二氫歐山芹素在制藥中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了二氫歐山芹素在制藥中的應用，所述藥物為治療流感性病毒疾病的藥物，或著為預防流感性病毒疾病的藥物。所述流感性病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒或柯薩奇病毒。二氫歐山芹素能夠劑量依賴地有效抑制甲型流感病毒H3N2的復制，其IC50為5.24μM，選擇指數(shù)(SI)高達53.24，可作為制備抗流感病毒藥物。此外，二氫歐山芹素具有非常廣譜的抗流感病毒及其他流感相關(guān)病毒活性。
【專利說明】
二氫歐山芹素在制藥中的應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于流感預防及治療藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及二氫歐山芹素在制藥中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(簡稱流感)是由流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)引起的急性呼吸道感染。流行性感冒是具有暴發(fā)突然、蔓延迅速、發(fā)病率高和并發(fā)癥重等特點的高傳染性疾病，在兒童、老人和高危人群中的死亡率較高。流感可以周期性地大范圍流行，至今為止尚未有能夠完全控制的有效措施。無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，每年的發(fā)病率都很高，且每次流感流行后，總會造成人群中不同程度的超額死亡和巨大的經(jīng)濟損失。能夠引起流感的病毒主要有正粘病毒科中的流感病毒(甲、乙、丙)；副粘病毒科中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒，以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、鼻病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒、麻疹病毒、風疹病毒等。近年來，隨著全球物種活動范圍的加大，流感病毒的變異性增強，人與禽等其他種屬間的流感病毒相互作用，產(chǎn)生具有高致病性的新變種病毒，人感染高致病性禽流感病例的發(fā)生、新發(fā)病毒的人群間高傳染性及感染者的高死亡率，曾一度引起了全球范圍對流感的恐慌，嚴重影響了人類的日常生活和經(jīng)濟穩(wěn)定發(fā)展。
[0003]目前，流感防治的主要措施仍然是疫苗接種和藥物治療。由于流感病毒亞型多，各亞型抗原易變異，而疫苗預防的有效性是建立在疫苗的病毒株與正在流行的流感病毒株相似的基礎(chǔ)上，且現(xiàn)有手段無法提前預測新發(fā)流感病毒，因此疫苗的作用就非常有限。對可能大規(guī)模爆發(fā)的流感疫情來講，藥物治療仍然是有效控制流感病毒傳播，保護人類健康的第一道防線。目前已上市的抗流感藥物種類依然有限，根據(jù)作用機制大致分為兩類，一類為M2離子通道阻斷劑，主要為20世紀60年代發(fā)現(xiàn)的金剛烷胺和金剛乙胺，此類藥主要對甲型流感病毒有預防和治療作用，研究表明此類藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且容易產(chǎn)生耐藥性和傳染性的耐藥株，因此M2離子通道阻斷劑的臨床使用并不廣泛。另一類是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，代表性藥物為20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的扎那米韋和奧司他韋，此類藥物對大多數(shù)的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來關(guān)于奧司他韋的耐藥株也不斷有報道。因此，開發(fā)更多基于新靶點和新結(jié)構(gòu)類型的流感防治藥物具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供二氫歐山芹素在制藥中的應用。
[0005]二氫歐山序素，英文名為Columbianetin或columbianet in，分子式為C14H14O4，為呋喃香豆素類化合物，為傘形科植物獨活(Angel icapubescensMaxim.f.biserrataShanetYuan)的有效成分之一。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:二氫歐山芹素在制藥中的應用，所述藥物為治療流感性病毒疾病的藥物，或為預防流感性病毒疾病的藥物。
[0007]本發(fā)明如上所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，優(yōu)選地，所述流感性病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒或柯薩奇病毒。
[0008]本發(fā)明如上所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，優(yōu)選地，所述藥物包括:藥用有效量的二氫歐山芹素和醫(yī)藥學上可接受的非活性成分。
[0009]更優(yōu)選地，醫(yī)藥學上可接受的非活性成分為:醫(yī)藥學上可接受的賦形劑，以及醫(yī)藥學上可接受的載劑。
[0010]本發(fā)明如上所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，優(yōu)選地，所述藥物為任意一種臨床可接受的口服劑型、注射劑型或外用劑型。
[0011]本發(fā)明如上所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，優(yōu)選地，所述藥物為為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、液體制劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、氣霧劑、貼劑。
[0012]本發(fā)明如上所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，優(yōu)選地，所述藥物為片劑，其組成包括:藥用有效量的二氫歐山芹素；藥用量的至少一種稀釋劑；藥用量的至少一種黏合劑;藥用量的至少一種崩解劑。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
[0014]1、二氫歐山芹素是小分子化合物，其對MDCK細胞的TC5q為278.97μΜ，最大無毒濃度為101.52μΜ。實驗研究發(fā)現(xiàn)二氫歐山芹素能夠劑量依賴地有效抑制甲型流感病毒Η3Ν2的復制，其IC5q為5.24μΜ。選擇指數(shù)(SI)高達53.24，二氫歐山芹素可作為制備抗流感病毒藥物。
[0015]2、二氫歐山芹素能夠劑量依賴地抑制甲型流感病毒HlNl、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒Β3型和腺病毒7型的復制，其SI分別為26.49、13.24,16.34和12.19。這充分表明二氫歐山芹素具有非常廣譜的抗流感病毒及其他流感相關(guān)病毒活性。
【附圖說明】
[0016]圖1為二氫歐山芹素化學結(jié)構(gòu)式。
[0017]圖2為二氫歐山芹素的MDCK細胞毒性檢測示意圖。
[0018]圖3為二氫歐山芹素抗流感病毒Η3Ν2檢測示意圖。
[0019]圖4為二氫歐山芹素的Hep-2細胞毒性檢測示意圖。
[0020]圖5為二氫歐山芹素抗流感病毒A/PR/8/34(HlNl)活性檢測結(jié)果。
[0021 ]圖6為二氫歐山芹素抗呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)活性檢測結(jié)果。
[0022]圖7為二氫歐山芹素抗柯薩奇病毒B3型活性檢測結(jié)果。
[0023]圖8為二氫歐山芹素抗腺病毒7型(Ad7)活性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0025]藥物的給藥劑量取決于很多因素，例如患者的性別、年紀、體重及個體反應。本發(fā)明劑量根據(jù)制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當調(diào)整，以達到治療的有效要求。本發(fā)明藥物的合適劑量在10?10mg/天/人。
[0026]實例I?6中所需原料:乳糖，硬脂酸，淀粉，蔗糖粉，糊精，苯甲酸，卡波姆940，三乙醇胺，甘油，亞硫酸氫鈉，乙醇(95%)，平平加0-15，依地酸二鈉，月桂氮酮，橙皮酊，氯化銨，苯甲酸鈉。以上原料來自供應商西安悅來醫(yī)藥科技有限公司，規(guī)格:藥用級，符合標準CP2010。
[0027]實施例1:二氫歐山芹素在制備片劑藥物中的應用
[0028]取二氫歐山芹素3g，加入乳糖25g，硬脂酸0.3g，淀粉5g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，16目篩整粒，壓片，片重約lOOmg，每片含活性成分10mg。服用方法為成人每次三片，每天三次。
[0029]實施例2:二氫歐山芹素在制備膠囊劑藥物中的應用
[0030]取二氫歐山芹素5g，加入乳糖160g，硬脂酸0.3g，淀粉30g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，40目篩整粒，裝入2號硬膠囊，內(nèi)容物約200mg，每粒膠囊含活性成分50mg。服用方法為成人每次I粒，每天兩次。
[0031]實施例3:二氫歐山芹素在制備顆粒劑藥物中的應用
[0032]取二氫歐山芹素3g，加入225g蔗糖粉與75g糊精的混合物(3:1)及適量的70%乙醇，拌合成軟材，擠壓過篩(12?14目篩)制顆粒，干燥，整粒，按每袋5g(含二氫歐山芹素50mg)分裝于塑料袋中，密封，即得。服用方法為成人每次I袋，每天兩次。
[0033]實施例4:二氫歐山芹素在制備液體制劑藥物中的應用
[0034]取二氫歐山芹素5g，加蒸餾水溶解并稀釋至500mL，加入0.05%的苯甲酸，亦可加入適量調(diào)味劑蔗糖，裝于5mL小瓶，壓蓋，即得。每瓶含活性成分50mg。服用方法為成人每次I瓶，每天兩次。
[0035]實施例5:二氫歐山芹素在制備糖漿劑藥物中的應用
[0036]取IL純水加入二氫歐山芹素27g，蔗糖1.7kg，攪拌過濾(300目篩)，加入輔料橙皮酊54mL，氯化銨27g，苯甲酸鈉13.5g。加純水至2.7L，攪拌30min，二次過濾(300目篩)，灌裝90mL/瓶，每瓶含活性成分900mg，成人每次取用5mL，一天兩次。
[0037]實施例6:二氫歐山芹素在制備凝膠劑藥物中的應用
[0038]原料配比:二氫歐山芹素5g，卡波姆940(凝膠基質(zhì))10g，三乙醇胺12g(pH調(diào)節(jié)劑)，甘油80g(保濕劑)，乙醇500mL(藥物溶劑)，平平加0-15，60g(增溶劑)，亞硫酸氫鈉0.5g(抗氧劑)，依地酸二鈉0.5g(金屬螯合劑)，月桂氮酮1mL(透皮促進劑)，蒸饋水加至lOOOmL。
[0039]將亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉溶于水中，攪拌下加入卡波姆940，溶脹得卡波姆膠液，將二氫歐山芹素溶于乙醇中，加入甘油、平平加0-15、月桂氮酮，攪拌均勻得藥物溶液。將藥物溶液加入卡波姆膠液，攪勻，加入三乙醇胺即得。
[0040]實施例7: 二氫歐山芹素對MDCK細胞的細胞毒性實驗
[0041 ] MDCK(狗腎)細胞按7000個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為lOOyL，細胞貼壁后，加入二氫歐山芹素溶液(用細胞維持液(DMEM+2 %血清)將藥物以812.15μΜ為起始濃度連續(xù)2倍比例稀釋8個梯度濃度)，每組重復2個孔，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，以3- (4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍，MTT)法檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示二氫歐山芹素對MDCK細胞的TC5q (半數(shù)有毒濃度)為278.97μΜ，最大無毒濃度為101.52μΜο
[0042]實施例8: 二氫歐山芹素抗流感病毒活性評價實驗
[0043]將MDCK細胞按2*14細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為10yL，置37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，每孔加入10TCID5q流感病毒液(流感病毒A/漢防/359/95(H3N2))感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度樣品的維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，進行MTT比色分析，計算二氫歐山芹素對流感病毒的IC5Q(半數(shù)抑制濃度)。結(jié)果顯示:二氫歐山芹素明顯抑制了流感病毒復制，且成劑量依賴型，其IC5q為5.24μΜ。
[0044]實施例9:二氫歐山芹素抗流感性病毒的廣譜性評價實驗
[0045]Hep-2細胞按5000個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為lOOyL，細胞貼壁后，分別加入濃度為6.34μΜ、12.69μΜ、25.38μΜ、50.76μΜ、101.52μΜ、203.04μΜ、406.08μΜ、812.15μΜ的二氫歐山芹素溶液，每組重復2個孔，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，以MTT法檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示二氫歐山芹素對Hep-2細胞的TC5q為356.94μΜ，最大無毒濃度為101.52μΜ。
[0046]將MDCK細胞按2*14細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為10yL，置37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，每孔加入10TCID5q流感病毒液(流感病毒A/PR/8/34(H1N1))感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度樣品的維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，進行MTT比色分析，計算二氫歐山芹素對流感病毒的IC5Q。結(jié)果顯示:二氫歐山芹素明顯抑制了流感病毒HlNl復制，且成劑量依賴型，其IC5q為10.53μΜ。
[0047]將Hep-2細胞按1.5*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為100yL，置37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，每孔加入10TCID5q流感病毒液(分別為呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)、柯薩奇病毒B3型(CVB3，Nancy株)和腺病毒7型(Ad7))感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度樣品的維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，進行MTT比色分析，計算二氫歐山芹素對各病毒的IC5q ο結(jié)果顯示:二氫歐山芹素能夠劑量依賴地有效抑制呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒B3型和腺病毒7型等流感性病毒的復制，其IC5O分別為26.96μΜ、21.84μΜ和29.27μΜ。
[0048]目前，抗流感病毒藥物的體外細胞篩選方法主要包括空斑減數(shù)法、MTT(噻唑藍)比色分析法及CPE(細胞病變)觀察法等?？瞻邷p數(shù)法可以敏感精確地測定病毒的感染程度，檢查結(jié)果直觀可靠，但是其對操作技術(shù)要求較高，操作較繁瑣，可推廣性受限。CPE觀察法檢測藥物毒性是以前用最為常用的，通過在顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)變化，但此法定量不準確，主觀性強，難以判斷結(jié)果，而且統(tǒng)計困難。MTT分析法是使用MTT對細胞進行染色，通過檢測其光密度(0D值)的改變可判斷細胞的活性，從而實現(xiàn)藥物抗病毒活性的定量分析，該法操作簡便，在國內(nèi)外實驗室中廣泛應用。本發(fā)明將MTT法與CPE法進行結(jié)合，通過在光鏡下觀察細胞的CPE，決定進行MTT測定的最適時間，從而保證結(jié)果的準確性。
[0049]實施例10:二氫歐山芹素抗流感病毒活性的評價
[0050]1.實驗材料
[0051 ] 1.1細胞、病毒和藥物
[0052]MDCK細胞購自美國模式菌種保藏中心(ATCC);病毒株:流感病毒A/漢防/359/95(Η3Ν2)，在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代，-80°C保存;藥物:二氫歐山芹素購于中國藥品生物制品檢定所。
[0053]1.2實驗儀器
[0054]酶標儀，moleculardevicesspectraMaxM2e;天平，MettlerToledoAL104
[0055]2.實驗方法與結(jié)果
[0056]2.1細胞培養(yǎng):37 °C，5 %⑶2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長液為DMEM培養(yǎng)基，加10 %小牛血清、100U/mL的青霉素和鏈霉素。細胞維持液除新生小牛血清為2 %外，其余同細胞生長液。
[0057]2.2二氫歐山芹素的細胞毒性檢測:MDCK(狗腎)細胞按7000個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為100μL，細胞貼壁后，分別加入濃度為6.34μM、12.69μM、25.38μM、50.76μΜ、101.52μΜ、203.04μΜ、406.08μΜ、812.15μΜ的二氫歐山芹素溶液(采用細胞維持液配制)，每個濃度重復2個孔，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液10yL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMS0150yL，振蕩lOmin，待結(jié)晶完全溶解，用酶標儀檢測550nm處的OD值，計算細胞存活率。用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0的Probit回歸法，計算藥物TC50。
[0058]結(jié)果(附圖2)顯示二氫歐山芹素在101.52μΜ以下的濃度范圍內(nèi)對MDCK細胞完全沒有細胞毒性。本實施案例中二氫歐山芹素細胞水平抗病毒實驗的給藥劑量范圍為0.63?81.21μΜ，完全處在安全無毒性濃度范圍。
[0059]2.3二氫歐山芹素對流感病毒4/漢防/359/95(!13吧)的抑制活性:將100(細胞按2*14細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為lOOyL，置37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，每孔加入10yL的10TCID5q流感病毒液(流感病毒A/漢防/359/95 (H3N2))感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度藥物(以81.21μΜ為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋8個梯度濃度，每個濃度設(shè)2個復孔)的細胞維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，且細胞對照無病變時，確定為MTT比色的最適時間點(約38小時)，進行MTT比色分析，用酶標儀在550nm處讀取OD值。
[0060]依下式計算各檢測孔中藥物對病毒的抑制率:抑制率(%)=(試驗組OD值-病毒對照組OD值)/(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值)。用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0的Probit回歸法，計算藥物抗病毒的IC50。
[0061]結(jié)果(附圖3)顯示二氫歐山芹素明顯抑制了流感病毒復制，且成劑量依賴型，其IC5O為 5.24μΜ。
[0062]實施例11:二氫歐山芹素抗流感性病毒活性廣譜性的評價
[0063]本實驗主要是檢測二氫歐山芹素對甲型流感病毒亞型HlNl，以及其他一些流感相關(guān)病毒，如呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒和腺病毒的抑制活性，以評價二氫歐山芹素抗流感性病毒活性的廣譜性。
[0064]1.細胞、病毒:Hep-2細胞(人咽喉癌上皮細胞)購自美國模式菌種保藏中心(ATCC);病毒株:流感病毒A/PR/8/34(HlNl)、呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)、柯薩奇病毒B3型(CVB3，Nancy株)和腺病毒7型(Ad7)。
[0065]2.Hep-2細胞培養(yǎng):37 °C，5 %CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長液為DMEM培養(yǎng)基，加10%小牛血清、100U/mL的青霉素和鏈霉素。
[0066]3.二氫歐山芹素對Hep-2細胞的毒性檢測:Hep_2細胞按5000個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為100μL，細胞貼壁后，分別加濃度為6.34μM、12.69μM、25.38μM、50.76μΜ、101.52μΜ、203.04μΜ、406.08μΜ、812.15μΜ的二氫歐山芹素溶液(采用細胞維持液配制)，每個濃度重復2個孔，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液10yL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMS0150yL，振蕩1min，待結(jié)晶完全溶解，酶標儀測550nm處的OD值，計算細胞存活率。用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0的Probit回歸法，計算藥物對H印-2細胞的TC50。
[0067]結(jié)果(附圖4)顯示二氫歐山芹素在101.52μΜ以下的濃度范圍內(nèi)對Hep-2完全沒有細胞毒性。本實施案例中二氫歐山芹素細胞水平抗病毒實驗的給藥劑量范圍為0.63?81.21μΜ，完全處在安全無毒性濃度范圍。
[0068]4.二氫歐山芹素對流感病毒A/PR/8/3(HlNl)的抑制活性:將MDCK細胞按2*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為10yL，置37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，每孔加入10yL的10TCID5q流感病毒液(流感病毒A/PR/8/34(HlNl))感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度樣品(以81.21μΜ為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋8個梯度濃度，每個濃度設(shè)2個復孔)的細胞維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，且細胞對照無病變時，確定為MTT比色的最適時間點(約38小時)，進行MTT比色分析，用酶標儀在550nm處讀取OD值。
[0069]依下式計算各檢測孔中藥物對病毒的抑制率:抑制率(%)=(試驗組OD值-病毒對照組OD值)/(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值)。用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0的Probit回歸法，計算藥物抗病毒的IC50。
[0070]結(jié)果(附圖5)顯示二氫歐山芹素明顯抑制了流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的復制，且成劑量依賴型。
[0071 ] 5.二氫歐山芹素對RSV、CVB3和Ad7的抗病毒活性:Hep-2細胞按1.5*104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，體積為10yL，置370C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，細胞長成單層，將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS液洗兩遍，每孔加入10yL的10TCID5q流感病毒液(RSV、CVB3、Ad7)感染細胞，吸附2小時，棄病毒液，加入200yL含有不同稀釋濃度樣品(以81.21μΜ為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋8個梯度濃度，每個濃度設(shè)2個復孔)的細胞維持液，同時設(shè)細胞對照孔和病毒對照孔，置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察各組CPE，在病毒對照組細胞病變達4+時，且細胞對照無病變時，確定為MTT比色的最適時間點(約38小時)，進行MTT比色分析，用酶標儀在550nm處讀取OD值。
[0072]依下式計算各檢測孔中藥物對病毒的抑制率:抑制率(%)=(試驗組OD值-病毒對照組OD值)/(細胞對照組OD值-病毒對照組OD值)。用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0的Probit回歸法，計算藥物抑制各病毒的IC50。
[0073]結(jié)果(附圖6-附圖8)顯示二氫歐山芹素明顯抑制了各種流感性病毒的復制，且成劑量依賴型。
[0074]以上實施例僅為本發(fā)明的示例性實施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實質(zhì)和保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應視為落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述藥物為治療流感性病毒疾病的藥物，或為預防流感性病毒疾病的藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述流感性病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、麻疹病毒或風疹病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述藥物包括:藥用有效量的二氫歐山芹素和醫(yī)藥學上可接受的非活性成分。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，醫(yī)藥學上可接受的非活性成分為:醫(yī)藥學上可接受的賦形劑，以及醫(yī)藥學上可接受的載劑。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述藥物為任意一種臨床可接受的口服劑型、注射劑型或外用劑型。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、液體制劑、煎膏劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、凝膠劑、氣霧劑、貼劑。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二氫歐山芹素在制藥中的應用，其特征在于，所述藥物為片劑，其組成包括:藥用有效量的二氫歐山芹素;藥用量的至少一種稀釋劑;藥用量的至少一種黏合劑;藥用量的至少一種崩解劑。
【文檔編號】A61P31/16GK106038536SQ201610369014
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】蕭偉, 孫莉瓊, 廉源沛, 李艷靜, 黃文哲, 王振中
【申請人】江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司