，需要增稠劑。此類增稠劑的實(shí)例包括蒼耳烷樹膠和淀粉。輪狀病毒活性甚至在蒼耳烷樹膠和淀粉存在下得以維持。
5.10用于放置在嘴中時迅速崩解的凍干片劑 下列制劑證實(shí)速溶(“l(fā)yoc”)概念。也就是凍干塊狀物在嘴中迅速溶解。
表15
在“速溶概念”中，蒼耳烷和淀粉均可以得到使用(維持凍干塊狀物的速溶解特性). 實(shí)施例6碳酸鈣作為抗酸劑用于輪狀病毒疫苗組合物 當(dāng)CaCO3在水中的混懸液作為抗酸劑用于輪狀病毒時，存在這樣的問題，即碳酸鈣粒子在水中靜置于時迅速沉降，原因在于粉末密度值接近2.6以及平均粒度是30μm. 這種沉降可以通過如下方式延緩 1增加周圍介質(zhì)的密度 2增加周圍介質(zhì)的黏度 3縮小粒徑 4保持粒子彼此分開 6.1增加周圍介質(zhì)的密度 當(dāng)CaCO3-水混懸液(當(dāng)置于注射器內(nèi))在凍干塊狀物(含有蔗糖2％；右旋糖酐4％；山梨醇3％；氨基酸2％)上放置時，增加周圍介質(zhì)的密度，但是CaCO3沉降的速度并沒有明顯與CaCO3-水混懸液不同。
6.2增加周圍介質(zhì)的黏度 假塑性賦形劑 將假塑性溶液定義為與其攪拌下的黏度相比，在靜置時具有更高黏度的溶液 該類型的常用賦形劑是 天然聚合物例如 阿拉伯樹膠 黃蓍樹膠 瓊脂 藻酸鹽 果膠 半合成性聚合物例如 羧甲基纖維素(Tyloses

) 甲基纖維素(Methocels

Viscotrans

Tylose

和

) 羥丙基纖維素
羥丙基甲基纖維素(Methocels

和

Viscontrans

) 通常，這些假塑性賦形劑與觸變劑一起使用。
具有低流動能力的假塑性賦形劑 這些聚合物在足夠高的濃度時產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性流體排列，形成在靜置時具有低流動能力的高黏度溶液。需要向該系統(tǒng)給予一定量的能量以允許流動和轉(zhuǎn)移。需要外來能量(攪拌)來臨時破壞結(jié)構(gòu)性流體排列以便得到流體溶液。
此類聚合物的實(shí)例是

和蒼耳烷樹膠 觸變賦形劑 借助這些賦形劑，在靜置時得到凝膠結(jié)構(gòu)；而在攪拌下得到流體溶液。
觸變賦形劑的實(shí)例是

(鎂鋁硅酸鹽)和Avicel

(約89％微晶纖維素和11％羧甲基纖維素鈉)。
6.3減小粒徑 CaCO3粒徑的減小導(dǎo)致該化合物抗酸容量的下降。
6.4保持粒子彼此分開 這在

和

中就是如此，也就是將比CaCO3粒子更小的不溶性粒子(約1μm)置于CaCO3粒子之間，以防止聚集。
實(shí)施例7產(chǎn)品設(shè)計(jì) 如下示意圖展示可能的產(chǎn)品設(shè)計(jì)實(shí)例。
7.1在注射器中的CaCO3 讓臨床批(clinical batche)的輪狀病毒位于凍干小瓶后，可以將抗酸劑置于容納在注射器中的重構(gòu)液體內(nèi)。

在這種產(chǎn)品形式中，CaCO3的沉降在灌裝步驟期間和產(chǎn)品的整個保存期間(至少2年)必須得到控制。
7.2在凍干小瓶中的CaCO3
7.3.在水泡眼內(nèi)的凍干 在本例子中，輪狀病毒、CaCO3和蒼耳烷樹膠一起直接在水泡眼包裝內(nèi)進(jìn)行凍干。

實(shí)施例8對輪狀病毒不同株的凍干 表16 DS-1株、P株及VA70株在1990年Raven出版社“Fields”第二版第361頁中分別作為血清型G2、G3和G4的人輪狀病毒參考株得到描述。
在本實(shí)驗(yàn)中，使不同的輪狀病毒株凍干。
對于全部輪狀病毒毒而言，不但病毒滴度在凍干期間得到維持，而且加速穩(wěn)定性(在37℃下1周)得以證實(shí)。
實(shí)施例9在口服施用一次輪狀病毒疫苗的成人中的I期安全性研究 實(shí)施I期研究以評估P43疫苗的單個口服劑量106.0ffu在年齡18-45歲健康成人中的安全性和反應(yīng)原性。
臨床研究是雙盲和隨機(jī)化的。它是安慰劑-對照和自我包含(self-contained)的。該項(xiàng)研究在比利時的一單中心實(shí)施。
9.1.研究群體 招募了總計(jì)33位受試者，其中11位在安慰劑組，22位在疫苗組，并且全部受試者完成研究。全部志愿者是白種人。他們在接種時的平均年齡是35.3歲，范圍在18-44歲。試驗(yàn)在一月份開始并且僅進(jìn)行1個月時間。
9.2.材料 疫苗 P43疫苗的臨床批根據(jù)良好制造規(guī)范(Good Manufacturing Practices)進(jìn)行生產(chǎn)、純化、配制和凍干。各批次按照質(zhì)量控制和質(zhì)量保證(QualityControl and Quality Assurance)分發(fā)。每小瓶疫苗含有下列成分 活性組分 P43株 最少105.8ffu 賦形劑，穩(wěn)定劑 蔗糖9mg 右旋糖酐18mg 山梨醇 13.5mg 氨基酸 9mg 安慰劑 制備并分發(fā)小瓶的安慰劑。每小瓶安慰劑含有下列成分 賦形劑，穩(wěn)定劑 蔗糖9mg 右旋糖酐18mg 山梨醇 13.5mg 氨基酸 9mg 稀釋劑 使用注射用水作為稀釋劑以重構(gòu)疫苗和安慰劑。
9.3.施用 在施用疫苗或安慰劑前大約10-15分鐘，口服給予兩個組的受試者10ml的


是注冊的抗酸劑。該抗酸劑增加胃內(nèi)pH，防止輪狀病毒在通過胃期間失活。
為制備疫苗，將每小瓶含有105.8ffu的兩小瓶凍干的P43用1.5ml稀釋劑即注射用水重構(gòu)。這實(shí)現(xiàn)每劑所計(jì)算的病毒滴度106.1ffu。重構(gòu)的疫苗作為單個口服劑量迅速施用。
為制備安慰劑，將兩小瓶凍干的安慰劑用1.5ml稀釋劑即注射用水重構(gòu)并作為單個劑量口服施用。
9.4.安全性和反應(yīng)原性 采用下列安全性和反應(yīng)原性的標(biāo)準(zhǔn) 所要求的一般癥狀是發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、惡心、腹痛和食欲不振。這些癥狀在施用后8日進(jìn)行記錄。
不作要求的癥狀在施用后30日進(jìn)行記錄。
嚴(yán)重有害事件在整個研究期間得到記錄。
腹瀉樣品在施用后8日收集。
結(jié)果是 所要求的癥狀、不作要求的癥狀和嚴(yán)重有害事件在各自觀察時間期間均未報道。
無腹瀉病例報道。
9.5.結(jié)論 在將106.1ffu劑量作為單次劑量以雙盲方式對年齡18-44歲健康成人口服施用時，SB生物學(xué)P43疫苗相對于安慰劑是安全的。
實(shí)施例10-兩劑含有RIX 4414的人單價輪狀病毒疫苗在預(yù)防因G1和非G1(G9)輪狀病毒所致胃腸炎中的效力 10.1.方法 隨機(jī)化、雙盲、安慰劑作對照的II期試驗(yàn)在拉丁美洲實(shí)施以評估用于嬰兒免疫的衍生自G1P[8]人89-12株(RIX4414人輪狀病毒毒株)的疫苗的保護(hù)效力。RIX4414疫苗包含作為輪狀病毒成分的減毒G1P[8]人毒株，其作為ECACC保藏物99081301(WO 01/12797)被保藏。
疫苗組合物(表17) 通過將含有碳酸鈣緩沖劑的一預(yù)填充注射器的全部內(nèi)容物注射進(jìn)凍干產(chǎn)物(疫苗或安慰劑)的小瓶內(nèi)，制備HRV疫苗或安慰劑以施用。振搖小瓶以使疫苗/安慰劑重懸。將全部體積的重懸產(chǎn)物抽入同一個注射器，棄去針頭并且重懸產(chǎn)物作為單個口服劑量迅速予以施用(大約1.0ml)。
表17-RIX4414輪狀病毒疫苗組合物 疫苗施用 健康嬰兒(493名)在2月齡和4月齡接受兩個劑量(每劑105.8ffu的病毒濃度)的RIX4414-輪狀病毒疫苗或安慰劑(504名)，伴以百白破疫苗-乙型肝炎疫苗(DTPw-HBV疫苗)和Hib疫苗。距離研究疫苗2周，給予三個劑量的OPV(口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗)，即OPV在從每劑研究疫苗2周前開始至每劑研究疫苗2周后結(jié)束的時間期間不予施用。兩個其它組接受兩個劑量的具有不同病毒濃度即104.7ffu和105.2ffu的RIX4414輪狀病毒疫苗。檢測腹瀉樣品是否存在輪狀病毒(ELISA)，并且在陽性樣品內(nèi)確定血清型(RT-PCR)。第二個劑量2周后所報道的腹瀉發(fā)作被考慮用于效力分析。使用20點(diǎn)量表(Ruuska和Vesikari，1990)確定嚴(yán)重性。本研究中用來評估每次腹瀉發(fā)作嚴(yán)重性的20點(diǎn)評分系統(tǒng)在下表18中顯示。評分≥11定義嚴(yán)重疾病。
表18 *對發(fā)作期間記錄的最高溫度評分 10.2.結(jié)果 在以上提及的組中開展效力的期中分析，分離的血清型主要是G1和G9，幾乎呈均勻分布。安慰劑組中的整體侵襲率在6個月觀察時間期間對于G1是4.8％-對于G9是3.6％。兩劑105.8ffu的RIX4414輪狀病毒疫苗以83％效力[95％CI50.4-95.7]抗由G1所致全部類型的腹瀉，并且以92.1％效力[95％CI47.6-99.8]抗嚴(yán)重胃腸炎。若腹瀉由G9引起，則抗全部類型的腹瀉是60.2％[95％CI0.2-86.0]，抗嚴(yán)重胃腸炎是80.8％[95％CI33.0-96.4]。對于這些效力終點(diǎn)的每個(對G1和G9來說任意的和嚴(yán)重的)，與安慰劑組相比，在HRV組中存在統(tǒng)計(jì)顯著的腹瀉發(fā)作下降(p＜0.05，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。
在其它2個疫苗組(輪狀病毒的濃度不同)中得到的結(jié)果與實(shí)施例中所報道的結(jié)果一致，在終末分析中呈現(xiàn)(實(shí)施例11)。還分析G2、G3和G4的效力數(shù)據(jù)。從本項(xiàng)研究中沒有得出關(guān)于G2、G3和G4交叉保護(hù)的結(jié)論，原因是報道的病例數(shù)太少。然而，針對G2、G3和G4的效力數(shù)在更大樣本量上的終末分析中呈現(xiàn)(實(shí)施例11)。
10.3.結(jié)論 這些結(jié)果高度地支持2個劑量的單價HRV疫苗即RIX4414輪狀病毒疫苗在保護(hù)幼嬰抵抗G1株和交叉保護(hù)抵抗G9株方面的效力。
實(shí)施例11-兩劑含有RIX 4414株的人單價輪狀病毒疫苗在預(yù)防因G1和非G1(G2、G3、G4、G9)輪狀病毒所致胃腸炎中的效力，其中所述的人輪狀病毒單價疫苗在3個不同的病毒濃度上施用 11.1.方法 隨機(jī)化、雙盲、安慰劑作對照的II期試驗(yàn)在拉丁美洲實(shí)施以評估用于嬰兒免疫的衍生自G1P[8]人89-12株(RIX4414人輪狀病毒毒株)的疫苗的保護(hù)效力和免住院效力。具體地，使用的疫苗名為RIX4414疫苗，并包含作為輪狀病毒成分的減毒G1人毒株，其作為ECACC保藏物99081301被保藏。
健康嬰兒接受兩劑在3個不同病毒濃度上的RIX4414-輪狀病毒疫苗。效力分析用隊(duì)列由2月齡和4月齡的1846名受試者組成(468名受試者在104.7ffu HRV疫苗組，460名受試者在105.2ffu HRV疫苗組，464名受試者在105.8ffu HRV疫苗組并且454名受試者在安慰劑組)，伴以DTPw-HBV和Hib疫苗。距離研究疫苗2周，給予三個劑量的OPV，即OPV在從研究疫苗的每個劑量2周前開始并在研究疫苗的每個劑量2周后結(jié)束的時間期間不予施用。檢驗(yàn)腹瀉樣品是否存在輪狀病毒(ELISA)并且在陽性樣品內(nèi)確定血清型(RT-PCR)。從第二個劑量2周后至受試者滿一歲時所報道的腹瀉發(fā)作被考慮用于效力分析。使用20點(diǎn)量表(Ruuska和Vesikari，1990)確定嚴(yán)重性。評分≥11定義嚴(yán)重疾病(見實(shí)施例10對20點(diǎn)評分系統(tǒng)的描述)。
11.2.結(jié)果 在下表中顯示作為對實(shí)施例10內(nèi)所提及數(shù)據(jù)的終末分析的結(jié)果。疫苗組中的嬰兒比安慰劑組中的兒童具有顯著更少的輪狀病毒胃腸炎發(fā)作(p＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))(表19)。取決于劑量，抗嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)效力達(dá)85.6％(95％CI63.0％-95.6％)并且抗任意輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)效力達(dá)70％(95％CI，45.7％-84.4％)(表20)。對于這些效力終點(diǎn)中的每一個，與安慰劑組相比，在HRV組內(nèi)存在統(tǒng)計(jì)顯著的腹瀉發(fā)作下降(p＜0.05，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。從胃腸炎糞便中(ELISA和RT-PCR)鑒定出多個輪狀病毒血清型(G1、G2、G3、G4和G9)，允許還計(jì)算出抗非G1血清型的疫苗效力。尤其如可以從表21中看到，對于非G1血清型(G2、G3、G4和G9)并且取決于劑量，抗嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的效力達(dá)82.7％(95％CI40.3％-96.8％)，這為如此概念提供了證據(jù)，即單價的基于G1的G1P1A P[8]人輪狀病毒疫苗激發(fā)抗異型(即非G1和非P[8])株的交叉保護(hù)。
表19研究期間所報道的輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的特征
表20兩劑RIX4414人輪狀病毒疫苗抗輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)效力
*對于疫苗組與安慰劑組間的每種比較，通過雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)p＜0.001(α的顯著水平＝0.05)

對于疫苗組與安慰劑組間的比較，通過雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)p＝0.037(α的顯著水平＝0.05)

對于疫苗組與安慰劑組間的比較，通過雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)p＝0.007(α的顯著水平＝0.05) N＝受試者人數(shù) n/％＝報告至少一種所述的輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的受試者人數(shù)/百分?jǐn)?shù)。
顯示精確95％置信區(qū)間 表21兩劑的RIX4414人輪狀病毒疫苗的抗血清型特異性嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的保護(hù)效力
*用于疫苗組與安慰劑組間每種比較的雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)(α的顯著水平＝0.05) N＝受試者人數(shù) n/％＝報告至少一種所述嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的受試者人數(shù)/百分?jǐn)?shù) 顯示精確95％置信區(qū)間 11.3.結(jié)論 這些結(jié)果高度支持2劑量的含有RIX4414的單價HRV疫苗的效力，其中該效力體現(xiàn)在保護(hù)幼嬰抵抗由G1株所致的任意輪狀病毒胃腸炎和嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎以及抗其它RV G型即G2、G3、G4和G9的廣泛交叉保護(hù)方面。
實(shí)施例12-兩劑人輪狀病毒減毒疫苗RIX4414疫苗在拉丁美洲和歐洲顯示異型保護(hù) 2劑含有RIX4414株的口服人輪狀病毒(RV)減毒G1P[8]活疫苗的效力在芬蘭和拉丁美洲在II/III期臨床試驗(yàn)中得以分析。RIX 4414輪狀病毒疫苗包含作為輪狀病毒成分的減毒G1人病毒株，其作為ECACC保藏物99081301被保藏。
12.1.方法 實(shí)施例12的部分結(jié)果已經(jīng)在實(shí)施例10和11中顯示。匯集一個在芬蘭和一個在拉丁美洲(巴西、墨西哥和委內(nèi)瑞拉)進(jìn)行的II期研究(實(shí)施例10和11)和一個在11個拉丁美洲國家中進(jìn)行的III期研究(實(shí)施例13)的數(shù)據(jù)，這些研究使用相同方法學(xué)和效力標(biāo)準(zhǔn)。隨訪了對用2劑RIX 4414疫苗或安慰劑在2月齡和4月齡接種的總計(jì)20081名健康嬰兒(用于效力分析的隊(duì)列)，直至一周歲，觀察具有在Vesikari(Ruuska T等Scand.J.Infect.Dis.1990，22，259-267)嚴(yán)重性量表上的評分≥11的嚴(yán)重胃腸炎(GE)。對GE樣品(通過ELISA)檢驗(yàn)輪狀病毒以及通過RT-PCR檢驗(yàn)輪狀病毒型。
在三個提及的研究上實(shí)施Meta分析。對嚴(yán)重RV GE(定義為Vesikari嚴(yán)重性評分≥11)的匯集的效力從給予2次劑量2周后至1周歲進(jìn)行計(jì)算(使用Mantel-Haenszel近似法調(diào)整研究效果)。
12.2.結(jié)果 在該效力隊(duì)列中，在疫苗組內(nèi)檢測到具有Vesikari評分≥11的5例G2P[4]型嚴(yán)重輪狀病毒GE發(fā)作并且在安慰劑組中檢測到13例發(fā)作。抗G2P[4]型的疫苗效力是67.2％(95％CI14.8；87.1)，這表明除抗同型株(G1P[8]、G3P[8]和G4P[8])的保護(hù)外，RIX4414疫苗還保護(hù)免受由異型非P[8]非G1的G2P[4]株引起的嚴(yán)重輪狀病毒GE的影響。
跨越不同研究間的型特異性效力如下給出(表22)。
表22
*VE用Mantel-Haenszel近似法對研究效果作調(diào)整 僅3個G4病例出現(xiàn)在全部3個試驗(yàn)中，1個G4病例出現(xiàn)在疫苗受者中和2個G4病例出現(xiàn)在安慰劑受者中。
12.3.結(jié)論 本分析顯示除產(chǎn)生抗同源G1輪狀病毒株(該毒株具有在抗原性上與疫苗相似的兩種外衣殼蛋白(VP4和VP7)和一種內(nèi)衣殼蛋白(VP6))的高水平保護(hù)之外，RIX4414疫苗也提供針對其它株的高度保護(hù)，其中所述的其它株具有不同的G型(例如G3、G9)、不同的P型(例如P[4])或同時不同的G型及P型，如對G2P[4]的效力所示。
實(shí)施例13-Meta分析表明兩個劑量的人輪狀病毒減毒疫苗RIX 4414顯示異型保護(hù) 隨著更多數(shù)據(jù)可從新加坡并從歐洲研究(實(shí)施例15)獲得，實(shí)施了額外的Meta分析，以便除了實(shí)施例12內(nèi)提到的研究之外，還包括進(jìn)這些研究。
13.1.方法 3個II期研究(芬蘭和拉丁美洲和新加坡)和2個III期研究(拉丁美洲和歐洲)被包括進(jìn)meta-分析內(nèi)。兩次口服給藥根據(jù)根據(jù)0、1月至2月的計(jì)劃施用至在給予劑量1時6-14周周齡的健康嬰兒。在全部研究中，將嚴(yán)重RVGE定義為在20點(diǎn)Vesikari量表中的評分≥11。腹瀉樣品就RV的存在通過ELISA進(jìn)行分析并通過基于RT-PCR的方法進(jìn)行分型?？谷我釸V GE的效力在3個II期研究中并僅在III期歐洲研究中得到評估，如在III期拉丁美洲研究那樣，僅記錄嚴(yán)重RV GE。
采用該研究分層的精確泊松率比(exact Poisson rate ratio)(ProcStatXact4 for SAS Users，1999，cytel software corporation，exactConfidence Interval for common relative risk，第298頁)，VE及其95％CI相對于安慰劑被評估為RVGE 1-rate， 13.2.結(jié)果 在用兩劑RIX4414或安慰劑接種的總共8221名嬰兒中，在RIX4414(N＝5783)內(nèi)檢測到4例任意G2P[4]RVGE發(fā)作并且在安慰劑(N＝2438)組內(nèi)檢測到9例任意G2P[4]RVGE發(fā)作，這表明對于因G2P[4]株所致的具有任意嚴(yán)重性的RVGE，VE是81.0％(95％CI31.6；95.8)。
在用兩劑RIX4414或安慰劑接種的總共26088名健康嬰兒中，在RIX4414(N＝14792)內(nèi)檢測到6例因G2P[4]型所致的嚴(yán)重G2P[4]RVGE發(fā)作并且在安慰劑(N＝11296)組內(nèi)檢測到15例因G2P[4]型所致的嚴(yán)重G2P[4]RVGE發(fā)作，表明對于因G2P[4]株所致的嚴(yán)重RVGE，VE是71.4％(95％CI20.1；91.1)。結(jié)果在表23中報告。
表23-報告由G2P[4]RV型所致的任意RV GE發(fā)作或嚴(yán)重RV GE發(fā)作的受試者人數(shù)和在第一效力期期間的疫苗效力百分?jǐn)?shù)-(Meta分析)、效力隊(duì)列 表23
N＝各組內(nèi)包括的受試者人數(shù)； n/％＝各組內(nèi)報告至少一種所述RV G2P[4]GE發(fā)作的受試者人數(shù)/百分?jǐn)?shù)； ％VE＝觀察到的疫苗效力， 95％CI＝95％置信區(qū)間 *13個G2中的2個未進(jìn)行P分型。
13.3.結(jié)論 在抗RV G2P[4]型的疫苗效力上的這個Meta分析表明抗因G2P[4]型所致的任意RV GE的疫苗效力是81.0％(95％CI31.6％；95.8％)并且抗G2P[4]型所致的嚴(yán)重RV GE的疫苗效力是71.4％(95％CI20.1％；91.1％)。
實(shí)施例14-人輪狀病毒減毒疫苗RotarixTM在多個國家的III期試驗(yàn)中的效力 14.1.方法 來自11個拉丁美洲國家的20169名健康嬰兒將在約2月齡和4月齡口服接受2劑的HRV疫苗(10159)或安慰劑(10010)。糞便樣品通過ELISA檢驗(yàn)輪狀病毒(RV)并采用合適引物和型特定探針通過RT-PCR分型。對捕獲嚴(yán)重胃腸炎發(fā)作的臨床病例定義是伴有或沒有嘔吐的腹瀉發(fā)作(在24小時內(nèi)連續(xù)3次或更多次的比正常更松散的糞便或水樣糞便)，這種腹瀉發(fā)作需要住院過夜和/或在醫(yī)療機(jī)構(gòu)如醫(yī)院、診所或受監(jiān)督的鄉(xiāng)村護(hù)理中心中進(jìn)行與WHO計(jì)劃B(口服補(bǔ)水療法)或WHO計(jì)劃C(靜脈內(nèi)補(bǔ)水療法)(http://www.who.int/child-adolescent-health/New Publications/CHILDHEALTH/textrev4.htm)等同的補(bǔ)水療法。疾病嚴(yán)重性使用20點(diǎn)Vesikari量表進(jìn)行分級；將嚴(yán)重RVGE定義為評分≥11。Vesikari評分受到改良因?yàn)槊撍趀CRF內(nèi)未得到記錄，下列規(guī)則得到使用將具有嚴(yán)重GE發(fā)作的受試者視為脫水1％-5％，若該受試者接受口服補(bǔ)水。將受試者視為脫水≥6％，若該受試者入院和/或接受靜脈內(nèi)(IV)補(bǔ)水。
14.2.疫苗效力 抗嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的疫苗效力(表24) 效力隊(duì)列由以HRV疫苗接種的9009名受試者和接受安慰劑的8858名受試者組成。根據(jù)臨床定義在疫苗組內(nèi)存在12名患有嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的兒童并且在安慰劑組內(nèi)存在77名患有嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的兒童(2.0名兒童對13.3名兒童，每1,000個兒童-年≥1次發(fā)作；p＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))，產(chǎn)生從給予2次劑量后15日直至1周歲的84.7％抗嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎的疫苗效力(在表24中顯示)。相似結(jié)果用從給予1次劑量直至1周歲的全部接種隊(duì)列得到(疫苗效力81.1％；95％C.I.68.5-89.3；p＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。疫苗組中9名兒童及安慰劑組中59名兒童需要住院至少1個晚上(每1,000個兒童-年分別是1.5例住院對10.2例住院)，免于因嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎而住院的疫苗效力是85％(p＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))(表24)。
表24-在給予第2劑后2周直至1周歲時間期間，抗輪狀病毒嚴(yán)重胃腸炎、特異性輪狀病毒G型嚴(yán)重胃腸炎和全因(all-cause)嚴(yán)重胃腸炎的疫苗效力

對表24的說明 有發(fā)作并攜帶多于一種已分離G型輪狀病毒的參與者在檢測到的輪狀病毒型分類的每個分類中計(jì)數(shù) n＝報告至少一種所述發(fā)作的嬰兒人數(shù) RR＝相對風(fēng)險＝疫苗組中報告至少1種發(fā)作的受試者發(fā)病率與安慰劑組中報告至少1種發(fā)作的受試者發(fā)病率的比率。
CI＝置信區(qū)間 1000嬰兒-年比例是每嬰兒-年表現(xiàn)＞＝1的所述發(fā)作的嬰兒人數(shù) *根據(jù)研究計(jì)劃的病例定義伴有或沒有嘔吐的腹瀉發(fā)作(1日內(nèi)連續(xù)3次或更多次的比正常糞便更松散或水樣的糞便)，這種腹瀉發(fā)作需要住院過夜和/或在醫(yī)療機(jī)構(gòu)如醫(yī)院、診所或受監(jiān)督的鄉(xiāng)村護(hù)理中心中進(jìn)行與WHO計(jì)劃B(口服補(bǔ)水療法)或WHO計(jì)劃C(靜脈內(nèi)補(bǔ)水療法)等同的補(bǔ)水療法 #分離的全部G1型是野生型輪狀病毒；G1P[8]和G9P[8]從1名嬰兒中分離 aG1P[8]型單從2名嬰兒中分離；G1P[8]和G9P[8]從1名嬰兒中分離 bG1P[8]型單從34名嬰兒中分離；G1P[8]和G9P[8]從1名嬰兒中分離；G1、G2、G9型從1名嬰兒中分離 cG3P[8]型單從1名嬰兒中分離，G4P[8]型單從1名嬰兒中得到并且G9P[8]單從1名嬰兒中分離；G1P[8]和G9P[8]從1名嬰兒中分離 dG3P[8]型單從8名嬰兒中分離，G4P[8]型單從2名嬰兒中分離并且G9P[8]單從19名嬰兒中分離；G1P[8]和G9P[8]從1名嬰兒中分離并且G1P[8]與G2P[4]及G9P[8]從1名嬰兒中分離 eG2P[4]單從9名嬰兒中分離并且G1P[8]、G2P[4]和G9P[8]從1名嬰兒中分離。
p_值＝雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)(α的顯著水平＝0.05) 根據(jù)Vesikari評分的疫苗效力 疫苗組中具有嚴(yán)重輪狀病毒發(fā)作的12名兒童中11名兒童以及安慰劑組內(nèi)具有嚴(yán)重輪狀病毒發(fā)作的77名兒童中71名兒童具有Vesikari評分≥11，得到84.7％的疫苗效力(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。對于上升的具有11-20評分的疾病嚴(yán)重性，疫苗效力更高，達(dá)到100％抵抗更嚴(yán)重的輪狀病毒胃腸炎。Vesikari評分≥11的總共16個嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎發(fā)作從給予第一劑量直至給予第二劑量期間得到報告，6個在疫苗組，10個在安慰劑組。
每個輪狀病毒型的根據(jù)Vesikari評分的疫苗效力 抗野生型毒株的型特異性疫苗效力在表24中顯示?？筕esikari評分≥11的嚴(yán)重輪狀病毒發(fā)作的疫苗效力是91.8％(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))，其中所述的嚴(yán)重輪狀病毒發(fā)作由與疫苗株同源的G1P[8]型株引起。對共有P[8]抗原(G3P[8]、G4P[8]和G9P[8])的毒株的疫苗效力是86.9％(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。與疫苗株未共有G抗原及P抗原的輪狀病毒G2P[4]型在疫苗組內(nèi)的5個發(fā)作中及在安慰劑組內(nèi)的9個發(fā)作中得到檢測，導(dǎo)致45％的效力(P＝0.298，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。因?yàn)樵诒卷?xiàng)研究中G2發(fā)作的數(shù)目少，故對5項(xiàng)研究(實(shí)施例13)開展meta分析并且在匯集這5項(xiàng)研究(實(shí)施例13)的結(jié)果時，本項(xiàng)研究中所觀察到的趨勢變成一個顯著值。
在腹瀉疾病的負(fù)擔(dān)方面的疫苗效力 需要住院和/或根據(jù)WHO計(jì)劃B/C補(bǔ)水的患有任意病因性胃腸炎的兒童在疫苗組中具有發(fā)病率30.9/1,000名兒童-年，與之相比，在安慰劑組中的發(fā)病率是51.7/1,000名兒童-年，因而在疫苗受者中全因性嚴(yán)重腹瀉發(fā)作整體減少40％(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。類似地，因任意病因性腹瀉所致的住院顯著下降42％(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))(表24，全因GE))。
14.3.結(jié)果總結(jié) 抗嚴(yán)重輪狀病毒胃腸炎(RV GE)及免于輪狀病毒相關(guān)性住院的疫苗效力是85％(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))，在患有Vesikari評分＞＝19的RV GE的群體中達(dá)到100％。針對G1P[8]的效力和針對與HRV僅共有P[8]表位的毒株的效力分別是92％(95％C.I.74，98)和87％(95％C.I.64，97)(P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))，因全因性腹瀉所致的住院減少42％(95％C.I.29，53；P＜0.001，雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn))。
實(shí)施例15-人輪狀病毒減毒疫苗RotarixTM在6個歐洲國家的效力 15.1.方法 將在6個歐洲國家的3,994名兒童隨機(jī)分組，以便在隨常規(guī)兒童接種共同施用時接受106.5CCID50HRV(人輪狀病毒)疫苗RotarixTM(見組合物)或安慰劑。第一效力隨訪期始自第2次劑量后2周并截止于2005年6月-7月?？偣?874名受試者是首年效力隊(duì)列的一部分。
疫苗組合物(表25) 15.2.疫苗效力 在第一效力期期間，HRV疫苗在抗RV GE保護(hù)方面是高度有效的。抗任意RV GE發(fā)作的疫苗效力是87.1％(95％CI79.6％；92.1％)并且抗嚴(yán)重RV GE發(fā)作的疫苗效力是95.8％(95％CI89.6％；98.7％)。對于上升的疾病嚴(yán)重性(Vesikari評分在11和20之間)，疫苗效力更高，在患有Vesikari評分≥17點(diǎn)的RV GE的群體中達(dá)到100％。免于因RV GE所致的住院的疫苗效力是100％(95％CI81.8％；100％)并且免于需要醫(yī)學(xué)護(hù)理的RV GE發(fā)作的疫苗效力是91.8％(95％CI84.0％；96.3％)(表26和表27)。
表26-報告任意RV GE和嚴(yán)重RV GE的受試者百分?jǐn)?shù)、因RV GE發(fā)作所致住院的受試者百分?jǐn)?shù)和在第一效力期期間的疫苗效力-效力隊(duì)列
N＝各組中包括的受試者人數(shù) N％＝各組中報告有至少一種所述的RV GE發(fā)作的受試者人數(shù)和百分?jǐn)?shù) P-值＝雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)(α的顯著水平＝0.05) ％VE＝觀察到的疫苗效力 95％CI＝95％置信區(qū)間 在20點(diǎn)Vesikari量表中評分≥11被定義為嚴(yán)重 表27-報告需要醫(yī)學(xué)護(hù)理的RV GE發(fā)作的受試者百分?jǐn)?shù)和在第一效力期期間的疫苗效力-效力隊(duì)列
N＝各組中包括的受試者人數(shù)； N/％＝各組中報告有至少一種需要醫(yī)學(xué)護(hù)理的RV GE發(fā)作的受試者人數(shù)/百分?jǐn)?shù)； P-值＝雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)(α的顯著水平＝0.05)； ％VE＝觀察到的疫苗效力， 95％CI＝95％置信區(qū)間 這種HRV疫苗高度有效地保護(hù)免受由G1P[8]，G3P[8]，G4P[8]和G9P[8]株所致的任意RV GE和嚴(yán)重RV GE(表28)。
這項(xiàng)研究中針對不與HRV疫苗共有任何外衣殼抗原的G2P[4]RV型的保護(hù)較低，然而將II和III期效力研究納入考慮的Meta分析結(jié)果顯示針對由G2P[4]所致的任意GE和嚴(yán)重GE的有效保護(hù)性效力(見實(shí)施例13)。
表28-報告任意RV GE發(fā)作或嚴(yán)重RV GE發(fā)作的受試者百分?jǐn)?shù)和在第一效力期期間針對血清型的疫苗效力-效力隊(duì)列
N＝各組中包括的受試者人數(shù)； n/％＝各組中報告有至少一種RV GE發(fā)作的受試者人數(shù)/百分?jǐn)?shù)； P-值＝雙側(cè)Fisher精確檢驗(yàn)(α的顯著水平＝0.05)； ％VE＝觀察到的疫苗效力， 95％CI＝95％置信區(qū)間 在20點(diǎn)Vesikari量表中評分≥11被定義為嚴(yán)重

將一名來自安慰劑組的受試者在G1和G4類別中計(jì)數(shù)，因?yàn)檫@兩個血清型均得到分離。
15.3.結(jié)果總結(jié) 與兒童接種而共同施用的2個口服劑量的HRV RotarixTM疫苗在第一效力期期間與安慰劑相比，在保護(hù)嬰兒抵抗由G1P[8]野生型RV和由非G1P[8]RV型所致的任意RV GE方面是高度有效的，疫苗效力分別是95.6％(95％CI87.9％；98.8％)和79.3％(95％CI64.6％；88.4％)。抵抗由G1P[8]野生型RV和由非G1P[8]RV型所致的嚴(yán)重RV GE的效力分別是96.4％(95％CI85.7％；99.6％)和95.4％(95％CI85.3％；99.1％)。
這些結(jié)果極大地支持如此結(jié)論，即HRV疫苗提供抗循環(huán)RV株的廣泛覆蓋性(見表28G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8])。進(jìn)行了特異針對抗G2P[4]的疫苗效力的Meta分析，請參考實(shí)施例13。
總體結(jié)論 RIX4414輪狀病毒疫苗證明是高度保護(hù)免受輪狀病毒胃腸炎發(fā)作的影響，其中所述的輪狀病毒胃腸炎發(fā)作由用于以住院及補(bǔ)水為核心的病例捕獲的臨床定義衡量，以及由有效的Vesikari量表衡量，其中所述的Vesikari量表包括涉及腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、脫水和住院的可定量性發(fā)病率后果。兩劑口服的HRV疫苗在保護(hù)嬰兒抵抗由多種循環(huán)性輪狀病毒毒株所致的任意RV GE和嚴(yán)重RVGE和住院方面是高度有效的。
針對具有在抗原上與HRV疫苗相似的兩種外衣殼蛋白(VP4和VP7)和一種內(nèi)衣殼蛋白(VP6)的同源G1P[8]輪狀病毒顯示了高水平的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用還對僅共有基因型P[8]抗原(VP4抗原)和VP6抗原的毒株。在Meta分析內(nèi)還顯示針對不共有HRV疫苗的任何外衣殼抗原的保護(hù)，其中所述的Meta分析包括來自芬蘭、新加坡和拉丁美洲(均使用相同的方法學(xué)和效力標(biāo)準(zhǔn))的3項(xiàng)II期研究以及來自拉丁美洲和歐洲的2項(xiàng)III期研究的結(jié)果，并且如在實(shí)施例13中報告，抗G2P[4]型任意嚴(yán)重性GE的疫苗效力)是81％(95％C.I.31.6-95.8)，抗因G2P[4]型嚴(yán)重GE的疫苗效力是71.4％(95％C.I.20.1-91.1)，表明該疫苗也可以對與疫苗株不共有相同G蛋白或P蛋白的毒株提供保護(hù)。
序列表
<110>GlaxoSmithKline Biologicals s.a.
<120>疫苗
<130>VB61582
<160>42
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2350
<212>DNA
<213>輪狀病毒
<400>1
atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat 60
gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120
gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180
gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240
tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300
ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360
atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420
gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480
accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540
ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600
cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660
aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720
tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780
tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840
gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900
caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960
ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg1020
tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca1080
tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca1140
ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct1200
gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta1260
aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga1320
acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac1380
tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag1440
actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta1500
cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca1560
ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact1620
aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt1680
tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt1740
agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta1800
actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta1860
aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta1920
aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca1980
gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta2040
atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg2100
ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata2160
atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg2220
ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca2280
attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga2340
ggatgtgacc 2350
<210>2
<211>2359
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<213>輪狀病毒
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<212>PRT
<213>輪狀病毒
<400>5
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val
1 5 10 15
Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn
20 25 30
Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val
35 40 45
Asn Trp Asp His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Ile
50 55 60
Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Thr Pro Pro Asn Asp Tyr
65 70 75 80
Trp Ile Leu Ile Asn Ser Asn Thr Asn Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr
85 90 95
Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Val Ala Ile Glu Pro His Val
100 105 110
Asn Pro Val Asp Arg Gln Tyr Met Ile Phe Gly Glu Ser Lys Gln Phe
115 120 125
Asn Val Ser Asn Asp Ser Asn Lys Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg
130 135 140
Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp
145 150 155 160
Thr Arg Leu Val Gly Ile Phe Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe
165 170 175
His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Asn
180 185 190
Leu Asn Asn Ile Ser Ile Thr Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Pro Leu Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Ile Val Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile
260 265 270
Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Ile Val Lys Met Gly Gly Leu Gly Tyr
275 280 285
Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn
305 310 315 320
Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Phe Leu Pro Thr Asp Phe
325 330 335
Gly Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val
340 345 350
Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg
355 360 365
Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Thr Gly Gly Ser Tyr
370 375 380
Tyr Phe Ser Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Asn Gly Gly Ala
385 390 395 400
Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp
405 410 415
Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp
420 425 430
Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Thr Val Asn Leu Tyr Gly
435 440 445
Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Ile Ser
450 455 460
Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln
465 470 475 480
Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Thr Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala
500 505 510
Met Ala Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser
515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala
530 535 540
Thr Ser Val Met Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile
545 550 555 560
Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg
565 570 575
Asn Val Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ile Ser Asn Trp Thr Asn
580 585 590
Val Ser Asn Asp Val Ser Asn Val Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ile Ser
595 600 605
Thr Gln Thr Ser Thr Ile Ser Lys Lys Leu Arg Leu Lys Glu Met Ile
610 615 620
Thr Gln Thr Glu Gly Met Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu
625 630 635 640
Lys Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro
645 650 655
Asp Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr
660 665 670
Arg Ile Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Ile Asn Thr Glu Gly Lys
675 680 685
Phe Phe Ala Tyr Lys Ile Asn Thr Phe Asp Glu Val Pro Phe Asp Val
690 695 700
Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile
705 710 715 720
Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr
725 730 735
Arg Thr Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Met Leu Arg
740 745 750
Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln
755 760 765
Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu
770 775
<210>6
<211>326
<212>PRT
<213>輪狀病毒
<400>6
Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Ile Leu Ile Phe Leu Ile Ser Ile
1 5 10 15
Ile Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Ile Met Asp Tyr
20 25 30
Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe Ala Leu Thr
35 40 45
Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp
50 55 60
Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu Thr Ser Thr
65 70 75 80
Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Asn Asp Gly
85 90 95
Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro
100 105 110
Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Ser
115 120 125
Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu Met Lys Tyr
130 135 140
Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu
145 150 155 160
Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln
165 170 175
Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser Ser Cys Thr
180 185 190
Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile Gly Cys Gln
195 200 205
Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn Glu Lys Leu
210 215 220
Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile Asn Leu Thr
225 230 235 240
Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu
245 250 255
Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu Asp Ile Thr
260 265 270
Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn
275 280 285
Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn
290 295 300
Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Tyr Arg Val
325
<210>7
<211>175
<212>PRT
<213>輪狀病毒
<400>7
Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Leu
1 5 10 15
Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr
20 25 30
Phe Ser Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Ile Leu His Lys
35 40 45
Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser
50 55 60
Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Ile Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu
85 90 95
Gln Gln Met Asp Arg Ile Val Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Asp Met
100 105 110
Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys
115 120 125
Arg Ile His Asp Asn Leu Ile Thr Arg Pro Val Asp Val Ile Asp Met
130 135 140
Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Lys Thr Leu Asp Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met
165 170 175
<210>8
<211>750
<212>DNA
<213>輪狀病毒
<400>8
ggcttttaaa agttctgttc cgagagagcg cgtgcggaaa gatggataag cttgccgacc 60
tcaactacac attgagtgta atcactttaa tgaatgacac attgcattet ataattcaag120
atcctggaat ggcgtatttt tcatatattg catctgttct aacagtttta ttcatattac180
ataaagcttc aattccaacc atgaaaatag cattgaaaac atcaaaatgt tcatataaag240
tgattaaata ttgtatagtc acgatcatta atactctttt aaaattggct ggatataaag300
agcaggttac tacaaaagac gaaattgagc aacagatgga cagaattgtt aaagagatga360
gacgtcagct ggatatgatt gataaattaa ctactcgtga aattgaacag gttgaattgc420
ttaaacgtat acatgacaac ctgataacta gaccagttga cgtcatagat atgtcgaagg480
aattcaatca gaaaaacatc aaaacgctag atgaatggga gagtggaaaa aatccatatg540
aaccgtcaga agtgactgca tccatgtgag aggttgagtt accgtcgtct gtcttcggaa600
gcggcggaac tcttcaccgc aagccccatt agacctgatg attgactgag aagccacagt660
caatcatatc gcgtgtggct cagccttaat cccgtttaac caatccagcg agtgttggac720
gttaatggaa ggaatggtct tagtgtgacc 750
<210>9
<211>397
<212>PRT
<213>輪狀病毒
<400>9
Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly lle Gly Asn Leu Pro Val Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn
65 70 75 80
Ala Arg Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Val Ser Pro Gln
100 105 110
Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ala Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
130 135 140
Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Met His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile
275 280 285
Arg Leu Leu Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Asn Ala Leu Phe Pro Gln Ala Gln Pro Phe Gln His His Ala Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Asn Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys
385 390 395
<210>10
<211>1356
<212>DNA
<213>輪狀病毒
<400>10
ggctttaaaa cgaagtcttc gacatggagg ttctgtactc actgtcaaaa actcttaaag 60
atgctaggga caaaattgtt gaaggtacat tatattctaa cgttagcgat cttattcagc120
aattcaatca aatgatagta actatgaatg gaaatgactt tcagactgga ggaattggta180
atttacctgt tagaaattgg actttcgatt ttggtctatt aggtacaaca cttttgaact240
tggatgctaa ttatgttgag aatgcaagaa ctacaattga atattttatt gactttattg300
ataatgtatg tatggatgaa atggcaagag aatctcaaag aaatggagta tcgccacaat360
ctgaagcgtt aagaaagcta gcgggaatta aatttaagag aataaatttc gataattcat420
cagaatacat agaaaattgg aacttacaaa atagaagaca gcgcaccgga tttgtttttc480
ataaacctaa catttttcca tactcagctt catttactct aaatagatct caaccaatgc540
atgataattt aatgggaacc atgtggctta atgctggatc agaaattcaa gtggctggat600
ttgattactc atgcgccata aatgcaccag cgaacataca gcaatttgag catatcgttc660
agcttaggcg cgcactgact acagctacta taactttatt acctgatgca gagagattta720
gttttccaag agtaattaat tcagctgatg gcgcgactac atggttcttt aatccagtta780
ttctaagacc aaacaatgta gaggtagaat ttttattgaa tggacaaatt attaatacat 840
atcaggctag atttggtact atcatcgcaa gaaattttga tacaattcgt ttattatttc 900
agttgatgcg tccacctaat atgacaccag ctgttaatgc actatttcca caagcacaac 960
cttttcagca ccatgcaaca gttggactta cattacgtat tgaatctgcg gtttgtgaat1020
cagtgcttgc ggacgcgaat gaaactctgt tagcaaatgt gaccgcggtg cgtcaagaat1080
atgccatacc agttggaccg gtatttccac caggcatgaa ttggactgaa ttgattacta1140
actattcgcc atctagagaa gataacttgc aacgcgtttt cacggtagct tccattagaa1200
gcatgttgat taagtgagga ccagactaaa catctggtat ccaatcttag ttagcatgta1260
gctacatcaa gtcattcaga ctcttcaagt aaggacatga tttcatgttc gctacgtaga1320
gtaactgtct gaatgatgta gtgagaggat gtgacc 1356
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>11
ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>12
ggttagctcc ttttaatgta tggta 25
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>13
ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>14
caagtactca aatcaatgat gg 22
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>15
tgttgatttt tctgtcgatc cac 23
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>16
ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>17
ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc32
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>18
tggcttcgcc attttataga ca 22
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>19
atttcggacc atttataacc 20
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>20
tggcttcact catttataga ca 22
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>21
atttcagacc atttataacc tag23
<210>22
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>22
ggagtagtat atgaaagtac aaataatag 29
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>23
ctattatttg tactttcata tactactcc 29
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>24
tcgatacagt ataagagagc acaag 25
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>25
ttcattaact tgtgctctct tatactg 27
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>26
gtatatgtag actattggga tg 22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>27
catcccaata gtctacatat ac 22
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>28
tgtaactccg gcaaaatgca acg 23
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>29
cgttgcattt tgccggagtt aca 23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>30
gtaagacaag atttagagcg cca 23
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>31
tggcgctcta aatcttgtct tac 23
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>32
cttgatgctg atgaagcagc atctg 25
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>33
cagatgctgc ttcatcagca tcaag 25
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>34
cgatcatatc gaatattaaa ggatg 25
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>35
catcctttaa tattcgatat gatcg 25
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>36
agcgttcaca caatttacat tgtag 25
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>37
agtattttat actatagtag attatattaa tc 32
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>38
agtattttat actatggtag attatattaa tc 32
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>39
atccccatta tactgcattc ctttc 25
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>40
atccctatta tactgcattt ctttc 25
<210>41
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>41
atccccatta tactgcattt ctttc 25
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>與輪狀病毒共有同源性的寡核苷酸
核苷酸序列
<400>42
atccctatta tactgcattc ctttc 2權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)針對輪狀病毒株的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含減毒GxPy型輪狀病毒株的組合物，所述的組合物產(chǎn)生針對既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
2.來自GxPy型的減毒輪狀病毒株在制備用來誘導(dǎo)針對輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述的輪狀病毒感染由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株引起。
3.根據(jù)任一在先權(quán)利要求的方法或用途，其中所述的組合物包含具有如此VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在核苷酸序列內(nèi)包含如下堿基的至少一種從起始密碼子起在位置788的腺嘌呤堿基(A)、在位置802的腺嘌呤堿基(A)以及在位置501的胸腺嘧啶堿基(T)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法或用途，其中所述VP4基因包含如此核苷酸序列，其在從起始密碼子起的位置788和802包含腺嘌呤堿基(A)以及在位置501包含胸腺嘧啶堿基(T)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含具有如此VP7基因的輪狀病毒，所述VP7基因在核苷酸序列內(nèi)包含如下堿基的至少一種從起始密碼子起在位置605的胸腺嘧啶(T)、在位置897的腺嘌呤(A)和在位置897的鳥嘌呤(G)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法或用途，其中VP7基因包含如此核苷酸序列，其在從起始密碼子起的位置605包含胸腺嘧啶(T)和在位置897包含腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含具有如此VP4基因的輪狀病毒，所述VP4基因在核苷酸序列內(nèi)在從起始密碼子起的位置788和802包含腺嘌呤(A)和在位置501包含胸腺嘧啶(T)；以及其中VP7基因在核苷酸序列內(nèi)在從起始密碼子起的位置605包含胸腺嘧啶(T)和在位置897包含腺嘌呤(A)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含G1輪狀病毒株并且被用來誘導(dǎo)針對G1血清型及至少一種選自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型的非G1血清型的免疫應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中所述的組合物包含G1輪狀病毒株并且被用來誘導(dǎo)針對G1血清型和G2血清型的免疫應(yīng)答。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法或用途，其中所述的組合物還能夠誘導(dǎo)針對至少一種選自G3、G4和G9的非-G1血清型的免疫應(yīng)答。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含P[8]輪狀病毒株并且被用來誘導(dǎo)針對P[8]和至少一種選自P[1]、P[2]、P[3]、P[4]、P[5]、P[6]、P[7]、P[9]、P[11]、P[12]、P[14]和P[19]型的非P[8]型的免疫應(yīng)答。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法或用途，其中所述的組合物被用來誘導(dǎo)針對P[4]型的免疫應(yīng)答。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含G1P[8]輪狀病毒株并且誘導(dǎo)針對G2P[4]輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
14.根據(jù)任一在先權(quán)利要求的方法或用途，其中所述包含減毒GxPy型輪狀病毒株的組合物提供針對輪狀病毒誘導(dǎo)的嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)，其中所述輪狀病毒誘導(dǎo)的嚴(yán)重胃腸炎由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒毒株的感染引起。
15根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述包含減毒GxPy型輪狀病毒株的組合物在接種個體群中提供針對由既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒株所致的腹瀉至少40％保護(hù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法或用途，其中所述的組合物提供至少50％保護(hù)。
17.根據(jù)任一在先權(quán)利要求的方法或用途，其中所述的組合物提供至少60％保護(hù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物提供40％-80％保護(hù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法或用途，其中所述的組合物提供50％-70％保護(hù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物包含G1P[8]輪狀病毒株，其在接種個體群中提供針對由具有G2P4血清型的輪狀病毒感染引起的嚴(yán)重胃腸炎40％-75％保護(hù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)中的方法或用途，其中在所述組合物中的輪狀病毒株是ECACC保藏物99081301，或是從ECACC保藏物99081301中可得到的或可衍生的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任意項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的組合物以2劑方案施用。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21任意項(xiàng)中的方法或用途，其中所述的減毒輪狀病毒株與合適的藥物載體或與抗酸緩沖劑或與兩者一起配制。
全文摘要
本發(fā)明提供誘導(dǎo)針對輪狀病毒株的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用包含減毒GxPy型輪狀病毒株的組合物，該組合物產(chǎn)生針對既非Gx型亦非Py型的輪狀病毒株的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/15GK101291690SQ200680038637
公開日2008年10月22日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日
發(fā)明者B·D·A·科勞, B·A·V·德沃斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司