專利名稱：基于肽的用于毛發(fā)、皮膚和指甲的調(diào)理劑和著色劑的制作方法
本專利申請(qǐng)要求享有2003年9月8日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/501498和2004年4月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/562645的利益。
本發(fā)明涉及個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及基于特異性皮膚結(jié)合肽、毛發(fā)結(jié)合肽、和指甲結(jié)合肽的皮膚調(diào)理劑、毛發(fā)調(diào)理劑、毛發(fā)著色劑、指甲著色劑和皮膚著色劑。
背景技術(shù)：
成膜物質(zhì)作為調(diào)理劑和保濕劑，被廣泛應(yīng)用于進(jìn)行皮膚和毛發(fā)護(hù)理的組合物中，以保護(hù)皮膚和毛發(fā)避免環(huán)境和化學(xué)品的傷害。這些物質(zhì)吸附在皮膚或毛發(fā)上和/或被皮膚或毛發(fā)吸收，從而形成一種保護(hù)膜。常用的成膜物質(zhì)包括合成的聚合物，如聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物、和多糖、和蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白、酪蛋白、絲蛋白和豆蛋白。已知許多蛋白是非常有效的成膜試劑。因?yàn)樵谟糜谄つw和毛發(fā)護(hù)理產(chǎn)品中的條件下，蛋白的溶解性較低，因此蛋白通常以蛋白水解后所形成的肽的形式使用。
在毛發(fā)護(hù)理和毛發(fā)著色組合物中，成膜物質(zhì)用于在毛發(fā)表面形成一種保護(hù)膜，以保護(hù)毛發(fā)免受由修飾和定型、洗發(fā)和暴露于紫外線和通常應(yīng)用于永久性卷發(fā)劑(wave agent)、毛發(fā)著色產(chǎn)品、漂白劑和毛發(fā)拉直劑(straightener)中的活性化學(xué)品所導(dǎo)致的損害，上述化學(xué)品能夠使毛發(fā)角蛋白變性。此外，這些成膜物質(zhì)能夠增強(qiáng)毛發(fā)的彈性。應(yīng)用于毛發(fā)護(hù)理產(chǎn)品中的成膜物質(zhì)包括蛋白，如角蛋白、膠原蛋白、豆蛋白和絲蛋白、以及它們的水解產(chǎn)物，和聚合物材料，如聚丙烯酸酯、長鏈烷基季銨化胺、和硅氧烷聚合物。例如，在美國專利號(hào)6,013,250中，Cannell等描述了一種毛發(fā)護(hù)理組合物，其用于處理毛發(fā)，使之免受化學(xué)品和紫外線的損害。該組合物包含水解蛋白，具有豐富的陰離子氨基酸，尤其是含硫的氨基酸和二價(jià)的陽離子。該公開內(nèi)容提示水解蛋白中的陰離子成分通過陽離子橋的方式結(jié)合到毛發(fā)上。氨基酸和它們的衍生物也已經(jīng)被應(yīng)用于毛發(fā)護(hù)理組合物中，以調(diào)節(jié)毛發(fā)并增強(qiáng)其強(qiáng)度。例如，在WO 0051556中，O’Toole等描述了包含四種或更多種氨基酸成分的毛發(fā)護(hù)理組合物，氨基酸選自組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸、和半胱氨酸。
成膜物質(zhì)還被應(yīng)用于皮膚護(hù)理組合物中，使之在皮膚上形成一種保護(hù)膜。這些膜能夠潤滑皮膚并在皮膚上形成涂層以被動(dòng)地防止皮膚水分的蒸發(fā)，并且能使皮膚光滑和柔軟。在皮膚護(hù)理組合物中通常使用的成膜物質(zhì)包括水解動(dòng)物和植物蛋白(Puchalski等，美國專利號(hào)4,416,873，El-Menshawy等，美國專利號(hào)4,482,537，和Kojima等，JP02311412)和絲蛋白(Philippe等，美國專利號(hào)6,280,747和Fahnestock等，共同未決的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/704337)。在皮膚護(hù)理組合物中也已經(jīng)使用了氨基酸和衍生物作為調(diào)節(jié)劑。例如，JP06065049中，Kojima等描述了包含氨基酸和/或其衍生物和二十二碳六烯酸、其鹽或其酯的皮膚護(hù)理組合物。
毛發(fā)著色劑可分為三類，具體地分為永久性、半永久性或直接的、和臨時(shí)的。永久性毛發(fā)染料通常是氧化染料，其能夠使毛發(fā)的色彩維持大約四到六周。這些氧化毛發(fā)染料由兩部分組成，一部分除其它成分之外包含氧化染料，第二部分包含一種氧化劑，如過氧化氫。在使用前，將上述兩種組分立即混合在一起。氧化劑氧化染料前體，氧化后的產(chǎn)物在毛干內(nèi)結(jié)合在一起形成巨大的帶有顏色的分子。雖然氧化毛發(fā)染料能夠使色彩長時(shí)間維持，但是其中所包含的氧化劑卻使毛發(fā)受到損害。半永久性或直接的毛發(fā)染料是預(yù)先形成的染料分子，然后施用到毛發(fā)上，其能夠使毛發(fā)的色彩維持大約六到十二次洗發(fā)次數(shù)。這種類型的毛發(fā)染料因?yàn)椴缓^氧化物，因此對(duì)于毛發(fā)來說比較溫和，但是毛發(fā)的色彩維持的時(shí)間不夠長。通過使用納米顆粒毛發(fā)著色材料能夠提高色彩的耐久性，納米顆粒的粒徑在10-500納米之間，在WO 01045652中，Hensen等描述了上述內(nèi)容。這些納米顆粒毛發(fā)著色物質(zhì)是常規(guī)的直接毛發(fā)染料，經(jīng)處理，獲得納米大小的尺寸，并由此提高了毛發(fā)對(duì)其的吸收。臨時(shí)毛發(fā)染料是一種施用到毛發(fā)表面上并經(jīng)一次洗發(fā)就能去掉的著色劑?，F(xiàn)在需要開發(fā)一種不使用損傷毛發(fā)的氧化劑就能夠提供永久性毛發(fā)染料的耐久性的毛發(fā)著色劑。
在當(dāng)前皮膚護(hù)理和毛發(fā)護(hù)理組合物、非氧化毛發(fā)染料、還有指甲著色劑中，存在的主要問題是它們?nèi)狈S持長期效果所需的耐久性。因此，人們已經(jīng)嘗試著增強(qiáng)化妝品試劑對(duì)毛發(fā)、皮膚或指甲的結(jié)合能力。例如，Richardson等在美國專利號(hào)5,490,980中和Green等在美國專利號(hào)6,267,957中描述了化妝品試劑利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在毛發(fā)、皮膚和指甲上的共價(jià)附著，化妝品試劑如皮膚調(diào)理劑、毛發(fā)調(diào)理劑、著色劑、防曬劑、和香水。該酶將化妝品試劑上的胺部分交聯(lián)到皮膚、毛發(fā)和指甲里的谷氨酰胺殘基上。類似的，Green等在WO0107009中描述了使用賴氨酸氧化酶將化妝品試劑共價(jià)附著到毛發(fā)、皮膚和指甲上。
在另外一類方法中，采用了將化妝品試劑共價(jià)附著到蛋白或蛋白水解產(chǎn)物上的方法。例如，Lang等在美國專利號(hào)5,192,332中描述了包含動(dòng)物或植物蛋白、或其水解產(chǎn)物的臨時(shí)著色組合物，其包含嫁接到蛋白鏈上的染料分子殘基。在上述組合物中，蛋白是作為一種調(diào)理劑在使用，不能增強(qiáng)化妝品試劑結(jié)合到毛發(fā)、皮膚或指甲上的能力。Horikoshi等在JP 08104614中和Igarashi等在美國專利號(hào)5,597,386中描述了由共價(jià)附著到染料或色素上的抗-角蛋白抗體組成的毛發(fā)著色劑?？贵w結(jié)合到毛發(fā)上，從而增強(qiáng)了毛發(fā)著色劑結(jié)合到毛發(fā)上的能力。類似的，Kizawa等在JP 09003100描述了一種能夠識(shí)別毛發(fā)表層的抗體及其在處理毛發(fā)方面的應(yīng)用。另外，還描述了一種由偶聯(lián)到有色乳膠顆粒上的抗-毛發(fā)抗體組成的毛發(fā)著色劑?？贵w的使用增強(qiáng)了染料與毛發(fā)的結(jié)合能力，能夠有效提高毛發(fā)著色的耐久性，但是這些抗體在生產(chǎn)上難度較大，并且比較昂貴。Terada等在JP 2002363026中描述了綴合物在皮膚和毛發(fā)護(hù)理組合物中的應(yīng)用，其由單鏈抗體，優(yōu)選抗-角蛋白抗體組成，該抗體與染料、配體、和化妝品試劑相偶聯(lián)。盡管可以使用基因工程技術(shù)來制備上述單鏈抗體，但是因?yàn)槭谴蠓肿?，所以在制備上仍然比較困難和昂貴。Findlay在WO 00048558中描述了萼狀蛋白，如β-乳球蛋白，在調(diào)理劑、染料和香水中的應(yīng)用，其包含一個(gè)與化妝品試劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，和另外一個(gè)與毛發(fā)纖維表面或皮膚表面的至少一部分結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。這些蛋白還是太大，而在制備上很困難和昂貴。
Linter在美國專利號(hào)6,620,419中描述了嫁接到脂肪酸鏈上的肽，并描述了它們?cè)诨瘖y品和皮膚藥物方面的用途。在上述公開內(nèi)容中，所選擇的肽是能夠刺激膠原蛋白的合成的肽，而不是能夠增強(qiáng)毛發(fā)和皮膚調(diào)理劑和毛發(fā)、指甲和皮膚著色劑耐久性的特異性結(jié)合肽。
自從1985年引入以來，噬菌體展示被廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了多種用于藥物靶的配體，包括肽、蛋白和小分子(Dixit，J.of Sci & Ind.Research，57173-183(1998))。該用途隨后被擴(kuò)展到其它領(lǐng)域，如蛋白折疊研究、新的催化活性、新特異性的DNA-結(jié)合蛋白、和用于組織工程的基于新肽的生物材料支架(Hoess，Chem.Rev.1013205-3218(2001)和Holmes，Trends Biotechnol.2016-21(2002)).Whaley等(Nature 405665-668(2000))公開了噬菌體展示篩選方法在鑒別肽序列中的用途，其中肽能夠特異性結(jié)合到無機(jī)半導(dǎo)體基質(zhì)的不同晶體形式上。
描述了一種修改的篩選方法，包括將肽文庫與一種抗靶(anti-target)相接觸，去掉結(jié)合到抗靶上的肽，然后將未結(jié)合的肽與靶相接觸(Estell等WO 0179479，Murray等美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2002/0098524，和Janssen等美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976)。使用上述方法，鑒別出了能夠與毛發(fā)結(jié)合但不與皮膚結(jié)合的肽序列，如SEQ ID NO1所示，和與皮膚結(jié)合但不與毛發(fā)結(jié)合的肽序列，如SEQ IDNO2所示。使用相同的方法，Janssen等(WO 04048399)鑒別出了其它皮膚-結(jié)合和毛發(fā)-結(jié)合肽，以及幾種結(jié)合基元。盡管在這些公開內(nèi)容中已經(jīng)提示了上述肽在個(gè)人護(hù)理用品方面的潛在應(yīng)用，但是沒有描述將這些肽與著色劑和調(diào)理劑共價(jià)偶聯(lián)，來制備具有高度親和力的毛發(fā)調(diào)理劑、皮膚調(diào)理劑、毛發(fā)著色劑、指甲著色劑和皮膚著色劑。在這些公開內(nèi)容中，還描述了一種鑒別高度親和力噬菌體-肽克隆的方法。該方法中使用了PCR技術(shù)來鑒別經(jīng)過酸洗脫仍然與靶保持結(jié)合的肽。
Reisch(Chem.Eng.News 8016-21(2002))報(bào)道在個(gè)人護(hù)理用品中已開發(fā)了一族設(shè)計(jì)為靶向特定人組織成分的肽。然而，在該文獻(xiàn)中沒有描述基于肽的調(diào)理劑或著色劑。
本發(fā)明中的一種肽結(jié)合序列，SEQ ID NO3，已經(jīng)為了幾個(gè)其他目的進(jìn)行報(bào)道。例如，Hupp等，在WO 02065134中公開了肽序列SEQ IDNO3作為一種肽用于調(diào)節(jié)p53多肽與p300多肽的結(jié)合，以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期或誘導(dǎo)或防止細(xì)胞死亡。Liu等在美國專利號(hào)6,344,443公開了相同的肽序列在抑制腫瘤壞死因子α與它的受體結(jié)合方面的應(yīng)用，以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)帶有關(guān)節(jié)炎和其它炎性疾病的病人的炎性變化。本發(fā)明中的另外一個(gè)肽結(jié)合序列，SEQ ID NO4，在WO 03102020中Jagota等已將其作為一種碳納米管結(jié)合肽進(jìn)行報(bào)道。
綜上所述，需要提供一種能夠延長效果耐久性，并且制備上簡單和低廉的毛發(fā)和皮膚調(diào)理劑、和毛發(fā)、指甲、和皮膚著色劑。
申請(qǐng)人使用噬菌體展示篩選方法鑒別出了能以高度親和力與毛發(fā)、皮膚和指甲特異性結(jié)合的肽序列，并應(yīng)用這些肽序列設(shè)計(jì)出了基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑、皮膚調(diào)理劑、毛發(fā)著色劑、指甲著色劑和皮膚著色劑，從而解決了上述所提出的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了與毛發(fā)、皮膚和指甲具有高親和力的肽序列。本發(fā)明還提供了基于肽的用于毛發(fā)、皮膚和指甲的調(diào)理劑和著色劑。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的調(diào)理劑和著色劑是二嵌段(diblock)組合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種毛發(fā)-結(jié)合肽，選自SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、64、66、69和70。
類似的，本發(fā)明提供了一種SEQ ID NO60所示的指甲-結(jié)合肽。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種SEQ ID NO61所示的皮膚-結(jié)合肽。
在其中優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種二嵌段的、基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其通式為(HBP)n-HCA，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)HCA是一種毛發(fā)調(diào)節(jié)劑；和c)n從1到約1000。
類似的，本發(fā)明提供了一種二嵌段的、基于肽的皮膚調(diào)理劑，其通式為(SBP)n-SCA，其中a)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；b)SCA是一種皮膚調(diào)節(jié)劑；和
c)n從1到約1000。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種二嵌段的、基于肽的毛發(fā)著色劑，其通式為(HBP)n-C，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種二嵌段的、基于肽的指甲著色劑，其通式為(NBP)n-C，其中a)NBP是一種指甲-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種二嵌段的、基于肽的皮膚著色劑，其通式為(SBP)n-C，其中a)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
在類似的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種三嵌段的、基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其通式為[(HBP)m-S]n-HCA，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)HCA是一種毛發(fā)調(diào)理劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約1000。
可選擇的，本發(fā)明提供了一種三嵌段的、基于肽的皮膚調(diào)理劑，其通式為[(SBP)m-S]n-SCA，其中a)SBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)SCA是一種皮膚調(diào)理劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約1000。
類似的，本發(fā)明提供了一種三嵌段的、基于肽的毛發(fā)著色劑，其通式為[(HBP)m-S]n-C，其中
a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約10,000。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種三嵌段的、基于肽的指甲著色劑，其通式為[(NBP)m-S]n-C，其中a)NBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約10,000。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種三嵌段的、基于肽的皮膚著色劑，其通式為[(SBP)m-S]n-C，其中a)SBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50，和e)n從1到約10,000。
另外，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)高度親和力毛發(fā)、皮膚或指甲-結(jié)合肽的方法，包含如下步驟a)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；b)將(a)的文庫與毛發(fā)、皮膚或指甲樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚、或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的毛發(fā)、皮膚或指甲，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；c)分離(b)中的噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚、或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；d)從(b)的噬菌體-肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的噬菌體-肽；e)將經(jīng)過步驟(d)后保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚、或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物直接感染細(xì)菌宿主細(xì)胞；
f)在合適的生長培養(yǎng)基上生長步驟(e)感染的細(xì)胞；和g)從步驟(f)的生長細(xì)胞中分離并鑒別噬菌體-肽，其中該噬菌體-肽對(duì)毛發(fā)、皮膚或指甲具有高度的結(jié)合親和力。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于肽的調(diào)理劑在毛發(fā)上形成保護(hù)層的方法，包含將本發(fā)明的組合物施用到毛發(fā)上，并使之形成所述的保護(hù)層。
類似的，本發(fā)明提供了基于肽的調(diào)理劑在皮膚或唇上形成保護(hù)層的方法，包含將本發(fā)明的組合物施用到皮膚或唇上，并使之形成所述的保護(hù)層。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)頭發(fā)、眉毛、皮膚或指甲進(jìn)行著色的方法，包含將本發(fā)明的頭發(fā)、眉毛、皮膚或指甲著色組合物施用到頭發(fā)、眉毛、皮膚或指甲上，并經(jīng)過一段時(shí)間，該時(shí)間足以使頭發(fā)、眉毛、皮膚或指甲著色。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種對(duì)頭發(fā)、眉毛或睫毛進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含毛發(fā)著色劑的毛發(fā)著色組合物，其中毛發(fā)著色劑選自i)(HBP)n-C和ii)[(HBP)m-S]k-C其中1)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的毛發(fā)-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)的文庫與毛發(fā)樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；
(ii)未結(jié)合的毛發(fā)，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于毛發(fā)的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的毛發(fā)著色劑施用到頭發(fā)、眉毛或睫毛上，維持一段時(shí)間，該時(shí)間足以使基于肽的著色劑結(jié)合到頭發(fā)、眉毛或睫毛上。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基于肽的調(diào)理劑在毛發(fā)上形成保護(hù)層的方法，包含如下步驟a)提供一種包含毛發(fā)調(diào)理劑的毛發(fā)護(hù)理組合物，其中毛發(fā) 調(diào)理劑選自i)(HBP)n-HCA和ii)[(HBP)m-S]k-HCA其中1)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；2)HCA是一種毛發(fā)調(diào)理劑；3)n從1到約1,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約1,000；并且其中的毛發(fā)-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與毛發(fā)樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的毛發(fā)，和
(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于毛發(fā)的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的毛發(fā)調(diào)理劑施用到毛發(fā)上，并使之形成所述的保護(hù)層。
可選擇的，本發(fā)明提供了一種在皮膚或唇上形成保護(hù)層的方法，包含如下步驟a)提供一種包含皮膚調(diào)理劑的皮膚護(hù)理組合物，其中皮膚調(diào)理劑選自i)(SBP)n-SCA和ii)[(SBP)m-S]k-SCA其中1)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；2)SCA是一種皮膚調(diào)理劑；3)n從1到約1,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約1,000；并且其中的皮膚-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與皮膚樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的皮膚，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；
C)分離(B)中的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于皮膚的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的皮膚調(diào)理劑施用到皮膚或唇上，并使之形成所述的保護(hù)層。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)皮膚或唇進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含皮膚著色劑的化妝品組合物，其中皮膚著色劑選自i)(SBP)n-C和ii)[(SBP)m-S]k-C其中1)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的皮膚-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與皮膚樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的皮膚，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；
D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于皮膚的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的皮膚著色劑施用到皮膚或唇上。
可選擇的，本發(fā)明提供了一種對(duì)指甲進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含指甲著色劑的指甲油組合物，其中指甲著色劑選自下組i)(NBP)n-C和ii)[(NBP)m-S]k-C其中1)NBP是一種指甲-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的指甲-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與指甲樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的指甲，和(iii)未形成復(fù)合物的肽C)分離(B)中的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于指甲的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的指甲著色劑施用到指甲上。
序列描述的簡要說明通過以下的詳細(xì)說明和所附的序列描述，可以更充分地理解本發(fā)明，其中序列描述也是本申請(qǐng)的一部分。
以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列的專利申請(qǐng)所必備的條件-序列條款”)規(guī)定，并符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)ST.25(1998)的標(biāo)準(zhǔn)，以及EPO和PCT(5.2條和49.5(a-bis)條和使用說明208章節(jié)和C附件)所規(guī)定的序列表?xiàng)l件。在核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)中所使用的符號(hào)和形式均符合37C.F.R.§1.822的規(guī)定。
SEQ ID NO1是毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO2是皮膚-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO3-52、54-59是本發(fā)明毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO53是本發(fā)明毛發(fā)-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO60是本發(fā)明指甲-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO61是本發(fā)明皮膚結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO62是用于噬菌體DNA測(cè)序的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO63是在ELISA結(jié)合分析試驗(yàn)中作為對(duì)照的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO64是附著有半胱氨酸的毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO65是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3切割位點(diǎn)的氨基酸序列。
SEQ ID NO66、69和70是抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO67和68是實(shí)施例8中所描述的用于擴(kuò)增抗洗發(fā)水的、毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO71-74是實(shí)施例9中所使用的生物素化的毛發(fā)-結(jié)合肽和皮膚-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO75是實(shí)施例16中所使用的被完全保護(hù)的D21肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO76-98是毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO99-104是皮膚-結(jié)合肽的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了對(duì)人毛發(fā)、皮膚和指甲以高度親和力特異性結(jié)合的肽序列。另外，本發(fā)明還提供了提高了耐久性的基于肽的毛發(fā)和皮膚調(diào)理劑，和毛發(fā)、指甲、和皮膚著色劑。
本說明書中采用如下定義，其用于解釋權(quán)利要求書和說明書。
“HBP”表示毛發(fā)-結(jié)合肽。
“SBP”表示皮膚-結(jié)合肽。
“NBP”表示指甲-結(jié)合肽。
“HCA”表示毛發(fā)調(diào)理劑。
“SCA”表示皮膚調(diào)理劑。
“C”表示毛發(fā)、皮膚或指甲著色劑。
“S”表示間隔物。
術(shù)語“肽”指的是兩個(gè)或多個(gè)氨基酸通過肽鍵或修飾肽鍵彼此連接在一起。
在此所使用的術(shù)語“毛發(fā)”指的是人頭發(fā)、眉毛和睫毛。
在此所使用的術(shù)語“皮膚”指的是人皮膚或豬皮膚、用作人皮膚替代品的Vitro-Skin和EpiDermTM。
在此所使用的術(shù)語“指甲”指的是人手指甲和腳趾甲。
在選擇本發(fā)明毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽時(shí)，所使用的術(shù)語“嚴(yán)格”指的是用于從毛發(fā)、皮膚或指甲上洗脫肽的洗脫試劑(通常為去污劑)的濃度。較高濃度的洗脫試劑提供更加嚴(yán)格的條件。
術(shù)語“肽-毛發(fā)復(fù)合物”是指一種結(jié)構(gòu)，包含通過肽上的結(jié)合位點(diǎn)與毛發(fā)纖維結(jié)合的肽。
術(shù)語“肽-皮膚復(fù)合物”是指一種結(jié)構(gòu)，包含通過肽上的結(jié)合位點(diǎn)與皮膚結(jié)合的肽。
術(shù)語“肽-指甲復(fù)合物”是指一種結(jié)構(gòu)，包含通過肽上的結(jié)合位點(diǎn)與手指甲或腳趾甲結(jié)合的肽。
術(shù)語“肽-底物復(fù)合物”既指肽-毛發(fā)、肽-皮膚復(fù)合物，也指肽-指甲復(fù)合物。
術(shù)語“MB50”是指在基于ELISA的結(jié)合分析試驗(yàn)中，當(dāng)獲得的信號(hào)是最大信號(hào)的50％時(shí)的結(jié)合肽的濃度，在實(shí)施例9中對(duì)此有所描述。MB50指示出復(fù)合物各成分之間的結(jié)合相互作用強(qiáng)度或親和力。MB50值越低，則表明肽與它相應(yīng)的底物之間的相互作用越強(qiáng)。
術(shù)語“結(jié)合親和力”指的是結(jié)合肽與各自的底物之間的相互作用強(qiáng)度。在本申請(qǐng)中結(jié)合親和力用在基于ELISA的結(jié)合分析試驗(yàn)中所測(cè)定出的MB50值來表示。
術(shù)語“氨基酸”是指蛋白或多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)單元。在本申請(qǐng)中使用如下的縮寫，分別代表特定的氨基酸。
氨基酸 三字母的縮寫單字母的縮寫丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺Asn N天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q谷氨酸 Glu E甘氨酸 Gly G組氨酸 His H異亮氨酸Ile I亮氨酸 Leu L賴氨酸 Lys K甲硫氨酸Met M苯丙氨酸Phe F脯氨酸 Pro P
絲氨酸 Ser S蘇氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y纈氨酸 Val V“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括編碼序列之前的調(diào)控序列(5’非編碼序列)和之后的序列(3’非編碼序列)，“天然基因”是指在天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的帶有自有調(diào)控序列的基因?！扒逗匣颉笔侵溉我环翘烊换?，其包含在天然狀態(tài)下不會(huì)同時(shí)在一起的調(diào)控序列和編碼序列。相應(yīng)的，嵌合基因可能包含衍生自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包含衍生自相同來源，但排列方式不同于天然狀態(tài)的調(diào)控序列和編碼序列?！巴庠椿颉笔侵冈谒拗饔袡C(jī)體中通常不存在，而是通過基因轉(zhuǎn)移引入到宿主有機(jī)體的基因。外源基因包含插入到非天然有機(jī)體的天然基因，或嵌合基因。
“合成基因”是利用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法，通過化學(xué)合成的方法將寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元裝配在一起所形成的。將這些結(jié)構(gòu)單元連接到一起，然后退火使之形成基因片段，然后再將這些片段用酶法裝配到一起構(gòu)成完整的基因。“化學(xué)合成”，當(dāng)涉及DNA序列時(shí)，是指核苷酸成分是在體外裝配到一起的。人工化學(xué)合成DNA可以采用充分確立的技術(shù)來完成，或自動(dòng)化學(xué)合成可以使用許多市售儀器中的某一種來進(jìn)行。相應(yīng)的，可以根據(jù)反映宿主細(xì)胞密碼子偏倚的核苷酸序列最優(yōu)化，對(duì)基因進(jìn)行裁剪，以利于基因的優(yōu)化表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識(shí)到如果密碼子使用偏倚于宿主所偏愛的密碼子，則更能使基因獲得成功的表達(dá)?；趯?duì)來自序列信息已知的宿主細(xì)胞的基因的分析，就能夠確定出優(yōu)選的密碼子。
“編碼序列”是指編碼一種特定氨基酸序列的DNA序列。“適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列”是指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、其中或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA的加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
“啟動(dòng)子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般來說，編碼序列位于與啟動(dòng)子序列的3’。啟動(dòng)子可以是來自天然基因的完整形式，或者是由不同天然啟動(dòng)子的不同元件組成的，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于一種基因來說，在不同組織或細(xì)胞類型、或不同的發(fā)育階段、或?qū)Σ煌h(huán)境或生理?xiàng)l件所作出的反應(yīng)，基因的表達(dá)是由不同的啟動(dòng)子來指導(dǎo)的。在大多數(shù)細(xì)胞類型、在大多數(shù)時(shí)間導(dǎo)致一種基因表達(dá)的啟動(dòng)子一般被稱為“組成型啟動(dòng)子”。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下不能完全確定調(diào)控序列的確切界限，因此不同長度的DNA片段有可能具有相同的啟動(dòng)子活性。
在此所使用的術(shù)語“表達(dá)”是指來自本發(fā)明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達(dá)還指mRNA翻譯成多肽。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主有機(jī)體的基因組中，形成穩(wěn)定的基因遺傳。包含轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主有機(jī)體也被稱作“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化的”有機(jī)體。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者是能夠被外源多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”是指一種經(jīng)常攜帶基因的染色體外元件，它不是細(xì)胞中心代謝的一部分，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。上述元件可以是任意來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線狀或環(huán)狀自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列結(jié)合或組合在一種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列連同適當(dāng)?shù)?’非翻譯序列引入到細(xì)胞中?！稗D(zhuǎn)化盒”是指這樣一種特殊的載體，其包含外源基因，除外源基因外還具有能夠促進(jìn)特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件?！氨磉_(dá)盒”是指這樣一種特殊的載體，其包含外源基因，除外源基因外還具有能夠在外源宿主中增強(qiáng)該基因表達(dá)的元件。
術(shù)語“噬菌體(phage)”或“噬菌體(bacteriophage)”是指一種感染細(xì)菌的病毒。變化了形式的噬菌體也能用于本發(fā)明目的。優(yōu)選的噬菌體是來自叫做M13的“野生”噬菌體。M13系統(tǒng)能夠在細(xì)菌內(nèi)生長，因此不會(huì)破壞它所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，只是使細(xì)胞不斷地制造新的噬菌體。M13是一種單鏈的DNA噬菌體。
術(shù)語“噬菌體展示”是指在噬菌體或噬菌粒顆粒表面所進(jìn)行的功能性外源肽或小蛋白的展示?？梢允褂没蚬こ袒氖删w用于展示本發(fā)明的肽，在展示時(shí)，本發(fā)明的肽作為噬菌體天然表面蛋白的一個(gè)片段。帶有不同基因序列的噬菌體群可以產(chǎn)生肽文庫。
“PCR”或“聚合酶鏈反應(yīng)”是一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)(美國專利號(hào)4,683,195和4,800,159)。
本發(fā)明所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，下列文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了描述，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文稱作”Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，和Wiley-Interscience出版(1987)。
本發(fā)明包含特異性毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽，以及它們?cè)诿l(fā)、皮膚和指甲調(diào)理劑和著色劑中的應(yīng)用。
毛發(fā)、皮膚和指甲人毛發(fā)樣品是市售的，例如從International Hair Importers andProducts(Bellerose，NY)購得的，有不同的顏色，如棕色、黑色、紅色和金色，有各種類型，如非裔美籍人的、高加索人的和亞洲人的。另外，毛發(fā)樣品可以進(jìn)行處理，例如使用過氧化氫進(jìn)行處理，得到漂白后的毛發(fā)。豬皮可以在屠宰店和超市中買到，Vitro-Skin購自IMSInc.(Milford，CT)，EpiDermTM購自MatTek Corp.(Ashland，MA)，上述產(chǎn)品均是人皮膚的很好的替代品。人手指甲和腳趾甲來自志愿者。
毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽、和指甲-結(jié)合肽在本申請(qǐng)中毛發(fā)-結(jié)合肽(HBPs)、皮膚-結(jié)合肽(SBPs)和指甲-結(jié)合-肽(NBPs)的定義是指分別對(duì)毛發(fā)、皮膚和指甲以高度親和力特異性結(jié)合的肽序列。本發(fā)明中的毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽具有約7個(gè)到約45個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的，具有約7個(gè)到約20個(gè)氨基酸，最優(yōu)選的，具有約7個(gè)到約12個(gè)氨基酸。本發(fā)明中的結(jié)合肽對(duì)它們各自的底物所具有的結(jié)合親和力，以MB50值來表示，小于或等于約10-2M，小于或等于約10-3M，小于或等于約10-4M，小于或等于約10-5M，優(yōu)選小于或等于約10-6M，更優(yōu)選小于或等于約10-7M。
可以使用本領(lǐng)域已知的方法來選擇合適的毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽序列。隨機(jī)產(chǎn)生本發(fā)明的肽，然后根據(jù)它們對(duì)目標(biāo)底物的結(jié)合親和力，來針對(duì)特定的毛發(fā)、皮膚或指甲樣品進(jìn)行選擇。隨機(jī)產(chǎn)生肽文庫是公知技術(shù)，可以通過如下各種技術(shù)來完成，包括細(xì)菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7)4520-4524(1981)，和Helfamn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)31-35，(1983))、酵母展示(Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(21)9578-82(1991))、組合固相肽合成(美國專利號(hào)5,449,754、5,480,971、5,585,275、5,639,603)、和噬菌體展示技術(shù)(美國專利號(hào)5,223,409、5,403,484。5,571,698、5,837,500)。下列文獻(xiàn)記載了生產(chǎn)上述生物肽文庫的技術(shù)，Dani，M.，J.of Receptor & Signal Transduction Res.，21(4)447-468(2001)。
隨機(jī)生產(chǎn)肽的一個(gè)優(yōu)選的方法是利用噬菌體展示。噬菌體展示是一種體外選擇技術(shù)，其中肽或蛋白通過基因工程技術(shù)融合到噬菌體外殼蛋白上，從而在噬菌體病毒體的外部形成融合肽展示，同時(shí)編碼融合殘基的DNA在病毒體內(nèi)。展示肽和其編碼DNA的這種物理連接使得能夠篩選大量肽變體，其中每個(gè)肽均與其相應(yīng)的DNA序列連接，篩選方法是一種體外選擇過程，稱作“生物淘選(bioparming)”。生物淘選中最簡單的形式是將不同的噬菌體-展示變體庫與目標(biāo)靶一起溫育，其中靶固定在板上或珠子上，然后洗去未結(jié)合的噬菌體，并通過破壞噬菌體與靶之間的結(jié)合相互作用，洗脫得到特異性結(jié)合的噬菌體。然后將洗脫后的噬菌體在體內(nèi)擴(kuò)增，重復(fù)該過程，得到逐步濃縮的有利于最強(qiáng)結(jié)合序列的噬菌體庫。經(jīng)過3輪或更多輪的選擇/擴(kuò)增，對(duì)單個(gè)克隆通過DNA測(cè)序進(jìn)行表征。
在生產(chǎn)出合適的肽文庫后，將肽文庫與適量的試驗(yàn)底物相接觸，具體的是毛發(fā)、皮膚或指甲樣品。試驗(yàn)底物與肽文庫在懸浮溶液中相接觸。優(yōu)選的溶液是包含表面活性劑的鹽水緩沖液。合適的溶液是含有0.5％Tween20的Tris緩沖的鹽水(TBS)?？梢酝ㄟ^任意方式進(jìn)一步攪拌該溶液，目的是提高肽向毛發(fā)、皮膚或指甲表面的傳質(zhì)速度，從而縮短達(dá)到最大結(jié)合所需要的時(shí)間。
在接觸時(shí)，許多隨機(jī)產(chǎn)生的肽結(jié)合到毛發(fā)、皮膚或指甲底物上，形成肽-毛發(fā)、肽-皮膚或肽-指甲復(fù)合物?？梢酝ㄟ^洗滌的方法將未結(jié)合的肽洗去。在將所有未結(jié)合的材料去掉后，可以通過使用具有不同嚴(yán)格性的緩沖液進(jìn)行選擇性洗滌，從而將對(duì)試驗(yàn)底物具有不同程度結(jié)合親和力的肽進(jìn)行分級(jí)。提高所使用緩沖液的嚴(yán)格性能夠提高肽-底物復(fù)合物中肽和底物的所需結(jié)合強(qiáng)度。
可以使用許多物質(zhì)來改變緩沖溶液在肽選擇中的嚴(yán)格性，包括，但不限于，酸性pH(1.5-3.0)；堿性pH(10-12.5)；高鹽濃度，如MgCl2(3-5M)和LiCl(5-10M)；水；乙二醇(25-50％)；二氧六環(huán)(5-20％)；硫氰酸鹽(1-5M)；胍(2-5M)；脲(2-8M)；和各種不同濃度的表面活性劑，如SDS(十二烷基硫酸鈉)、DOC(脫氧膽酸鈉)、Nonidet P-40、Triton X-100、Tween20，其中優(yōu)選Tween20。可以在下列緩沖溶液制備這些物質(zhì)，緩沖液包括，但不限于Tris-HCl、Tris緩沖的鹽水、Tris硼酸鹽、Tris乙酸、三乙胺、磷酸鹽緩沖液、和甘氨酸-HCl，其中優(yōu)選Tris緩沖的鹽水。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，通過使用具有較高嚴(yán)格性的緩沖液重復(fù)上述選擇過程，能夠洗脫得到對(duì)毛發(fā)、皮膚和指甲底物具有較高結(jié)合親和力的肽。洗脫后的肽用本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行鑒別和測(cè)序。
因此，使用了如下的方法用于生產(chǎn)本發(fā)明的毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽、或指甲-結(jié)合肽。將組合生成的噬菌體-肽文庫與目標(biāo)底物相接觸，底物具體的是毛發(fā)、皮膚或指甲樣品，形成噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚、噬菌體-肽-指甲復(fù)合物。從未復(fù)合的肽和未結(jié)合的底物分離得到噬菌體-肽-底物復(fù)合物，并從噬菌體-肽-底物復(fù)合物上洗脫得到結(jié)合的噬菌體-肽，優(yōu)選使用酸處理。然后，對(duì)洗脫后的肽進(jìn)行鑒別和測(cè)序。為了鑒別出與一種底物結(jié)合而不與另一種底物結(jié)合的肽序列，例如與毛發(fā)結(jié)合但不與皮膚結(jié)合的肽、或與皮膚結(jié)合但不與毛發(fā)結(jié)合的肽，在該方法中加入了消減淘選步驟。具體的是，首選將組合生成的噬菌體-肽文庫與非-靶相接觸，去掉與非-靶結(jié)合的噬菌體-肽。然后，將未結(jié)合的噬菌體-肽與所需的底物相接觸，之后繼續(xù)進(jìn)行上述方法?？蛇x擇的，可以將組合生成的噬菌體-肽文庫同時(shí)與非-靶和所需底物相接觸。然后，將噬菌體-肽-非-靶復(fù)合物與噬菌體-肽-底物復(fù)合物分離，之后對(duì)所需的噬菌體-肽-底物復(fù)合物實(shí)施上述方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種修改的噬菌體展示篩選方法，用于分離對(duì)毛發(fā)、皮膚或指甲具有較高親和力的肽。在該修改型方法中，首先按照上述方法形成噬菌體-肽-底物復(fù)合物。然后，用洗脫緩沖液處理上述復(fù)合物。可以使用任意的上述洗脫緩沖液。優(yōu)選的，洗脫緩沖液是一種酸性溶液。然后，將剩下的抗-洗脫的噬菌體-肽-底物復(fù)合物直接感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)ER2738。在合適的生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)感染的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)基如LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物涂布到瓊脂上，瓊脂包含適合的生長培養(yǎng)基，如含有IPTG(異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-GalTM的LB培養(yǎng)基。生長后，挑取菌斑用于DNA分離和測(cè)序，以鑒別出對(duì)毛發(fā)、皮膚或指甲底物具有高度結(jié)合親和力的肽序列。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使用了PCR技術(shù)來鑒別由上述修改型噬菌體展示篩選方法得到的抗-洗脫的噬菌體-肽，該技術(shù)使用合適的引物將上述噬菌體-肽-底物復(fù)合物直接進(jìn)行PCR，按照J(rèn)anssen等在美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976中所記載的方法，該文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引作參考。
使用上述方法，已經(jīng)鑒別出了毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽和指甲-結(jié)合肽。具體來說，所分離的對(duì)普通棕色毛發(fā)具有高度結(jié)合親和力的結(jié)合肽是SEQ ID NO3-18、28-38、40-56和64；對(duì)普通棕色毛發(fā)并抗洗發(fā)水的結(jié)合肽是SEQ ID NO66、69和70；對(duì)漂白毛發(fā)的結(jié)合肽是SEQ ID NO7、8、19-27、38-40、43、44、47、57、58和59；對(duì)手指甲的是SEQ ID NO53和60；對(duì)皮膚的是SEQ ID NO61。另外，發(fā)現(xiàn)手指甲-結(jié)合肽能夠與漂白毛發(fā)結(jié)合，因此可以用于本發(fā)明基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑和毛發(fā)著色劑中。能夠與手指甲結(jié)合的漂白毛發(fā)-結(jié)合肽同樣也可以應(yīng)用于本發(fā)明的基于肽的指甲著色劑中。
結(jié)合肽的生產(chǎn)可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法來制備本發(fā)明的結(jié)合肽，該方法是本領(lǐng)域公知的(參見如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL，1984；Bodanszky，Priniciples of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，New York，1984；和Pennington等，PeptideSynthesis Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，1994)。另外，許多公司能夠提供定做合成肽的服務(wù)。
可選擇的，可以使用重組DNA和分子克隆技術(shù)來制備本發(fā)明的肽。可以在異源宿主細(xì)胞，尤其是微生物宿主細(xì)胞中生成編碼毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽或指甲-結(jié)合肽的基因。
表達(dá)本發(fā)明結(jié)合肽的優(yōu)選異源宿主細(xì)胞是微生物宿主，該細(xì)胞廣泛發(fā)現(xiàn)于真菌或細(xì)菌家族中，并能夠在很寬的溫度、pH值和溶劑耐受性范圍內(nèi)生長。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)生物合成裝置均與細(xì)胞原料供給無關(guān)而是相同的，因此功能性基因的表達(dá)與用于生成細(xì)胞生物量的碳原料供給無關(guān)。宿主菌株的實(shí)例包括，但不限于，真菌或酵母物種，如曲霉屬(Aspergillus)、木霉菌屬(Trichoderma)、糖酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)，或細(xì)菌物種，如沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。
可以使用多種不同的表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)本發(fā)明的肽。這樣的載體包括，但不限于，染色體型載體、附加型載體和病毒衍生型載體，如衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、插入元件、酵母附加體、和病毒的載體，該病毒如桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及上述載體組合后得到的載體，如衍生自質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體遺傳因子的載體，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體可以包含調(diào)控區(qū)，其調(diào)節(jié)表達(dá)又促成表達(dá)。通常在這點(diǎn)上來說，任何適合在宿主細(xì)胞中維持、繁殖或表達(dá)多核苷酸或多肽的系統(tǒng)或載體都可以用于上述目的的表達(dá)。微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體包含調(diào)控序列，該調(diào)控序列應(yīng)當(dāng)能夠指導(dǎo)外源蛋白相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長進(jìn)行高水平的表達(dá)。這樣的調(diào)控序列對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，實(shí)例包括，但不限于，那些在對(duì)化學(xué)或物理刺激的反應(yīng)中能夠引起基因開啟或關(guān)閉表達(dá)反應(yīng)的調(diào)控序列，包括存在于載體中的調(diào)控元件，如增強(qiáng)子序列?？梢允褂蒙鲜鋈我庹{(diào)控序列構(gòu)建嵌合基因，以用于生產(chǎn)本發(fā)明任意的結(jié)合肽。然后，將上述嵌合基因通過轉(zhuǎn)化引入到合適的微生物中，從而使肽進(jìn)行高水平的表達(dá)。
用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞的載體或盒是本領(lǐng)域公知的。該載體或盒一般包含指導(dǎo)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、和能使自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體包含基因5’的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)，和DNA片段3’的轉(zhuǎn)錄終止控制區(qū)。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員均清楚，上述控制區(qū)沒有必要來自選作為生產(chǎn)宿主的特定物種的基因，但是上述兩個(gè)控制區(qū)來自與所要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因卻是本發(fā)明最優(yōu)選的。選擇標(biāo)記基因?yàn)檫x擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供了表型性狀，如大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
能夠用于驅(qū)動(dòng)嵌合基因在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子有多種，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實(shí)際上任意能夠驅(qū)動(dòng)基因的啟動(dòng)子都適合用于生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)合肽，啟動(dòng)子包括，但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母屬中的表達(dá))；AOX1(用于在畢赤氏酵母屬中的表達(dá))；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac和trc(用于在大腸桿菌中的表達(dá))；以及用于在芽孢桿菌屬中表達(dá)的amy、apr、npr啟動(dòng)子和各種噬菌體啟動(dòng)子。
終止控制區(qū)也可以來自優(yōu)選宿主的各種天然基因。任選的，沒有必要必須包含終止位點(diǎn)，但是包含終止位點(diǎn)的終止控制區(qū)則是最優(yōu)選的。
可以使用上述包含合適的DNA序列以及合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體，來轉(zhuǎn)化合適的宿主，以使宿主表達(dá)本發(fā)明的肽?？梢允褂脽o細(xì)胞翻譯系統(tǒng)來生產(chǎn)所述的肽，在該系統(tǒng)中使用來自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNAs。任選的，以轉(zhuǎn)化宿主的分泌產(chǎn)物的形式來生產(chǎn)本發(fā)明的基因產(chǎn)物。將所需的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，這有利于簡化純化過程并降低純化成本。本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知，分泌信號(hào)序列常被用于促進(jìn)表達(dá)蛋白穿過細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸。通過將一段編碼分泌信號(hào)的DNA序列整合到宿主中，從而構(gòu)建出能夠分泌的轉(zhuǎn)化宿主，其中所使用的分泌信號(hào)要能夠在生產(chǎn)宿主中起作用。選擇合適的信號(hào)序列的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見如EP 546049和WO 9324631)。分泌信號(hào)DNA或促進(jìn)子(facilitator)可以位于表達(dá)-控制DNA和本發(fā)明基因或基因片段之間，并且與后者處于相同的閱讀框。
基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑將毛發(fā)-結(jié)合肽(HBP)與毛發(fā)調(diào)理劑(HCA)相偶聯(lián)，從而形成本發(fā)明基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑。調(diào)理劑的毛發(fā)-結(jié)合肽部分能夠很強(qiáng)地與毛發(fā)結(jié)合，從而使調(diào)理劑能夠附著在毛發(fā)上，維持持久的調(diào)節(jié)效果。毛發(fā)-結(jié)合肽包括，但不限于，通過上述篩選方法選擇出的毛發(fā)-結(jié)合肽，其中包括本發(fā)明給出的毛發(fā)-結(jié)合肽序列SEQ ID NO3-59、64、66、69和70，最優(yōu)選SEQ ID NO46和SEQ ID NO66所示的肽，上述兩種肽與毛發(fā)具備很強(qiáng)的結(jié)合能力，但與皮膚則不具備。另外，可以使用任意已知的毛發(fā)-結(jié)合肽，包括但不限于SEQ ID NO1和SEQ IDNO76-98，上述肽分別描述在下列文獻(xiàn)中Janssen等，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976和Janssen等，WO04048399，上述文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引作參考。對(duì)于漂白毛發(fā)，可以使用SEQ ID NO60所示的手指甲-結(jié)合肽。
在本申請(qǐng)中定義的毛發(fā)調(diào)理劑是指能夠改善毛發(fā)外觀、質(zhì)地和光澤度，以及提高毛發(fā)體或柔度的試劑。在本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑中，可以使用任何已知的毛發(fā)調(diào)理劑。毛發(fā)調(diào)理劑在本領(lǐng)域是公知的，參見如本申請(qǐng)引作參考的文獻(xiàn)Green等(WO 0107009)，其可以通過各種途徑購買到。合適的毛發(fā)調(diào)理劑的例子包括，但不限于陽離子聚合物，如陽離子化的瓜耳樹膠、二烯丙基季銨鹽/丙烯酰胺共聚物、季銨化的聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、和各種聚季銨化合物；陽離子表面活性劑，如硬脂基二甲基芐基氯化銨(steralkoniumchloride)、centrimonium chloride、和Sapamin hydrochloride；脂肪族醇，如二十二醇；脂肪族胺，如硬脂族胺；蠟；酯；非離子聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、和聚乙二醇；聚硅氧烷；硅氧烷，如十甲基環(huán)戊硅氧烷；聚合物乳劑，如氨基封端二甲基聚硅氧烷(amodimethicone)；和膨脹(voluminizing)試劑，如脫乙酰殼多糖。本發(fā)明優(yōu)選的毛發(fā)調(diào)理劑包含胺或羥基功能基團(tuán)，以促進(jìn)與毛發(fā)-結(jié)合肽的偶聯(lián)，如在下面所述的。優(yōu)選的調(diào)理劑的實(shí)例是辛胺(CASNo.111-86-4)、硬脂胺(CAS No.124-30-1)、二十二醇(CAS No.661-19-8，Cognis Corp.，Cincinnati，OH)、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的聚硅氧烷(CAS No.68083-19-2)、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基聚硅氧烷(CAS No.68951-99-5)、羥基封端的硅氧烷、羥基封端的聚硅氧烷(CAS No.80801-30-5)、氨基修飾的聚硅氧烷衍生物、[(氨乙基)氨基]丙基羥基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羥基二甲基聚硅氧烷、α-十三烷基-ω-羥基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)(CAS No.24938-91-8)。
本發(fā)明基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑的制備，是將特異性毛發(fā)-結(jié)合肽與毛發(fā)調(diào)理劑共價(jià)附著，附著方式既可以直接附著也可以通過間隔物來附著?？梢允褂萌我庖阎碾幕虻鞍拙Y合化學(xué)方法，來形成本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑。綴合化學(xué)在本領(lǐng)域是已知的(參見如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))。合適的偶聯(lián)劑包括，但不限于，碳二亞胺偶聯(lián)劑、二價(jià)(dicuid)氯化物、二異氰酸酯和其它雙功能偶聯(lián)劑，其中雙功能偶聯(lián)劑既能與肽的胺末端和/或羧酸末端基團(tuán)反應(yīng)，又能與毛發(fā)調(diào)理劑的胺、羧酸或醇基團(tuán)反應(yīng)。優(yōu)選的偶聯(lián)劑是碳二亞胺偶聯(lián)劑，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N，N’-二環(huán)己基-碳二亞胺(DCC)，其可用于活化羧酸基團(tuán)與醇和胺基團(tuán)偶聯(lián)。另外，需要對(duì)肽上的反應(yīng)性胺或羧酸基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，以產(chǎn)生預(yù)期結(jié)構(gòu)的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑。氨基酸的保護(hù)性基團(tuán)，如叔丁氧羰基(t-Boc)的應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的(參見如上述Stewart等的文獻(xiàn)；上述Bodanszky的文獻(xiàn)；和上述Pennington等的文獻(xiàn))。在某些情況下需要在毛發(fā)調(diào)理劑上引入反應(yīng)基團(tuán)，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之偶聯(lián)到毛發(fā)-結(jié)合肽上?？梢詰?yīng)用常規(guī)的化學(xué)方法，如氧化作用、還原作用等，完成上述修飾，這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。
也可以通過間隔物使毛發(fā)-結(jié)合肽與毛發(fā)調(diào)理劑相偶聯(lián)。間隔物將肽和調(diào)理劑分隔開來，以確保調(diào)理劑不干擾肽對(duì)毛發(fā)的結(jié)合。間隔物可以是任意類型的分子，如基鏈、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等。優(yōu)選的間隔物是親水性的，鏈長從1到約100個(gè)原子，更優(yōu)選的，鏈長從2到約30個(gè)原子。優(yōu)選的間隔物的實(shí)例包括，但不限于，乙醇胺、乙二醇、鏈長為6個(gè)碳原子的聚乙烯、3-6個(gè)重復(fù)單元的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、和乙基烷基鏈、丙基烷基鏈、己基烷基鏈、硬脂基烷基鏈、十六烷基烷基鏈和棕櫚酰基烷基鏈。可以使用任意上述的化學(xué)偶聯(lián)方法，使間隔物共價(jià)附著到肽和毛發(fā)調(diào)理劑上。為了便于間隔物的整合，可以使用一種雙功能交聯(lián)劑，其包含間隔物和處于兩末端的反應(yīng)基團(tuán)，以使肽與調(diào)理劑相偶聯(lián)。合適的雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是公知的，包括但不限于雙胺，如1，6-二氨基己烷；二醛，如戊二醛；雙N-羥基琥珀酰亞胺酯，如乙二醇-雙(琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)、雙琥珀酰亞胺基戊二酸酯、雙琥珀酰亞胺基辛二酸酯、和乙二醇-雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)；二異氰酸酯，如1，6-己二異氰酸酯；雙環(huán)氧乙烷，如1，4亞丁基二環(huán)氧甘油醚；二羧酸，如琥珀酰雙水楊酸酯等。也可以使用異雙功能交聯(lián)劑，該試劑各個(gè)末端的反應(yīng)基團(tuán)是不同的。異雙功能交聯(lián)劑的實(shí)例包括，但不限于具有如下結(jié)構(gòu)的化合物 其中R1是H或是取代基，如-SO3Na、-NO2、或-Br；R2是間隔物，如-CH2CH2(乙基)、-(CH2)3(丙基)或-(CH2)3C6H5(丙基苯基)。上述異雙功能交聯(lián)劑的一個(gè)實(shí)例是3-馬來酰亞胺基丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。該試劑的N-羥基琥珀酰亞胺酯基團(tuán)與調(diào)理劑上的胺或醇基反應(yīng)，馬來酰亞胺基團(tuán)與肽上的硫羥反應(yīng)。通過在結(jié)合肽序列的至少一個(gè)末端附加上半胱氨酸基團(tuán)，從而在肽上摻入硫羥基團(tuán)?？梢栽诮Y(jié)合肽序列和末端半胱氨酸之間整合幾種間隔物氨基酸殘基，如甘氨酸，以將反應(yīng)性硫羥基團(tuán)與結(jié)合序列分隔開來。
另外，間隔物可以是由任意種類的氨基酸及其混合物組成的肽。優(yōu)選的肽間隔物是由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸及其混合物組成的。另外，肽間隔物可以包含特異性酶切割位點(diǎn)，如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3位點(diǎn)(SEQ ID NO65所示)，其用于將調(diào)理劑從毛發(fā)上通過酶促反應(yīng)進(jìn)行切除。肽間隔物可以是從1到約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選從1到約20個(gè)氨基酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法將上述肽間隔物連接到結(jié)合肽序列上。例如，可以使用前面所述的標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)來制備完整的結(jié)合肽-肽間隔物二嵌段物。另外，還可以使用碳二亞胺偶聯(lián)劑(參見如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))、二價(jià)氯化物、二異氰酸酯和其它雙功能偶聯(lián)劑將結(jié)合肽序列和肽間隔物連接起來，其中上述試劑能夠與肽上的胺末端和/或羧酸末端反應(yīng)?？蛇x擇的，可以使用前面所描述的重組DNA和分子克隆技術(shù)來制備完整的結(jié)合肽-肽間隔物二嵌段物。間隔物可以是肽間隔物和有機(jī)間隔物分子的組合，其可以通過上述方法制備。
可以將多個(gè)毛發(fā)-結(jié)合肽附著到毛發(fā)調(diào)理劑上，以增強(qiáng)基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑和毛發(fā)之間的相互作用?？梢允褂孟嗤l(fā)-結(jié)合肽的多個(gè)拷貝，或可以使用不同毛發(fā)-結(jié)合肽的組合。對(duì)于大型的調(diào)理劑顆粒(如乳劑顆粒)，可以在調(diào)理劑上附著上大量的毛發(fā)-結(jié)合肽，即直到約1,000個(gè)。對(duì)于較小的調(diào)理劑分子，則所附著的毛發(fā)-結(jié)合肽的數(shù)量較小，即直到約50個(gè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑是一種二嵌段組合物，其由毛發(fā)-結(jié)合肽(HBP)和毛發(fā)調(diào)理劑(HCA)組成，通式為(HBP)n-HCA，其中n從1到約1,000，優(yōu)選從1到約50。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑包含上述將毛發(fā)-結(jié)合肽與毛發(fā)調(diào)理劑分隔開來的間隔物(S)。可以將多個(gè)毛發(fā)-結(jié)合肽拷貝附著到一個(gè)間隔物分子上。在該實(shí)施方案中，基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑是一種三嵌段組合物，其由毛發(fā)-結(jié)合肽、間隔物和毛發(fā)調(diào)理劑組成，通式為[(HBP)m-S]n-HCA，其中n從1到約1,000，優(yōu)選n從1到約50，m從1到約50，優(yōu)選m從1到約10。
可以將本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑用于毛發(fā)護(hù)理的組合物中。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，毛發(fā)-結(jié)合肽本身也能作為調(diào)理劑來處理毛發(fā)。在本發(fā)明中，毛發(fā)護(hù)理組合物是指用于毛發(fā)處理的組合物，包括但不限于洗發(fā)水、調(diào)理劑、洗劑、氣霧劑、凝膠、摩絲和毛發(fā)染料，其在化妝可接受的介質(zhì)中包含有效量的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑或由不同的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑組成的混合物。在本發(fā)明中，用于毛發(fā)護(hù)理組合物的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑或毛發(fā)-結(jié)合肽的所謂的有效量是指相對(duì)于組合物的總重量，所占的比例為從約0.01％到約10％，優(yōu)選為約0.01％到約5％。毛發(fā)護(hù)理組合物中的化妝可接受介質(zhì)成分在下列文獻(xiàn)中有所描述，Philippe等，美國專利號(hào)6,280,747和Omura等，美國專利號(hào)6,139,851和Cannell等，美國專利號(hào)6,013,250，上述文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引作參考。例如，這些毛發(fā)護(hù)理組合物可以是水溶液、醇溶液或水-醇溶液，對(duì)于水-醇溶液，優(yōu)選的醇是乙醇或異丙醇，比例是總重量的約1到約75％。另外，毛發(fā)護(hù)理組合物還可以包含一種或多種常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)添加劑或佐劑，包括但不限于抗氧化劑、防腐劑、填料、表面活性劑、UVA和/或UVB防曬劑、香料、增稠劑、濕潤劑和陰離子、非離子或兩性聚合物、和染料或色素。
基于肽的皮膚調(diào)理劑將皮膚-結(jié)合肽(SBP)與皮膚調(diào)理劑(SCA)相偶聯(lián)，從而形成本發(fā)明基于肽的皮膚調(diào)理劑。調(diào)理劑的皮膚-結(jié)合肽部分能夠強(qiáng)有力地結(jié)合到皮膚上，從而使調(diào)理劑在皮膚上保持附著，從而產(chǎn)生持久的調(diào)節(jié)效果。皮膚-結(jié)合肽包括，但不限于通過上述篩選方法選擇得到的皮膚-結(jié)合肽，包括本發(fā)明SEQ ID NO61所示的皮膚-結(jié)合肽序列。另外，可以使用任意已知的皮膚-結(jié)合肽，包括但不限于SEQ ID NO2和SEQ ID NO99-104，上述肽分別描述在下列文獻(xiàn)中Janssen等，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976和Janssen等，WO 04048399。
在本申請(qǐng)中，所定義的皮膚調(diào)理劑包括，但不限于能夠使皮膚變緊的收斂劑；能夠去除皮膚死細(xì)胞的剝落劑(exfoliant)；能夠保持光滑、柔軟、柔韌表現(xiàn)的潤膚劑；能夠增加皮膚表層含水量的吸濕劑；能夠減慢水分從皮膚表面蒸發(fā)的封閉劑(occlusive)；和能夠增強(qiáng)干燥或損傷皮膚外觀或減少脫皮和恢復(fù)柔度的混和化合物。在本發(fā)明的基于肽的皮膚調(diào)理劑中，可以使用任何已知的皮膚調(diào)理劑。皮膚調(diào)理劑在本領(lǐng)域中是已知的，參見如上述Green等的文獻(xiàn)，并且是可以通過各種途徑購買到的。合適的皮膚調(diào)理劑的實(shí)例包括，但不限于α-羥基酸、β-羥基酸、多元醇、透明質(zhì)酸、D，L-泛醇、聚水楊酸酯、維生素A棕櫚酸酯、維生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、聚硅氧烷、聚硅氧烷衍生物、羊毛脂、天然油和甘油三酯。本發(fā)明優(yōu)選的皮膚調(diào)理劑是聚水楊酸酯、丙二醇(CAS No.57-55-6，Dow Chemical，Midland，MI)、甘油(CAS No.56-81-5，Proctor & Gamble Co.，Cincinnati，OH)、羥基乙酸(glycolic acid)(CAS No.79-14-1，DuPont Co.，Wilmington，DE)、乳酸(CAS No.50-21-5，Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、蘋果酸(CAS No.617-48-1，Alfa Aesar)、檸檬酸(CAS No.77-92-9，AlfaAesar)、酒石酸(CAS No.133-37-9，Alfa Aesar)、葡糖二酸(CASNo.87-73-0)、半乳糖二酸(CAS No.526-99-8)、3-羥基戊酸(CASNo.10237-77-1)、水楊酸(CAS No.69-72-7，Alfa Aesar)和1，3丙二醇(CAS No.504-63-2，DuPont Co.，Wilmington，DE)。根據(jù)White等，美國專利號(hào)4,855,483所描述的方法制備了聚水楊酸酯，上述文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引作參考?？梢允褂肕erbouh等描述的方法合成葡糖二酸(Carbohydr.Res.33675-78(2001)。3-羥基戊酸可以按照Bramucci在WO 02012530中所描述的方法來制備。
本發(fā)明的基于肽的皮膚調(diào)理劑的制備方法是，將特異性皮膚-結(jié)合肽與皮膚調(diào)理劑共價(jià)附著，附著方式既可以直接附著也可以通過間隔物來附著?？梢允褂萌我庖阎纳鲜雠悸?lián)方法。如上面所述，可以在皮膚調(diào)理劑上引入反應(yīng)基團(tuán)，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之偶聯(lián)到毛發(fā)-結(jié)合肽上。還可以將多個(gè)皮膚-結(jié)合肽附著到皮膚調(diào)理劑上，以增強(qiáng)基于肽的皮膚調(diào)理劑與皮膚之間的相互作用。可以使用相同皮膚-結(jié)合肽的多個(gè)拷貝，或可以使用不同皮膚-結(jié)合肽的組合。對(duì)于大型的調(diào)理劑顆粒，可以在調(diào)理劑上附著上大量的皮膚-結(jié)合肽，即直到約1,000個(gè)。對(duì)于較小的調(diào)理劑分子，則所附著的皮膚-結(jié)合肽的數(shù)量較小，即直到約50個(gè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的皮膚調(diào)理劑是一種二嵌段組合物，其由皮膚-結(jié)合肽(SBP)和皮膚調(diào)理劑(SCA)組成，通式為(SBP)n-SCA，其中n從1到約1,000，優(yōu)選從1到約50。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的皮膚調(diào)理劑包含上述將皮膚-結(jié)合肽與皮膚調(diào)理劑分隔開來的間隔物(S)。可以將多個(gè)皮膚-結(jié)合肽拷貝附著到一個(gè)間隔物分子上。在該實(shí)施方案中，基于肽的皮膚調(diào)理劑是一種三嵌段組合物，其由皮膚-結(jié)合肽、間隔物和皮膚調(diào)理劑組成，通式為[(SBP)m-S]n-SCA，其中n從1到約1,000，優(yōu)選n從1到約50，m從1到約50，優(yōu)選m從1到約10。
可以將本發(fā)明的基于肽的皮膚調(diào)理劑用于皮膚護(hù)理組合物中。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，皮膚-結(jié)合肽本身也能作為皮膚的調(diào)理劑來使用。在本發(fā)明中，皮膚護(hù)理組合物是指在化妝可接受的介質(zhì)中包含有效量的基于肽的皮膚調(diào)理劑或由不同的基于肽的皮膚調(diào)理劑組成的混合物的組合物。所使用的這些組合物包括，但不限于皮膚護(hù)理、皮膚清潔、化妝和抗皺紋產(chǎn)品。在本發(fā)明中，用于皮膚護(hù)理組合物的基于肽的皮膚調(diào)理劑或皮膚-結(jié)合肽的所謂的有效量是指相對(duì)于組合物的總重量，所占的比例為從約0.001％到約10％，優(yōu)選為約0.01％到約5％。該比例可以作為皮膚護(hù)理組合物的不同類型的函數(shù)而加以改變。合適的化妝可接受介質(zhì)組合物在上述Philippe等的文獻(xiàn)中有所描述。例如，化妝可接受介質(zhì)可以是一種無水的組合物，其包含占組合物總重量比例通常從約10％到90％的脂肪物質(zhì)，其中脂相包含至少一種液體脂肪物質(zhì)、固體脂肪物質(zhì)或半固體脂肪物質(zhì)。脂肪物質(zhì)包括，但不限于油、蠟、樹膠和所謂的糊狀脂肪物質(zhì)?？蛇x擇的，組合物可以是一種穩(wěn)定的分散體，如油包水或水包油乳劑。另外組合物可以包含一種或多種常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)添加劑或佐劑，包括但不限于抗氧化劑、防腐劑、填料、表面活性劑、UVA和/或UVB防曬劑、香料、增稠劑、濕潤劑和陰離子、非離子或兩性聚合物、和染料或色素。
基于肽的毛發(fā)著色劑通過將毛發(fā)-結(jié)合肽(HBP)與著色劑(C)相偶聯(lián)，從而形成本發(fā)明基于肽的毛發(fā)著色劑?；陔牡拿l(fā)著色劑的毛發(fā)-結(jié)合肽部分可以與毛發(fā)強(qiáng)有力地結(jié)合，從而能夠使著色劑在毛發(fā)上保持附著時(shí)間，從而能夠產(chǎn)生持久的毛發(fā)著色效果。毛發(fā)-結(jié)合肽包括，但不限于通過上述篩選方法選擇出的毛發(fā)-結(jié)合肽，其中包括本發(fā)明給出的毛發(fā)-結(jié)合肽序列SEQ ID NO3-59、64、66、69和70，最優(yōu)選SEQ ID NO46和SEQ ID NO66所示的肽，上述兩種肽與毛發(fā)具備很強(qiáng)的結(jié)合能力，但與皮膚則不具備。另外，可以使用任意已知的毛發(fā)-結(jié)合肽，包括但不限于SEQ ID NO1和SEQ ID NO76-98，上述肽分別描述在下列文獻(xiàn)中Janssen等，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976和Janssen等，WO04048399。對(duì)于漂白毛發(fā)，可以使用SEQ ID NO60所示的手指甲-結(jié)合肽。
在本申請(qǐng)中，著色劑是指能夠用于改變毛發(fā)、皮膚或指甲顏色的任何染料和色素等。在本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)著色劑中，可以使用任何已知的著色劑。毛發(fā)著色劑在本領(lǐng)域是公知的(參見上述Green等的文獻(xiàn)，CFTA International Color Handbook，2nded.，Micelle Press，England(1992)和Cosmetic Handbook，US Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA/IAS Booklet(1992))，并且是可以通過各種途徑購買到的(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，奧地利；BASF，MountOlive，NJ；和Hoechst，F(xiàn)rankfurt，德國)。合適的毛發(fā)著色劑包括，但不限于染料，如4-羥基丙氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-對(duì)苯二胺、N，N-羥乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、指甲花、HC Blue1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、HC Blue 7、HC Blue 12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HC Yellow 12、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&C Yellow 3、D&C Blue 1、Disperse Blue3、Disperse violet 1、伊紅衍生物如D&C Red No.21和鹵化熒光素衍生物如D&C Red No.27、與D&C Red No.21和D&C Orange No.10組合的D&C Red Orange No.5；和色素，如D&C Red No.36和D&C OrangeNo.17、D&C Red No.7、11、31和34的鈣色淀、D&C Red No.12的鋇色淀、D&C Red No.13的鍶色淀、FD&C Yellow No.5、FD&C YellowNo.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21、和FD&C Blue No.1的鋁色淀、氧化鐵、錳紫(manganese violet)、氧化鉻、二氧化鈦、氧化鋅、氧化鋇、群青色、檸檬酸鉍和炭黑顆粒。本發(fā)明優(yōu)選的毛發(fā)著色劑是D&C Yellow 1和3、HC Yellow 6和8、D&C Blue 1、HC Blue 1、HCBrown 2、HC Red 5、2-硝基對(duì)苯二胺、N，N-羥乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚和炭黑。
金屬和半導(dǎo)體納米顆粒也可以被用作毛發(fā)著色劑，這是因?yàn)樗鼈兙哂泻軓?qiáng)的發(fā)光作用(Vic等，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2004/0010864)?！凹{米顆?！笔侵钙骄皆?到100nm之間的金屬或半導(dǎo)體顆粒。優(yōu)選的，顆粒的平均粒徑在約1到40nm之間。在本發(fā)明中所使用的“顆粒尺寸”和“粒徑”含義是相同的。金屬納米顆粒包括，但不限于金顆粒、銀顆粒、鉑顆粒、鈀顆粒、銥顆粒、銠顆粒、鋨顆粒、鐵顆粒、銅顆粒、鈷顆粒和由上述金屬組成的合金?！昂辖稹笔侵竷煞N或更多種金屬的均一混合物?！鞍雽?dǎo)體納米顆粒”包括，但不限于硒化鎘、硫化鎘、硫化銀、硫化鎘、氧化鋅、硫化鋅、硒化鋅、硫化鉛、砷化鎵、硅、氧化錫、氧化鐵和磷化銦。使用合適的有機(jī)包衣或單層使納米顆粒穩(wěn)定并具備水溶性。在本申請(qǐng)中，單層-保護(hù)的納米顆粒是一類穩(wěn)定的納米顆粒。制備穩(wěn)定的、水溶性金屬和半導(dǎo)體納米顆粒的方法是本領(lǐng)域已知的，描述在下列文獻(xiàn)中Huang等，共同未決的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/622889，在此引作參考。納米顆粒的顏色與顆粒尺寸有關(guān)。因此，通過控制納米顆粒的尺寸，可以獲得不同的顏色。例如，ZnS-包衣的CdSe納米顆粒在顆粒尺寸2到6nm內(nèi)時(shí)，其顏色覆蓋了整個(gè)可見光光譜。具體來說，CdSe納米顆粒核心尺寸分別為2.3、4.2、4.8和5.5nm時(shí)，其發(fā)射光的波長分別集中為485、565、590和625nm。按照上述Huang的尺寸分級(jí)方法，從較寬尺寸分布的納米顆粒中，可以獲得不同尺寸的水溶性納米顆粒。該方法包含在存在一種電解質(zhì)的情況下，有調(diào)節(jié)地向納米顆粒溶液中加入易溶于水的有機(jī)溶劑。易溶于水的有機(jī)溶劑所加入的量越高，所得到的納米顆粒沉淀中納米顆粒的尺寸就越小。
本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)著色劑的制備方法是，將特異性毛發(fā)-結(jié)合肽與著色劑共價(jià)附著，附著方式既可以是直接附著，也可以是通過間隔物來附著?？梢允褂蒙鲜鋈我馀悸?lián)方法?？赡苄枰谥珓┥弦敕磻?yīng)基團(tuán)，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之與毛發(fā)-結(jié)合肽相偶聯(lián)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的常規(guī)化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)上述修飾。例如，使用硝酸、過氧化物，如過氧化氫，或無機(jī)起始物，如過硫酸銨，氧化炭黑顆粒的表面，從而產(chǎn)生功能化基團(tuán)。優(yōu)選的，按照Carrasco-Marin等(J.Chem.Soc.，F(xiàn)araday Trans.932211-2215(1997))描述的方法，使用過硫酸銨氧化炭黑的表面。使用無機(jī)起始物，如2，2’-偶氮二(2-甲基丙酰胺)-二鹽酸化物，能夠在炭黑表面引入氨基功能團(tuán)。無機(jī)色素和納米顆粒也可以通過類似的方法進(jìn)行衍生化以引入羧酸或氨基功能團(tuán)。
根據(jù)需要，可以將多個(gè)毛發(fā)-結(jié)合肽附著到著色劑上，以增強(qiáng)基于肽的毛發(fā)著色劑與毛發(fā)之間的相互作用?？梢允褂孟嗤l(fā)-結(jié)合肽的多個(gè)拷貝，或可以使用不同毛發(fā)-結(jié)合肽的組合。對(duì)于尺寸較大的色素顆粒，可以在色素上附著較多數(shù)量的毛發(fā)-結(jié)合肽，即直至約10,000個(gè)。對(duì)于尺寸較小的染料分子，則所附著的毛發(fā)-結(jié)合肽數(shù)量較少，即直至約50個(gè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的毛發(fā)著色劑是一種二嵌段組合物，其由毛發(fā)-結(jié)合肽(HBP)和著色劑(C)組成，通式為(HBP)n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，如上面所述，基于肽的毛發(fā)著色劑包含一種間隔物(S)，其將結(jié)合肽和毛發(fā)著色劑分隔開來?？梢栽谝粋€(gè)間隔物分子上附著上多個(gè)拷貝的毛發(fā)-結(jié)合肽。在該實(shí)施方案中，基于肽的毛發(fā)著色劑是一種三嵌段的組合物，其由毛發(fā)-結(jié)合肽、間隔物和著色劑組成，通式為[(HBP)m-S]n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500，并且m從1到約50，優(yōu)選m從1到約10。
本發(fā)明的基于肽的毛發(fā)著色劑可以用于染發(fā)的毛發(fā)著色組合物中。在本申請(qǐng)中，毛發(fā)著色組合物是指用于毛發(fā)著色、染色或漂白的組合物，其在化妝可接受的介質(zhì)中包含有效量的基于肽的毛發(fā)著色劑或不同基于肽的毛發(fā)著色劑的組合。在毛發(fā)著色組合物中所使用的基于肽的毛發(fā)著色劑的有效量是指占組合物總重量的從約0.001％到約20％。在毛發(fā)著色組合物中所使用的化妝可接受介質(zhì)成分在下列文獻(xiàn)中有所描述Dias等，美國專利號(hào)6,398,821和Deutz等，美國專利號(hào)6,129,770，上述文獻(xiàn)在此引作參考。例如，毛發(fā)著色組合物可以包含鰲合劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、緩沖液、載體、表面活性劑、溶劑、抗氧化劑、聚合物和調(diào)理劑。調(diào)理劑包括本發(fā)明基于肽的調(diào)理劑和毛發(fā)-結(jié)合肽，其在毛發(fā)著色組合物中占總重量的約0.01％到約10％，優(yōu)選約0.01％到約5％。
本發(fā)明基于肽的毛發(fā)著色劑還可以作為著色劑用于化妝組合物中，其中化妝組合物是施用到睫毛或眉毛上的，包括但不限于，睫毛膏和眉筆。它們可以是包含化妝可接受介質(zhì)的無水化妝產(chǎn)品，該介質(zhì)所包含的脂肪物質(zhì)的含量通常占組合物總重量的從約10％到約90％，其脂相如上所述包含至少一種液體脂肪物質(zhì)、固體脂肪物質(zhì)或半固體脂肪物質(zhì)。脂肪物質(zhì)包括，但不限于，油、蠟、樹膠和所謂的糊狀脂肪物質(zhì)?？蛇x擇的，如上所述，上述組合物可以是一種穩(wěn)定的分散體形式，如油包水或水包油乳劑。在上述組合物中，基于肽的毛發(fā)著色劑的比例通常占組合物總重量的從約0.001％到約20％。
基于肽的指甲著色劑通過將指甲-結(jié)合肽(NBP)與著色劑(C)相偶聯(lián)，從而形成本發(fā)明基于肽的指甲著色劑?；陔牡闹讣字珓┑闹讣?結(jié)合肽部分可以與手指甲或腳趾甲強(qiáng)有力地結(jié)合，從而能夠使著色劑在指甲上保持附著，從而產(chǎn)生持的著色效果。指甲-結(jié)合肽包括，但不限于通過上述篩選方法持選擇出的指甲-結(jié)合肽，其中包括本發(fā)明給出的指甲-結(jié)合肽序列SEQ ID NO53和60，最優(yōu)選SEQ ID NO60所示的肽。另外，還可以使用SEQ ID NO7、8、19-27、38、39、40、43-45、47、57、58和59所示的漂白毛發(fā)-結(jié)合肽。
本發(fā)明基于肽的指甲著色劑的制備方法是，將特異性指甲-結(jié)合肽與著色劑共價(jià)附著，附著方式既可以是直接附著，也可以是通過間隔物來附著。在本發(fā)明基于肽的指甲著色劑中，可以使用前面所述的任意一種著色劑。在本發(fā)明基于肽的指甲著色劑中，優(yōu)選使用的著色劑包括D&C Red No.8、10、30和36，D&C Red No.6、9、和12的鋇色淀，D&C Red No.7、11、31和34的鈣色淀，D&C Red No.30、D&COrange No.17和D&C Blue No.6的鍶色淀。
還可以將多個(gè)指甲-結(jié)合肽附著到著色劑上，以增強(qiáng)基于肽的指甲著色劑與指甲之間的相互作用?？梢允褂孟嗤讣?結(jié)合肽的多個(gè)拷貝，或可以使用不同指甲-結(jié)合肽的組合。對(duì)于尺寸較大的色素顆粒，可以在色素顆粒上附著較多數(shù)量的指甲-結(jié)合肽，即直至約10,000個(gè)。對(duì)于尺寸較小的染料分子，則所附著的指甲-結(jié)合肽數(shù)量較少，即直至約50個(gè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的指甲著色劑是一種二嵌段組合物，其由指甲-結(jié)合肽(NBP)和著色劑(C)組成，通式為(NBP)n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，如上面所述，基于肽的指甲著色劑包含一種間隔物(S)，其將結(jié)合肽和著色劑分隔開來。可以在一個(gè)間隔物分子上附著上多個(gè)拷貝的指甲-結(jié)合肽。在該實(shí)施方案中，基于肽的指甲著色劑是一種三嵌段的組合物，其由指甲-結(jié)合肽、間隔物和著色劑組成，通式為[(NBP)m-S]n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500，并且m從1到約50，優(yōu)選m從1到約10。
本發(fā)明基于肽的指甲著色劑可以用于將手指甲和腳趾甲著色的指甲油組合物中。在本申請(qǐng)中，指甲油組合物是指用于處理和將指甲著色的組合物，其在化妝可接受基質(zhì)中包含有效量的基于肽的指甲著色劑或不同的基于肽的指甲著色劑組成的混合物。在本發(fā)明中，用于指甲油組合物的基于肽的指甲著色劑所謂的有效量是指相對(duì)于組合物的總重量，所占的比例為從約0.001％到約20％。上述Philippe等的文獻(xiàn)描述了用在指甲油組合物中的化妝可接受介質(zhì)成分。一般的，指甲油組合物包含溶劑和成膜物質(zhì)，如纖維素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸類聚合物或共聚物、乙烯類共聚物和聚酯類聚合物。另外，指甲油組合物中還可以包含增塑劑，如磷酸三甲苯酯、苯甲酸芐酯、磷酸三丁酯、乙酰蓖酸丁酯、檸檬酸三乙酯、乙酰檸檬酸三丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯或樟腦。
基于肽的皮膚著色劑通過將皮膚-結(jié)合肽(SBP)與著色劑(C)相偶聯(lián)，從而形成本發(fā)明基于肽的皮膚著色劑?；陔牡钠つw著色劑的皮膚-結(jié)合肽部分可以與皮膚強(qiáng)有力地結(jié)合，從而能夠使著色劑在皮膚上保持附著，從而能夠產(chǎn)生持久的皮膚著色效果。皮膚-結(jié)合肽包括，但不限于通過上述篩選方法選擇出的皮膚-結(jié)合肽，其中包括本發(fā)明給出的皮膚-結(jié)合肽序列SEQ ID NO61。另外，還可以使用任何已知的皮膚-結(jié)合肽，包括但不限于SEQ ID NO2和SEQ ID NO99-104，上述肽分別描述在下列文獻(xiàn)中Janssen等，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0152976和Janssen等，WO04048399。
本發(fā)明基于肽的皮膚著色劑的制備方法是，使用前面所述的任意偶聯(lián)方法，將特異性皮膚-結(jié)合肽與著色劑共價(jià)附著，附著方式既可以是直接附著，也可以是通過間隔物來附著?？梢允褂们懊嫠龅娜我庖环N著色劑。在本發(fā)明基于肽的皮膚著色劑中，優(yōu)選使用的著色劑包括如下的染料伊紅衍生物如D&C Red No.21和鹵化熒光素衍生物如D&C Red No.27、與D&C Red No.21和D&C Orange No.10組合的D&CRed Orange No.5；和色素二氧化鈦、氧化鋅、D&C Red No.36和D&COrange No.17、D&C Red No.7、11、31和34的鈣色淀、D&C Red No.12的鋇色淀、D&C Red No.13的鍶色淀、FD&C Yellow No.5、FD&C YellowNo.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21、和FD&C Blue No.1的鋁色淀、氧化鐵、錳紫、氧化鉻、群青色和炭黑。著色劑還可以是一種不曬太陽的褐色化劑(tanning agent)，如二羥基丙酮，其能夠使皮膚不經(jīng)過日曬就能夠獲得褐色外表。
還可以將多個(gè)皮膚-結(jié)合肽附著到著色劑上，以增強(qiáng)基于肽的皮膚著色劑與皮膚之間的相互作用?？梢允褂孟嗤つw-結(jié)合肽的多個(gè)拷貝，或可以使用不同皮膚-結(jié)合肽的組合。對(duì)于尺寸較大的色素顆粒，可以在色素顆粒上附著較多數(shù)量的皮膚-結(jié)合肽，即直至約10,000個(gè)。對(duì)于尺寸較小的染料分子，則所附著的皮膚-結(jié)合肽數(shù)量較少，即直至約50個(gè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于肽的皮膚著色劑是一種二嵌段組合物，其由皮膚-結(jié)合肽(SBP)和著色劑(C)組成，通式為(SBP)n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，如上面所述，基于肽的皮膚著色劑包含一種間隔物(S)，其將結(jié)合肽和著色劑分隔開來?？梢栽谝粋€(gè)間隔物分子上附著上多個(gè)拷貝的皮膚-結(jié)合肽。在該實(shí)施方案中，基于肽的皮膚著色劑是一種三嵌段組合物，其由皮膚-結(jié)合肽、間隔物和著色劑組成，通式為[(SBP)m-S]n-C，其中n從1到約10,000，優(yōu)選n從1到約500，并且m從1到約50，優(yōu)選m從1到約10。
本發(fā)明基于肽的皮膚著色劑可以作為著色劑用于化妝產(chǎn)品中，包括但不限于，粉底、腮紅(bluoh)、唇膏、唇線筆(lip liner)、潤唇膏、眼影和眼線膏。它們可以是包含化妝可接受介質(zhì)的無水化妝產(chǎn)品，其中介質(zhì)中包含了脂肪物質(zhì)，或者它們是如上所述的穩(wěn)定的分散體形式，如油包水或水包油乳劑。在上述組合物中，基于肽的皮膚著色劑的比例通常占組合物總重量的從約0.001％到約40％。
處理毛發(fā)、皮膚和指甲的方法在另外一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用本發(fā)明基于肽的調(diào)理劑和著色劑處理毛發(fā)、皮膚和指甲的方法。具體來說，本發(fā)明還包含在皮膚、毛發(fā)或唇上形成基于肽的調(diào)理劑保護(hù)膜的方法，具體步驟是將上述包含有效量的基于肽的皮膚調(diào)理劑或基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑的組合物施用到皮膚、毛發(fā)或唇上，然后使之形成保護(hù)膜?？梢酝ㄟ^各種方法將本發(fā)明的組合物施用到皮膚、毛發(fā)或唇上，包括但不限于，噴霧、用刷子涂抹和用手施用。使基于肽的調(diào)理劑組合物與皮膚、毛發(fā)或唇接觸一段足夠的時(shí)間，以形成保護(hù)膜，優(yōu)選接觸至少約0.1到60分鐘。
本發(fā)明還提供了將毛發(fā)進(jìn)行著色的方法，步驟是利用前面所述方法，將包含有效量基于肽的毛發(fā)著色劑的毛發(fā)著色組合物施用到毛發(fā)上。使毛發(fā)著色組合物與毛發(fā)接觸一段足夠的時(shí)間，以使毛發(fā)著色，優(yōu)選在約5分鐘到約50分鐘之間，然后將毛發(fā)著色組合物從毛發(fā)上漂洗掉。
本發(fā)明還提供了對(duì)皮膚或唇進(jìn)行著色的方法，步驟是利用前面所述的方法，將包含有效量基于肽的皮膚著色劑的皮膚著色組合物施用到皮膚或唇上。
本發(fā)明還提供了對(duì)手指甲或腳趾甲進(jìn)行著色的方法，步驟是利用前面所述的方法，將包含有效量基于肽的指甲著色劑的指甲油組合物施用到手指甲或腳趾甲上。
本發(fā)明還提供了對(duì)眉毛和睫毛進(jìn)行著色的方法，步驟是利用前面所述的方法，將包含有效量基于肽的毛發(fā)著色劑的化妝組合物施用到眉毛和睫毛上。
實(shí)施例下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例，是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，僅用作實(shí)例。根據(jù)上述描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠掌握本發(fā)明的基本特征，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，能夠?qū)Ρ景l(fā)明作出各種改變和修改，以滿足各種應(yīng)用和需要。
在本發(fā)明中所使用的縮寫的意思如下“min”表示分鐘、“sec”表示秒、“h”表示小時(shí)、“μL”微升、“mL”表示毫升、“L”表示升、“nm”表示納米、“mm”表示毫米、“cm”表示厘米、“μm”表示微米、“mM”表示毫摩爾的、“M”表示摩爾的、“mmol”表示毫摩爾、“μmole”表示微摩爾、“g”表示克、“μg”表示微克、“mg”表示毫克、“g”表示萬有引力常數(shù)、“rpm”表示每分鐘的旋轉(zhuǎn)次數(shù)、“pfu”表示蝕斑形成單位、“BSA”表示牛血清清蛋白、“ELISA”表示酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、“IPTG”表示異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷、“A”表示吸光度、“A450”表示在450nm下測(cè)定的吸光率、“TBS”表示Tris緩沖鹽水、“TBST-X”表示包含Tween20的Tris緩沖鹽水，其中“X”是Tween20的重量百分比、“Xgal”表示5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷、“ESCA”表示光電子能譜、“eV”表示電子伏特、“TGA”表示熱解重量分析法、“GPC”表示凝膠滲透色譜法、“MW”表示分子量、“Mw”表示重均分子量、“vol％”表示體積百分比。
常規(guī)方法實(shí)施例中所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中的公知技術(shù)，在下列文獻(xiàn)中有所描述，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989；T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；和Ausubel，F(xiàn).M.等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience，N.Y.，1987。
適用于細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法也是本領(lǐng)域中公知的技術(shù)。下面實(shí)施例所使用的技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有所描述Manual ofMethods for General Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Kriey和G.Briggs Phillips，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994，或者Thomas D.Brock，BiotechnologyATextbook of Industrial Microbiology，Second Edition，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，1989。除非另有說明，所有的試劑、限制性內(nèi)切酶和用于生長和維持細(xì)菌細(xì)胞的材料均購自AldrichChemicals(Milwaukee，Wl)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
實(shí)施例1使用標(biāo)準(zhǔn)的生物淘選技術(shù)選擇毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽該實(shí)施例的目的是利用標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示生物淘選技術(shù)來鑒別能夠與普通毛發(fā)和經(jīng)漂白的毛發(fā)結(jié)合的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽。
噬菌體展示肽文庫本發(fā)明所使用的噬菌體文庫，Ph.D.-12TM噬菌體展示肽文庫試劑盒和Ph.D.-7TM噬菌體展示文庫試劑盒，均購自New England BioLabs(Beverly，MA)。上述試劑盒是7或12聚的隨機(jī)肽組合文庫，其中隨機(jī)肽融合到噬菌體M13的一個(gè)較小的外殼蛋白(pIII)上。所要展示的肽位于pIII的N-末端，因此在切除信號(hào)肽后，外殼蛋白的首位殘基即是所要展示的肽的第一位殘基。Ph.D.-7和Ph.D.-12文庫分別由大約2.8×109和2.7×109個(gè)序列組成。對(duì)于每個(gè)肽序列來說，10μL的上述文庫包含大約55個(gè)拷貝。每次試驗(yàn)的初始循環(huán)均使用制造商提供的起始文庫，目的是為了避免給試驗(yàn)結(jié)果造成偏差。
毛發(fā)樣品的制備所使用的普通毛發(fā)樣品為6-英寸的中等棕色的人毛發(fā)，來自International Hair Importers and Products(Bellerose，NY)。將毛發(fā)放置在90％的異丙醇中，室溫放置30分鐘，然后用去離子水洗滌5次，每次10分鐘。最后將處理后的毛發(fā)室溫下風(fēng)干過夜。
對(duì)于制備漂白的毛發(fā)樣品，方法是將中等棕色的人毛發(fā)放置在6％的H2O2中，H2O2預(yù)先用氫氧化銨將pH值調(diào)到10.2，室溫放置10分鐘，然后用去離子水洗滌5次，每次10分鐘。最后將處理后的毛發(fā)室溫下風(fēng)干過夜。
將普通毛發(fā)樣品和漂白的毛發(fā)樣品剪成0.5-1厘米的長度，然后將大約5-10mg的毛發(fā)樣品放置于定做的24孔生物淘選裝置的孔中，該裝置的底部有一層豬皮。留出相同數(shù)量的帶有豬皮底的空孔。該帶有豬皮底的裝置作為一種消減反應(yīng)，可以去除對(duì)皮膚具有親和力的噬菌體-肽。該裝置是通過修改斑點(diǎn)印跡裝置(來自Schleicher & Schuell，Keene，NH)而生成的，以適應(yīng)生物淘選過程的需要。具體來說，是將斑點(diǎn)印跡裝置上部的96孔板換成24孔板。在24孔板的底物放置一塊4×6英寸的經(jīng)處理的豬皮，然后將該裝置繃緊，形成底部帶有豬皮的淘選孔。豬皮購自當(dāng)?shù)氐囊患页?，?chǔ)存溫度為-80℃。在使用前，將豬皮放置在去離子水中解凍，然后用紙巾吸干。用90％的異丙醇擦拭豬皮表面，然后用去離子水漂洗。將24孔裝置注滿封閉緩沖液，緩沖液的組成為1mg/mL BSA的TBST溶液，并含有0.5％的Tween20(TBST-0.5％)，4℃下溫育1小時(shí)?？缀兔l(fā)用TBST-0.5％洗滌5次。每個(gè)孔加入1毫升含有1mg/mL BSA的TBST-0.5％。然后，向帶有豬皮底的孔中加入10μL的起始噬菌體文庫(2×1011pfu)(12聚的文庫、或者7聚的文庫)，其中孔中不含有毛發(fā)樣品，噬菌體文庫在室溫下溫育15分鐘。然后將沒有結(jié)合的噬菌體轉(zhuǎn)移到含有毛發(fā)樣品的帶豬皮底的孔中，并在室溫下溫育15分鐘。將毛發(fā)樣品和孔用TBST-0.5％洗滌10次。然后將毛發(fā)轉(zhuǎn)移到潔凈的24孔板的塑料底孔中，每孔中加入1mL的非特異性洗脫緩沖液，該緩沖液組成為1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH為2.2，然后溫育10分鐘以洗脫結(jié)合噬菌體。然后，每孔中加入160μL中和緩沖液，緩沖液組成為1M Tris-HCl，pH為9.2。將每孔中洗脫后的噬菌體轉(zhuǎn)移到新的試管中，用于滴度測(cè)定和測(cè)序。
為了測(cè)定結(jié)合噬菌體的滴度，將洗脫后的噬菌體用SM緩沖液(100mM NaCl，12.3mM MgSO4-7H2O，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.01wt/vol％明膠)稀釋，以制備101到104的連續(xù)10倍稀釋液。每種稀釋液取10μL等分試樣，與200μL對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌ER2738(NewEngland BioLabs)一起溫育，在LB培養(yǎng)基上生長20分鐘，然后在45℃下與3mL上層瓊脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％瓊脂糖的LB培養(yǎng)基)混合。將混合物涂布到S-GalTM/LB瓊脂板上(Sigma ChemicalCo.)，在37℃培養(yǎng)過夜。S-GalTM/LB瓊脂混和物包含5g的胰蛋白胨、2.5g的酵母提取物、5g的氯化鈉、6g的瓊脂、150mg的3，4-環(huán)乙烯七葉亭(cydohexeno-esculetin)-β-半乳吡喃糖苷(S-GalTM)、250mg的檸檬酸鐵銨和15mg的異丙醇β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，溶解在500mL的蒸餾水中。在制備平板時(shí)，將上述S-GalTM/LB在121-124℃高壓滅菌15-20分鐘。隨機(jī)挑選單個(gè)的黑色噬菌斑用于DNA分離和測(cè)序分析。
剩余的洗脫后的噬菌體通過與稀釋后的大腸桿菌ER2738一起培養(yǎng)來擴(kuò)增，在37℃培養(yǎng)4.5小時(shí)，其中的大腸桿菌ER2738是以1∶100的比例稀釋在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)獲得的。之后，將細(xì)胞培養(yǎng)物離心30秒，將上層80％的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中，加入1/6體積的PEG/NaCl(20％的聚乙二醇-800、2.5M的氯化鈉)，在4℃過夜，使噬菌體沉淀。在4℃、10,000xg下離心，收集沉淀物，將收集到的沉淀重懸浮在1mL的TBS中。這即為第一輪的擴(kuò)增原液。然后根據(jù)與上述相同的方法測(cè)定第一輪噬菌體擴(kuò)增原液的滴度。在第二輪的生物淘選中，使用多于2×1011pfu的第一輪噬菌體原液。根據(jù)試驗(yàn)的需要，重復(fù)3-6次上述生物淘選過程。
根據(jù)制造商(New England Labs)的使用說明書來制備單噬菌斑裂解物，并使用QIAprep Spin M13試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化噬菌體單鏈基因組DNA，并使用96gIII測(cè)序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’)在DuPont測(cè)序儀上測(cè)序，其中引物的序列如SEQ ID NO62所示。所要展示的肽直接定位于基因III信號(hào)肽的后面。
在第五輪生物淘選中分離到的來自12聚文庫的洗脫的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列，顯示在表1中。在第五輪生物淘選中分離到的來自12聚文庫的洗脫的漂白毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列，顯示在表2中。在第三輪生物淘選中分離到的來自95個(gè)隨機(jī)選擇的克隆的7聚文庫的洗脫的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的重復(fù)氨基酸序列，顯示在表3中。
表1來自12聚文庫的洗脫的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
1頻率代表在23個(gè)測(cè)序的克隆中所出現(xiàn)的相同序列的數(shù)目。
表2來自12聚文庫的洗脫的漂白毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
1頻率代表在24個(gè)測(cè)序的克隆中所出現(xiàn)的相同序列的數(shù)目。
表3來自7聚文庫的洗脫的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
1在這些克隆中插入了多重DNA片段。
實(shí)施例2使用修改的方法選擇具有高度親和力的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽。
本實(shí)施例的目的是鑒別具有較高結(jié)合親和力的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽。
按照實(shí)施例1中所描述的，用酸性洗脫緩沖液處理毛發(fā)，用洗脫緩沖液洗滌時(shí)，比實(shí)施例1多洗滌3次，然后用TBST-0.5％洗滌3次。將抗酸的噬菌體肽仍然附著在其上的這些毛發(fā)直接感染500μL對(duì)數(shù)中期的細(xì)菌宿主細(xì)胞大腸桿菌ER2738(New England BioLabs)，然后在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20分鐘，然后在45℃下與3mL上層瓊脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％瓊脂糖的LB培養(yǎng)基)混合。將混合物涂布到LB培養(yǎng)基/IPTG/S-GalTM板上(LB培養(yǎng)基中含有15g/L的瓊脂、0.05g/L的IPTG和0.04g/L的S-GalTM)，在37℃培養(yǎng)過夜。對(duì)單個(gè)黑色噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，以計(jì)算噬菌體滴度。按照實(shí)施例1所描述的，隨機(jī)挑取單個(gè)黑色噬菌斑用于DNA分離和測(cè)序分析。按照實(shí)施例1中所描述的，對(duì)用7聚和12聚噬菌體展示文庫篩選出的普通毛發(fā)樣品和漂白毛發(fā)樣品分別進(jìn)行上述過程。這些具有高度親和力的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列，顯示在表4-7中。
表4從7聚文庫中篩選到的具有高度親和力的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
1在這些克隆中插入了多重DNA片段。
表5從7聚文庫中篩選到的具有高度親和力的漂白毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
表6從12聚文庫中篩選到的具有高度親和力的普通毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
表7從12聚文庫中篩選到的具有高度親和力的漂白毛發(fā)-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
實(shí)施例3選擇具有高度親和力的手指甲-結(jié)合噬菌體肽本實(shí)施例的目的是鑒別對(duì)手指甲具有高度結(jié)合親和力的噬菌體肽。使用實(shí)施例2中所描述的修改的生物淘選方法，來鑒別具有高度親和力的手指甲-結(jié)合噬菌體-肽克隆。
從受試者收集人手指甲。用肥皂溶液刷洗干凈手指甲，用去離子水漂洗，然后在室溫下風(fēng)干。將手指甲在液氮中研成粉末，在96孔過濾板的每個(gè)孔中分別加入10mg的手指甲。用封閉緩沖液處理手指甲樣品，時(shí)間為1小時(shí)，其中封閉緩沖液由1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液組成，然后用TBST-0.5％洗滌。將手指甲樣品與噬菌體文庫(Ph.D-12噬菌體展示肽文庫試劑盒)一起溫育，然后洗滌10次，條件與實(shí)施例1描述的相同。按照實(shí)施例1所描述的，在酸洗脫步驟后，用洗脫緩沖液對(duì)手指甲樣品多洗滌3次，然后用TBST-0.5％再洗滌3次。經(jīng)過上述酸處理的手指甲，抗酸的噬菌體肽仍然附著在手指甲上，按照實(shí)施例2所描述的，將上述手指甲直接感染大腸桿菌ER2738細(xì)胞。上述生物淘選過程重復(fù)進(jìn)行3次。隨機(jī)挑取總共75個(gè)單個(gè)黑色噬菌斑用于DNA分離和測(cè)序分析，其中經(jīng)鑒別有兩個(gè)重復(fù)克隆。這些噬菌體肽的氨基酸序列列于表8中。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些手指甲結(jié)合肽也能與漂白的毛發(fā)很好地結(jié)合。
表8具有高度親和力的手指甲-結(jié)合噬菌體肽的氨基酸序列
1頻率代表在75個(gè)測(cè)序的克隆中所出現(xiàn)的相同序列的數(shù)目。
實(shí)施例4具有高度親和力的皮膚-結(jié)合噬菌體肽的選擇本實(shí)施例的目的是鑒別對(duì)皮膚具有高度結(jié)合親和力的噬菌體肽。使用實(shí)施例2和4所描述的修改的生物淘選方法，來鑒別具有高度親和力的皮膚-結(jié)合噬菌體-肽克隆。在本方法中，豬皮作為人皮膚的一種模型。
按照實(shí)施例1所描述的方法制備豬皮。按照實(shí)施例4所描述的相同方法用定做的豬皮底的生物淘選裝置篩選3輪。隨機(jī)挑取總共28個(gè)單個(gè)黑色噬菌斑用于DNA分離和測(cè)序分析，其中經(jīng)鑒別有1個(gè)重復(fù)克隆。該噬菌體肽的氨基酸序列表示為SEQ ID NO61，該序列在28個(gè)序列中出現(xiàn)了9次，序列為TPFHSPENAPGS。
實(shí)施例5定量表征毛發(fā)-結(jié)合噬菌體克隆的結(jié)合親和力。
本實(shí)施例的目的是利用滴度測(cè)定法和ELISA來定量測(cè)定噬菌體克隆的結(jié)合親和力。
毛發(fā)-結(jié)合噬菌體克隆的滴度測(cè)定將展示出特異性肽的噬菌體克隆用于比較不同肽序列的結(jié)合特性。利用基于滴度的測(cè)定試驗(yàn)來定量噬菌體的結(jié)合能力。該試驗(yàn)測(cè)定了10mg毛發(fā)表面所保留的輸出量pfu，信噪比為103到104。所有噬菌體克隆的輸入量為1014pfu。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，該試驗(yàn)測(cè)定的是表達(dá)肽的噬菌體顆粒，而不是結(jié)合肽的噬菌體顆粒。
將普通毛發(fā)剪成0.5cm長的小段，取其中10mg至于96孔過濾板(Qiagen)的每個(gè)孔中。然后，給每孔注入封閉緩沖液，緩沖液包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，并在4℃溫育1小時(shí)。毛發(fā)用TBST-0.5％洗滌5次。然后將孔中注入1mL包含1mg/mL BSA的的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入純化的噬菌體克隆(1014pfu)。毛發(fā)樣品在室溫下溫育15分鐘，然后用TBST-0.5％溶液洗滌10次。將毛發(fā)轉(zhuǎn)移到潔凈的孔中，在每個(gè)孔中加入1.0mL的非特異性洗脫緩沖液，緩沖液組成為1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH為2.2。樣品溫育10分鐘，然后在每個(gè)孔中加入160μL的中和緩沖液(1MTris-HCl，pH 9.2)。將每孔中洗脫后的噬菌體轉(zhuǎn)移到新的試管中，用于滴度測(cè)定和序列分析。
為了測(cè)定結(jié)合噬菌體的滴度，將洗脫后的噬菌體用SM緩沖液稀釋，以制備101到108的10倍連續(xù)稀釋液。每種稀釋液取10μL等分試樣，與200μL對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌ER2738(New England BioLabs)一起溫育，在LB培養(yǎng)基上生長20分鐘，然后在45℃下與3mL上層瓊脂糖(含有5mM MgCl2和0.7％瓊脂糖的LB培養(yǎng)基)混合。將混合物涂布到LB培養(yǎng)基/IPTG/Xgal板上(含有15g/L瓊脂、0.05g/LIPTG和0.04g/L Xgal的LB培養(yǎng)基)，在37℃培養(yǎng)過夜。對(duì)藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，以計(jì)算出噬菌體的滴度，上述試驗(yàn)結(jié)果顯示在表9中。
表9毛發(fā)-結(jié)合噬菌體克隆的滴度
利用ELISA分析毛發(fā)-結(jié)合噬菌體克隆的特性
利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來評(píng)價(jià)所選擇出的噬菌體-肽克隆對(duì)毛發(fā)結(jié)合的特異性。擴(kuò)增實(shí)施例1和2中所鑒別出的噬菌體-肽克隆，還有隨機(jī)抽取的對(duì)照G-F9，對(duì)照的序列為KHGPDLLRSAPR(SEQID NO63)。向預(yù)先已經(jīng)進(jìn)行了封閉的毛發(fā)表面加入超過1014pfu的噬菌體。作為對(duì)照，向預(yù)先進(jìn)行了封閉的豬皮表面也加入等量的噬菌體，以證明其對(duì)于毛發(fā)的結(jié)合特異性。
在Minifold I Dot-Blot System(Schleicher & Schuell，Inc.，Keene，NH)的上層96孔板的底部加上一層Parafilm，然后在該P(yáng)arafilm層的上面附著上毛發(fā)或一層無毛的豬皮，最后將該裝置繃緊，從而形成了獨(dú)特的以毛發(fā)或豬皮為底的96孔裝置。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)克隆來說，覆蓋毛發(fā)的孔用200μL封閉緩沖液在室溫下溫育1小時(shí)，其中緩沖液組成為2％脫脂奶粉(Schleicher & Schuell，Inc.)的TBS溶液。同時(shí)用封閉緩沖液處理第二種以豬皮為孔底的Minifole系統(tǒng)，以作為對(duì)照。通過翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)去除封閉緩沖液，并用紙巾將其吸干。上述系統(tǒng)用洗滌緩沖液洗滌6次，緩沖液組成為TBST-0.05％。向孔中注入200μL包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入10μL(超過1012拷貝)純化的噬菌體原液。將上述樣品在37℃溫育15分鐘，同時(shí)緩慢搖動(dòng)。用TBST-0.5％洗滌孔10-20次，以除去未結(jié)合的噬菌體。然后，向每個(gè)孔中加入100μL的辣根過氧化物酶/抗-M13抗體綴合物(Amersham USA，Piscataway，NJ)，其中上述綴合物是以1∶500的比例在封閉緩沖液中稀釋的，在室溫下溫育1小時(shí)。去除綴合物溶液，并用TBST-0.05％溶液將孔洗滌6次。向每個(gè)孔中加入購自PierceBiotechnology(Rockford，IL)的TMB底物，室溫下保持5-30分鐘，一般為10分鐘，以顯示顏色。然后，向每個(gè)孔中加入終止溶液(200μL的2M H2SO4)，將溶液轉(zhuǎn)移到96孔板上，并使用微量培養(yǎng)板分光光度計(jì)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)測(cè)定溶液的A450值。以至少三個(gè)重復(fù)測(cè)定平均值報(bào)道的結(jié)果所得吸收值和平均標(biāo)準(zhǔn)誤差列于表10中。
實(shí)施例45～46、比較例33混合反離子為鈉的N-月桂?；?L-天冬氨酸鹽和焦磷酸鉀，通過上述測(cè)定方法和試驗(yàn)，確認(rèn)其磷含量和高溫穩(wěn)定性。如表14所示，磷含量在0.005質(zhì)量％～0.3質(zhì)量％的范圍顯示出良好的高溫穩(wěn)定性。
實(shí)施例47～51、比較例34～35混合反離子為鈉的N-椰油酰基-L-天冬氨酸鹽水溶液和偏磷酸鉀，通過上述測(cè)定方法和試驗(yàn)，確認(rèn)其磷含量、低溫穩(wěn)定性和高溫穩(wěn)定性。如表15所示，磷含量在0.005質(zhì)量％～0.3質(zhì)量％的范圍顯示出良好的低溫穩(wěn)定性和高溫穩(wěn)定性。
實(shí)施例52～54、比較例36～37混合反離子為鈉的N-月桂?；?L-天冬氨酸鹽水溶液和作為有機(jī)磷的植酸，通過上述測(cè)定方法和試驗(yàn)，確認(rèn)其磷含量、低溫穩(wěn)定性和高溫穩(wěn)定性。如表16所示，磷含量在0.005質(zhì)量％～0.3質(zhì)量％的范圍顯示出良好的低溫穩(wěn)定性和高溫穩(wěn)定性。
表12
表13
表11肽競爭性ELISA的結(jié)果
上述結(jié)果表明合成肽D21的確與噬菌體克隆D21競爭毛發(fā)表面的相同的結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例7使用生物淘選來選擇抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽本實(shí)施例的目的是使用生物淘選來選擇抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽，方法中使用洗發(fā)水洗滌。
為了選擇抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合肽，按照實(shí)施例2所描述的方法，使用抗普通毛發(fā)和漂白毛發(fā)的12聚噬菌體肽文庫淘選進(jìn)行生物淘選試驗(yàn)。不同之處在于，不再使用普通的TBST緩沖液洗滌掉未結(jié)合的噬菌體，而是用10％、30％和50％的洗發(fā)水溶液(Pantene Pro-Vshampoo，Sheer Volume，Proctor & Gamble，Cincinnati，OH)洗滌復(fù)合了噬菌體的毛發(fā)，每個(gè)反應(yīng)管洗滌5分鐘，之后用TBS緩沖液洗滌6次。按照實(shí)施例2所描述的修改的生物淘選方法，將洗滌后的毛發(fā)直接感染宿主細(xì)菌細(xì)胞。
在該方法中存在一個(gè)潛在的問題，也就是洗發(fā)水可能影響噬菌體感染細(xì)菌宿主細(xì)胞的能力。在對(duì)照試驗(yàn)中，將已知量的噬菌體顆粒加入到10％的洗發(fā)水溶液中，保持5分鐘，然后取一部分溶液感染細(xì)菌細(xì)胞。洗發(fā)水處理后的噬菌體的滴度比未處理的噬菌體低90％。用30％和50％洗發(fā)水處理更加嚴(yán)重?fù)p害了噬菌體感染宿主細(xì)胞的能力。不過，還是鑒別出了兩種抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽，結(jié)果顯示在表12中。
表12使用生物淘選方法鑒別出的抗洗發(fā)水毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽的肽序列。
實(shí)施例8使用PCR技術(shù)選擇抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽本實(shí)施例的目的是使用PCR方法選擇抗洗發(fā)水的毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽，以避免洗發(fā)水對(duì)噬菌體造成損害的問題。PCR方法的原理是噬菌體顆粒內(nèi)的DNA片段能夠使用PCR方法進(jìn)行回收，而不需要考慮噬菌體的生存力，并且回收的DNA片段，對(duì)應(yīng)于毛發(fā)-結(jié)合肽的序列，能夠被克隆返回到噬菌體載體中，并包裝成健康的噬菌體顆粒。
按照實(shí)施例1的方法，使用抗普通毛發(fā)和漂白毛發(fā)的7聚和12聚噬菌體-肽文庫進(jìn)行生物淘選試驗(yàn)。在最后一次洗滌后，用洗發(fā)水洗滌噬菌體處理后的毛發(fā)，洗滌5分鐘，之后用TBS緩沖液洗滌6次。將洗發(fā)水洗滌后的毛發(fā)置于帶有1mL水的新試管中，煮沸15分鐘，以釋放出DNA。煮沸的含有DNA的溶液用作PCR反應(yīng)的DNA模板。PCR反應(yīng)所使用的引物如下M13KE-1412正向引物5’-CAAGCCTCAGCGACCGAATA-3’(SEQ ID NO67)和M13KE-1794反向引物5’-CGTAACACTGAGTTTCGTCACCA-3’(SEQ IDNO68)。PCR反應(yīng)條件是96℃變性3分鐘，之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃30秒，50℃30秒和60℃2分鐘。PCR產(chǎn)物(～400bp)和M13KE載體(New England BioLabs)用限制性內(nèi)切酶Eag I和Acc65 I消化。應(yīng)用Ph.D.TMPeptide Display Cloning System(NewEngland Biolabs)所描述的連接和轉(zhuǎn)化條件。所得到的抗洗發(fā)水毛發(fā)-結(jié)合噬菌體-肽的氨基酸序列是NTSQLST(SEQ ID NO70)。
實(shí)施例9毛發(fā)-結(jié)合肽和皮膚-結(jié)合肽親和力的測(cè)定本實(shí)施例的目的是測(cè)定毛發(fā)-結(jié)合肽和皮膚-結(jié)合肽分別對(duì)各自底物的測(cè)定親和力，使用ELISA測(cè)定，以MB50值來表示。
毛發(fā)-結(jié)合肽和皮膚-結(jié)合肽是利用Synpep Inc.(Dublin，CA)來合成的。為了利于檢測(cè)，在肽氨基酸結(jié)合序列的C-末端附加了一個(gè)生物素化的賴氨酸殘基，從而使肽生物素化，并且在序列的C-末端附加了酰胺化的半胱氨酸。接受試驗(yàn)的肽的氨基酸序列是SEQ ID NO71-74，如表13所示。
對(duì)于毛發(fā)樣品，所用方法如下。所使用的表面特異性96孔系統(tǒng)的設(shè)置與實(shí)施例5所述的相同。簡言之，將帶有毛發(fā)或豬皮表面的96孔用封閉緩沖液(SuperBlockTM，購自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)進(jìn)行封閉，在室溫下進(jìn)行1小時(shí)，之后用TBST-0.5％溶液室溫下洗滌6次，每次2分鐘。向每個(gè)孔中加入不同濃度的生物素化的結(jié)合肽，在37℃溫育15分鐘，然后用TBST-0.5％室溫下洗滌6次，每次2分鐘。然后，向每孔中加入鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶(HRP)綴合物(Pierce Chemical Co.)(每孔1.0μg)，室溫下溫育1小時(shí)。溫育后，用TBST-0.5％溶液室溫下洗滌孔6次，每次2分鐘。最后，按照實(shí)施例5所描述的那樣產(chǎn)生顏色，并進(jìn)行測(cè)定。
使用如下的方法檢測(cè)肽-皮膚復(fù)合物的MB50值。首先，處理豬皮，以封閉皮上的內(nèi)源性生物素。該過程是通過向封閉緩沖液中加入鏈霉抗生物素來完成的。在完成豬皮樣品的封閉后，將皮用D-生物素進(jìn)行處理，以封閉過量的鏈霉抗生物素結(jié)合位點(diǎn)。其它的步驟與毛發(fā)樣品相同。
使用GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)軟件將結(jié)果以不同肽濃度下所對(duì)應(yīng)的A450值作圖。從斯卡查德圖計(jì)算出MB50值，結(jié)果總結(jié)在表13中。該結(jié)果表明毛發(fā)-結(jié)合肽(D21，F(xiàn)35和I-B5)和皮膚-結(jié)合肽(SEQW ID NO61)分別對(duì)各自的底物具有很高的結(jié)合親和力，但是毛發(fā)-結(jié)合肽(D-21，和I-B5)對(duì)皮膚的結(jié)合親和力則相對(duì)要低。
表13毛發(fā)和皮膚-結(jié)合肽的MB50值總結(jié)
*用于試驗(yàn)的肽是在氨基酸結(jié)合序列的C-末端進(jìn)行了生物素化的，并在結(jié)合序列的C-末端附加了酰胺化半胱氨酸的肽。
實(shí)施例10基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑的制備本實(shí)施例的目的是制備基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑，其是通過將毛發(fā)-結(jié)合肽D21(SEQ ID NO46)與炭黑顆粒的表面共價(jià)連接來完成的。通過與2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二鹽酸化物反應(yīng)，引入游離的氨基，從而使炭黑顆粒的表面功能化。然后將功能化的炭黑顆粒共價(jià)連接到特定的毛發(fā)-結(jié)合肽上。
炭黑表面的功能化將炭黑(Nipex160-IQ，購自Degussa，Allendale，NJ)，2.0g和1.0g的2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二鹽酸化物(Aldrich，Millwaukee，WI)加入到100mL的圓底燒瓶中，并加入30mL的二氧六環(huán)。用氮將燒瓶清洗5分鐘。然后用橡膠隔膜將燒瓶密封，然后將反應(yīng)混合物在65℃下攪拌14小時(shí)。之后，向反應(yīng)混合物中加入50mL的去離子水，其中去離子水是用Nanopure純化系統(tǒng)(Barnstead/Thermolyne，Dubuque，IA)制備的。將稀釋后的溶液進(jìn)行離心，收集功能化的炭黑顆粒，并去除有機(jī)溶劑和未反應(yīng)的試劑。用去離子水洗滌炭黑顆粒，并離心。洗滌和離心步驟再重復(fù)2次。然后將功能化的炭黑顆粒進(jìn)行冷凍干燥。
來自噬菌體克隆D21的t-Boc保護(hù)的毛發(fā)-結(jié)合肽的合成此反應(yīng)的目的是保護(hù)毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基末端基團(tuán)。在25mL的圓底燒瓶中，將來自噬菌體克隆D21的毛發(fā)-結(jié)合肽(0.25g，SEQ IDNO46，純度為95％，來自SynPep，Dublin，CA)與2.5mL的去離子水混合。然后，加入20mg的NaOH和0.25mL的叔丁醇。將混合物攪拌2分鐘，之后逐滴加入0.12g的二叔丁基碳酸氫鹽(t-Boc酐)(Aldrich)。燒瓶用橡膠隔膜密封，且反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。反應(yīng)混合物在反應(yīng)開始時(shí)是澄清的，之后慢慢變渾濁，在1小時(shí)后出現(xiàn)沉淀。向反應(yīng)混合物中加入水(10mL)后，反應(yīng)混合物形成乳白色的乳劑，然后用5mL份的二氯甲烷提取三次。用5mL份的去離子水將有機(jī)層洗滌二次。將澄清的水層收集在一起并冷凍干燥，得到0.20g的白色疏松粉末(得率為80％)。使用液相層析-質(zhì)譜分析法(LC-MS)分析所得到的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其分子量為1323g/mol，純度為90重量％。
氨基-功能化的炭黑與t-Boc-D21-肽的偶聯(lián)在3mL四氫呋喃(THF)中，加入氨基-功能化的炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二環(huán)己基碳二亞胺(22mg)。將二甲基氨基吡啶(17μL)溶解在幾滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，邊加入邊攪拌。將所得到的黑色懸浮液在40℃加熱6小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行攪拌，之后室溫下攪拌過夜。向產(chǎn)物中加入三氟乙酸(0.6mL)，并將混合物繼續(xù)攪拌6小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物中加入5mL去離子水。混合物在3,500rpm下離心2分鐘，并輕輕傾倒出上清液。用去離子水洗滌離心管中的固體殘留物，并再次離心。重復(fù)進(jìn)行洗滌步驟，直到上清液的pH值接近6.0。然后將黑色的殘?jiān)美鋬龈稍餀C(jī)干燥2天，得到黑色的粉末。
實(shí)施例11使用基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑對(duì)毛發(fā)進(jìn)行染色本實(shí)施例的目的是使用實(shí)施例10制備的基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑對(duì)天然白色毛發(fā)樣品進(jìn)行染色。
將一束天然白色毛發(fā)(約100根)(購自International HairImporters and Products，Inc.，Bellerose，NY)通過與10mL的50％異丙醇混合30分鐘來進(jìn)行清洗，然后用去離子水至少洗滌5次。毛發(fā)變干后，將洗凈的毛發(fā)浸入下列溶液中30分鐘，該溶液是將50mg實(shí)施例10所述的毛發(fā)-結(jié)合D21肽-炭黑毛發(fā)染色劑溶解在10mL去離子水中所形成的溶液。染色完成后，將毛發(fā)用去離子水至少洗滌5次。開始時(shí)的天然白色毛發(fā)變得黑亮。將染后的毛發(fā)用30％的洗發(fā)水(Pantene Pro-V洗發(fā)水)洗滌三次，方法是將毛發(fā)浸入洗發(fā)水中并用玻璃移液管攪拌。然后將毛發(fā)用蒸餾水漂洗至少10次。天然白色毛發(fā)經(jīng)過染色處理后的最終顏色非常黑亮。
實(shí)施例12基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑的制備本實(shí)施例的目的是制備基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其中使用碳二亞胺偶聯(lián)將毛發(fā)-結(jié)合D21肽(SEQ ID NO46)與二十二醇共價(jià)連接。
在25mL的圓底燒瓶中，將81.7mg的二十二醇(Aldrich)和62.0mg的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶解在2.0mL的THF中。向上述混合物中加入下列溶液，該溶液是將0.25g 9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)N-末端保護(hù)的SEQ ID NO46(純度為95％，來自SynPep，Dublin，CA)溶解在2.0mL的二甲基甲酰胺(DMF)中所形成的溶液。然后，向反應(yīng)混合物中加入50μL的二甲基氨基吡啶(DMAP)。將反應(yīng)混合物在40℃保持3小時(shí)，并不斷攪拌，然后置于室溫下過夜。然后將溶劑在室溫下真空蒸發(fā)4小時(shí)。之后，將混合物溶解在25mL的乙酸乙酯中，然后用水提取未反應(yīng)的肽3次，每次提取使用10mL去離子水。分離乙酸乙酯相，并使用旋轉(zhuǎn)式汽化器將乙酸乙酯蒸發(fā)掉。將所得到的固體產(chǎn)物溶解在下列溶劑中，該溶劑由2.5mL的THF和2.5mL的DMF組成，然后加入1.5mL的哌啶，以使D21肽的氨基基團(tuán)去封閉。將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后使用旋轉(zhuǎn)式汽化器在真空下將溶劑蒸發(fā)掉。通過LC/MS表征所得到的最終產(chǎn)物。
實(shí)施例13基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑的制備本實(shí)施例的目的是制備基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其中使用雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑3-馬來酰亞胺基丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯將附著了半胱氨酸的毛發(fā)-結(jié)合D21肽(SEQ ID NO64)與辛胺共價(jià)連接。
辛胺，購自Aldrich(Milwaukee，WI)，取其中11.6mg稀釋到0.3mL的DMF中。將稀釋后的溶液攪拌著加入到置于5mL圓底燒瓶中的下列溶液中，該溶液是將25mg的3-馬來酰亞胺基丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Aldrish)和5mg的二異丙基乙胺(Aldrish)溶解在0.2mL的DMF中所形成的溶液。反應(yīng)混合物立即變渾濁，然后在幾分鐘之后變澄清。將溶液繼續(xù)攪拌4小時(shí)。然后將溶液在高度真空下干燥。使用柱層析純化附著了辛胺的馬來酰亞胺丙酸酯，所使用的柱子是硅膠60(購自EMD Chemicals，以前叫做Science，Gibbstown，NJ)，洗脫液是DMF/醚。
將約12mg的上述產(chǎn)物置于5mL的圓底燒瓶中，加入50mg附著了半胱氨酸的D21肽(來自SynPep，Dublin，CA，SEQ ID NO64)和0.5mL 0.1M pH7.2的磷酸鹽緩沖液。附著了半胱氨酸的D21肽具有3個(gè)甘氨酸殘基，并在毛發(fā)-結(jié)合D21肽(SEQ ID NO46)的肽結(jié)合序列的末端附著了半胱氨酸。將混合物在室溫下繼續(xù)攪拌6小時(shí)。使用水/醚提取純化到最終產(chǎn)物，即C8-D21肽毛發(fā)調(diào)理劑。
實(shí)施例14基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑的制備本實(shí)施例的目的是制備基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑，其中所使用的炭黑是用乙醇胺進(jìn)行了功能化的。使用化學(xué)分析方法估計(jì)出了附著到炭黑表面上的肽的數(shù)量。
酸功能化的炭黑顆粒的制備在1,000mL的燒杯中，加入25.5g的炭黑(Nipex-160-IQ，購自Degussa)、100g的過二硫酸銨[(NH4)2S2O8](純度為98％，購自Aldrich)、333mL的1.0M的H2SO4(純度為98％，GR級(jí)，購自EMDChemicals)。將混合物在室溫下用磁力攪拌盤攪拌24小時(shí)。之后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到500mL的塑料離心管中，并在8,500rpm下離心20分鐘。將澄清后的上清液去掉。產(chǎn)物用去離子水洗滌6次，每次洗滌后進(jìn)行離心，收集產(chǎn)物。最終得到的產(chǎn)物是中性的(pH＝6.0)，然后進(jìn)行冷凍干燥24小時(shí)。所得到的功能化炭黑顆粒的平均大小是100nm，是通過粒徑分析儀測(cè)定的(Microtrac Ultrafine Particle Analyzer，Microtrac Inc.，Montgomeryvile，PA)。
使用乙醇胺制備氨基功能化的炭黑將2g干燥的酸功能化炭黑、25mL的乙醇胺(純度為99％，購自Aldrich)，和1mL的濃硫酸(H2SO4，純度為98％，GR級(jí)，購自EMDChemicals)在100mL的圓底燒瓶中混合。用磁力攪拌器快速攪拌上述混合物，并回流6小時(shí)。在混合物冷卻到室溫后，向混合物中加入足夠量的氫氧化銨(NH3含量為28.0-30.0％，購自EMD Chemicals)，以中和上述混合物。然后，按照實(shí)施例6所述的方法，將混合物離心，并用水洗滌。最終得到的產(chǎn)物是中性的(pH＝6.0)，并冷凍干燥24小時(shí)。該干燥的氨基功能化的炭黑易于在水中分散。
在DuPont Corporate Center for Analytical Science，使用ESCA法對(duì)功能化炭黑顆粒表面的成分進(jìn)行了分析。在ESCA方法中，單能X-射線聚焦到材料的表面，激發(fā)表面原子。具有表面上部10nm內(nèi)的元素能量特性的核和價(jià)層電子被噴射出來，分析它們的能量特性，從而獲得表面成分的定性或定量信息。激發(fā)電子的動(dòng)能提供了有關(guān)功能基團(tuán)和表面種類氧化狀態(tài)的信息。在該實(shí)施例中，所使用的X-射線源是鎂陽極，能量為1253.6eV。樣品在45度的出口角進(jìn)行分析(樣品厚度大約5-10nm)。ESCA分析結(jié)果顯示在表14中。乙醇胺功能化的炭黑表面主要組成為未反應(yīng)的-COOH基團(tuán)和-C(＝O)-OCH2CH2NH2基團(tuán)。為了計(jì)算胺(y)與羧酸基團(tuán)(x)的比例，對(duì)乙醇胺使用了一個(gè)簡單的方程式，具體來說是y/(x+y)＝(N％/14)/(O％/32)。結(jié)果列于表14中。
表14功能化炭黑的ESCA分析結(jié)果
*ND表示未檢測(cè)出氨基功能化的炭黑與t-Boc-D21-肽的偶聯(lián)然后將氨基功能化的炭黑與特定的毛發(fā)-結(jié)合肽D21(SEQ IDNO46)進(jìn)行共價(jià)連接。按照實(shí)施例10所述的方法合成t-Boc保護(hù)的D21肽。然后，將氨基功能化炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(22mg)加入到3mL的四氫呋喃(THF)中。將二甲基氨基吡啶(DMAP)(17μL)溶解在幾滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，同時(shí)進(jìn)行攪拌。將所得到的黑色懸浮液加熱到40℃，保持6小時(shí)，并伴隨著攪拌，然后在室溫下繼續(xù)攪拌過夜。為了去除D21肽上的t-Boc保護(hù)基團(tuán)，向上述產(chǎn)物中加入三氟乙酸(TFA)(0.6mL)，然后將混合物繼續(xù)攪拌6小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物中加入5mL去離子水。混合物在3,500rpm下離心2分鐘，并將上清液輕輕倒出。用去離子水洗滌離心管中的固體殘留物，并再次離心。重復(fù)進(jìn)行洗滌步驟，直至上清液的pH值接近6.0。將黑色的殘?jiān)美鋬龈稍飪x干燥2天，得到黑色粉末。
使用ESCA、元素分析、和TGA(熱解重量分析法)分析了氨基功能化的炭黑顆粒和連接了肽的炭黑顆粒。分析結(jié)果表明用乙醇胺修飾的炭黑的有機(jī)層占總重量的大約12％。在D21肽與炭黑顆粒附著后，肽的重量百分比為18％-30％。因此，對(duì)于粒徑為100nm的炭黑顆粒來說，在與乙醇胺反應(yīng)后，在顆粒表面附著上了總量為9.5×104的分子，在與肽反應(yīng)后，在顆粒表面附著上了總量為7,700的D21肽分子。計(jì)算在炭黑表面的肽密度，結(jié)果表明每個(gè)D21肽占4nm2的空間，這與附著于噬菌體的肽密度形成對(duì)比，后者約為12nm2。
實(shí)施例15基于肽的炭黑毛發(fā)著色劑的特異性本實(shí)施例的目的是驗(yàn)證D21肽-炭黑毛發(fā)著色劑的特異性。
按照實(shí)施例14所述的方法制備D21肽-炭黑著色劑。
將一塊豬皮(10cm×10cm，購自當(dāng)?shù)爻?通過與30mL 30％的異丙醇混合10分鐘進(jìn)行清洗，然后用蒸餾水洗滌至少5次。風(fēng)干后，將干凈的豬皮浸入帶有多個(gè)孔的平板固定器中，該容器中盛有下列溶液，50mg的D21肽-炭黑著色劑溶解在10mL的蒸餾水中。應(yīng)用著色劑15分鐘后，將豬皮用30％的洗發(fā)水溶液(Pantene Pro-V洗發(fā)水)洗滌3次，方法是將洗發(fā)水溶液滴入孔中，然后再將其倒出。最后將豬皮用蒸餾水漂洗5次。
按照上述處理豬皮的方法對(duì)一束普通白色毛發(fā)樣品(購自International Hair Importers and Products，Bellerose，NY)，進(jìn)行了相同的處理。
在進(jìn)行完洗滌步驟后，豬皮的黑色非常輕，可以忽略不計(jì)，而毛發(fā)則是非常黑亮。上述結(jié)果表明D21肽-炭黑著色劑對(duì)毛發(fā)具有結(jié)合特異性，對(duì)皮膚則沒有。
實(shí)施例16肽-聚硅氧烷毛發(fā)調(diào)理劑的制備本實(shí)施例的目的是合成D21肽-聚硅氧烷毛發(fā)調(diào)理劑。將D21肽(SEQ ID NO46)的側(cè)鏈反應(yīng)功能團(tuán)完全保護(hù)，以使得聚硅氧烷僅與肽的C-末端基團(tuán)反應(yīng)。另外，在結(jié)合序列的C-末端加上了一個(gè)三肽間隔物，該三肽間隔物由甘氨酸殘基組成。
在5mL的圓底燒瓶中，將50mg完全被保護(hù)的D21肽Fmoc-R(Pbf)T(tBu)N(Trt)AAD(OtBu)H(Trt)PAAVT(tBu)GGG(其中Fmoc表示9-芴基甲氧基羰基；Pbf表示2，2，6，4，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；籺Bu表示叔丁基；Trt表示三苯甲基；Otbu表示叔丁氧基)(分子量為2522，0.02mmol，純度為95％，來自SynPep，Dublin，CA)(SEQ ID NO78)溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF，購自E.Merck，Darmstadt，德國)。在樣品小瓶中，將聚硅氧烷流體2-8566(77mg)(N％＝0.875％，0.024mmol-NH2，購自Dow Corning，Midland，MI)溶解在2mL的THF(購自E.Merck)中，然后轉(zhuǎn)移到含有肽溶液的圓底燒瓶中。然后，向燒瓶中加入5mg的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，0.024mmol)和5μL的二甲基氨基吡啶(DMAP)。用橡膠塞將燒瓶密封，然后在50℃將反應(yīng)混合物攪拌5小時(shí)，之后在室溫下過夜。在反應(yīng)完成后，將溶劑在真空下抽空。干燥后，得到122mg的固體產(chǎn)物。得率大約是90％。
將固體產(chǎn)物溶解在N，N-二甲基乙酰胺(DMAC，購自EMDChemicals)中，制得產(chǎn)物為5mg/mL的DMAC溶液，用于GPC(凝膠滲透色譜法)分析，進(jìn)行折射率檢測(cè)，從而確定分子量。最初的聚硅氧烷(Dow Corning 2-8566)是不溶于DMCA的，因此在層析譜的分離區(qū)內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)聚硅氧烷。D21肽是一個(gè)尖的低分子量峰，產(chǎn)物樣品包含2個(gè)峰，一個(gè)是沒有連接D21肽的峰，另一個(gè)是寬的峰，是聚硅氧烷嫁接上了D21肽的結(jié)果。以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算了重均分子量(Mw)。D21肽和肽-聚硅氧烷調(diào)理劑的Mw分別是4.7×103和4.4×104。
使用了一種切割試劑來切割D21肽側(cè)鏈功能團(tuán)的保護(hù)性基團(tuán)，切割試劑(稱作試劑K，購自SynPep)具有如下組成三氟乙酸/H2O/苯硫基甲烷/乙二硫醇/酚(85∶5∶5∶2.5∶2.5體積比)。首先將試劑K(1mL)預(yù)冷到-20℃，然后加入100mg的D21肽-聚硅氧烷調(diào)理劑。將混合物室溫下攪拌3-4小時(shí)，然后在高度真空下去掉試劑K。向混合物中加入61.2mg占DMF體積20％的哌啶DMF溶液，并攪拌30分鐘，去除肽N-末端的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，之后在高真空下抽空。最終的產(chǎn)物在THF、DMF或DMAC中不能完全溶解。因?yàn)槿芙庑暂^低，因此不能對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行GPC分析。
實(shí)施例17基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑的效力本實(shí)施例的目的是驗(yàn)證基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑在降低人毛發(fā)纖維摩擦力方面的效力，并與市售的調(diào)理劑進(jìn)行比較。對(duì)于毛發(fā)纖維集合(即多根纖維)來說，其梳理的性能在很大程度上取決于毛發(fā)纖維的摩擦。單根毛發(fā)纖維的摩擦力特性與毛發(fā)集合的梳理特性相關(guān)。纖維之間的摩擦研究表明施用調(diào)理劑能夠改善毛發(fā)表面。纖維間的摩擦越小，則毛發(fā)看上去越光滑，感覺上也越光滑，并且在梳理時(shí)更加容易。在本實(shí)施例中所使用的測(cè)定纖維間摩擦的方法是幾種毛發(fā)纖維試驗(yàn)的一種，該方法能夠給出確定的定量數(shù)據(jù)，是工業(yè)上常用的一種方法。
將實(shí)施例12所述的由毛發(fā)-結(jié)合肽(SEQ ID NO46)與二十二醇共價(jià)連接組成的基于肽的毛發(fā)調(diào)節(jié)劑用于如下制劑中，該制劑由溶于蒸餾水中的0.25％的基于肽的調(diào)節(jié)劑和重量百分比為1.5％的PerformixTM卵磷脂(ADM Lecithin，Decatur，IL)組成。將上述水溶液在7000rpm下混合4分鐘，使用的儀器是Silverson L4RT-A HighShear Laboratory Mixer(Silverson Machines，Inc.，East Longmeadow，MA)，混合時(shí)使用一個(gè)常規(guī)用途的裂解頭(disintegrating uead)和一個(gè)0.95cm的微型管形支架。制備含量為0.5％的Dow Dow Corning929陽離子乳劑(Dow Corning Corp.，Midland，MI)(一種市售的調(diào)理劑)蒸餾水溶液，混合條件與上述方法相同。
在試驗(yàn)前將一種歐洲人黑棕色毛發(fā)假發(fā)(International HairImporters and Products)進(jìn)行清洗，方法為將毛發(fā)浸入異丙醇中30分鐘，然后用蒸餾水洗滌10次。將這些假發(fā)的單根毛發(fā)纖維送到TextileResearch Institute(TRI)，Princeton，NJ作摩擦測(cè)試。在TRI，將毛發(fā)纖維浸入調(diào)理劑溶液中5分鐘，溫度大約為35℃，不要攪拌。之后，在微溫的水中漂洗1分鐘，然后在21℃、65％相對(duì)濕度下過夜干燥。
按照Kamath等(J.Appl.Polymer Sci.，85394-414(2002))的方法，使用單根纖維摩擦儀通過纖維間摩擦試驗(yàn)，對(duì)經(jīng)過處理的毛發(fā)纖維作摩擦力測(cè)量。使用Instron拉伸測(cè)試儀(Tensile Testing machine)，在高正交力(高負(fù)荷)(0.74g)下估計(jì)了毛發(fā)纖維對(duì)鍍鉻鋼絲的摩擦力，十字頭速度是1mm/分鐘。使用TRI/ScanTMSurface Force Analyzer(Textile Research Institute)在低正交力(低負(fù)荷)(8.5mg)下，測(cè)量對(duì)另外一根毛發(fā)纖維的摩擦力。該儀器能夠用Cahn微量天平測(cè)量出很小的力(質(zhì)量分辨率為0.1mg)并且有一個(gè)計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)。測(cè)試結(jié)果顯示在表15中。
表15摩擦力測(cè)量結(jié)果
兩種情況下的結(jié)果表明，使用基于肽的調(diào)理劑處理后的毛發(fā)，其平均摩擦力小于用Dow Corning929陽離子乳劑調(diào)理劑處理的毛發(fā)。隨后，對(duì)用1.5％卵磷脂調(diào)理后的樣品進(jìn)行了纖維摩擦力測(cè)試(低負(fù)荷)，平均摩擦力為3.366mg，這表明基于肽的調(diào)理劑所具有的調(diào)理效果不是因?yàn)樵谥苿┲写嬖诼蚜字脑?。該結(jié)果驗(yàn)證了本發(fā)明基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑所具有的效果。
序列表<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
<120>基于肽的用于毛發(fā)、皮膚和指甲的調(diào)理劑和著色劑<130>CL2296 PCT<160>104<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>1Leu Glu Ser Thr Pro Lys Met Lys1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>2Phe Thr Gln Ser Leu Pro Arg1 5<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>3Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>4Leu Asp Val Glu Ser Tyr Lys Gly Thr Ser Met Pro1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>5Arg Val Pro Asn Lys Thr Val Thr Val Asp Gly Ala1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>6Asp Arg His Lys Ser Lys Tyr Ser Ser Thr Lys Ser1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>7Lys Asn Phe Pro Gln Gln Lys Glu Phe Pro Leu Ser1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>8Gln Arg Asn Ser Pro Pro Ala Met Ser Arg Arg Asp1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽
<400>9Thr Arg Lys Pro Asn Met Pro His Gly Gln Tyr Leu1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>10Lys Pro Pro His Leu Ala Lys Leu Pro Phe Thr Thr1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>11Asn Lys Arg Pro Pro Thr Ser His Arg Ile His Ala1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>12
Asn Leu Pro Arg Tyr Gln Pro Pro Cys Lys Pro Leu1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>13Arg Pro Pro Trp Lys Lys Pro Ile Pro Pro Ser Glu1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>14Arg Gln Arg Pro Lys Asp His Phe Phe Ser Arg Pro1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Thr或Pro<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa＝Glu或Ala<400>15Ser Val Pro Asn Lys Xaa Val Thr Val Asp Gly Xaa1 5 10<210>16<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>16Thr Thr Lys Trp Arg His Arg Ala Pro Val Ser Pro1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>17Trp Leu Gly Lys Asn Arg Ile Lys Pro Arg Ala Ser1 5 10<210>18<211>12<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>18Ser Asn Phe Lys Thr Pro Leu Pro Leu Thr Gln Ser1 5 10<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>19Lys Glu Leu Gln Thr Arg Asn Val Val Gln Arg Glu1 5 10<210>20<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>20Thr Pro Thr Ala Asn Gln Phe Thr Gln Ser Val Pro1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>21Ala Ala Gly Leu Ser Gln Lys His Glu Arg Asn Arg1 5 10<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>22Glu Thr Val His Gln Thr Pro Leu Ser Asp Arg Pro1 5 10<210>23<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>23Leu Pro Ala Leu His Ile Gln Arg His Pro Arg Met1 5 10<210>24<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽
<400>24Gln Pro Ser His Ser Gln Ser His Asn Leu Arg Ser1 5 10<210>25<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>25Arg Gly Ser Gln Lys Ser Lys Pro Pro Arg Pro Pro1 5 10<210>26<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>26Thr His Thr Gln Lys Thr Pro Leu Leu Tyr Tyr His1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>27
Thr Lys Gly Ser Ser Gln Ala Ile Leu Lys Ser Thr1 5 10<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>28Asp Leu His Thr Val Tyr His1 5<210>29<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>29His Ile Lys Pro Pro Thr Arg1 5<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>30His Pro Val Trp Pro Ala Ile
1 5<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>31Met Pro Leu Tyr Tyr Leu Gln1 5<210>32<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>32His Leu Thr Val Pro Trp Arg Gly Gly Gly Ser Ala Val Pro Phe Tyr1 5 10 15Ser His Ser Gln Ile Thr Leu Pro Asn His20 25<210>33<211>41<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>33
Gly Pro His Asp Thr Ser Ser Gly Gly Val Arg Pro Asn Leu His His1 5 10 15Thr Ser Lys Lys Glu Lys Arg Glu Asn Arg Lys Val Pro Phe Tyr Ser20 25 30His Ser Val Thr Ser Arg Gly Asn Val35 40<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>34Lys His Pro Thr Tyr Arg Gln1 5<210>35<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>35His Pro Met Ser Ala Pro Arg1 5<210>36<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>36Met Pro Lys Tyr Tyr Leu Gln1 5<210>37<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>37Met His Ala His Ser Ile Ala1 5<210>38<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>38Thr Ala Ala Thr Thr Ser Pro1 5<210>39<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>39Leu Gly Ile Pro Gln Asn Leu1 5<210>40<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>40Ala Lys Pro Ile Ser Gln His Leu Gln Arg Gly Ser1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>41Ala Pro Pro Thr Pro Ala Ala Ala Ser Ala Thr Thr1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽
<400>42Asp Pro Thr Glu Gly Ala Arg Arg Thr Ile Met Thr1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>43Glu Gln Ile Ser Gly Ser Leu Val Ala Ala Pro Trp1 5 10<210>44<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>44Leu Asp Thr Ser Phe Pro Pro Val Pro Phe His Ala1 5 10<210>45<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>45
Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser1 5 10<210>46<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>46Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr1 5 10<210>47<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>47Ser Leu Asn Trp Val Thr Ile Pro Gly Pro Lys Ile1 5 10<210>48<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>48Thr Asp Met Gln Ala Pro Thr Lys Ser Tyr Ser Asn
1 5 10<210>49<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>49Thr Ile Met Thr Lys Ser Pro Ser Leu Ser Cys Gly1 5 10<210>50<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>50Thr Pro Ala Leu Asp Gly Leu Arg Gln Pro Leu Arg1 5 10<210>51<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>51Thr Tyr Pro Ala Ser Arg Leu Pro Leu Leu Ala Pro1 5 10
<210>52<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>52Ala Lys Thr His Lys His Pro Ala Pro Ser Tyr Ser1 5 10<210>53<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽和指甲指合肽<400>53Tyr Pro Ser Phe Ser Pro Thr Tyr Arg Pro Ala Phe1 5 10<210>54<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>54Thr Asp Pro Thr Pro Phe Ser Ile Ser Pro Glu Arg1 5 10<210>55
<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>55Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly1 5 10 15Ala Ala Thr Ala20<210>56<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>56Trp His Asp Lys Pro Gln Asn Ser Ser Lys Ser Thr1 5 10<210>57<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>57Asn Glu Val Pro Ala Arg Asn Ala Pro Trp Leu Val1 5 10
<210>58<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>58Asn Ser Pro Gly Tyr Gln Ala Asp Ser Val Ala Ile Gly1 5 10<210>59<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>59Thr Gln Asp Ser Ala Gln Lys Ser Pro Ser Pro Leu1 5 10<210>60<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>指甲結(jié)合肽<400>60Ala Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser1 5 10<210>61
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>61Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser1 5 10<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62ccctcatagt tagcgtaacg20<210>63<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)照肽<400>63Lys His Gly Pro Asp Leu Leu Arg Ser Ala Pro Arg1 5 10<210>64<211>16<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>附著了半胱氨酸的毛發(fā)結(jié)合肽<400>64Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly Cys1 5 10 15<210>65<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割位點(diǎn)<400>65Leu Glu Ser Gly Asp Glu Val Asp1 5<210>66<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>66Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser1 5 10<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>67caagcctcag cgaccgaata20<210>68<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68cgtaacactg agtttcgtca cca23<210>69<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>69Thr Pro Pro Thr Asn Val Leu Met Leu Ala Thr Lys1 5 10<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>70Asn Thr Ser Gln Leu Ser Thr1 5
<210>71<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生物素化的毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>生物素化的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>酰胺化的<400>71Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Lys Cys1 5 10<210>72<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生物素化的毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>生物素化的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>酰胺化的
<400>72Ala Leu Pro Arg Ile Ala Asn Thr Trp Ser Pro Ser Lys Cys1 5 10<210>73<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生物素化的毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>生物素化的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>酰胺化的<400>73Thr Pro Pro Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Arg Ser Lys Cys1 5 10<210>74<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生物素化的皮膚結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)
<223>生物素化的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>酰胺化的<400>74Thr Pro Phe His Ser Pro Glu Asn Ala Pro Gly Ser Lys Cys1 5 10<210>75<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>完全被保護(hù)的毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>芴基甲氧基羰基(Fmoc)-保護(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>2，2，6，4，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；Ｗo(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>叔丁基-保護(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>三苯甲基-保護(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)<223>叔丁氧基-保護(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>三苯甲基-保護(hù)的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>叔丁基保護(hù)的<400>75Arg Thr Asn Ala Ala Asp His Pro Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly1 5 10 15<210>76<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>76Asn Thr Pro Lys Glu Asn Trp1 5<210>77<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>77Asn Thr Pro Ala Ser Asn Arg
1 5<210>78<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>78Pro Arg Gly Met Leu Ser Thr1 5<210>79<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>79Pro Pro Thr Tyr Leu Ser Thr1 5<210>80<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>80Thr Ile Pro Thr His Arg Gln His Asp Tyr Arg Ser1 5 10
<210>81<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>81Thr Pro Pro Thr His Arg Leu1 5<210>82<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>82Leu Pro Thr Met Ser Thr Pro1 5<210>83<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>83Leu Gly Thr Asn Ser Thr Pro1 5<210>84
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>84Thr Pro Leu Thr Gly Ser Thr Asn Leu Leu Ser Ser1 5 10<210>85<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>85Thr Pro Leu Thr Lys Glu Thr1 5<210>86<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>86Gln Gln Ser His Asn Pro Pro1 5<210>87<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>87Thr Gln Pro His Asn Pro Pro1 5<210>88<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>88Ser Thr Asn Leu Leu Arg Thr Ser Thr Val His Pro1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>89His Thr Gln Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Asn Leu Phe1 5 10<210>90<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>90Ser Leu Leu Ser Ser His Ala1 5<210>91<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>91Gln Gln Ser Ser Ile Ser Leu Ser Ser His Ala Val1 5 10<210>92<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>92Asn Ala Ser Pro Ser Ser Leu1 5<210>93<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽
<400>93His Ser Pro Ser Ser Leu Arg1 5<210>94<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa＝His，Arg，或Asn<400>94Lys Xaa Ser His His Thr His1 5<210>95<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa＝His，Arg，或Asn<400>95Glu Xaa Ser His His Thr His
15<210>96<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>96Leu Glu Ser Thr Ser Leu Leu1 5<210>97<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>97Thr Pro Leu Thr Lys Glu Thr1 5<210>98<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>毛發(fā)結(jié)合肽<400>98Lys Gln Ser His Asn Pro Pro1 5
<210>99<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>99Lys Gln Ala Thr Phe Pro Pro Asn Pro Thr Ala Tyr1 5 10<210>100<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>100His Gly His Met Val Ser Thr Ser Gln Leu Ser Ile1 5 10<210>101<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>101Leu Ser Pro Ser Arg Met Lys1 5<210>102
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>102Leu Pro Ile Pro Arg Met Lys1 5<210>103<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>103His Gln Arg Pro Tyr Leu Thr1 5<210>104<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>皮膚結(jié)合肽<400>104Phe Pro Pro Leu Leu Arg Leu1 權(quán)利要求
1.一種毛發(fā)-結(jié)合肽，選自SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、64、66、69和70。
2.由SEQ ID NO60所示的指甲-結(jié)合肽。
3.由SEQ ID NO61所示的皮膚-結(jié)合肽。
4.一種二嵌段、基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其通式為(HBP)n-HCA，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)HCA是一種毛發(fā)調(diào)理劑；和c)n從1到約1,000。
5.一種二嵌段、基于肽的皮膚調(diào)理劑，其通式為(SBP)n-SCA，其中a)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；b)SCA是一種皮膚調(diào)理劑；和c)n從1到約1,000。
6.一種二嵌段、基于肽的毛發(fā)著色劑，其通式為(HBP)n-C，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
7.一種二嵌段、基于肽的指甲著色劑，其通式為(NBP)n-C，其中a)NBP是一種指甲-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
8.一種二嵌段、基于肽的皮膚著色劑，其通式為(SBP)n-C，其中a)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；和c)n從1到約10,000。
9.一種三嵌段、基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其通式為[(HBP)m-S]n-HCA，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)HCA是一種毛發(fā)調(diào)理劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約1,000。
10.一種三嵌段、基于肽的皮膚調(diào)理劑，其通式為[(SBP)m-S]n-SCA，其中a)SBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)SCA是一種皮膚調(diào)理劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約1,000。
11.一種三嵌段、基于肽的毛發(fā)著色劑，其通式為[(HBP)m-S]n-C，其中a)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約10,000。
12.一種三嵌段、基于肽的指甲著色劑，其通式為[(NBP)m-S]n-C，其中a)NBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約10,000。
13.一種三嵌段、基于肽的皮膚著色劑，其通式為[(SBP)m-S]n-C，其中a)SBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；b)C是一種著色劑；c)S是一種間隔物；d)m從1到約50；和e)n從1到約10,000。
14.根據(jù)權(quán)利要求4、6、9或11任一項(xiàng)所述的調(diào)理劑或著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽具有約7到約25個(gè)氨基酸，并且其對(duì)毛發(fā)的結(jié)合親和力，以MB50計(jì)，等于或小于10-5M。
15.根據(jù)權(quán)利要求5、8、10或13任一項(xiàng)所述的調(diào)理劑或著色劑，其中皮膚-結(jié)合肽具有約7到約25個(gè)氨基酸，并且其對(duì)皮膚的結(jié)合親和力，以MB50計(jì)，等于或小于10-5M。
16.根據(jù)權(quán)利要求7或12任一項(xiàng)所述的著色劑，其中指甲-結(jié)合肽具有約7到約25個(gè)氨基酸，并且其對(duì)指甲的結(jié)合親和力，以MB50計(jì)，等于或小于10-5M。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的調(diào)理劑或著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽是通過如下方法分離的，包含如下步驟(i)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；(ii)將(i)的文庫與毛發(fā)樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(A)噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；(B)未結(jié)合的毛發(fā)，和(C)未形成復(fù)合物的肽；(iii)分離(ii)中的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；(iv)從(ii)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；(v)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的調(diào)理劑或著色劑，其中皮膚-結(jié)合肽是通過如下方法分離的，包含如下步驟(i)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；(ii)將(i)的文庫與皮膚樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(A)噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(B)未結(jié)合的皮膚，和(C)未形成復(fù)合物的肽；(iii)分離(ii)中的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(iv)從(ii)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；(v)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的著色劑，其中指甲-結(jié)合肽是通過如下方法分離，包含如下步驟(i)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；(ii)將(i)的文庫與指甲樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(A)噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(B)未結(jié)合的指甲，和(C)未形成復(fù)合物的肽；(iii)分離(ii)中的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(iv)從(ii)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；(v)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(iv)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽。
20.權(quán)利要求4-13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽或指甲-結(jié)合肽具有約7到約20個(gè)氨基酸。
21.權(quán)利要求4-13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽或指甲-結(jié)合肽具有約7到約12個(gè)氨基酸。
22.權(quán)利要求4-13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽、皮膚-結(jié)合肽或指甲-結(jié)合肽在肽序列的至少一個(gè)末端進(jìn)一步包含半胱氨酸殘基。
23.權(quán)利要求4、6、9或11所述的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑或基于肽的毛發(fā)著色劑，其中毛發(fā)-結(jié)合肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO1、3-59、64、66、69、70、76-97和98。
24.權(quán)利要求5、8、10或13所述的基于肽的皮膚調(diào)理劑或基于肽的皮膚著色劑，其中皮膚-結(jié)合肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO2、61、99-103和104。
25.權(quán)利要求7或12所述的基于肽的指甲著色劑，其中指甲-結(jié)合肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO7、8、19-27、38-40、43-45、47、53、57、58、59和60。
26.權(quán)利要求4或9所述的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑，其中毛發(fā)調(diào)理劑選自辛胺、硬脂胺、二十二醇、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的聚硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基聚硅氧烷、羥基封端的硅氧烷、羥基封端的聚硅氧烷、氨基修飾的聚硅氧烷衍生物、[(氨乙基)氨基]丙基羥基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羥基二甲基聚硅氧烷、α-十三烷基-ω-羥基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)、氨基封端二甲基聚硅氧烷和脫乙酰殼多糖。
27.權(quán)利要求5或10所述的基于肽的皮膚調(diào)理劑，其中皮膚調(diào)理劑選自聚水楊酸酯、丙二醇、甘油、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、葡糖二酸、半乳糖二酸、3-羥基戊酸、水楊酸和1，3丙二醇。
28.權(quán)利要求6或11所述的基于肽的毛發(fā)著色劑，其中著色劑選自D&C Yellow 1、D&C Yellow 3、HC Yellow 6、HC Yellow 8、D&CBlue 1、HC Blue 1、HC Brown 2、HC Red 5、2-硝基-對(duì)苯二胺、N，N-羥乙基-2-硝基苯二胺、4-硝基-吲哚、炭黑、金屬納米顆粒和半導(dǎo)體納米顆粒。
29.權(quán)利要求7或12的基于肽的著色劑，其中著色劑選自D&CRed No.8，10，30，36、D&C Red No.6，9，12的鋇色淀、D&C Red No.7，11，31，34的鈣色淀、D&C Red No.30的鍶色淀、D&C Orange No.17的鍶色淀和D&C Blue No.6的鍶色淀。
30.權(quán)利要求8或13所述的基于肽的皮膚著色劑，其中著色劑選自D&C Red No.21、D&C Red No.27、D&C Red Orange No.5、D&CRed No.21、D&C Orange No.10、二氧化鈦、氧化鋅、D&C Red No.36、D&C Orange No.17、D&C Red No.7，11，31，34的鈣色淀、D&C RedNo.12的鋇色淀、D&C Red No.13的鍶色淀、FD&C Yellow No.5的鋁色淀、FD&C Yellow No.6的鋁色淀、D&C Red No.27的鋁色淀、D&CRed No.21的鋁色淀、FD&C Blue No.1的鋁色淀、氧化鐵、錳紫、氧化鉻、群青色、炭黑和二羥基丙酮。
31.權(quán)利要求9、10、11、12或13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中所述間隔物選自乙醇胺、乙二醇、鏈長為6個(gè)碳原子的聚乙烯、3-6個(gè)重復(fù)單元的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、乙基烷基鏈、丙基烷基鏈、己基烷基鏈、硬脂基烷基鏈、十六烷基烷基鏈和棕櫚?；榛?。
32.權(quán)利要求9、10、11、12或13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中所述間隔物是一種包含氨基酸的肽，氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和它們的組合。
33.權(quán)利要求9、10、11、12或13所述的基于肽的調(diào)理劑或著色劑，其中所述間隔物是一種包含SEQ ID NO65所示氨基酸序列的肽。
34.一種毛發(fā)護(hù)理組合物，其包含有效量的權(quán)利要求4或9所述的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑。
35.一種皮膚護(hù)理組合物，其包含有效量的權(quán)利要求5或10所述的基于肽的皮膚調(diào)理劑。
36.一種毛發(fā)著色組合物，其包含有效量的權(quán)利要求6或11所述的基于肽的毛發(fā)著色劑。
37.一種化妝品組合物，其包含有效量的權(quán)利要求6或11所述的基于肽的毛發(fā)著色劑。
38.一種指甲油組合物，其包含有效量的權(quán)利要求7或12所述的基于肽的指甲著色劑。
39.一種化妝品組合物，其包含有效量的權(quán)利要求8或13所述的基于肽的皮膚著色劑。
40.一種毛發(fā)著色組合物，其包含有效量的權(quán)利要求4或9所述的基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑。
41.一種生產(chǎn)高度親和力的毛發(fā)、皮膚或指甲-結(jié)合肽的方法，包含a)提供組合生成的噬菌體-肽文庫；b)將(a)的文庫與毛發(fā)、皮膚或指甲樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的毛發(fā)、皮膚或指甲，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；c)分離(b)中的噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；d)從(b)的噬菌體-肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的噬菌體-肽；e)將經(jīng)過步驟(d)后保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)、噬菌體-肽-皮膚、或噬菌體-肽-指甲復(fù)合物直接感染細(xì)菌宿主細(xì)胞；f)在合適的生長培養(yǎng)基上生長步驟(e)感染的細(xì)胞；和g)從步驟(f)的生長細(xì)胞中分離并鑒別噬菌體-肽，其中該噬菌體-肽對(duì)毛發(fā)、皮膚或指甲具有高度的結(jié)合親和力。
42.基于肽的調(diào)理劑在毛發(fā)上形成保護(hù)層的方法，包含將權(quán)利要求28所述的組合物施用到毛發(fā)上，并使之形成所述的保護(hù)層。
43.基于肽的調(diào)理劑在皮膚或唇上形成保護(hù)層的方法，包含將權(quán)利要求29所述的組合物施用到皮膚或唇上，并使之形成所述的保護(hù)層。
44.一種對(duì)毛發(fā)進(jìn)行著色的方法，包含將權(quán)利要求36或40所述的毛發(fā)著色組合物施用到毛發(fā)上，保持一段時(shí)間，該時(shí)間足以使毛發(fā)著色。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中將組合物施用到毛發(fā)上所保持的時(shí)間為約5到約50分鐘。
46.一種對(duì)指甲進(jìn)行著色的方法，包含將權(quán)利要求38所述的指甲油組合物施用到指甲上。
47.一種對(duì)皮膚或唇進(jìn)行著色的方法，包含將權(quán)利要求39所述的化妝品組合物施用到皮膚或唇上。
48.一種對(duì)眉毛或睫毛進(jìn)行著色的方法，包含將權(quán)利要求37所述的化妝品組合物施用到眉毛或睫毛上。
49.一種對(duì)頭發(fā)、眉毛或睫毛進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含毛發(fā)著色劑的毛發(fā)著色組合物，其中毛發(fā)著色劑選自i)(HBP)n-C；和ii)[(HBP)m-S]k-C其中1)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的毛發(fā)-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)的文庫與毛發(fā)樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的毛發(fā)，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于毛發(fā)的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的毛發(fā)著色劑施用到頭發(fā)、眉毛或睫毛上，維持一段時(shí)間，該時(shí)間足以使基于肽的著色劑結(jié)合到頭發(fā)、眉毛或睫毛上。
50.基于肽的調(diào)理劑在毛發(fā)上形成保護(hù)層的方法，包含如下步驟a)提供一種包含毛發(fā)調(diào)理劑的毛發(fā)護(hù)理組合物，其中毛發(fā)調(diào)理劑選自i)(HBP)n-HCA；和ii)[(HBP)m-S]k-HCA其中1)HBP是一種毛發(fā)-結(jié)合肽；2)HCA是一種毛發(fā)調(diào)理劑；3)n從1到約1,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約1,000；并且其中的毛發(fā)-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)的文庫與毛發(fā)樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的毛發(fā)，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-毛發(fā)復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于毛發(fā)的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的毛發(fā)調(diào)理劑施用到毛發(fā)上，并使之形成所述的保護(hù)層。
51.在皮膚或唇上形成保護(hù)層的方法，包含如下步驟a)提供一種包含皮膚調(diào)理劑的皮膚護(hù)理組合物，其中皮膚調(diào)理劑選自i)(SBP)n-SCA；和ii)[(SBP)m-S]k-SCA其中1)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；2)SCA是一種皮膚調(diào)理劑；3)n從1到約1,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約1,000；并且其中的皮膚-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與皮膚樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的皮膚，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于皮膚的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的皮膚調(diào)理劑施用到皮膚或唇上，并使之形成所述的保護(hù)層。
52.一種對(duì)皮膚或唇進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含皮膚著色劑的化妝品組合物，其中皮膚著色劑選自i)(SBP)n-C；和ii)[(SBP)m-S]k-C其中1)SBP是一種皮膚-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的皮膚-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)的文庫與皮膚樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的皮膚，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-皮膚復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于皮膚的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的皮膚著色劑施用到皮膚或唇上。
53.一種對(duì)指甲進(jìn)行著色的方法，包含如下步驟a)提供一種包含指甲著色劑的指甲油組合物，其中指甲著色劑選自i)(NBP)n-C；和ii)[(NBP)m-S]k-C其中1)NBP是一種指甲-結(jié)合肽；2)C是一種著色劑；3)n從1到約10,000；4)S是一種間隔物；5)m從1到約50；和6)k從1到約10,000；并且其中的指甲-結(jié)合肽是通過如下方法選擇的，該方法包含如下步驟A)提供一種組合生成的噬菌體-肽文庫；B)將(A)文庫與指甲樣品進(jìn)行接觸，形成一種反應(yīng)溶液，其包含(i)噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；(ii)未結(jié)合的指甲，和(iii)未形成復(fù)合物的肽；C)分離(B)中的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物；D)從(B)的肽復(fù)合物中洗脫去結(jié)合能力弱的肽；E)鑒別仍然結(jié)合的噬菌體-肽，既可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，也可以直接將經(jīng)過步驟(D)后所保留下來的噬菌體-肽-指甲復(fù)合物感染細(xì)菌宿主細(xì)胞，在合適的生長培養(yǎng)基上生長感染的細(xì)胞，并從生長細(xì)胞中分離、鑒定噬菌體-肽，其中噬菌體-肽具有約7-約25個(gè)氨基酸，并且對(duì)于指甲的結(jié)合親和力以MB50計(jì)，等于或小于10-5M；和b)將(a)的指甲著色劑施用到指甲上。
54.根據(jù)權(quán)利要求49-53任一項(xiàng)所述的方法，其中組合生成的噬菌體-肽文庫選自Ph.D.-12噬菌體展示文庫和Ph.D.-7噬菌體展示文庫。
全文摘要
已經(jīng)確定，肽對(duì)毛發(fā)、皮膚和指甲具有很高的結(jié)合親和力。本發(fā)明描述了基于肽的毛發(fā)調(diào)理劑、毛發(fā)著色劑、皮膚調(diào)理劑、皮膚著色劑、和指甲著色劑?；陔牡拿l(fā)調(diào)理劑和毛發(fā)著色劑由一種分別與毛發(fā)調(diào)理劑或著色劑偶聯(lián)的毛發(fā)－結(jié)合肽組成?；陔牡钠つw調(diào)理劑和皮膚著色劑由一種分別與皮膚調(diào)理劑或著色劑偶聯(lián)的皮膚－結(jié)合肽組成。基于肽的指甲著色劑由一種與著色劑偶聯(lián)的指甲－結(jié)合肽組成。在所有的這些組合物中，肽可以直接與活性試劑偶聯(lián)，或者可以通過一種間隔物來偶聯(lián)。同時(shí)本發(fā)明還描述了包含這些基于肽的調(diào)理劑和著色劑的個(gè)人護(hù)理組合物。
文檔編號(hào)A61Q5/12GK1863501SQ200480001202
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者X·黃, H·王, Y·吳 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司