專利名稱：利用脂肪酶的甘油酯的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用脂肪酶的甘油酯的制造方法。更具體而言，本發(fā)明涉及利用脂肪酶的2-甘油一酸酯或甘油三酯、特別是在sn-2位上具有高度不飽和脂肪酸(PUFA)酸根的甘油三酯(TG)的制造方法。
在本發(fā)明中，“DHA”是表示二十二碳六烯酸的略稱，“EPA”是表示二十碳五烯酸的略稱，“ARA”是表示花生四烯酸的略稱。另外，當(dāng)使用DHA濃縮油脂、三DHA-甘油三酯的表示方法時，是作為二十二碳六烯酸酸根的略稱來使用的。
另外，“MG”是表示甘油一酸酯的略稱，“2-MG”是表示2-甘油一酸酯的略稱，“TG”是表示甘油三酯的略稱。
此外，“第一脂肪酶”是指對1，3位具有選擇性、并且進(jìn)行醇解時對長鏈脂肪酸也發(fā)生作用的脂肪酶。
“第二脂肪酶”是指對1，3位具有選擇性、并且當(dāng)使2-MG與脂肪酸酯或游離脂肪酸發(fā)生反應(yīng)時生成TG的脂肪酶。
而且就脂肪酶來說，根據(jù)脂肪酸的碳鏈長度不同，其活性也有很大的變化，針對于DHA等的長鏈脂肪酸的活性明顯減弱，因此，有可能得不到目的構(gòu)造類脂物。
另外，在脂肪酶的反應(yīng)中，可以舉出水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、酸解、酯化反應(yīng)等，但所有的脂肪酶并不是在相同條件下對任何反應(yīng)都顯示出相同程度的活性，而是存在著具有各種各樣特性的脂肪酶。例如，如果利用對于酸解具有強(qiáng)活性的1，3-脂肪酶，對1，3位的脂肪酸的置換就很有利，但這種脂肪酶在對DHA等不具有充分活性的情況下，由DHA位于1，3位的TG置換為其它的目的脂肪酸就變得非常困難。當(dāng)然，如果利用對酸解具有高活性、對DHA活性也很高的脂肪酶可以達(dá)到目的，但是這樣的脂肪酶難以得到，而且因為極其昂貴，一般不被選擇用于工業(yè)用途。
本發(fā)明以甘油酯的制造方法為要點，其特征在于利用第一1，3-脂肪酶對原料TG進(jìn)行醇解，從而制造2-MG。
當(dāng)2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是利用第一1，3-脂肪酶對原料TG進(jìn)行醇解，從而制造2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG。
當(dāng)原料TG是含有高度不飽和脂肪酸的油酯、優(yōu)選為DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂或ARA濃縮油脂時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是利用第一1，3-脂肪酶對含有高度不飽和脂肪酸的油酯、優(yōu)選為DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂或ARA濃縮油脂進(jìn)行醇解，從而制造2-MG。
當(dāng)上述的油脂是魚油時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是利用第一1，3-脂肪酶對魚油、優(yōu)選為DHA濃縮魚油或EPA濃縮魚油進(jìn)行醇解，從而制造2-MG。
當(dāng)原料TG是三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是利用第一1，3-脂肪酶對三DHA-TG或三EPA-TG進(jìn)行醇解，從而制造2-MG。
另外，本發(fā)明以甘油酯的制造方法為要點，其特征在于首先利用第一1，3-脂肪酶對上述的2-MG、即原料TG進(jìn)行醇解，得到2-MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
當(dāng)2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對原料TG進(jìn)行醇解，得到2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
當(dāng)在1，3位上導(dǎo)入的脂肪酸酸根是碳原子數(shù)為8、10或12的中鏈飽和脂肪酸酸根時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對原料TG進(jìn)行醇解，得到2-MG、優(yōu)選為在2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入碳原子數(shù)為8、10或12的中鏈飽和脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
當(dāng)原料TG是含有高度不飽和脂肪酸的油酯、優(yōu)選為DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂或ARA濃縮油脂時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對含有高度不飽和脂肪酸的油酯、優(yōu)選為DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂或ARA濃縮油脂進(jìn)行醇解，得到2-MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
上述的油脂是魚油時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對魚油、優(yōu)選為DHA濃縮魚油或EPA濃縮魚油進(jìn)行醇解，得到2-MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
原料TG是三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG時，本發(fā)明的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG進(jìn)行醇解，得到2-MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。
本發(fā)明的優(yōu)選的甘油酯的制造方法的特征是首先利用第一1，3-脂肪酶對原料TG進(jìn)行醇解，得到2-MG，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的TG。即，本發(fā)明是，將脂肪酶的反應(yīng)分為兩個階段，首先利用第一1，3-脂肪酶從TG開始經(jīng)醇解調(diào)制得到2-MG，然后，使用希望導(dǎo)入至1，3位上的脂肪酸的低級烷基酯或游離脂肪酸，在第二1，3-脂肪酶的作用下，通過2-MG的酯化反應(yīng)調(diào)制得到TG的方法。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，某種脂肪酶與TG反應(yīng)，即使在酸解或水解中未得到所期望的結(jié)果，但經(jīng)過醇解，即使DHA等難以使脂肪酶發(fā)揮作用的脂肪酸處于1，3位時，大體上也可以完全地將1，3位上的脂肪酸除去，從而得到2-MG。又發(fā)現(xiàn)，接著使希望導(dǎo)入1，3位的脂肪酸酯或游離脂肪酸對2-MG作用，可以非常高純度且高效率地得到目的構(gòu)造的TG，將這些程序按順序進(jìn)行組合，就完成了本發(fā)明。
就第一階段所使用的第一脂肪酶來說，只要是對1，3位具有選擇性、并在進(jìn)行乙醇分解、甲醇分解等的醇解時能對DHA等長碳鏈的脂肪酸也產(chǎn)生作用，就不特別限制。作為達(dá)到此目的可以利用的脂肪酶，可舉出南極洲念珠菌屬(Candida antarctica)脂肪酶(例如Novozym435[諾和諾德生物工業(yè)公司(株)])，并作為優(yōu)選的例子。
就第二階段所使用的第二脂肪酶來說，只要是對1，3位具有選擇性、并能使2-MG與脂肪酸酯或游離脂肪酸在減壓下發(fā)生反應(yīng)、從而生成TG，就不特別限制。作為達(dá)到此目的可以利用的脂肪酶，可舉出Rhizomucor miehei脂肪酶(例如Lipozyme IM[諾和諾德生物工業(yè)公司(株)])，并作為優(yōu)選的例子。作為脂肪酸酯，可例舉出乙酯等的低級烷基酯。
本發(fā)明的最優(yōu)選的制造方法的特征是首先利用Novozym435對原料TG進(jìn)行醇解，得到2-MG，再用Lipozyme IM在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，從而得到目的構(gòu)造的TG。
原料TG優(yōu)選為含有高度不飽和脂肪酸的油脂，高度不飽和脂肪酸是DHA、EPA或ARA。本發(fā)明的方法中所用的原料TG例如為魚油，優(yōu)選為DHA濃縮油脂或三DHA-TG、或者、EPA濃縮油脂或三EPA-TG、或者、ARA濃縮油脂或三ARA-TG。本發(fā)明的方法中所用的導(dǎo)入到1，3位上的脂肪酸，優(yōu)選為碳原子數(shù)是8、10或12的飽和脂肪酸。
在本發(fā)明中，作為原料的TG，在使用只由高度精制的DHA構(gòu)成的三DHA-TG時，可得到高純度的X-DHA-X型的TG，而這在現(xiàn)有的酸解和市售脂肪酶的組合中所進(jìn)行的調(diào)制是非常困難的。另外，此時如果選擇碳原子數(shù)為8～12的中鏈脂肪酸為導(dǎo)入到1，3位上的脂肪酸，則可以得到具有良好吸收性的含有DHA的TG，如果將其用于嬰幼兒的奶粉中，則可以期待得到很好的效果。
此外，也可以同樣地調(diào)制含有EPA的構(gòu)造類脂物，得到吸收性高的含有EPA的TG，此時可以得到具備EPA所固有的多種生理活性的食品、醫(yī)藥品。
眾所周知，魚油本身在sn2位上就存在DHA，如果將本發(fā)明適用于DHA含量比較高的金槍魚油或鰹魚油，則可以得到使吸收性增大、具有良好營養(yǎng)的油脂。另外，如果使用以脫蠟等方法將原料魚油中的DHA濃度已濃縮的魚油，還可以得到DHA含量高的目的構(gòu)造的TG。
將脂肪酶的反應(yīng)分為兩個階段，在第一階段，首先從TG開始用第一1，3-脂肪酶進(jìn)行醇解，即使DHA等難以發(fā)揮脂肪酶作用的脂肪酸處于1，3位上，也可基本上將1，3位上的脂肪酸完全地除去，得到2-MG。
然后，在第二階段，使用要導(dǎo)入到1，3位上的脂肪酸的低級烷基酯或游離脂肪酸，在第二1，3-脂肪酶的作用下，進(jìn)行2-MG的酯化反應(yīng)，就可以非常高純度且高效率地得到目的構(gòu)造的TG。
實施例1將1g鰹魚油、3g乙醇、0.4g Novozym435混合，并在氮氣氣流、35℃下進(jìn)行2小時的攪拌。反應(yīng)后，反應(yīng)混合物的類脂物組成用Iatroscan測定，其結(jié)果為乙酯69.5％，甘油二酯2.3％，MG28.3％，TG、游離脂肪酸未檢出。用薄層色譜法分析的結(jié)果，確認(rèn)MG是2-MG。另外，經(jīng)用氣相色譜法對脂肪酸的組成進(jìn)行測定后的結(jié)果為相對于原料鰹魚油的DHA的27.9％，MG的DHA為51.5％。
實施例2以沙丁魚油作為原料，為達(dá)到將PUFA濃縮的目的，以丙酮作溶媒進(jìn)行脫蠟，將所得的1g油、3g乙醇、0.4gNovozym435混合，并在氮氣氣流、35℃下進(jìn)行3小時的攪拌。反應(yīng)后，反應(yīng)混合物的類脂物組成用Iatroscan測定，其結(jié)果為乙酯67.7％，甘油二酯1.9％，MG30.4％，TG、游離脂肪酸未檢出。用薄層色譜法分析的結(jié)果，確認(rèn)MG是2-MG。另外，經(jīng)用氣相色譜法對脂肪酸的組成進(jìn)行測定后的結(jié)果為相對于脫蠟油的DHA的13.0％，MG的DHA為28.8％。
實施例3將0.184g甘油、0.184g水、0.239g Novozym435混合并攪拌30分鐘后，加入1.971g的DHA，在60℃、3～5mmHg的減壓下進(jìn)行一夜的攪拌。將酶過濾分離，反應(yīng)混合物用硅膠柱進(jìn)行精制，結(jié)果得到1.83g的三DHA-TG(純度99％、回收率89％)。
將得到的0.102g三DHA-TG、0.306g乙醇和0.046g的Novozym435混合，并在35℃氮氣氣流中進(jìn)行4小時的攪拌。將酶過濾分離，甘油酯組分的組成用Iatroscan分析，其結(jié)果為MG為92.7％，甘油二酯為5.35％，TG為1.96％。用薄層色譜法分析的結(jié)果，確認(rèn)MG為100％的2-MG。
實施例4進(jìn)行與實施例3同樣的操作，從得到的反應(yīng)混合物開始，將酶過濾分離后殘存的乙醇，進(jìn)行減壓蒸餾除去，在全部殘留物質(zhì)中加入0.345g的辛酸乙脂、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在氮氣氣流、35℃下進(jìn)行30分鐘的攪拌。接著用真空泵將反應(yīng)容器減壓至3～5mmHg，在35℃下繼續(xù)進(jìn)行3.5小時的攪拌。將所得的混合物的甘油酯組分的組成用氣相色譜法以及銀離子柱高速液相色譜儀進(jìn)行分析，其結(jié)果為2位為DHA、1，3位為辛酸的TG含量是81.4％。
實施例5進(jìn)行與實施例3同樣的操作，在由所得到的反應(yīng)混合物經(jīng)分餾所得的0.040g 2-DHA-MG中，加入0.289g的辛酸、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮氣氣流下進(jìn)行30分鐘的攪拌。接著用真空泵將反應(yīng)容器減壓至3～5mmHg，在35℃下繼續(xù)進(jìn)行3.5小時的攪拌。將所得的反應(yīng)混合物的甘油酯組分的組成用氣相色譜法以及銀離子柱高速液相色譜儀進(jìn)行分析，其結(jié)果為2位為DHA、1，3位為辛酸的TG含量是78.8％。
實施例6將0.184g甘油、0.184g水和0.239g Novozym435混合并攪拌30分鐘后，加入1.815g EPA，在60℃、3～5mmHg的減壓下進(jìn)行一夜的攪拌。將酶過濾分離，反應(yīng)混合物用硅膠柱進(jìn)行精制，結(jié)果得到1.74g的三EPA-TG(純度99％、回收率92％)。
將得到的0.094g三EPA-TG、0.283g乙醇和0.038g Novozym435混合，并在35℃下進(jìn)行4小時的攪拌。將酶過濾分離，甘油酯組分的類脂物組成用Iatroscan分析，其結(jié)果為MG為98.5％，甘油二酯為5.35％，TG為0.42％。用薄層色譜法分析的結(jié)果，確認(rèn)MG為100％的2-MG。
實施例7進(jìn)行與實施例6同樣的操作，從得到的反應(yīng)混合物開始，將酶過濾分離后殘存的乙醇，進(jìn)行減壓蒸餾除去，在全部殘留物質(zhì)中加入0.400g的癸酸乙脂、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮氣氣流下進(jìn)行30分鐘的攪拌。接著用真空泵將反應(yīng)容器減壓至3～5mmHg，在35℃下繼續(xù)進(jìn)行3.5小時的攪拌。將反應(yīng)后所得的甘油酯組分的組成用氣相色譜法以及銀離子柱高速液相色譜儀進(jìn)行分析，其結(jié)果為2位為EPA、1，3位為癸酸的TG的含量是72.7％。
實施例8進(jìn)行與實施例6同樣的操作，在由所得到的反應(yīng)混合物經(jīng)分餾所得的0.037g 2-EPA-MG中，加入0.345g的癸酸、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮氣氣流下進(jìn)行30分鐘的攪拌。接著用真空泵將反應(yīng)容器減壓至3～5mmHg，在35℃下繼續(xù)進(jìn)行3.5小時的攪拌。將反應(yīng)后所得的甘油酯組分的組成，用氣相色譜法以及銀離子柱高速液相色譜儀進(jìn)行分析，其結(jié)果為2位為EPA、1，3位為癸酸的TG的含量是70.6％。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性可以提供非常高效率且高純度地制造目的構(gòu)造的TG、特別是在sn-2位上具有PUFA的TG的制造方法。
另外，也可提供對作為用于目的構(gòu)造的TG制造的中間體特別有用的2-MG的制造方法。
權(quán)利要求
1.一種甘油酯的制造方法，其特征在于利用第一1，3-脂肪酶對原料甘油三酯進(jìn)行醇解，制造2-甘油一酸酯。
2.一種甘油酯的制造方法，其特征在于首先利用第一1，3-脂肪酶對原料甘油三酯進(jìn)行醇解，得到2-甘油一酸酯，再利用第二1，3-脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，得到在2位上具有來自原料甘油三酯的脂肪酸酸根、在1，3位上具有新導(dǎo)入的同一脂肪酸酸根的構(gòu)造的甘油三酯。
3.如權(quán)利要求2所述的甘油酯的制造方法，其特征在于2位的脂肪酸酸根為DHA、EPA或ARA的酸根。
4.如權(quán)利要求2或3所述的甘油酯的制造方法，其特征在于導(dǎo)入到1，3位上的脂肪酸酸根是碳原子數(shù)為8、10或12的中鏈飽和脂肪酸酸根。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項所述的甘油酯的制造方法，其特征在于原料甘油三酯為含有高度不飽和脂肪酸的油脂。
6.如權(quán)利要求5所述的甘油酯的制造方法，其特征在于所述油脂為DHA濃縮油脂、EPA濃縮油脂或ARA濃縮油脂。
7.如權(quán)利要求5或6所述的甘油酯的制造方法，其特征在于所述油脂為魚油。
8.如權(quán)利要求1或2所述的甘油酯的制造方法，其特征在于原料甘油三酯為三DHA-甘油三酯、三EPA-甘油三酯或三ARA-甘油三酯。
全文摘要
本發(fā)明提供一種非常高純度且高效率地制造2－甘油一酸酯(2－MG)或甘油三酯(TG)、特別是在sn－2位上具有高度不飽和脂肪酸(PUFA)酸根的TG的方法。利用第一1，3位脂肪酶對原料TG進(jìn)行加醇分解，制造2－MG。再將得到的2－MG利用第二1，3位脂肪酶在1，3位上導(dǎo)入脂肪酸酸根，制造TG。2位的脂肪酸酸根優(yōu)選為DHA、EPA、ARA的酸根。在此，“第一脂肪酶”是指對1，3位具有選擇性、并且進(jìn)行醇解時對長鏈的脂肪酸也發(fā)生作用的脂肪酶，“第二脂肪酶”是指對1，3位具有選擇性、并且當(dāng)使2－MG與脂肪酸酯或游離脂肪酸發(fā)生反應(yīng)時生成TG的脂肪酶。
文檔編號C11C3/00GK1441848SQ01812559
公開日2003年9月10日 申請日期2001年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月13日
發(fā)明者羅克薩娜·伊里梅斯庫, 降旗清代美, 秦和彥, 山根恒夫 申請人:日本水產(chǎn)株式會社