用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括間充質(zhì)干細(xì)胞特別是GD2表達(dá)呈陽(yáng)性的基質(zhì)細(xì)胞和KDR2表達(dá)呈陽(yáng)性的造血干細(xì)胞的治療劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞特別是GD2表達(dá)呈陽(yáng)性的基質(zhì)細(xì)胞和KDR2表達(dá)呈陽(yáng)性的造血干細(xì)胞二者組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。本發(fā)明治療劑和治療方法可以有效地用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退，并有效地應(yīng)用于早老癥和早衰患者。
【專利說(shuō)明】
用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括GD2+基質(zhì)細(xì)胞和KDR2+造血干細(xì)胞的治療劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及GD2+基質(zhì)細(xì)胞和KDR2+造血干細(xì)胞二者組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明治療劑可以有效地用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制等特點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，尤其對(duì)治療衰老和組織器官損傷修復(fù)有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003]MSC在骨髓中蘊(yùn)含豐富，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細(xì)胞數(shù)目也會(huì)顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植給異體可能引起免疫反應(yīng)，且提取干細(xì)胞過(guò)程對(duì)患者的損傷性和在采集時(shí)遇到的其他問(wèn)題，都直接影響了骨髓MSC的臨床應(yīng)用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源成為一個(gè)重要的問(wèn)題。
[0004]近期的研究顯示，臍帶組織和胎盤組織中也含有間充質(zhì)干細(xì)胞并且能成功分離。這種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，而且分離出來(lái)的干細(xì)胞更原始，有更強(qiáng)的增殖分化能力。其免疫細(xì)胞的功能活性低，大大減低了觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)產(chǎn)婦及新生兒無(wú)任何危害及損傷。以上原因足以令臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物。
[0005]造血干細(xì)胞(通?？s寫為HSC)，是指具有自我更新和多向分化能力的一類細(xì)胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期活動(dòng)之后，可以產(chǎn)生兩個(gè)與分裂前性質(zhì)相同的造血干細(xì)胞，同時(shí)又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細(xì)胞具有向各系血細(xì)胞分化的能力。
[0006]造血干細(xì)胞移植目前廣泛應(yīng)用于惡性血液病(如急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等)、非惡性難治性血液病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)遺傳性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海貧血等)和某些實(shí)體瘤治療。造血干細(xì)胞移植是指對(duì)病人進(jìn)行全身照射、化療和免疫抑制預(yù)處理后，將正常供體或自體的造血干細(xì)胞經(jīng)血管輸注給病人，使重建正常的造血和免疫功能。
[0007]一般來(lái)說(shuō)，造血干細(xì)胞存在于三個(gè)部位，分別是骨髓、外周血和臍帶血，根據(jù)其來(lái)源分別稱之為骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞。隨著醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)胎盤里含有大量的造血干細(xì)胞，與上述三種來(lái)源的造血干細(xì)胞相比，胎盤中所含造血干細(xì)胞的數(shù)量很高，而且移植胎盤造血干細(xì)胞的配型要求不需要很嚴(yán)格，且移植后反應(yīng)較輕且不需要采用藥物。此外，作為胎盤造血干細(xì)胞來(lái)源-胎盤，來(lái)源廣泛，孕婦生產(chǎn)后往往成為廢棄物，其采集不會(huì)引起母親和新生兒任何不適的感覺(jué)或產(chǎn)生任何不良的影響。諸多優(yōu)點(diǎn)使胎盤造血干細(xì)胞有望取代骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì)胞和臍帶血造血干細(xì)胞用于造血干細(xì)胞移植中。
[0008]目前在國(guó)際血液系統(tǒng)疾病的治療中主要采取的造血干細(xì)胞移植的方法，根據(jù)細(xì)胞的來(lái)源，可分為三類:骨髓造血干細(xì)胞移植(BMT)、動(dòng)員周圍血干細(xì)胞移植(MPST)和臍帶血干細(xì)胞移植(UCBT) ο前兩者干細(xì)胞來(lái)源豐富，一般有核細(xì)胞數(shù)可達(dá)5-10 X 108/Kg，⑶34+細(xì)胞(一種造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)記)可達(dá)1-5 XlOVKg，可是由于供者和受體之間需HLA嚴(yán)格相符，才能保證移植的成功，否則供者造血干細(xì)胞不易在病人體內(nèi)植活，即使成活也會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的移植物抗宿主病(GVHD)。在一個(gè)家庭的子女中，僅有1/4HLA相符的機(jī)率，而在非血緣關(guān)系的無(wú)關(guān)供者中，這種機(jī)率只有百分之一，極大的限制了BMT或MPST在臨床上的廣泛應(yīng)用。
[0009]近十余年來(lái)臍帶血造血干細(xì)胞移植在臨床上成功的應(yīng)用促進(jìn)了臍帶血造血干細(xì)胞研究的發(fā)展。臍帶血來(lái)自于胎盤，通常在婦女分娩后廢棄，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)臍帶血中含豐富的造血干細(xì)胞，其⑶34+細(xì)胞的濃度和骨髓類似，約占總細(xì)胞數(shù)的0.1-0.5 %，而更早期的造血干細(xì)胞CD34-還較骨髓濃度更高。作為一種造血細(xì)胞的來(lái)源，現(xiàn)在利用臍帶血移植手術(shù)正在逐漸增加。與BMT相比，UCBT的優(yōu)勢(shì)在于減少了嚴(yán)重的移植物抗宿主反應(yīng)，有效的擴(kuò)大了對(duì)于那些缺少合適的人類白細(xì)胞抗原配型家庭或者無(wú)關(guān)供體移植的可能性。臍帶血移植主要的限制在于臍血中的造血干細(xì)胞數(shù)量有限，這種限制促使臨床中需要使用2倍劑量單位的臍血，移植體重較大的成年受助人;另一種方法是進(jìn)行體外造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，但體外擴(kuò)增需要花費(fèi)時(shí)間，費(fèi)用也高，更重要的是擴(kuò)增的同時(shí)，造血干細(xì)胞也發(fā)生分化，臨床應(yīng)用的結(jié)果表明臍血造血干細(xì)胞擴(kuò)增前后對(duì)移植無(wú)多大差異。
[0010]人類足月胎盤存在大量的造血干細(xì)胞，比臍帶血有更多的造血干細(xì)胞，而且這些胎盤造血干細(xì)胞在冷凍儲(chǔ)存前后都可以分離出來(lái)。胎盤造血干細(xì)胞菌落形成單位(CFU)的活性是確定的，在免疫缺陷鼠中的移植實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明胎盤造血干細(xì)胞在移植中的潛力。這些結(jié)果有力地表明，人類足月胎盤有可能成為一種新型的用于移植的造血干細(xì)胞的來(lái)源。胎盤中有大量的造血干細(xì)胞，胎盤造血干細(xì)胞是較為早期的干細(xì)胞，能在體內(nèi)分化成各種細(xì)胞，胎盤血內(nèi)含有豐富的各種階段早期造血干細(xì)胞，其含量大約是臍帶血的十幾倍，一個(gè)胎盤中的造血干細(xì)胞可完全滿足于兩個(gè)成年人的需求，若能和臍帶血細(xì)胞一起應(yīng)用于病人，無(wú)疑大大增加了造血干細(xì)胞的含量，這使造血干細(xì)胞可完全應(yīng)用于所有的適用人群。
[0011]機(jī)體機(jī)能老化和臟器功能衰退較為特殊且典型的表現(xiàn)為早老癥(人們通常亦稱為早衰癥)。修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退是治療早老癥的必要手段。令人遺憾的是，迄今為止臨床上尚無(wú)有效的治療早老癥的方法。
[0012]因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切期待有一種有效的方法來(lái)治療早老癥，從而實(shí)現(xiàn)修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種有效的方法來(lái)延緩和治療早老癥，從而實(shí)現(xiàn)修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞可以有效地修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化以及延緩臟器功能衰退，從而達(dá)到治療早老癥的目的。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。
[0014]為此，本發(fā)明一方面提供了間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。
[0015]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是GD2+基質(zhì)細(xì)胞。
[0016]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0017]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞。
[0018]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞，且⑶2陽(yáng)性表達(dá)率大于90%，例如大于95%。
[0019]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞來(lái)源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動(dòng)員外周血。
[0020]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞。
[0021]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%，例如大于90%。
[0022]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細(xì)胞中⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%，例如大于85%。
[0023]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。
[0024]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。
[0025]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞?；蛘?，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物，例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5)X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤體重用量為(2?4) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在I個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。
[0027]進(jìn)一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，其呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。
[0028]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是GD2+基質(zhì)細(xì)胞。
[0029]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞。
[0031]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞，且GD2陽(yáng)性表達(dá)率大于90%，例如大于95%。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞來(lái)源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動(dòng)員外周血。
[0033 ]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞。
[0034]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%，例如大于90%。
[0035]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細(xì)胞中CD34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%，例如大于85 %。
[0036]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。
[0037]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞?；蛘撸谝粋€(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5)X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。
[0038]根據(jù)本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在I個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。
[0039]本發(fā)明所用的間充質(zhì)干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。
[0040]例如，對(duì)于通過(guò)胎盤獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210292509.9中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的GD2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%的GD2+基質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，獲得該GD2+基質(zhì)細(xì)胞的方法包括以下步驟:
[0041 ] (I)胎盤組織清洗:胎盤組織是在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行處理，根據(jù)胎盤大小使用適量PBS緩沖液對(duì)胎盤組織進(jìn)行沖洗2-3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無(wú)血液凝塊；
[0042](2)胎盤組織消化處理:使用手術(shù)剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把小葉轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上，加入25ml PBS緩沖液并把胎盤小葉盡量剪碎，加入25ml 0.25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養(yǎng)皿放進(jìn)37°C的恒溫?fù)u床里消化20分鐘；
[0043](3)胎盤組織過(guò)濾處理:往培養(yǎng)皿里加入5ml FBS(Gibco)并混勻以達(dá)到終止消化的目的，把消化過(guò)后的胎盤組織碎片轉(zhuǎn)移到200目金屬過(guò)濾器上，對(duì)胎盤組織碎片進(jìn)行研磨并利用另一培養(yǎng)皿收集過(guò)濾完的液體，分開(kāi)兩次往金屬過(guò)濾器加入1ml的PBS緩沖液清洗組織并繼續(xù)研磨，將收集的濾液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，以速度HOOrpm離心10分鐘，去除上清液并加入I3BS緩沖液重懸細(xì)胞，以速度HOOrpm離心10分鐘，去除上清液，加入I3BS緩沖液重懸細(xì)胞，抽取小量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以速度1400rpm離心10分鐘以達(dá)到清洗細(xì)胞的效果；
[0044](4)配制胎盤全細(xì)胞凍存液:所述胎盤全細(xì)胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO(二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-Fl2，配好的凍存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0045](5)胎盤全細(xì)胞凍存:將步驟(3)得到的胎盤組織過(guò)濾液離心后去除上清液，在4°C的低溫環(huán)境下，加入步驟(4)得到的全細(xì)胞凍存液，然后以每一管每毫升4X 17到I X 18的細(xì)胞密度加入凍存管里，此過(guò)程需在4°C的低溫條件下進(jìn)行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏0.5小時(shí)，再-80°C的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；
[0046]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括與凍存方法配套使用的復(fù)蘇方法:
[0047](6)凍存胎盤全細(xì)胞復(fù)蘇:將步驟(4)冷凍的胎盤全細(xì)胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開(kāi)始融化，利用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1%L_Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)進(jìn)行點(diǎn)滴法清洗胎盤全細(xì)胞，解凍獲得的細(xì)胞懸液與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比為1:3(lml:3ml)，將混合有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，以速度HOOrpm離心10分鐘清洗DMSO，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并以I份細(xì)胞懸液比2-3份紅細(xì)胞裂解液的比例加入紅細(xì)胞裂解液(Roche)，在15-25°C的環(huán)境下培養(yǎng)10-15分鐘，放進(jìn)離心機(jī)以速度HOOrpm離心10分鐘進(jìn)行離心，離心后去除上清液，觀察紅細(xì)胞裂解情況，如有需要再重復(fù)紅細(xì)胞裂解的步驟進(jìn)行裂解，最后加入PBS緩沖液重懸細(xì)胞并抽取小量樣本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，放進(jìn)離心機(jī)以速度1400rpm離心10分鐘進(jìn)行離心以清洗細(xì)胞，去除上清液；
[0048]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括復(fù)蘇后間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的方法:
[0049](7)細(xì)胞培養(yǎng):向步驟(6)得到的全細(xì)胞中補(bǔ)加適量的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶，再將T25培養(yǎng)瓶放進(jìn)C02濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天時(shí)將T25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行第一次半換液，繼續(xù)培養(yǎng)，在第9天時(shí)將T25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進(jìn)行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養(yǎng)基抽走，加入15ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，往后每2天進(jìn)行一次全換液；
[0050](8)細(xì)胞傳代:當(dāng)T25培養(yǎng)瓶里面的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細(xì)胞脫離T25培養(yǎng)瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng);此后每?jī)商鞊Q液一次直至融合率達(dá)到80 %后，即得，必要時(shí)再進(jìn)行傳代。
[0051]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地針對(duì)以上步驟(8)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng):細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；
[0052]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地將以上步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存，備用。
[0053]在上述獲得的⑶2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞的這種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行GD2陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)，選取GD2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%例如不低于95%的GD2+基質(zhì)細(xì)胞作為本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0054]又例如，對(duì)于通過(guò)臍帶獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210159916.2中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的GD2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%的GD2+基質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，獲得該GD2+基質(zhì)細(xì)胞的方法包括以下步驟:
[0055](I)配制臍帶組織凍存液:所述臍帶組織凍存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMS0(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)，配好的冷存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0056](2)消毒和清洗:在生物安全柜中，用酒精對(duì)臍帶組織表面進(jìn)行消毒，將臍帶從中間剪開(kāi)，平鋪在無(wú)菌1cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿上，利用PBS清洗組織，以減小組織上面的紅細(xì)胞；
[0057](3)臍帶組織處理:將步驟(2)得到的臍帶組織轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，將臍帶組織剪成大小lcm3的正方形狀；
[0058](4)臍帶組織冷存:在4°C的低溫環(huán)境下，將組織塊和凍存液加入凍存管中，然后將凍存管放入程序降溫盒，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏0.5小時(shí)，再-80 V的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；
[0059]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括與凍存方法配套使用的復(fù)蘇方法:
[0060](5)凍存臍帶組織復(fù)蘇:將步驟(4)冷凍的臍帶組織從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開(kāi)始融化，利用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1%L-Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)進(jìn)行點(diǎn)滴法清洗臍帶組織，利用10um過(guò)濾器將廢液去掉；
[0061]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地包括復(fù)蘇后間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴(kuò)增的方法:
[0062](6)臍帶組織貼壁處理:將復(fù)蘇的凍存臍帶組織平鋪于另一個(gè)1cm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，每個(gè)平皿中的組織塊數(shù)量維持在10-15塊，使組織塊風(fēng)干10-15分鐘直至組織貼在平皿上；
[0063](7)臍帶組織培養(yǎng):沿平皿邊緣慢慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1 % L-Glutamine+0.05% Gentami cin+84 % DMEM-F12)至組織淹沒(méi)即可；將平皿置于 C02濃度為5%的37 °C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五天時(shí)將平皿從培養(yǎng)箱取出，補(bǔ)加5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基;在第十天將平皿內(nèi)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移，加入15ml新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基;在第十二天清除所有臍帶組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)，此后每?jī)商爝M(jìn)行一次全換液；
[0064](8)細(xì)胞傳代:當(dāng)平皿里面的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細(xì)胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng);此后每?jī)商鞊Q液一次直至融合率達(dá)到80 %后，即得，必要時(shí)再進(jìn)行傳代；
[0065]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地針對(duì)以上步驟(8)所得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng):細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；
[0066]必要時(shí)，可以進(jìn)一步地將以上步驟(8)所得傳代后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存，備用。
[0067]在上述獲得的⑶2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%的⑶2+基質(zhì)細(xì)胞的這種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行GD2陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)，選取GD2陽(yáng)性表達(dá)率不低于90%例如不低于95%的GD2+基質(zhì)細(xì)胞作為本發(fā)明使用的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0068]本發(fā)明所用的造血干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。
[0069]例如，對(duì)于通過(guò)胎盤獲得的造血干細(xì)胞，可以參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?014104050724中的方法獲得，例如通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的造血干細(xì)胞中CD34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%，例如大于85% ;并且，通過(guò)該文獻(xiàn)方法獲得的造血干細(xì)胞中KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%，例如大于90 % ο在一個(gè)實(shí)例中，獲得該KDR2陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞的方法包括以下步驟:胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預(yù)消毒、胎盤及母血檢測(cè)、胎盤造血干細(xì)胞的灌洗、造血干細(xì)胞的濃縮純化。各步驟具體為:
[0070](I)胎盤的收集:在手術(shù)室無(wú)菌環(huán)境下收集胎盤及母血，存放于無(wú)菌的胎盤儲(chǔ)運(yùn)盒中，貼好標(biāo)簽、條碼，胎盤儲(chǔ)運(yùn)盒的溫度保持在4-10°C，24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；
[0071](2)胎盤的初檢:檢查胎盤儲(chǔ)運(yùn)盒盒內(nèi)溫度、標(biāo)簽、送達(dá)日期、儲(chǔ)運(yùn)盒是否有滲漏、是否有母血血樣；
[0072](3)胎盤的預(yù)消毒:將胎盤的胎兒面展開(kāi)放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開(kāi)胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤表面鈣化情況；
[0073](4)胎盤及母血檢測(cè):對(duì)所取的胎盤和母血樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的項(xiàng)目包括肝炎病毒檢測(cè)、艾滋病毒檢測(cè)、性病檢測(cè)、組織配型(HLA)檢測(cè)、造血干/祖細(xì)胞定性檢測(cè)(CFU-GM);
[0074](5)胎盤造血干細(xì)胞的灌洗:將胎盤在無(wú)菌條件下用無(wú)菌生理鹽水清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將灌洗液針頭插入胎盤臍動(dòng)脈中，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，緩慢開(kāi)啟恒流栗，灌洗液經(jīng)膠管、開(kāi)關(guān)、蠕動(dòng)栗、針頭、胎盤動(dòng)脈、胎盤、胎盤靜脈、胎盤灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
[0075](6)造血干細(xì)胞的濃縮純化:將灌洗出來(lái)的灌洗液，在離心機(jī)中以1500-2000rpm離心15-20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按2: 1-1:2的比例混勻得混合液，然后將混合液和淋巴細(xì)胞分離液按2: 1-1: 2的比例分別加入到離心管中，添加的順序?yàn)橄仍陔x心管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過(guò)程中注意保持淋巴細(xì)胞分離液的液面平整，加完后以2200-2500rpm離心20-25分鐘，離心時(shí)慢加速慢減速，離心結(jié)束后，收集中間白膜層到新的離心管中，以2:1 -1:2的比例加生理鹽水混勻，1200-1500rpm離心10-15分鐘；離心結(jié)束后去掉上清液，加入10-20mL生理鹽水吹打沉淀，再1200-1500rpm離心10-15分鐘，離心結(jié)束后，去掉上清液，用DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細(xì)胞群，將重懸的細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細(xì)胞定量檢測(cè)(CD34)，造血干細(xì)胞活性檢測(cè)(臺(tái)盼藍(lán)染色)，造血干細(xì)胞定性檢測(cè)(CFU-GM)。
[0076]在上述獲得的⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%例如大于85%，且KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85 %例如大于90 %的造血干細(xì)胞過(guò)程中，對(duì)所獲得的造血干細(xì)胞進(jìn)行⑶34陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)和KDR2陽(yáng)性表達(dá)率，選取⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80 %例如大于85 %且KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85 %例如大于90 %的造血干細(xì)胞過(guò)作為本發(fā)明使用的造血干細(xì)胞。
[0077]或者，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的造血干細(xì)胞可照如下方法獲得:取造血干細(xì)胞來(lái)源組織(包括但不限于臍帶血、骨髓、胎盤血、動(dòng)員外周血)，按8:1?1:8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉(zhuǎn)移到AXP造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內(nèi)，裝入AXP造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)，放入離心機(jī)，以離心率(RCF) 1200?1600離心10?30min，再以RCF50?200離心5?15min后取出，自動(dòng)分離得到單個(gè)核細(xì)胞，導(dǎo)出AXP數(shù)據(jù)得到造血干細(xì)胞的分離數(shù)量。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的到的細(xì)胞的CD34和KDR2含量。然后將分離得到的細(xì)胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降溫至-90°C后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復(fù)蘇。使用上述方法獲得的⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%例如大于85%，且KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%例如大于90%的造血干細(xì)胞。
[0078]進(jìn)一步的，在凍存前，可以將本發(fā)明所述間充質(zhì)干細(xì)胞即⑶2+基質(zhì)細(xì)胞和KDR2+造血干細(xì)胞各自獨(dú)立地分裝于瓶子中，接著將兩個(gè)瓶子置于本發(fā)明所述藥盒中，得到本發(fā)明用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，接著將該治療劑在凍存條件下保存。
[0079]根據(jù)本發(fā)明記載的在動(dòng)物試驗(yàn)中獲得的結(jié)果，本發(fā)明人嘗試將本發(fā)明方法用于人特別是具有早老癥特征的患者以修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。結(jié)果顯示，本發(fā)明方法不但在動(dòng)物試驗(yàn)中呈現(xiàn)優(yōu)良的結(jié)果，而且在人體中呈現(xiàn)令人鼓舞結(jié)果。
[0080]本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實(shí)施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用其它任一實(shí)施方案或其它任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)相互矛盾，當(dāng)然在相互之間適用時(shí)，必要的話可對(duì)相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。
[0081]本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)作更詳盡的說(shuō)明和解釋，提及的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0082]通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。
[0083]在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞即GD2+基質(zhì)細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210292509.9之實(shí)施例1、6、7的方法獲得的，并且⑶2陽(yáng)性表達(dá)率大于95%。
[0084]在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即GD2+基質(zhì)細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210159916.2之實(shí)施例1、6、7的方法獲得的，并且⑶2陽(yáng)性表達(dá)率大于95%。
[0085]在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的胎盤造血干細(xì)胞是參照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?014104050724之實(shí)施例1的方法獲得的，并且CD34標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于85%、KDR2標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于90 %。
[0086]在本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)中，使用到的臍帶血造血干細(xì)胞其⑶34標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于85%、KDR/2標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率大于90%，并且是參照如下方法制備的:按8:1?1:8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉(zhuǎn)移到AXP造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內(nèi)，裝入AXP造血干細(xì)胞分離系統(tǒng)，放入離心機(jī)，以離心率(RCF) 1200?1600離心10?30min，再以RCF50?200離心5?15min后取出，自動(dòng)分離得到單個(gè)核細(xì)胞，導(dǎo)出AXP數(shù)據(jù)得到造血干細(xì)胞的分離數(shù)量。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的到的細(xì)胞的CD34和KDR2含量。然后將分離得到的細(xì)胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降溫至-90°C后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復(fù)蘇。
[0087]實(shí)施例1:使用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞即⑶2+基質(zhì)細(xì)胞與臍帶血KDR2+造血干細(xì)胞治療衰老小鼠
[0088]一、動(dòng)物的選擇和分組
[0089 ] 1、動(dòng)物的選擇:模型小鼠為健康C57BL/6 J小鼠，雌性，8周齡，重18?22g，60只。
[0090]2、動(dòng)物分組:單純隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組三組，每組20只。
[0091]二、建立小鼠衰老模型
[0092]模型組和治療組每日頸背部皮下注射5%的D-半乳糖，注射量為0.25ml/10g，連續(xù)給藥8-16周建立衰老動(dòng)物模型。對(duì)照組則給予相同體積的生理鹽水。
[0093]三、輸注
[0094]衰老模型建成兩周之后，治療組注射⑶2+胎盤MSC和KDR2+臍帶血HSC。采用表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體標(biāo)記GD2+MSC及臍帶血KDR2+HSC，以確定⑶2+MSC及臍帶血KDR2+HSC在小鼠各臟器的植入情況。檢測(cè)治療前后衰老相關(guān)指標(biāo):包括小鼠體重、胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的變化。
[0095]治療組第一個(gè)療程:經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源GD2+胎盤MSC單細(xì)胞懸液2 X 16/
0.2mL/只，每周給藥一次，共給藥4次為一個(gè)療程。第二個(gè)療程:第一周經(jīng)小鼠尾靜脈輸注人源⑶2+胎盤MSC單細(xì)胞懸液2 X 106/0.2mL/只，第二周輸注人源KDR2+臍帶血HSC單細(xì)胞懸液2 X 106/0.2mL/只，以后每療程均輸注GD2+胎盤MSC;對(duì)照組和衰老模型組給予同等劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0096]四、方法
[0097]1、用尾靜脈注射架固定小鼠。
[0098]2、用酒精棉球擦尾巴使血管擴(kuò)張;注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見(jiàn)兩根紅色靜脈。
[0099]3、用左手的食指，中指，無(wú)名指及大拇指將小鼠尾巴固定。握住Iml注射器前面
0.1CM處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處，按此手形進(jìn)針。
[0100]4、注射:注射時(shí)左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進(jìn)針部位，一般選擇距離尾尖1/4或1/3處進(jìn)針。針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進(jìn)針，針扎入時(shí)有落空感，緩慢推注。
[0101]五、結(jié)果:
[0102]1.治療組在受體小鼠中定植，治療組小鼠胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織MDA及CAT含量明顯低于對(duì)照組、SOD活力明顯高于對(duì)照組并且存在顯著性差異(P彡0.05)，與模型組相比，則存在極顯著性差異(PS0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0103]2.各組小鼠的組織病理切片顯示，模型組小鼠的各臟器結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，而細(xì)胞治療組小鼠的各臟器損傷有明顯修復(fù)。結(jié)果可見(jiàn)MSC對(duì)衰老小鼠的臟器損傷有修復(fù)作用，從而發(fā)揮其抗衰老作用。
[0104]六、結(jié)論:GD2+MSC與KDR2+HSC聯(lián)合治療明顯改善D-半乳糖誘導(dǎo)亞急性衰老模型小鼠的衰老相關(guān)指標(biāo)，表明GD2+MSC和KDR2+HSC 二者組合使用具有顯著的修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和臟器功能衰退的作用。
[0105]補(bǔ)充試驗(yàn):參照以上實(shí)施例1，但是在治療時(shí)僅使用GD2+MSC以及僅使用KDR2+HSC治療，卻發(fā)現(xiàn)均未呈現(xiàn)任何治療作用。
[0106]實(shí)施例2:MSC+HSC治療衰老小鼠的機(jī)制研究
[0107]衰老相關(guān)B-半乳糖苷酶(SAKal)活性檢測(cè)
[0108]1、細(xì)胞標(biāo)本收集分別取對(duì)照組和治療組治療后1(1、3(1、5(1、7(1、14(1、28(1 MSC，以3%中性甲醛室溫固定5min后染色。
[0109]2、SAKa I 染色
[0110]先將X-Gal以20/L的濃度溶入二甲基甲酰胺配成X-Gal儲(chǔ)存液，常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。新鮮染液的配制:lmg/mL X-Gal+40mmol/L檸檬酸緩沖液(PH 6.0)+5mmol/L亞鐵氰化鉀+5mmol/L鐵氛化鉀+150mmol/L NaCl+2mmol/L MgCbo
[0111]染色:將標(biāo)本浸入新鮮染液室溫染色12?16h，蒸餾水漂洗，中性紅或Giemsa染液復(fù)染，光鏡下觀察。
[0112]3、SAKal顯色結(jié)果觀察
[0113]SA-P-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比率以顯微鏡下隨機(jī)所選5個(gè)視野/玻片的陽(yáng)性染色細(xì)胞均數(shù)作為每張玻片的陽(yáng)性率，陽(yáng)性率以3張玻片的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。
[0114]4、衰老相關(guān)B-半乳糖苷酶(SAKal)活性檢測(cè)結(jié)果
[0115]對(duì)照組SA-P-Gal染色陽(yáng)性率為3.03±0.66 % ;而GD2+MSC和KDR2+HSC治療后IcU3d、7d、14d、28d后MSC的SA-P-Gal染色陽(yáng)性率分別為2.92±0.58%，3.17±0.76%，3.13土
0.76%，2.37±0.76%，2.61 ±0.76%;它們分別與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著差異(ρ>0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明⑶2+MSC與KDR2+HSC不能引起MSC衰老。
[0116]5.細(xì)胞衰老相關(guān)基因？161吐4&、？53、？21(^?1/￥&^的相對(duì)表達(dá)
[0117](I )pl6:GD2+MSC 與 KDR2++HSC 治療后 ld、3d、7d、14d 的 MSC 的 ρ16 未見(jiàn)明顯升高，與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(Ρ>0.05)<^2+Μ3(:與KDR2+HSC治療后28d的ρ16與對(duì)照組間的差異有極顯著意義(Ρ〈0.001)，明顯降低。
[0118](2)ρ21: GD2+MSC與KDR2+HSC治療后Id、7d、14d、28d的MSC的p21未見(jiàn)明顯升高，與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。⑶2+MSC與KDR2+HSC治療后3d的p21與對(duì)照組間的差異有顯著意義(p〈0.05)，明顯降低。
[0119](3453:602+]\^(:與1(01?2+!^(:治療后1(1、3(1、7(1、14(1、28(1的]\^(:的？53與對(duì)照組相比明顯降低，組間差異有顯著意義(P〈0.05)。
[0120]以上結(jié)果顯示⑶2+MSC與KDR2+HSC組合治療對(duì)于衰老小鼠有顯著的治療作用。
[0121]本發(fā)明人在充分的生物學(xué)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用本發(fā)明方法嘗試治療患者早老癥的患者，結(jié)果顯示本發(fā)明方法具有對(duì)早老癥優(yōu)異的治療作用，這種治療作用還體現(xiàn)在其能夠修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。
[0122]補(bǔ)充試驗(yàn):參考實(shí)施例1的方法，使用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞即GD2+基質(zhì)細(xì)胞與KDR2+胎盤造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0123]補(bǔ)充試驗(yàn):參考實(shí)施例1的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即GD2+基質(zhì)細(xì)胞與KDR2+胎盤造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0124]補(bǔ)充試驗(yàn):參考實(shí)施例1的方法，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞即GD2+基質(zhì)細(xì)胞與KDR2+臍帶血造血干細(xì)胞治療衰老小鼠，結(jié)果顯示與實(shí)施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0125]產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
[0126]本發(fā)明屬于細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括GD2+基質(zhì)細(xì)胞和KDR2+造血干細(xì)胞的治療劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及GD2+基質(zhì)細(xì)胞和KDR2+造血干細(xì)胞二者組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。本發(fā)明治療劑可以有效地用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞組合在制備用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是GD2+基質(zhì)細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于: 其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞； 其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質(zhì)細(xì)胞;和/或其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質(zhì)細(xì)胞，且GD2陽(yáng)性表達(dá)率大于90%，例如大于95%。4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于: 其中所述造血干細(xì)胞來(lái)源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動(dòng)員外周血； 其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞； 其中所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%，例如大于90% ;和/或 其中所述造血干細(xì)胞中⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%，例如大于85%。5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述治療劑呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于: 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞； 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞;或者，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞;和/或 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在I個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。7.用于修復(fù)機(jī)體機(jī)能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，其呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨(dú)密封包裝的間充質(zhì)干細(xì)胞和單獨(dú)密封包裝的造血干細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7的治療劑，其特征在于: 所述間充質(zhì)干細(xì)胞是GD2+基質(zhì)細(xì)胞； 所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞； 所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質(zhì)細(xì)胞； 所述間充質(zhì)干細(xì)胞是來(lái)源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質(zhì)細(xì)胞，且GD2陽(yáng)性表達(dá)率大于90%，例如大于95 %。9.根據(jù)權(quán)利要求7的治療劑，其特征在于: 所述造血干細(xì)胞來(lái)源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動(dòng)員外周血； 所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞； 所述造血干細(xì)胞是KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞，該KDR2陽(yáng)性表達(dá)的造血干細(xì)胞中KDR2陽(yáng)性表達(dá)率大于85%，例如大于90% ;和/或 所述造血干細(xì)胞中⑶34陽(yáng)性表達(dá)率大于80%，例如大于85%。10.根據(jù)權(quán)利要求7的治療劑，其特征在于: 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為17個(gè)基質(zhì)細(xì)胞； 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個(gè)單個(gè)核細(xì)胞;或者，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)所述造血干細(xì)胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個(gè)單個(gè)核細(xì)胞;和/或 所述治療劑在用于哺乳動(dòng)物例如人時(shí)，先使用間充質(zhì)干細(xì)胞，在I個(gè)月之后使用造血干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61P43/00GK106074604SQ201610551770
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月13日
【發(fā)明人】許曉椿, 肖海蓉, 劉冰, 程霞, 周丹
【申請(qǐng)人】博雅干細(xì)胞科技有限公司