用于持續(xù)的免疫治療的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了組合物和方法，它們用于通過抗原特異性的方式來促進(jìn)TR1細(xì)胞和/或Breg細(xì)胞的形成、擴(kuò)增和招募，以及在有需要的對(duì)象中治療自身免疫性疾病和病癥。
【專利說明】
用于持續(xù)的免疫治療的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C. § 119(e)要求2013年11月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/ 899,826號(hào)的優(yōu)先權(quán)，通過引用將其W整體形式合并至本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及和免疫療法和藥物相關(guān)的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在本說明書的全文中都有用標(biāo)識(shí)性引用或用阿拉伯?dāng)?shù)字來引用的技術(shù)和專利公 開文獻(xiàn)。在權(quán)利要求書之前的說明書中，可W找到對(duì)應(yīng)于阿拉伯?dāng)?shù)字的所有引用文獻(xiàn)的目 錄。通過引用的方式將所有在此引用的文獻(xiàn)合并入本申請(qǐng)，W更完整地描述與本發(fā)明相關(guān) 的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)。
[0004] 自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是由免疫系統(tǒng)由自身組織的攻擊引起 的。理想的療法是能夠選擇性地純化(blunt)自身免疫反應(yīng)(針對(duì)在該疾病中祀定的所有抗 原表位)而不會(huì)損害全身免疫(對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng))的療法。不幸地，任何一種自身免疫 性疾病設(shè)及的淋己細(xì)胞特異性都非常多并且沒有被完全地界定，使其成為具有挑戰(zhàn)性的目 標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為響應(yīng)現(xiàn)有技術(shù)的運(yùn)一需求，本發(fā)明描述的是在治療自身免疫性疾病中有用的治 療性組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種用于在有需要的對(duì)象中擴(kuò)增和/或發(fā)展抗致病的 自身反應(yīng)性T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的群體的方法，所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟 組成、或由W下步驟組成：向所述對(duì)象施用抗原-II類MHC-納米顆粒（"NP")復(fù)合物（"NP-復(fù) 合物"），其中所述抗原是自身免疫相關(guān)的抗原或自身抗原。在一些方面，在特定的NP上的所 有抗原都是相同的或者它們可W是不同的。在另一個(gè)方面，在NP上的抗原具有不同的氨基 酸序列，但是可W分離自相同的抗原蛋白。在另一個(gè)方面，在NP上的抗原來自不同的抗原。 在另一個(gè)方面，所述MHCII是相同的或不同的。
[0006] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 NP-復(fù)合物，所述NP-復(fù)合物包括W下物質(zhì)、或?qū)嵸|(zhì)上由 W下物質(zhì)組成、或由W下物質(zhì)組成:納米顆粒、II類血1C蛋白和疾病相關(guān)的抗原，它可W是抗 原/ MHCII復(fù)合物的形式，用于在對(duì)象中擴(kuò)增和/或發(fā)展B調(diào)節(jié)細(xì)胞和TR1細(xì)胞(例如TR1和 CD4+細(xì)胞）的一個(gè)或多個(gè)群體，其中所述納米顆粒的直徑選自：從約1 nm至約100 nm的直 徑;從約1 nm至約50 nm的直徑或從約1皿至約20皿或從約5nm至約100皿的直徑，并且抗 原-MHCII復(fù)合物與納米顆粒的數(shù)量的比例是從約10:1至約1000:1。在一個(gè)方面，所述復(fù)合 物的II類MHC密度為從約0.05 pMHCII /100 nm2NP表面積(包括涂層)至約25 pMHCII /100 nm2NP表面積(包括涂層）。所述抗原是設(shè)及自身免疫反應(yīng)的自身抗原或其模擬物，所述反應(yīng) 例如是糖尿病前期、糖尿病、多發(fā)性硬似"MS")或多發(fā)性硬化相關(guān)的疾病，并且任選地其中 當(dāng)疾病是糖尿病前期或糖尿病時(shí)，所述自身抗原是來自由膜腺β細(xì)胞或自身抗原IGRP、膜島 素、GAD或IA-2蛋白表達(dá)的抗原的表位（epitope)。在另一個(gè)方面，所述II類MHC成分包括 HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。所述抗原-II類MHC復(fù)合物被共價(jià)地或非共價(jià)地連 接至所述納米顆粒。所述納米顆粒是生物可吸收的和/或生物可降解的。
[0007] 在另一個(gè)方面，所述納米顆粒是非脂質(zhì)體的和/或具有固體核屯、，所述核屯、優(yōu)選是 金核屯、或氧化鐵核屯、。當(dāng)被共價(jià)地連接時(shí)，所述抗原-II類MHC復(fù)合物通過尺寸小于5 kD的 接頭被共價(jià)地連接至所述納米顆粒。在一個(gè)方面，所述接頭包括聚乙二醇(PEG)。所述pMHC 可W通過任何結(jié)構(gòu)(包括但不限于接頭)或通過交聯(lián)被連接至所述納米顆?；蚣{米顆粒涂 層。在一個(gè)方面，所述MHC通過C末端被定向地連接至所述納米顆粒或涂層。
[0008]
【申請(qǐng)人】已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗原-Π 類MHC復(fù)合物在納米顆粒上的密度對(duì)治療效果有貢獻(xiàn)。 因此，如本文所描述地，抗原-MHCII納米顆粒復(fù)合物可W具有確定的密度，所述密度的范圍 是從納米顆粒的表面積(包括任何涂層而測(cè)量的表面積)的每100 nm2約0.05(個(gè))MHC分子， 假設(shè)至少有2 MHCII、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12(個(gè))MHCII被復(fù)合至 納米顆粒。在一個(gè)方面，所述復(fù)合物的MHCn的密度為從每100 nm2約0.01 MHCII (0.05 MHCII/100 醒2)至約30 MHCII/100 醒2、或從約Q.1 MHCII/100 醒2至約25 MHCII/100 皿2、或從約0.3 MHCII/100 皿2至約25 MHCII/100 皿2、或從約Q.4 MHCII/100 皿2至約25 MHCII/100 nm2、或從約0.5 MHCII/100 醒2至約20 MHCII/100 nm2、或從0.6 MHCII/100 皿2至約20 MHCII/100 皿2、或從約 1.0 MHCII/100 皿2至約20 MHCII/100 皿2、或從約5.0 MHCII/100 皿2至約20 MHCII/100 ηπΛ或從約 10.0MHCII/100 皿2至約20 MHCII/100 皿2、 或從約15 MHCII/100 nm2至約20 MHCII/100 nm2、或至少約0.5、或至少約1.0、或至少約 5.0、或至少約10.0、或至少約15.0 Μ肥11/100 nm2，納米顆粒的nm嗦面積包括任何涂層。在 一個(gè)方面，當(dāng)9個(gè)或至少9個(gè)MHCII被復(fù)合至納米顆粒時(shí)，密度是從約0.3 MHCII/100 nm2至 約20 MHCII/100 nm2。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其包括治療有效量的本文所述NP復(fù)合物W及載體 (例如藥學(xué)上可接受的載體）。在一個(gè)方面，在所述組合物中的所有NP復(fù)合物是相同的。在另 一個(gè)方面，所述組合物的NP復(fù)合物包括多樣化的或不同的MHC-抗原復(fù)合物。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了制造復(fù)合物和組合物的方法。所述方法可W包括W下步驟、 或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組成、或由W下步驟組成:將抗原-MHCII復(fù)合物(例如MHCII復(fù)合物)非 共價(jià)地涂布或共價(jià)地復(fù)合至納米顆粒上。
[0011] 本發(fā)明還提供了醫(yī)療和診斷方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在有需要 的對(duì)象中W抗原特異性的方式促進(jìn)B調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或化1細(xì)胞(例如TR1和CD4+細(xì)胞）的形成、 擴(kuò)增和招募的方法，所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組成、或由W下步驟組 成：向所述對(duì)象施用有效量的本文所述的NP復(fù)合物或組合物。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在有需要的對(duì)象中治療或抑制本文所述的 自身免疫性疾病或病癥(例如MS、MS相關(guān)的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包 括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組成、或由W下步驟組成：向所述對(duì)象施用有效量的本文 所述的NP復(fù)合物或組合物，其中所述自身抗原對(duì)于將要治療的疾病來說是疾病相關(guān)的，例 如為了防止或治療糖尿病，所述抗原是糖尿病相關(guān)的抗原。在另一個(gè)方面，所述自身免疫性 疾病是MS或MS相關(guān)的疾病并且所述抗原是MS相關(guān)的。
[0013] 本發(fā)明還提供了試劑盒。所述試劑盒包括W下物質(zhì)、或?qū)嵸|(zhì)上由W下物質(zhì)組成、或 由W下物質(zhì)成:本文所述的NP復(fù)合物或組合物W及使用說明。
[0014] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制造納米顆粒的方法，所述方法包括熱分解或加 熱納米顆粒前體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒是金屬或金屬氧化物納米顆粒。在一個(gè) 實(shí)施方式中，所述納米顆粒是氧化鐵納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒是金納米 顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)目前的技術(shù)制備的納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式 中，本發(fā)明提供了一種制造氧化鐵納米顆粒的方法，所述方法包括乙酷丙酬鐵的熱分解反 應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，得到的所述氧化鐵納米顆粒是可溶于水的。在一個(gè)方面，氧化鐵納 米顆粒適于蛋白結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括單一步驟的熱分解反應(yīng)。
[0015] 在一個(gè)方面，所述熱分解在存在功能化的PEG分子的情況下發(fā)生。功能化的PEG接 頭的一些非限制性例子示出于表1中。
[0016] 在一個(gè)方面，所述熱分解包括加熱乙酷丙酬鐵。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熱分解包 括在存在功能化的PEG分子的情況下加熱乙酷丙酬鐵。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熱分解包括 在存在芐基酸和功能化的PEG分子的情況下加熱乙酷丙酬鐵。
[0017]不受理論約束，在一個(gè)實(shí)施方式中，功能化的PEG分子被用作還原劑和表面活性 劑。本發(fā)明提供的制造納米顆粒的方法通過使顆?？扇苡谒腜EG分子，簡(jiǎn)化和改進(jìn)了常規(guī) 方法(其使用難W被置換或難W被完全置換的表面活性劑）。常規(guī)地，表面活性劑可W是昂 貴的（例如憐脂)或有毒的（例如油酸和油胺）。在另一個(gè)方面，不受理論約束，制造納米顆粒 的所述方法避免了使用常規(guī)的表面活性劑的需要，從而得到了較高程度的分子純度和水溶 性。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熱分解設(shè)及乙酷丙酬鐵和芐基酸W及在不存在常規(guī)的表 面活性劑(除了運(yùn)里使用的試劑)的情況下進(jìn)行。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用于熱分解的溫度是約80°C至約300°C、或約80°C至約200°C、 或約80°C至約150°C、或約100°C至約250°C、或約100°C至約200°C、或約150°C至約250°C、或 約150°C至約250°C。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述熱分解在約1小時(shí)至約2小時(shí)的時(shí)間發(fā)生。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述制備氧化鐵納米顆粒的方法包括純化步驟，所述步驟例 如通過使用MiItenyi Biotec LS磁性柱進(jìn)行。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒在憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)中在約4°C下是穩(wěn)定 的，沒有任何可檢測(cè)的降解或聚集。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒能夠穩(wěn)定至少6個(gè)月。
[0022] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制造納米顆粒復(fù)合物的方法，所述方法包括將 pMHC與本發(fā)明提供的氧化鐵納米顆粒接觸。不受理論約束，pMHC編碼在其簇基末端的半脫 氨酸，它能夠在約pH 6.2至約抑6.5下與功能化的PEG中的馬來酷亞胺基反應(yīng)約12至約14 小時(shí)。
[0023] 在一個(gè)方面，所述制造納米顆粒復(fù)合物的方法包括純化步驟，所述步驟例如通過 使用Mi Itenyi Biotec LS 磁性柱(ma 即 etic column)進(jìn)行。
【附圖說明】
[0024] 附圖構(gòu)成說明書的一部分并且用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明可通過 參考運(yùn)些附圖中的一個(gè)或多個(gè)并結(jié)合所呈現(xiàn)的【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述而被更好地理解。
[00劇圖lA-lC示出了NP-復(fù)合物的示意圖。圖ΙΑ示出了單鏈I類pMHC表達(dá)構(gòu)建體(上）和 對(duì)應(yīng)的pMHC四聚體(標(biāo)記有巧光物）結(jié)合至同源CD8+ T-細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)圖。圖 1B示出了接頭/連接物和NP復(fù)合物的二維結(jié)構(gòu)。如可W看到的，一個(gè)NP能夠包含通過各種化 學(xué)接頭復(fù)合至納米顆粒核屯、的相同的抗原。圖1C示出了結(jié)合至NP的馬來酷亞胺功能化的 NP。
[0026] 圖2示出了典型的II類pMHC單體的結(jié)構(gòu)(上）W及使用對(duì)應(yīng)的pMHC四聚體染色或未 染色的同源CD4+ T-細(xì)胞的代表性FACS簡(jiǎn)圖。
[0027] 圖3A-3B示出了在剛患糖尿病的NOD小鼠中不同的T1D-相關(guān)的II類pMHC-NP逆轉(zhuǎn)血 糖升高。圖3A示出了單個(gè)小鼠血糖曲線。在正常血糖穩(wěn)定4周時(shí)，認(rèn)為小鼠"被治愈"，此后停 止治療。將外來抗原肥L14-22作為對(duì)照。圖3B示出了疾病逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。
[0028] 圖4示出了腹腔糖耐量試驗(yàn)（IPTGTT)和在長(zhǎng)期被治愈的小鼠中的膜島素生產(chǎn)能 力。IDDM，糖尿病的未治療的小鼠；被治愈的，在50周齡(治療停止之后>30周)具有正常血糖 的小鼠；對(duì)照，年齡匹配的非糖尿病的未治療的小鼠巧0周齡）。
[0029] 圖5示出了 T1D相關(guān)的II類pMHC-NP擴(kuò)增同源的自身調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞。數(shù)據(jù)與使 用2.5mi/I-Ag7-NP處理的小鼠一致。右下角，擴(kuò)增對(duì)于NP上的pMHC是特異的，因?yàn)槭褂?2.5mi/I-Ag7-NP處理的小鼠沒有顯示出兩種其他自身反應(yīng)性CD4+ T-特異性的增加百分 比。PLN，膜腺淋己結(jié);MN，腸系膜淋己結(jié);BM，骨髓(巧區(qū)T細(xì)胞的儲(chǔ)存庫(kù)）。
[0030] 圖6示出了 T1D相關(guān)的II類pMHC-NP擴(kuò)增同源的自身調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞。示出的擴(kuò) 增是對(duì)于脾的，但是在膜腺淋己結(jié)、血液和骨髓中看到了相似的模式。"發(fā)病"對(duì)應(yīng)于治療之 前的值；"被治愈的"是使用pMHC-NP而血糖正常的小鼠（在治療停止的>30周分析）；"IDDM" 是在治療停止之后復(fù)發(fā)的小鼠（~25%); "59周齡"對(duì)應(yīng)于年齡匹配的未處理的非糖尿病的對(duì) 照。
[0031] 圖7示出了T1D相關(guān)的II類pMHC-NP擴(kuò)增同源記憶樣T-調(diào)節(jié)-U "Trl或ΤΚΓ )細(xì)胞。
[0032] 圖8示出了由II類pMHC-NP擴(kuò)增的自身反應(yīng)性CD4+ T-細(xì)胞制造化-10。使用同源的 和非同源的膚對(duì)來自使用IGRPi26-i45^-Ag7-NP或?qū)φ誑P處理的小鼠的IGRPi26-i4s/I-Ag 7四聚 體+細(xì)胞進(jìn)行分選、處理，并通過1皿inex技術(shù)測(cè)試上清液的細(xì)胞因子含量。
[0033] 圖9示出了 II類pMHC-NPW依賴于IL-10和TG化的方式逆轉(zhuǎn)高血糖。圖9示出了 IGRP4-22/IAs7-NP能夠使使用細(xì)胞因子阻斷抗體（"Ab")處理的小鼠恢復(fù)正常血糖(上）、擴(kuò)增 同源化1細(xì)胞（左下）并抑制化N中的自身抗原提呈（至IGRP206-214-反應(yīng)性CD8+ T-細(xì)胞；右 下）?？?IL10和抗-TG邱Ab部分地恢復(fù)自身抗原提呈并抑制pMHC-NP的治療效果，而不損害 Trl細(xì)胞擴(kuò)增。
[0034] 圖10A-10B顯示，II類pMHC-NP治療不損害全身免疫。圖10A顯示，經(jīng)pMHC-NP處理的 NOD小鼠能夠容易地清除急性病毒(牛痘病毒)感染(下，比較感染后4日與14日），而不管自 身調(diào)節(jié)化1 CD4+ T-細(xì)胞的全身擴(kuò)增(上）。圖10B顯示，與未處理和未接種疫苗的小鼠相比， 經(jīng)pMHC-NP處理的小鼠（10個(gè)劑量)能夠在CFA中的免疫接種時(shí)對(duì)KLH-DNP產(chǎn)生抗體反應(yīng)。
[0035] 圖11示出了 II類pMHC-NP治療降低了在巧7BL/6小鼠中已經(jīng)建立的EAE的嚴(yán)重程 度。使用在CFA中的PM0G35-55免疫接種B6小鼠，并靜脈內(nèi)使用百日咳毒素進(jìn)行處理。使用15 分制的已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)EAE的癥狀對(duì)小鼠進(jìn)行打分。從免疫接種之后21日開始，使用 兩周劑量的7.5-22.5 ug的涂布有pM0G38-4VlAb的NP處理被感染的小鼠。
[0036] 圖12A-12C示出了 II類pMHC-NP的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。圖12A描述了能夠被用來將pMHC共 價(jià)地涂布至功能化的、生物相容的氧化鐵NP的不同的化學(xué)方法。圖12B是涂布了 pMHC的NP的 透射電子顯微照片。圖12B示出了涂布了 pMHC的NP和未涂布的NP的動(dòng)態(tài)光散射圖。
[0037] 圖13A-13C示出了在經(jīng)II類pMHC-NP處理的小鼠中，同源B細(xì)胞進(jìn)入化eg細(xì)胞的擴(kuò) 增和分化。在圖13A中，將經(jīng)PKH26標(biāo)記/經(jīng)2.5mi膚脈沖的B細(xì)胞(下）（或者樹突狀細(xì)胞，上） W及經(jīng)CFSE標(biāo)記/經(jīng)GPI膚脈沖的B細(xì)胞（下）（或者樹突狀細(xì)胞，上）的1:1混合物注射進(jìn)經(jīng) 2.5mi/IAg7-NP處理的N孤小鼠中。屯天之后，分析宿主的B細(xì)胞(下)或樹突狀細(xì)胞(上）的亞 型的出現(xiàn)。左側(cè)圖板顯示了代表性的結(jié)果，右側(cè)直方圖顯示了從幾個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果的概 述。該數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)2.5mi-膚脈沖的B細(xì)胞(而非DC)在經(jīng)2.5mi/IAg7-NP處理的NOD小鼠中擴(kuò) 增。在B(左側(cè)面板），
【申請(qǐng)人】比較了在經(jīng)處理2.5mi/IAg7-NPW及經(jīng)涂布有對(duì)照(糖尿病不相 關(guān)的)pMHC-NP的NP處理的NOD小鼠的膜腺癌(PLN)和腸系膜(MLN)淋己結(jié)中的B細(xì)胞含量。數(shù) 據(jù)顯示，B細(xì)胞在前者中的招募增加。在B(右側(cè)面板），
【申請(qǐng)人】比較了B細(xì)胞至PLN的招募隨著 Trl細(xì)胞招募的變化。使用數(shù)種不同的pMHC-NP制劑得到數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示，在擴(kuò)增有pMHC-NP 的TR1細(xì)胞的招募和B細(xì)胞至PLN的招募之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。在圖13B中，申請(qǐng) 人將經(jīng)2.5mi膚或?qū)φ漳w脈沖的B細(xì)胞(來自ILlO-eGFP敲入的NOD小鼠）轉(zhuǎn)移入數(shù)種不同的 供體小鼠類型（上部標(biāo)簽）。7天之后，分析脾的被灌注的B細(xì)胞向表達(dá)高水平的CDld和CD5、 產(chǎn)生IL10的（eGFP+化細(xì)胞(B調(diào)節(jié)細(xì)胞）的轉(zhuǎn)變。數(shù)據(jù)顯示，只有在經(jīng)2.5mi/IAg7-NP處理的 宿主中，存在穩(wěn)健的擴(kuò)增和同源(裝載有2.5mi)B細(xì)胞向B-reg細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
[0038] 圖14示出了通過乙酷丙酬鐵的熱分解及生物結(jié)合而合成表面功能化的氧化鐵納 米顆粒。
[0039] 詳細(xì)描述 要理解的是，本發(fā)明并不限于所描述的特定實(shí)施方式，因?yàn)檫\(yùn)些實(shí)施方式肯定可W變 化。還要理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅為描述特定實(shí)施方式的目的而使用，并非意在限 審IJ，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求來限定。
[0040] 必須注意的是，本文和權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一個(gè)"和"該"，除非文中有 明確說明，否則都包括復(fù)數(shù)個(gè)指代。因此，例如，當(dāng)提到"賦形劑"時(shí)，其包括多種賦形劑。 [0041 ] 定義 除非另有定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的含義。如本文所使用的，W下術(shù)語(yǔ)具有下述含義。
[0042] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"包括"是指該組合物和方法包括所引述的內(nèi)容，但不排除 其他內(nèi)容。當(dāng)用來定義組合物和方法時(shí)，"實(shí)質(zhì)上由…組成"意味著排除對(duì)于該組合物或方 法具有任何實(shí)質(zhì)性意義的其他內(nèi)容。因此，如本文所定義的，實(shí)質(zhì)上由該元素組成的組合物 不會(huì)排除不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響所要求保護(hù)的發(fā)明的基本的和新穎的特性的材料或步驟，例如是 用于治療或防止多發(fā)性硬化癥的組合物。"由…組成"意味著排除高于痕量的其他組分和實(shí) 質(zhì)性的方法步驟。由每個(gè)運(yùn)些過渡術(shù)語(yǔ)定義的實(shí)施方式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0043] "自身反應(yīng)性T細(xì)胞"是識(shí)別"自身抗原"的T細(xì)胞，該抗原是由包含該T細(xì)胞的相同 的個(gè)體產(chǎn)生和包含的分子。
[0044] "致病性T細(xì)胞"是對(duì)含有該T細(xì)胞的對(duì)象有害的T細(xì)胞。反之，非致病性T細(xì)胞是對(duì) 對(duì)象實(shí)質(zhì)上無害的T細(xì)胞，并且抗致病性T細(xì)胞減少、改善、抑制或無效化致病性T細(xì)胞的損 害。
[0045] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)B細(xì)胞或B-調(diào)節(jié)細(xì)胞（"B-reg")是指對(duì)抗炎癥作用負(fù)責(zé) 的那些細(xì)胞，該作用是由CDld、CD5的表達(dá)和IL-10的分泌表征的。B-reg還通過Tim-1的表達(dá) 來識(shí)別，并且可W通過Tim-1連接來誘導(dǎo)從而提高耐受性。資料顯示，作為B-reg的能力是由 許多刺激因子驅(qū)動(dòng)的，運(yùn)些因子例如是toll樣受體、CD40配體和其它因子。但是，B-reg的全 面表征正在進(jìn)行中。B-reg還表達(dá)高水平的CD25XD86和TGF-βηΒ細(xì)胞的運(yùn)一亞型能夠抑制 Thl增殖，因此對(duì)自身耐受的維持有貢獻(xiàn)。B-reg作用的增強(qiáng)應(yīng)該成為許多免疫調(diào)節(jié)藥物的 目標(biāo)，有助于更好地控制自身免疫疾病。參看例如：ncbi . nlm. nih. gov/pubmed/23707422， 最后一次登錄是在2013年10月31日。
[0046] T調(diào)節(jié)1細(xì)胞(化1)是CD4+ T的亞型，它具有調(diào)節(jié)特性并且能夠抑制體外和體內(nèi)的 抗原特異性免疫反應(yīng)。運(yùn)些T調(diào)節(jié)l(Trl)細(xì)胞是由它們獨(dú)特的細(xì)胞因子生成來界定的，并且 制造高水平的IL-10和TGF-β而不制造比-4或比-2。由運(yùn)些細(xì)胞生成的比-10和TGF-β介導(dǎo)體 外的主要的初始(naive^細(xì)胞的抑制。還存在化1細(xì)胞在體內(nèi)存在的證據(jù)，并且有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo) 了在已經(jīng)接受了異基因干細(xì)胞移植的具有嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷的患者中存在生成高水平 比-10的CD4( + ) T細(xì)胞。Trl細(xì)胞參與外周耐受的調(diào)控，并且它們有可能被用作細(xì)胞療法W 調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。參看例如:ncbi .nlm.nih.gOv/pubmed/10887343,最后一次登錄是在 2013年10月31日。
[0047] 1型T調(diào)節(jié)(Trl)細(xì)胞是由它們制造高水平的化-10和TGF-β的能力來界定的。對(duì)多 種抗原特異的Tr 1細(xì)胞出現(xiàn)在體內(nèi)，但是也可W存在IL-10的情況下分化自體外的初始CD4+ T細(xì)胞。Trl細(xì)胞具有較低增殖能力，運(yùn)可W通過IL-15來克服。Trl細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-10和 TGF-β來抑制初始和記憶T輔助1或2型響應(yīng)。分子水平的化1細(xì)胞的進(jìn)一步表征將界定它們 的作用機(jī)制并弄清它們與化細(xì)胞的其他亞型的關(guān)系?？蒞預(yù)見化1細(xì)胞被用來識(shí)別新型祀 標(biāo)W用于開發(fā)新的治療劑W及被用作細(xì)胞療法W調(diào)節(jié)外周耐受。參看例如： ncbi . nlm. nih. gov/pubmed/11722624，最后一次登錄是在2013年 10月31 日。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"抑制"、"減少"或"防止"或運(yùn)些術(shù)語(yǔ)的任何變形，當(dāng)被用在權(quán)利要求和/或說 明書中時(shí)，包括任何可檢測(cè)的下降或完全抑制W達(dá)到期望的結(jié)果。
[0049] 在本發(fā)明全文中，術(shù)語(yǔ)"約"被用來表示該值包含用來檢測(cè)該值的裝置或方法的誤 差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)用在數(shù)字表示（例如溫度、時(shí)間、量和濃度）之前時(shí)（包括范圍值），術(shù)語(yǔ) "約"表示近似值，其可上(+)下（-)改變10 %、5 %或1 %。
[0050] "生物相容性的"是指遞送系統(tǒng)的成分不會(huì)導(dǎo)致組織損傷或?qū)θ祟惿锵到y(tǒng)造成 損傷。為賦予生物相容性，會(huì)優(yōu)先使用已在人體中有安全使用記錄或具有GRAS化enerally Accepted As Safe)狀態(tài)的聚合物和賦形劑。生物相容性是指用在組合物中的組分和賦形 劑最終會(huì)被"生物吸收"或被身體清除而不會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生不利作用。一種組合物要成為生物 相容的，并且被認(rèn)為是無毒的，其必須不能對(duì)細(xì)胞造成毒性。類似地，術(shù)語(yǔ)"生物可吸收的" 是指由在一段時(shí)間內(nèi)在體內(nèi)經(jīng)歷生物吸收的材料制成的納米顆粒，因而可避免在患者體內(nèi) 形成該材料的長(zhǎng)期累積。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該生物相容性納米顆粒在少于2年的時(shí)間段 內(nèi)被生物吸收，優(yōu)選少于1年，更優(yōu)選少于6個(gè)月。生物吸收率與顆粒的尺寸、所使用的材料、 W及本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍意識(shí)到的其他因素相關(guān)。生物可吸收的生物相容性材料的混合物 可被用來形成本發(fā)明中使用的納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將氧化鐵和生物相容性的 生物可吸收的聚合物混合。例如，可將氧化鐵與PGLA混合W形成納米顆粒。
[0051] 抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物(NP-復(fù)合物)是指在表面上(例如生物相容性生物可降 解納米球上）的抗原分子或蛋白質(zhì)的膚、碳水化合物、脂質(zhì)或其他抗原節(jié)段、片段或表位的 表現(xiàn)形式（即，自身膚或自身抗原）。如本文所使用的，"抗原"是指可在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫響應(yīng) 或抗病原性細(xì)胞的擴(kuò)增的分子的全部、部分、片段或節(jié)段。
[0052] "模擬物"是特定配體或膚的類似物，其中該類似物與該配體實(shí)質(zhì)上相似。"實(shí)質(zhì)上 相似"是指該類似物的結(jié)合屬性與該配體類似，但該模擬物具有一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)或修 飾位點(diǎn)，它們共同占據(jù)該配體的分子量的少于約50%、少于約40%、少于約30%、少于約20%、少 于約10%、或少于約5〇/〇。
[0053] 術(shù)語(yǔ)"抗病原性自身反應(yīng)性T細(xì)胞"是指具有抗病原性特性的T細(xì)胞(即抵消自身免 疫疾病(例如MS、MS相關(guān)的疾病或病癥、或糖尿病前期）的T細(xì)胞）。運(yùn)些T細(xì)胞可W包括抗炎T 細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、低親和力T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、自動(dòng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、 自然殺傷T細(xì)胞、TR1細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞等。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"抗炎T細(xì)胞"是指促進(jìn)抗炎響應(yīng)的T細(xì)胞。T細(xì)胞的抗炎功能可通過抗炎蛋白 質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子等的生成和/或分泌而實(shí)現(xiàn)?？寡椎鞍踪|(zhì)也旨在包括抑制免疫響應(yīng) 的抗增殖性信號(hào)蛋白?？寡椎鞍踪|(zhì)包括化-4、化-10、化-13、化-21、化-23、化-27、IFN-a、 TGF-β、比-lra、G-CSFW及TNF和比-6的可溶性受體。還包括具有炎癥表型但殺死抗原提呈 細(xì)胞或安排特定自身免疫響應(yīng)的抗炎細(xì)胞。相應(yīng)地，本發(fā)明的一些方面設(shè)及用于在患者中 治療自身免疫疾病(例如MS、MS相關(guān)的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，該方法包括W下 步驟、實(shí)質(zhì)上由W下步驟組成或進(jìn)一步由W下步驟組成：向該患者施用抗原MHCII -納米顆 粒復(fù)合物，其中所述抗原是疾病相關(guān)的抗原。
[00對(duì)術(shù)語(yǔ)"比-10"或"白介素-10"是指由比-10基因編碼的細(xì)胞因子。比-10序列可通過 GenBank 登錄號(hào) NM_000572.2(mRNA)和 NP_000563.1 (蛋白質(zhì)）獲得。
[0056] 術(shù)語(yǔ)"TGF-護(hù)或"轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子護(hù)是指可具有抗炎作用的蛋白質(zhì)。TGF-β是W至少 Ξ種同種型存在的分泌蛋白，分別被稱為TGF-m、TGF-的和TGF-防。它也是TGF-βΙ的原名， 其是該家族的創(chuàng)始成員。TGF-β家族是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一部分，其包括抑制素類、激 活素、抗中腎旁管激素、骨形態(tài)生成蛋白、decapen化plegic蛋白和Vg-1。
[0057] "有效量"是足W實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量，預(yù)期目的的非限制性的例子包括：?jiǎn)?dòng)免疫 響應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)、抑制炎癥響應(yīng)和調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性或T細(xì)胞群。在一個(gè)方面，有效量是指 實(shí)現(xiàn)所提及的治療目的的量，例如治療有效量。如本文所詳細(xì)描述的，有效量或劑量取決于 目的和組合物、成分，并且可根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容來確定。
[0058] 詞語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"與術(shù)語(yǔ)"包括"在權(quán)利要求和/或說明書中結(jié)合使用時(shí)，其可 能意味著"一個(gè)"，但也與"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)"W及"一個(gè)或多于一個(gè)"的意思一致。
[0059] "納米球"、"NP"或"納米顆粒"在本文是指W單個(gè)或多個(gè)形式適當(dāng)施用給對(duì)象、細(xì) 胞或組織的小的離散顆粒。在某些實(shí)施方式中，納米顆粒的形狀是實(shí)質(zhì)上球形的。在一些實(shí) 施方式中，納米顆粒并非是脂質(zhì)體或病毒顆粒。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，納米顆粒是固體或 者具有固體核屯、。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上球形的"是指顆粒的形狀不偏離球狀超過 約10%。本發(fā)明的各種已知抗原或膚復(fù)合物可被施用至運(yùn)種顆粒。本發(fā)明的納米顆粒的尺寸 為約1皿至約1 μηι，并且優(yōu)選地為約1皿至約100皿，或者約1皿至約50皿，或者約5至50 nm或者約5 nm至100 nm，并且在某些方面，當(dāng)指代多個(gè)納米顆粒時(shí)，是指多個(gè)納米顆粒的平 均直徑或中間值。較小的納米尺寸的顆粒可通過例如分離工藝獲得，從而允許較大的顆粒 沉淀在水性溶液中。該溶液的上部隨后通過本領(lǐng)域已知的方法回收。該上部富集了較小尺 寸的顆粒。該工藝可被重復(fù)直到生成期望的平均尺寸。
[0060] 權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)"或"，除非另有明確說明僅指擇一方案或運(yùn)些替代方案相 互排斥之外，是指"和/或"，即使公開的內(nèi)容支持指代擇一方案和"和/或"的定義。
[0061] 如本文所使用的，短語(yǔ)"免疫響應(yīng)"或其等同體"免疫學(xué)響應(yīng)"是細(xì)胞介導(dǎo)的響應(yīng) (由抗原特異性T細(xì)胞或它們的分泌產(chǎn)物介導(dǎo)）的進(jìn)展。細(xì)胞免疫響應(yīng)是通過將多膚表位與I 類或II類MHC分子相關(guān)聯(lián)而提呈來誘導(dǎo)，從而治療或防止病毒感染、擴(kuò)增抗原特異性化eg細(xì) 胞、TCUCD4+ T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或疾病生成的、自動(dòng)調(diào)節(jié)的T細(xì)胞和 B"記憶"細(xì)胞。運(yùn)些響應(yīng)有可能設(shè)及其他成分的激活。
[0062] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"炎癥反應(yīng)"和"發(fā)炎"表示個(gè)體的血管組織對(duì)有害刺激(例如病原 體、受損細(xì)胞或刺激物）的復(fù)雜的生物學(xué)響應(yīng)，包括分泌細(xì)胞因子，更具體地是促炎性細(xì)胞 因子，即，主要是由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生并且設(shè)及炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大的細(xì)胞因子。促炎性細(xì)胞 因子的例子包括但不限于，比-1、比-6、比-10、TNF-a、比-17、化21、化23、化27和了6。-0。示例 性的發(fā)炎包括急性發(fā)炎和慢性發(fā)炎。急性發(fā)炎表示短期過程，其特點(diǎn)在于由于血漿和白細(xì) 胞對(duì)組織的浸潤(rùn)導(dǎo)致的典型的發(fā)炎癥狀(腫脹、發(fā)紅、疼痛、發(fā)熱和功能喪失）。急性發(fā)炎通 常只要存在損傷刺激即出現(xiàn)，并且一旦刺激被除去、分解或通過形成癒痕而隔離(纖維化） 即停止。慢性發(fā)炎表示一種狀態(tài)，其特點(diǎn)是并發(fā)活性炎癥、組織破壞并且嘗試修復(fù)。慢性發(fā) 炎沒有W上列出的急性發(fā)炎的那些典型癥狀。相反，慢性發(fā)炎組織的特點(diǎn)是單核免疫細(xì)胞 (單細(xì)胞、巨隧細(xì)胞、淋己細(xì)胞和漿細(xì)胞)的浸潤(rùn)、組織破壞，并嘗試愈合(包括血管生成和纖 維化）。在本發(fā)明的意義上，發(fā)炎可通過影響，特別是抑制形成個(gè)體內(nèi)炎癥相關(guān)的復(fù)雜生物 學(xué)響應(yīng)的任何一個(gè)事件來抑制。
[0063] 自身免疫性疾病可W包括但不限于:糖尿病、糖尿病前期、移植排斥、多發(fā)性硬化、 多發(fā)性硬化相關(guān)的疾病、卵巢早衰、硬皮病、斯耶格倫氏病、狼瘡、vilelego病、脫發(fā)(秀頂）、 腺體衰竭、格雷夫斯病、甲狀腺功能減退癥、多發(fā)性肌炎、天瘤瘡、克羅恩病、結(jié)腸炎、自身免 疫性肝炎、垂體功能減退癥、屯、肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮膚病、葡萄膜炎、惡性貧血、 甲狀旁腺功能減退、和/或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一些方面，抗原/ MHCII/顆粒復(fù)合物的膚成 分衍生自或設(shè)計(jì)自在將被該治療探測(cè)、調(diào)制、或減弱的自身免疫響應(yīng)中設(shè)及的自身抗原或 自身抗原表位、或其模擬物。在特定的方面，自身抗原是膚、碳水化合物、或脂質(zhì)。在一些方 面，自身抗原是由對(duì)象的某些細(xì)胞(例如膜腺β細(xì)胞)表達(dá)的片段、表位、或蛋白的膚、碳水化 合物、或脂質(zhì)，并且包括但不限于IGRP的片段、膜島素、GAD或ΙΑ-2蛋白。已經(jīng)對(duì)多種自身免 疫性疾病鑒定了多種運(yùn)樣的蛋白或表位。所述自身抗原可W是衍生自第二內(nèi)分泌或神經(jīng)分 泌成分(例如膜島周圍雪旺氏細(xì)胞等)的膚、碳水化合物、或脂質(zhì)。
[0064] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"疾病相關(guān)的"抗原是指其被選擇來治療被選擇的疾病的抗 原或片段。例如，糖尿病相關(guān)的抗原是其將會(huì)治療糖尿病的抗原或片段。MS相關(guān)的抗原被選 擇來治療MS。糖尿病相關(guān)的抗原不會(huì)被選擇來治療MS。相似地，自身免疫相關(guān)的抗原是與自 身免疫疾病相關(guān)的并且不會(huì)被選擇來治療自身免疫之外的疾病或病癥(例如癌癥)的抗原。
[0065] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"糖尿病"是指由遺傳和環(huán)境因素引起的碳水化合物代謝的 可變疾病，其特征通常是膜島素的分泌或利用不足、生成的尿量過多、在血液和尿中的糖含 量過多、W及口渴、饑餓和體重減輕。糖尿病的特征在于1型糖尿病和2型糖尿病。非肥胖糖 尿病（"NOD")小鼠是被接受的用于研究和治療糖尿病的動(dòng)物模型。小鼠中的1型糖尿病 (T1D)與自身反應(yīng)性CD8+ T-細(xì)胞相關(guān)。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠發(fā)展出與人類T1D非常相似 的一種形式的T1D，它起因于識(shí)別不斷增加的自身抗原的T細(xì)胞對(duì)膜腺β細(xì)胞的選擇性破壞。 雖然T1D的引發(fā)明顯需要CD4+細(xì)胞的參與，但是有令人信服的證據(jù)表明T1D是CD8+ Τ細(xì)胞依 賴性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠中的膜島相關(guān)的CD8+細(xì)胞的很大一部分使用CDR3-不變的να17- Ja4化TCR(被稱為巧.3-TCR樣"）。運(yùn)些細(xì)胞在MHC分子Kd的情況下識(shí)別模擬表位NRP-A7(使 用組合膚庫(kù)來定義的），它們已經(jīng)是最早的NOD膜島CD8+浸潤(rùn)物的顯著成分、是致糖尿病的， 并且祀定來自膜島特異性葡萄糖-6-憐酸酶催化的亞基相關(guān)的蛋白（IGRP，一種未知功能的 蛋白）的膚。識(shí)別該膚（IGRP206-214 ,與NRP-A7相似）的CD8+細(xì)胞在循環(huán)中異常頻繁O(jiān)1/200 CD8 +細(xì)胞）。值得注意的是，NOD小鼠中的膜島炎到糖尿病的進(jìn)展總是伴隨著循環(huán)的 IGRP206-214-反應(yīng)性CD8+池的循環(huán)擴(kuò)展，W及其膜島相關(guān)的配對(duì)物的快速成熟。最近，已經(jīng)顯 示，NOD小鼠中的膜島相關(guān)的CD8 +細(xì)胞識(shí)別多個(gè)IGRP表位，表明IGRP是對(duì)CD8+細(xì)胞的主要 的自身抗原，至少在鼠類T1D中是。NOD膜島相關(guān)的CD8 +細(xì)胞，特別是那些早在疾病過程中 發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，也識(shí)別膜島素表位(Ins Bi日-23)。
[0066] 相關(guān)研究已經(jīng)表明，某些化A I類等位基因（即化A-A*0201)使得易患人類T1D。病 理學(xué)研究已經(jīng)顯示，初診患者的膜島病變主要由（HLA I類限制的乂D8+ T-細(xì)胞組成，運(yùn)些 細(xì)胞也是通過移植膜腺同基因移植物(來自同卵雙胞胎)或同種異體移植(來自相關(guān)的捐獻(xiàn) 者)治療的患者中主要的細(xì)胞群體。
[0067] 膜島素是人類和鼠類T1D中抗體和CD4+響應(yīng)的關(guān)鍵祀標(biāo)。在膜島移植接受者和在 自發(fā)性疾病的過程中，人類膜島素 B鏈表位hInsBio-18由HLA-A*0201提呈至自身反應(yīng)性CD8+ 細(xì)胞。此外，已經(jīng)從小鼠前膜島素原1或2識(shí)別了四個(gè)額外的膚，它們?cè)贖LA-A*0201的情況下 從HLA-A*0201-轉(zhuǎn)基因小鼠中被膜島相關(guān)的CD8+ T-細(xì)胞識(shí)別。
[0068] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"糖尿病前期"是指在糖尿病癥狀之前的無癥狀期，其特征 是亞臨床β細(xì)胞損傷，其中患者表現(xiàn)出正常的血漿葡萄糖水平。它的特征還在于存在膜島細(xì) 胞自身抗體(ICAs)，當(dāng)接近的臨床癥狀的發(fā)作時(shí)，還伴隨著對(duì)葡萄糖的不耐受。
[0069] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"多發(fā)性硬化癥"或"MS"是指自身免疫性疾病，其中身體的 免疫系統(tǒng)在覆蓋神經(jīng)的保護(hù)套進(jìn)行侵蝕。運(yùn)干擾了大腦和身體其余部分的通信。最終，運(yùn)會(huì) 導(dǎo)致神經(jīng)自身的惡化，該過程是不可逆的。
[0070] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"多發(fā)性硬化癥相關(guān)的疾病"是指與MS的易感性或與MS共同 呈現(xiàn)的疾病。運(yùn)些疾病的非限制性例子包括:視神經(jīng)脊髓炎(NM0)、葡萄膜炎、神經(jīng)性疼痛硬 化、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、硬化播散性全身性硬化癥、脊髓-光學(xué)MS、原發(fā)性進(jìn)行MS (PPMS)、W及復(fù)發(fā)緩解型MS(PPMS)、進(jìn)行性全身性硬化癥、W及共濟(jì)失調(diào)硬化癥。
[0071 ]術(shù)語(yǔ)"表位"和"抗原決定簇"可互換使用，并且是指抗原上B細(xì)胞和/或T細(xì)胞所響 應(yīng)或識(shí)別的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由連續(xù)氨基酸形成或通過蛋白質(zhì)的Ξ次折疊而并置的非連 續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑時(shí)仍保留，但由Ξ次折疊 形成的表位通常在用變性溶劑處理時(shí)會(huì)丟失。表位通常包括至少3個(gè)、更常見為至少5個(gè)或 8-10個(gè)W獨(dú)特空間構(gòu)象存在的氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括例如X射線晶體分 析法和2維核磁共振法。參見例如Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996) dT細(xì)胞識(shí)別CDS細(xì)胞的約9個(gè)氨基酸的連續(xù)表位，或CD4細(xì)胞的約13-15個(gè)氨基酸的表 位。識(shí)別該表位的T細(xì)胞可通過測(cè)定抗原依賴性增殖的體外實(shí)驗(yàn)來識(shí)別，該測(cè)定可通過化- 胸腺喀晚加入、通過已接觸抗原的T細(xì)胞對(duì)表位的響應(yīng)(Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119，1994)、通過抗原依賴性殺傷(細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，Tigges et al.， J. Immunol.，156(10):3901-3910, 1996)、或通過細(xì)胞因子分泌來確定。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫 響應(yīng)的存在可通過增殖實(shí)驗(yàn)(CD4+ T細(xì)胞)或CTL實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞)來確定。
[0072] 任選地，抗原或優(yōu)選地抗原的表位可化學(xué)地結(jié)合至，或表達(dá)為，與其他蛋白融合的 融合蛋白，所述其他蛋白例如是MHC和MHC相關(guān)蛋白。
[0073] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"患者"和"對(duì)象"可意思相近，并且是指哺乳動(dòng)物。在一些實(shí) 施方式中，患者是人。在其他實(shí)施方式中，患者是通常用在實(shí)驗(yàn)室中的哺乳動(dòng)物，例如是小 鼠、大鼠、猴、狗、貓、牛、馬或羊。
[0074] 如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)"多核巧酸"是指一種核酸分子，其可為重組的，或是分 離的且不含全基因組核酸。術(shù)語(yǔ)"多核巧酸"包括寡核巧酸（長(zhǎng)度為100個(gè)殘基或更少的核 酸）、重組載體(包括例如質(zhì)粒、粘粒、隧菌體、病毒等）。在某些方面，多核巧酸包括調(diào)節(jié)序 列，它們被分離得實(shí)質(zhì)上遠(yuǎn)離它們的天然基因或蛋白質(zhì)編碼序列。多核巧酸可為RNA、DNA、 其類似物、或它們的組合。編碼多膚的全部或部分的核酸可含有編碼該多膚的全部或一部 分的連續(xù)核酸序列，并具有 W 下長(zhǎng)度：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、 330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、 700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、 1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、或更多個(gè)核巧酸、核巧或堿基對(duì)。還預(yù)期的是，來 自特定物種的特定多膚可由含有天然變體的核酸編碼，所述天然變體具有稍微不同的核酸 序列但編碼相同或?qū)嵸|(zhì)性相似的蛋白質(zhì)、多膚或膚。
[0075] 多核巧酸是由特定序列的四種核巧酸堿基構(gòu)成的：腺嚷嶺(A);胞喀晚(C);鳥嚷嶺 (G);胸腺喀晚(T);W及如果多核巧酸是RNA時(shí)替代胸腺喀晚的尿喀晚(U)。因此，術(shù)語(yǔ)"多核 巧酸序列"是多核巧酸分子的字母表現(xiàn)形式。該字母表現(xiàn)形式可被輸入到具有中央處理單 元的計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，并且可用于生物信息學(xué)應(yīng)用，例如功能基因組學(xué)和同源性檢索。
[0076] 如本文關(guān)于核酸(例如DNA或RNA)所使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的"或"重組的"是指分離自 其它DNA或RNA的分子，分別為存在于大分子W及多膚的天然來源中的分子。術(shù)語(yǔ)"分離的或 重組的核酸"包括不是天然地作為片段存在并且在自然狀態(tài)下找不到的核酸片段。術(shù)語(yǔ)"分 離的"在本文中也用來指分離自其他細(xì)胞蛋白質(zhì)的多核巧酸、多膚和蛋白質(zhì)，并且意在包括 純化的和重組的多膚。在其他實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"分離的或重組的"是指分離自成分、細(xì)胞， 其中細(xì)胞、組織、多核巧酸、膚、多膚、蛋白質(zhì)、抗體或其片段在天然狀態(tài)下通常是聯(lián)合在一 起的。例如，一個(gè)分離的細(xì)胞是指分離自不相似表型或基因型的組織或細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞。分 離的多核巧酸是分離自3'和5'連續(xù)核巧酸，該分離的多核巧酸在其天然或自然環(huán)境中（例 如在染色體上)通常是與3'和5'連續(xù)核巧酸相連的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，非天 然的核巧酸、膚、多膚、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要進(jìn)行"分離"從而預(yù)期天然副本相區(qū)別。
[0077] 多核巧酸或多核巧酸區(qū)域(或多膚或多膚區(qū)域）與另一序列具有特定百分?jǐn)?shù)（例 如，80%、85%、90%或95%)的"序列一致性"是指，在比較著兩個(gè)序列時(shí)，當(dāng)比對(duì)時(shí)，該百分?jǐn)?shù)的 堿基(或氨基酸)是相同的。該比對(duì)W及同源性或序列一致性百分比可利用本領(lǐng)域已知的軟 件來確定，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30，7.7.18部分，表格7.7.1中描述的那些軟件。優(yōu)選地，比對(duì)時(shí)使用默 認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選的比對(duì)程序是BLAST，使用默認(rèn)參數(shù)。特別地，優(yōu)選的程序?yàn)锽LASTN和BLASTP， 使用W下默認(rèn)參數(shù):遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾器=無;鏈=兩種；切斷=60;預(yù)期=10; Ma化ix =化0SUM62;描述=50個(gè)序列；分類=HI細(xì)SCORE;數(shù)據(jù)庫(kù)=非冗余，GenBank + EMBL + 孤BJ + PDB + GenBank CDS翻譯 + SwissProtein + SPupdate + PIR。運(yùn)些程 序的詳細(xì)信息可在W下網(wǎng)址找到ncbi .nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
[0078] 不用明確說明即可推測(cè)得出，除非另有說明，否則當(dāng)本發(fā)明設(shè)及到多膚、蛋白質(zhì)、 多核巧酸或抗體時(shí)，其等價(jià)物或生物學(xué)等價(jià)物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。如本文所使用 的，當(dāng)提到參考抗原、蛋白、抗體、片段、多膚或核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)"其生物學(xué)等價(jià)物"與"其等價(jià) 物"同義，并且是指具有最小同源性但仍保持期望的結(jié)構(gòu)或功能性的抗原、蛋白、抗體、片 段、多膚或核酸。除非本文另有特別說明，否則預(yù)期的是，任何本文提及的多核巧酸、多膚 或蛋白質(zhì)也包括其等價(jià)物。在一個(gè)方面，等價(jià)多核巧酸是在嚴(yán)格條件下與本文所述用于所 描述的方法的多核巧酸或其互補(bǔ)序列雜交的多核巧酸。在另一個(gè)方面，等價(jià)抗體或抗原結(jié) 合多膚是指W至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的親和性 或更高的親和性結(jié)合至參考抗體或抗原結(jié)合片段的抗體或多膚。在另一個(gè)方面，其等價(jià)物 在競(jìng)爭(zhēng)性化ISA實(shí)驗(yàn)中與該抗體或抗原結(jié)合片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至其抗原。在另一個(gè)方面，等價(jià)物 具有至少約80%同源性或一致性，或者至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約98% 的同源性或一致性，并且表現(xiàn)出與參考蛋白、多膚或核酸實(shí)質(zhì)上等同的生物學(xué)活性。
[0079] "雜交"是指一個(gè)或多個(gè)多核巧酸發(fā)生反應(yīng)W形成復(fù)合物的反應(yīng)過程，該復(fù)合物通 過核巧酸殘基的堿基之間的氨鍵結(jié)合而穩(wěn)定化。氨鍵結(jié)合可為Watson-Crick堿基配對(duì)、 Hoogstein結(jié)合或任何其他序列特異性方式結(jié)合。該復(fù)合物可包括形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩個(gè)鏈、 形成多鏈復(fù)合物的Ξ個(gè)或更多個(gè)鏈、單個(gè)自身雜交的鏈、或運(yùn)些的任何組合。雜交反應(yīng)可W 為更廣泛過程中的一個(gè)步驟，例如是PC反應(yīng)的起始步驟，或多核巧酸核酶催化中的酶促裂 解步驟。
[0080] 嚴(yán)格雜交條件的例子包括:溫育溫度為約25°C至約37°C;雜交緩沖液濃度為約6x SSC至約lOx SSC;甲酯胺濃度為約0%至約25%;并且洗涂溶液為約4x SSC至約8x SSC。中等 雜交條件的例子包括:溫育溫度為約40°C至約50°C ;緩沖液濃度為約9x SSC至約2x SSC;甲 酷胺濃度為約30%至約50%;并且洗涂溶液為約5x SSC至約2x SSC。高嚴(yán)格雜交條件的例子 包括:溫育溫度為約55°C至約68°C ;緩沖液濃度為約lx SSC至約0. lx SSC;甲酯胺濃度為約 55%至約75%;并且洗涂溶液為約lx SSC、0. lx SSC、或去離子水。一般而言，雜交溫育時(shí)間為 5分鐘至24小時(shí)，具有1、2或更多個(gè)洗涂步驟，并且洗涂溫育時(shí)間為約1、2、或15分鐘。SSC是 0.15 Μ化C1和15 mM巧樣酸鹽緩沖液。要理解的是，可使用利用其它緩沖系統(tǒng)的SSC等價(jià) 物。
[0081 ]"同源性"或"一致性"或"相似性"是指兩個(gè)膚之間或兩個(gè)核酸分子之間的序列相 似性。同源性可通過比較每個(gè)序列中的一個(gè)位置來確定，運(yùn)些序列可被對(duì)齊從而進(jìn)行比較。 當(dāng)被比序列中的一個(gè)位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么運(yùn)些分子在該位置是同源的。 序列之間的同源性程度與序列共享的匹配或同源位置的數(shù)量有關(guān)。"不相關(guān)的"或"非同源 的"序列與本發(fā)明的序列中的一個(gè)共享少于40%的一致性，或少于25%的一致性。
[0082] "同源性"或"一致性"或"相似性"也可W指在嚴(yán)格條件下雜交的兩個(gè)核酸分子。
[0083] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"治療"是指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。該效果可 為治療性的，表現(xiàn)為部分地或完全地治愈疾病和/或由該疾病造成的負(fù)面作用。在一個(gè)方 面，治療表示使用已建立的規(guī)模的疾病癥狀的減少。
[0084] IGRP是由基因 IDDM7(2q31)(位于染色體2q28-32,與T1D易感基因重疊 )編碼的，近 期它也被識(shí)別為人類T1D中潛在相關(guān)的β-細(xì)胞自身抗原。通過表達(dá)HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因的、來 自鼠類I類MHC缺失的NOD小鼠的膜島相關(guān)的CD8+細(xì)胞識(shí)別了人類IGRP的兩個(gè)HLA-A*0 201 - 結(jié)合表位(hIGRP228-236和hIGRP26日-273)。結(jié)合至鼠類II類Μ肥分子（IAg7)的IGRP抗原的非限制 性例子包括例如IGRP2G6-214(其包含抗原膚VYLKTNVFL)、IGRP4-22(其包含抗原膚 LHRSG化II皿LQ抓YRTY或其等價(jià)物）和IGRPi28-i45(其包含抗原膚TAALSYTISRMEESSVTL或其 等價(jià)物）。
[0085] "防止"是指在體外或體內(nèi)防止在傾向于患有疾病或具有作用的系統(tǒng)或?qū)ο笾谐?現(xiàn)的該疾病或作用。
[0086] "組合物"是指活性試劑和惰性(例如可檢測(cè)試劑或標(biāo)記物)或活性的另一種化合 物或組合物(例如佐劑)的組合。在一些實(shí)施例中，該組合物不包含助劑。
[0087] "藥物組合物"包括活性試劑與惰性或活性的載體的組合，所述載體使得該組合物 適于體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)的診斷或治療用途。
[0088] 術(shù)語(yǔ)"功能上等同的密碼子"是指編碼相同氨基酸的密碼子，例如精氨酸或絲氨酸 的6個(gè)密碼子，并且也指編碼生物學(xué)等價(jià)氨基酸的密碼子(見下表）。
[0089] 密碼子表
[0090] 如本文所使用的，"蛋白質(zhì)"或"多膚"或"膚"是指包含至少五個(gè)氨基酸殘基的分 子。
[0091] 本發(fā)明的其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將從W下詳細(xì)描述中明顯看出。但是，要理解的 是，詳細(xì)的描述和具體的例子雖然表示了本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但僅為了解釋的目的而 給出，因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可根據(jù)該詳細(xì)的描述，在本發(fā)明的范圍內(nèi)做出各 種改變和修飾。
[0092] 描述性實(shí)施方式 目前沒有治療平臺(tái)使得能夠完全抑制多克隆自身免疫反應(yīng)而不影響全身免疫。本文描 述的本
【申請(qǐng)人】的發(fā)現(xiàn)使得能夠設(shè)計(jì)自身免疫性疾病特異性藥物，該藥物使自身反應(yīng)性疾病 特異的CD4+ T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥吹?、單特異性的調(diào)節(jié)CD4+ T細(xì)胞和B細(xì)胞，它們協(xié)同 地抑制宿主的所有其他自身反應(yīng)性T和B細(xì)胞反應(yīng)，不論其精細(xì)的抗原特異性，但是具有靈 敏的疾病特異性，而不會(huì)損害全身免疫。
[0093] 型糖尿病(T1D)的自身抗原復(fù)雜性 TID是由逐漸侵蝕膜島β細(xì)胞的慢性自身免疫反應(yīng)引起的。在人類和NOD小鼠中的B細(xì)胞 破壞都受到識(shí)別許多自身抗原的T細(xì)胞影響（Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Lieberman, S. et al. (2003) Tissue Antigens 62:359-377)。雖然運(yùn)些 事件的精確序列仍然不明確，但是目前的證據(jù)表明：TID需要CD4+和CD8+細(xì)胞；自身反應(yīng)性Τ 細(xì)胞通過結(jié)合在局部APC上的Β細(xì)胞抗原而分化為殺傷子;運(yùn)些Τ細(xì)胞祀定相當(dāng)多的自身抗 原（Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Santamaria, Ρ. (2010) Immunity 32:437-445)。
[0094]已經(jīng)表明，可溶性膚能夠引起體內(nèi)的膚特異性T細(xì)胞耐受，但是不能夠純化多特異 性自身免疫反應(yīng)化an et al. (2005) NaUire Medicine 11(6) :645-652)。令人意外地，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與使用可溶性膚的治療不同，使用涂布有單T1D相關(guān)的I型pMHC的NP的治療(最初被 用作陰性對(duì)照）純化了糖尿病前期NOD小鼠的惡化并且恢復(fù)了糖尿病動(dòng)物中的正常血糖 (Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580)。后續(xù)的工作意外地發(fā)現(xiàn)，pMHC-NP治療 通過W表位特異性的方式使經(jīng)歷了自身抗原的自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞擴(kuò)增而發(fā)生作用，運(yùn)些 CD8+細(xì)胞通過抑制和殺死裝載了自身抗原的APC，從而抑制其他自身抗原性T細(xì)胞特異性的 招募。更近地，
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)，該治療平臺(tái)可W被用于自身反應(yīng)性T調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞的體外擴(kuò)增。 特別地，
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)，涂布有單個(gè)T1D相關(guān)的II類pMHC的NP使疾病特異性TR1 CD4+ T細(xì)胞擴(kuò) 增，表達(dá)TR1 標(biāo)記物CD49b 和LAG3 (Gagliani, N. et al. (2013)化ture Medicine 19: 739-746)并產(chǎn)生細(xì)胞因子ILIO和TGF-β(見W下）。
[00%]運(yùn)些發(fā)現(xiàn)共同地支持了自身免疫的進(jìn)展中的新范例，其中通過內(nèi)源性表位進(jìn)行的 初始自身反應(yīng)性CD8+或CD4+ T細(xì)胞的慢性刺激觸發(fā)了它們分化為記憶樣自身反應(yīng)性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞;運(yùn)些記憶自身反應(yīng)性調(diào)節(jié)細(xì)胞通過抑制和/或殺死裝載了自身抗原的APC，抑制同源 和非同源的高親和力的自身反應(yīng)性T細(xì)胞特異性的激活（Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32: 568-580)。重要地，并且不受理論約束，當(dāng)被作為配體涂布至NP上時(shí)，在自身 免疫性疾病(在眾多之中的）中設(shè)及的任何單個(gè)表位(pMHC)特異性都可W被用來純化復(fù)雜 的自身免疫反應(yīng)。
【申請(qǐng)人】相信，運(yùn)些NP制劑不能激活初始T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)， 因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙訇P(guān)鍵的共刺激分子(例如CD80和CD86)。實(shí)際上，同源的初始和效應(yīng)自身反應(yīng) 性細(xì)胞通過該方法被刪除。所W，實(shí)行其發(fā)現(xiàn)的治療方法為自身免疫中的一類新的治療提 供了平臺(tái)，它潛在地能夠W疾病和器官特異性的方式解決多克隆自身免疫反應(yīng)，而不會(huì)影 響全身免疫。
[0096] 方法 本發(fā)明還提供了醫(yī)療和診斷方法。在一個(gè)方面，提供了一種用于在有需要的對(duì)象中W 抗原特異性方式促進(jìn)B調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或TR1細(xì)胞(例如TR1和CD4+細(xì)胞)的形成、擴(kuò)增和招募的 方法，所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組成、或由W下步驟組成：向所述對(duì)象 施用有效量的本文所述的NP-復(fù)合物或組合物。
[0097]在另一個(gè)方面，提供了一種在有需要的對(duì)象中治療或防止自身免疫性疾病或病癥 (例如MS、MS相關(guān)的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上 由W下步驟組成、或由W下步驟組成：向所述對(duì)象施用有效量的本文所述的NP-復(fù)合物或組 合物，其中抗原對(duì)于將要治療的疾病是疾病相關(guān)的，例如，對(duì)于糖尿病的防止或治療，抗原 是糖尿病相關(guān)的抗原。在進(jìn)一步的方面，自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化或多發(fā)性硬化相關(guān) 的疾病并且抗原是MS相關(guān)的。
[009引用于治療或防止糖尿病前期或糖尿病的膚抗原包括但不限于：hInsBio-18 (HLVEALYLV)、hIGRP228-236 化NIDLLWSV)、hIGRP265-273 (VLF化GFAI)、IGRP206-214 (VYLKTNVFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db (FQDENYLYL)和/或INS Bis-23 化化VCGERG)、GAD65ii4-i23、VMNILLQYVV;GAD65536-54己、 RMMEYGTTMV; GFAPi43-i5i、NLAQTDLATV; GFAP214-222、QLARQQVHV; IA-2i72-i80、SLS 化 QA化；I A- 2482-490、化 AAGVK1X;IA-28 日日-813、VIVMLTTLV;卵 lAPP 日-i3、KLQWLIV1^;wIAPP9-i7JLIVLSVA1^; IGRP152-160、化WSVFMLI; IGRP211-219、化化化FAV; IGRP215-223、化FAVGFYL; IGRP222-230、 YIXLR化NI; IGRP228-236、LNIDLLWSV; IGRP26日-273、VLF化GFAI; IGRP293-30i、RUXALT化；Pro- insul inL2-io、ALWMRLLPM Pro-insul inL3-ii、LWMRLLPIX; Pro-insul inL6-i4、RLLPLLAIX; Pro- insul inB 日-i4、HLCG 細(xì) LVEA; Pro-insul inBio-18、HLVEALYLV; Pro-insul inBi4-22、ALYLVCG ?。?Pro-i n su 1 i ΠΒ15-24、LYLVCGERGF; Pro-in sul inBi7-25、LVCGERGFF; Pro-in sul inBi8-27、 VCGERGFFYT; Pro-insul inB20-27、GERGFFYT ; Pro-insul inB2i-29、ERGFFYTPK; Pro- insul i 郵2 已-Cl 、FYTPKTRRE; Pro-insul i 郵27-C5 、TPKTRREAEDM Pro-insul inc20-28、 SLQPLALEG; Pro-insul inc25-33、ALEGSLQKR; Pro-insul inc29-A5、SLQKRGIVEQ; Pro-insul iriAi-io、 GIVEQCCTSI; Pro-insul inA2-io、IVEQCCTSI; Pro-insul inAi2-20、SLYQLENYC 或其等價(jià)物和/或 組合。額外的例子包括：Pro Ins 76-90、化QPLALEGSLQKRG、Pro Ins 79-89、化ALEG化QKR、 Prolns 90-109、GIVEQCCTSIC化YQLENYC、ProIns 94-105、QCCTSICSLY化、GAD 247-266、 NMYAMMIARFKMF陽(yáng)VKEKG、GAD 255-265、RFKMF陽(yáng)VK邸、GAD 555-567、NFFRMVISNPAAT、IGRP 13-25、QHLQKDYRAYYTF、IGRP 8-27、GVLIIQHLQKDYRAYYTTLN、Pro Ins B24-C36、 FFYTPMSRREVED及其每個(gè)的等價(jià)物。
[0099] 當(dāng)所述方法設(shè)及MS或MS相關(guān)的疾病的治療時(shí)，所述復(fù)合物包括設(shè)及多發(fā)性硬化的 抗原。運(yùn)些抗原包括例如在美國(guó)專利公開2012/0077686號(hào)中公開的抗原，W及來源于髓銷 堿性蛋白、髓銷相關(guān)糖蛋白、髓銷少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓銷糖 蛋白、髓銷相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白、熱休克蛋白、少突膠 質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白N0G0 A、糖蛋白Po、外周髓銷蛋白22、W及2'3'環(huán)狀核巧酸3'-憐酸二醋 酶的抗原。在一些實(shí)施例中，所述抗原來源于髓銷少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（M0G)。非限制性的 例子包括例如MAG287-29日、S化LELEEV; MAG日日9-日 17、LMWAKIGPV; MAG日日6-日64、VLFSSDFRI; MBPiio-118、 SLSRFSWGA; MOG114-122、KVEDPFYWV; MOG166-17日、RT抑PHFLRV; MOG172-180、FLRVPCWKI; MOG179-188、 ?αTLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; M0G181-189、TLFVIVP化；M0G2日日-214、RLAGQFLffiL; PLP80-88、 FLYGA化LA或其等價(jià)物或組合。
[0100] 能夠被用在本發(fā)明中的抗原的其他非限制性例子包括多膚，運(yùn)些多膚包括W下多 膚、或?qū)嵸|(zhì)上由W下多膚組成、或由W下多膚組成:MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29 日、化化化邸 V; MAG 日日 9-日 17、LMWAKIGPV; MAG 日日 6-564、 VLFSSDFRI; MBPI110-118、化SRFSWGA; M0G114-122、KVEDPFYWV; M0G166-175、RT抑PHFLRV; MOG172-180、 FLRVPCWKI ;M0Gi79-i88、KITLFVIVPV;M0Gi88-i96、VLG化VALI;M0Gi8i-i89、TLFVIVP化；MOG2日日-214、 RLAGQFLffiL; PLP8Q-88、FLYGA化LA或其每一個(gè)的等價(jià)物、或其組合。
[0101] 確定和監(jiān)控療法的方法在本領(lǐng)域是已知的，并在本文簡(jiǎn)要描述。當(dāng)在體外遞送時(shí)， 施用通過將組合物與組織或細(xì)胞W任何適當(dāng)方法接觸而進(jìn)行，例如，通過施用至細(xì)胞或組 織培養(yǎng)基，并且用作篩選器w確定該療法是否適合某個(gè)個(gè)體或者用w篩選出替代性療法， 從而作為所公開的組合物的替代或與其結(jié)合。當(dāng)在體內(nèi)遞送時(shí)，施用通過全身或局部施用 進(jìn)行。在體內(nèi)，所述方法可在人體施用之前在非人動(dòng)物上實(shí)施，W篩選出替代性療法，從而 作為所公開的組合物的替代或與其結(jié)合。在人或非人哺乳動(dòng)物中，它們對(duì)于治療疾病或病 癥也是有用的。
[0102] 上述方法要求有效量的NP-復(fù)合物的施用。
[0103] 抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的MHC可為MHC I、MHC II或非經(jīng)典Μ肥，但優(yōu)選MHCII。 MHC蛋白在本文中有描述。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的MHC是I類MHC。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，該MHC是II類MHC。在其他實(shí)施方式中，抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的 MHC成分是II類MHC或如本文所述的非經(jīng)典MHC分子。在一個(gè)方面，所述抗原包括W下多膚 GWYRSPFSRVVH或GWYRSPFSRVVH的等價(jià)物、或?qū)嵸|(zhì)上由其組成、或由其組成。
[0104] 納米顆粒的尺寸可在約1 nm至約1皿之間變化。在某些實(shí)施方式中，納米顆粒的 直徑小于約1 μπι。在其他實(shí)施方式中，納米顆粒的直徑小于約500 nm、小于約400 nm、小于 約300 nm、小于約200 nm、小于約100 nm、或小于約50 nm。在另外的實(shí)施方式中，納米顆粒 的直徑為約 1 nm至約 10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或 100 nm。在 具體的實(shí)施方式中，納米顆粒為約1皿至約100 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約20 nm、 或約5 nm至約20 nm。
[0105] 復(fù)合物的尺寸可在約5 nm至約1皿之間變化。在某些實(shí)施方式中，復(fù)合物的直徑 小于約1 ym或小于100 nm。在其他實(shí)施方式中，復(fù)合物的直徑小于約500 nm、小于約400 皿、小于約300皿、小于約200皿、小于約100皿、或小于約50皿。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 復(fù)合物為約5皿或10皿至約50皿、或約5皿至約75皿、或約5皿至約50皿、或約5皿至 約60 nm、或約10 nm至約60 nm,或者在一個(gè)方面為約55 nm。
[0106]
【申請(qǐng)人】已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，納米顆粒上的抗原-ifflC復(fù)合物的密度對(duì)治療效果有貢獻(xiàn)。因此， 如本文公開的，抗原-MHC納米顆粒復(fù)合物可W具有所定義的密度，該密度為包括該復(fù)合物 的納米顆粒的每100皿2表面積上約0.05個(gè)MHC分子，假設(shè)至少2 MHC、或至少8、或至少9、或 至少10、或至少11、或至少12(個(gè))MHC被復(fù)合至納米顆粒。在一個(gè)方面，復(fù)合物的MHC密度為 每100皿2約0.01 Μ肥（0.05 Μ肥/100皿2)至約30 MHC/100皿2、或約0.1 Μ肥/100皿2至 約25 MHC/100皿2、或約Q.3 MHC/100皿2至約25 Μ肥/100皿2、或約Q.4 Μ肥/100皿2至約 25 Μ肥/100皿2、或約0.5 Μ肥/100皿2至約20 MHC/100皿2、或約0.6 MHC/100皿2至約20 MHC/100 ηπΛ或約 1.0 MHC/100 醒2至約20 MHC/100 nm2、或約5.0 MHC/100 歴2至約20 MHC/100 ηπΛ或約 10.0MHC/100 歴2 至約 20 MHC/100 ηπΛ或約 15 MHC/100 歴2 至約 20 MHC/100 nm2、或至少約0.5、或至少約1.0、或至少約5.0、或至少約10.0、或至少約15.0 MHC/100 nm2。在一個(gè)方面，當(dāng)9或至少9(個(gè))MHC被復(fù)合至納米顆粒時(shí)，密度范圍是約0.3 Μ肥A00nm2至約 20 Μ肥/100皿2。
[0107] 在其方法的一個(gè)方面，提供了一種用于在有需要的患者中積累Β調(diào)節(jié)細(xì)胞和/或抗 炎Τ細(xì)胞的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Τ細(xì)胞是CD4+或CD8+ Τ細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施方式 中，Τ細(xì)胞分泌IL-10或TG邱。所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組成、或由W下 步驟組成：向所述患者施用有效量的本文所述的抗原-MHC納米顆粒復(fù)合物。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的組合物和方法是用于治療自身免疫性疾病，例如 MS、MS相關(guān)的疾病、糖尿病或糖尿病前期。所述方法包括W下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由W下步驟組 成、或由W下步驟組成：向由此需要的患者施用有效量的本文所述的抗原-MHCII納米顆粒 復(fù)合物。
[0109] 在本文中描述了關(guān)于體外和體內(nèi)施用的模型的細(xì)節(jié)。
[0110] 本發(fā)明還提供了 NP-復(fù)合物用于制備用于治療和/或防止本文所述的疾病或病癥 的藥物的用途。
[0111] 抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物 A.多膚和多核巧酸 另一些方面設(shè)及分離和或純化的多膚抗原，其包含W下組分、或?qū)嵸|(zhì)上由W下組分構(gòu) 成、或由W下組分構(gòu)成:本文所述的氨基酸序列，或與抗原的氨基酸序列具有至少約80%的 序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列一致性的多膚，或由與編 碼抗原的氨基酸序列的多核巧酸具有至少約80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或 至少95%、或至少98%的序列一致性的多核巧酸或其互補(bǔ)序列編碼的多膚，或由在中等至高 嚴(yán)格條件下與編碼抗原的氨基酸序列的多核巧酸或其互補(bǔ)序列雜交的多核巧酸編碼的多 膚。本發(fā)明還提供了分離的和純化的編碼本文所述的抗原多膚的多核巧酸，或與本文公開 的序列具有至少約80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列 一致性的氨基酸或等價(jià)物，或者是在嚴(yán)格條件下與所述多核巧酸、其等價(jià)物或其互補(bǔ)序列 雜交的多核巧酸，并且提供了由運(yùn)些多核巧酸編碼的分離且純化的多膚。運(yùn)些多膚和多核 巧酸能夠與它們?cè)谔烊粻顟B(tài)下不聯(lián)合在一起的非天然的物質(zhì)聯(lián)合在一起，運(yùn)些物質(zhì)例如是 載體、藥學(xué)上可接受的載體、運(yùn)載體和血1C分子、本領(lǐng)域已知的和本文所述的納米顆粒。
[0112] 來自抗原物種(antigenic species)的抗原(包括區(qū)段、片段和其他分子），包括但 不限于，由本發(fā)明的經(jīng)典和非經(jīng)典MHC分子提呈的膚、碳水化合物、脂質(zhì)或其他分子，通常被 復(fù)合或可操作地連接至血1C分子或其衍生物。T淋己細(xì)胞的抗原識(shí)別受限于主要組織相容性 復(fù)合物(MHC)。特定的T淋己細(xì)胞僅在其被結(jié)合至特定的MHC分子時(shí)才識(shí)別抗原。一般而言，T 淋己細(xì)胞僅在存在自身血1C分子的情況下被刺激，并且當(dāng)抗原的片段結(jié)合至自身血1C分子時(shí) 抗原被識(shí)別。MH邱良制作用確定出了 T淋己細(xì)胞特異性，表現(xiàn)在所識(shí)別的抗原W及結(jié)合其抗 原片段的Μ肥分子方面。在特定的方面，某些抗原可與某些Μ肥分子或由其衍生的多膚配對(duì)。
[0113] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"或"涂布"是指單個(gè)多膚(例如MHC)和抗原（例如 膚)成分被結(jié)合從而在結(jié)合于祀定位點(diǎn)（例如免疫細(xì)胞)之前形成活性復(fù)合物的情況。運(yùn)包 括單個(gè)多膚復(fù)合物成分被合成或重組表達(dá)并隨后被分離和組合W在施用至對(duì)象之前在體 外形成復(fù)合物的情況;嵌合或融合多膚（即復(fù)合物的每個(gè)離散的蛋白質(zhì)成分被包含在單個(gè) 多膚鏈中）被合成或重組表達(dá)為完整復(fù)合物的情況。通常，多膚復(fù)合物被添加至納米顆粒W 產(chǎn)生具有被吸附的或鏈接的多膚復(fù)合物的納米顆粒，其中分子的數(shù)量:納米顆粒的數(shù)量的 比率為從約、至少約、或至多約 0.1、0.5、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50、100、125、 150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、 1000、1500或更多：1，更常見地為0.1:1、1:1至50:1或300:1。納米顆粒的多膚含量可利用標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)來確定。
[0114] 分子 細(xì)胞內(nèi)抗原和細(xì)胞外抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的作用在識(shí)別和適當(dāng)響應(yīng)方面有很大區(qū)別?？乖?向τ細(xì)胞的提呈通過兩種不同種類的分子來介導(dǎo)，即I類MHC(MHC-I)和II類MHC(MHC-II)(在 本文中還被稱為"pMHC'），它們使用不同的抗原加工途徑。來源于細(xì)胞內(nèi)抗原的膚由I類MHC 分子提呈至CD8+ T細(xì)胞，I類MHC分子幾乎在所有細(xì)胞上都表達(dá)，而細(xì)胞外抗原來源的膚由 MHC-II分子提呈至CD4+ T細(xì)胞。但是，運(yùn)種二分法也有例外。多項(xiàng)研究顯示，由胞飲顆粒生 成的多膚或可溶性蛋白質(zhì)在巨隧細(xì)胞W及樹突細(xì)胞中被提呈在MHC-I分子上。在本發(fā)明的 某些實(shí)施方式中，特定的抗原在合適血1C I類或II類多膚的情況下被識(shí)別并被提呈在抗原- MHC-納米顆粒復(fù)合物中。在某些方面，對(duì)象的基因組成可被評(píng)估從而確定哪種MHC多膚要被 用于特定的患者W及特定一組的膚。在一些實(shí)施方式中，I類MHC成分包括化A-A、化A-B、 HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或CD-1的全部或部分。在Μ肥成分是II類Μ肥成分的實(shí)施方式中， 所述II類Μ肥成分可W包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。
[0115] 預(yù)期非經(jīng)典MHC分子也可用在本發(fā)明的MHC復(fù)合物中。非經(jīng)典MHC分子是非多態(tài)性 的，在物種之間是保守的，并且具有狹窄、深的、疏水的配體結(jié)合袋。運(yùn)些結(jié)合袋能夠?qū)⑻侵?和憐脂提呈至自然殺傷T(NKT)細(xì)胞或特定亞型的CD8+ T細(xì)胞（例如Qal或化A-E-限制的 CD8+ T細(xì)胞）dNKT細(xì)胞是獨(dú)特的淋己細(xì)胞群，其共表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記物和半不變（semi- invarianOT細(xì)胞受體(TCR)。它們參與了與許多疾病相關(guān)的免疫響應(yīng)的調(diào)節(jié)。
[0116] 抗原成分 本發(fā)明的某些方法包括關(guān)于抗原成分的方法和組合物，所述抗原成分包括多膚的區(qū) 段、片段或表位、膚、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)和其他引起或誘導(dǎo)抗原響應(yīng)的分子(統(tǒng)稱為抗 原）。具體而言，抗原決定簇的抗原區(qū)段或片段，經(jīng)自身免疫響應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞破壞，其可W被識(shí) 別并用于制造本文所述的抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物。本發(fā)明的實(shí)施方式包括用于調(diào)節(jié)身 體的細(xì)胞或組織中的免疫響應(yīng)的組合物和方法。
[0117] 本發(fā)明的抗原多膚和膚可通過各種氨基酸缺失、插入和/或取代而被修飾。在特定 實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的多膚和/或膚能夠調(diào)節(jié)對(duì)象中的免疫響應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，使用 了野生型的蛋白質(zhì)或膚，但在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，使用了經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或多膚W 生成抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物。抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物可被用來產(chǎn)生抗炎免疫響應(yīng)， 從而改變免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞群（即，改造免疫系統(tǒng)），和/或?yàn)樘囟ńM織招募和累積抗炎T細(xì) 胞。W上所述術(shù)語(yǔ)可在本文中被互換使用。"經(jīng)修飾的蛋白脈'或"經(jīng)修飾的多膚"或"經(jīng)修飾 的膚"是指相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)或多膚化學(xué)結(jié)構(gòu)(特別是其氨基酸序列)被改變了的蛋白質(zhì) 或多膚。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或多膚或膚具有至少一種經(jīng)改變的活性或功 能（要意識(shí)到蛋白質(zhì)或多膚或膚可具有多種活性或功能）。特別預(yù)期的是，經(jīng)修飾的蛋白質(zhì) 或多膚或膚的一種活性或功能可被改變，但另一方面可保留一種野生型活性或功能，例如 免疫原性或在MHC-納米顆粒復(fù)合物的情況下的與免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞相互作用的能力。 [011引膚抗原的非限制性例子包括但不限于：hInsBio-18 (HLVEAL化V)、hIGRP228-236 化NIDLLWSV)、hIGRP26日-273 (VLFGLGFAI)、IGRP206-214 (νπΧΓΝν化）、NRP-A7 化YNKANA化）、 NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db (FQDENYLYL)和/或INS Bi己-23 (LYLVCGERG)，W及在美國(guó)專利申請(qǐng)公開2005/0202032號(hào)中公開的膚和蛋白W及其等價(jià)物 和/或組合。
[0119]在一些方面，用于 T1D 的治療的膚抗原是 GAD65ii4-i23、VMNI1XQYVV;GAD65536-545、 RMMEYGTTMV; GFAP143-151、NLAQTDLATV; GFAP214-222、QLARQQVHV; IA-2172-180、SLS化QA化；IA- 2482-490、化 AAGVK1X;IA-28 日日-813、VIVMLTTLV;卵 ΙΑΡΡ 日-i3、KLQWLIV1^;wIAPP9-i7JLIVLSVA1^; IGRPi52-i6〇、化WSVFMLI; IGRP211-219、化化化FAV; IGRP215-223、化FAVGFYL; IGRP222-230、 化化RVLNI; IGRP228-236、LNIDLLWSV; IGRP26日-273、VLF化GFAI; IGRP293-3〇i、RUXALT化；Pro- insul inL2-io、ALWMRLLPM Pro-insul inL3-ii、LWMRLLPIX; Pro-insul inL6-i4、RLLPLLAIX; Pro- insul inB 日-i4、HLCG 細(xì) LVEA; Pro-insul inBio-18、HLVEALYLV; Pro-insul inBi4-22、ALYLVCG ??； Pro-i n su 1 i ΠΒ15-24、LYLVCGERGF; Pro-in sul inBi7-25、LVCGERGFF; Pro-in sul inBi8-27、 VCGERGFFYT; Pro-insul inB2〇-27、GERGFFYT ; Pro-insul inB2i-29、ERGFFYTPK; Pro- insul i 郵2 已-Cl 、FYTPKTRRE; Pro-insul i 郵27-C5 、TPKTRREAEDM Pro-insul inc2〇-28、 SLQPLALEG; Pro-insul inc25-33、ALEGSLQKR; Pro-insul inc29-A5、SLQKRGIVEQ; Pro-insul iriAi-io、 GIVEQCCTSI;Pro-insul inA2-io、IVEQCCTSI; Pro-insul inAi2-2〇、SLYQLENYC或其等價(jià)物和/或 組合。
[0120] 抗原的其他非限制性例子包括能夠被用在本發(fā)明中的MS和MS相關(guān)的抗原，它們包 括W下多膚、或?qū)嵸|(zhì)上由W下多膚組成、或由W下多膚組成：MOG35-55、 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK ; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29日、SLLLELEEV; MAG509-517、LMWAKIGPV; MAG556-564、VLFSSDFRI; MBPI110-118、化SRFSWGA; M0G114-122、KVEDPFYWV; M0G166-175、RT抑PHFLRV; MOG172-180、化RVPCWKI; M0G179-188、?α TLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; M0G181-189、TLFVIVP 化;M0G2 日日-214、RLAGQFLffiL; PLP80-88、化 YGA1XLA、或其每一個(gè)的等價(jià)物、或 其組合。
[0121] 在進(jìn)一步的方面，用于治療MS和MS相關(guān)的疾病的膚抗原包括但不限于:M0G35-55、 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; M0G36-日日、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-29日、S化LELEEV; MAG 日日 9-517、 LMWAKIGPV;MAG556-564、VLFSSDFRI;MBPiio-118、SLSRFSWGA;M0G114-122、KVEDPFYWV;M0G166-17已、 RTFDPHFLRV; M0G172-18Q、FLRVPCWKI; M0G179-188、UTLFVIVPV; M0G188-196、VLG化VALI; MOGisi-189、 TLFVIVP化；MOG2日日-214、化AGQFL邸L; PLP80-88、化YGAIXLA MAG287-29日、化化化邸V; MAG日日9-517、 LMWAKIGPV; MAG日日6-日64、VLFSSDFRI、及其等價(jià)物和/或組合。
[0122] 用于治療MS和MS相關(guān)的疾病的抗原包括在美國(guó)專利申請(qǐng)公開2012/0077686號(hào)中 公開的抗原、W及來源于髓銷堿性蛋白、髓銷相關(guān)糖蛋白、髓銷少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白、蛋白脂 質(zhì)蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓銷糖蛋白、髓銷相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異 性蛋白、熱休克蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白N0G0 A、糖蛋白Po、外周髓銷蛋白22、W及2' 3'環(huán)狀核巧酸3'-憐酸二醋酶的抗原。在一些實(shí)施例中，所述抗原來源于髓銷少突膠質(zhì)細(xì)胞 糖蛋白（M0G)。
[0123] 在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)或多膚(野生型或經(jīng)修飾）（包括感興趣的蛋白質(zhì)或膚 的任何復(fù)合物，特別是MHC-膚融合體)的尺寸可包含，但不限于，5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、 625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、 1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個(gè)氨基分子或更多，包括延伸出的任何范圍或值， W及它們的衍生物。在某些方面，5、6、7、8、9、10或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸(包括其衍生物)和 抗原的片段(例如本文所公開和引用的那些氨基酸序列）可被用作抗原。預(yù)期的是，多膚可 通過截?cái)喽蛔?，使得它們短于它們相?yīng)的野生型形式，但它們也可能通過融合或結(jié)合具 有特定功能(例如為實(shí)現(xiàn)W蛋白質(zhì)復(fù)合物形式呈現(xiàn)，或?yàn)閷?shí)現(xiàn)增強(qiáng)的免疫原性等等）的異源 蛋白質(zhì)序列而被改變。
[0124] 蛋白質(zhì)組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來制備，包括（i)通過標(biāo)準(zhǔn) 化分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多膚或膚，（ii)從自然來源中分離蛋白質(zhì)化合物，或（iii) 化學(xué)合成蛋白質(zhì)物質(zhì)。各種基因的核巧酸W及蛋白質(zhì)、多膚和膚序列之前已公開，并且可在 公認(rèn)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。一種運(yùn)樣的數(shù)據(jù)庫(kù)是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、的GenBank 和GenPept數(shù)據(jù)庫(kù)（網(wǎng)址ncbi .nlm.n化.gov/)。運(yùn)些基因的全部或部分編碼區(qū)可利用本文公 開的技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來擴(kuò)增和/或表達(dá)。
[0125] 運(yùn)些組合物的自身抗原表位和其他多膚的氨基酸序列變化可W是取代變化、插入 變化或缺失變化。本發(fā)明的多膚的修飾，與野生型相比，可能影響膚或多膚的1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、 162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、 238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、 268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、 287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、 306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、 325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、 ：M4、：M5、：M6、：M7、：M8、：M9、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、 363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、 382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、 401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、4：34、435、436、437、438、 439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、 458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、 477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、 496、497、498、499、500個(gè)或更多個(gè)非連續(xù)或連續(xù)的氨基酸。
[0126] 缺失改變通常缺乏了天然或野生型氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)殘基?？赡苋笔蝹€(gè) 殘基，或者缺失多個(gè)連續(xù)的氨基酸。終止密碼子可被引入(通過取代或插入)到編碼核酸序 列中，W產(chǎn)生截短蛋白。插入突變通常設(shè)及在多膚的非末端位點(diǎn)添加物質(zhì)。運(yùn)可包括插入一 個(gè)或多個(gè)殘基。也可W進(jìn)行末端添加，產(chǎn)生所謂的融合蛋白。
[0127] 取代變化通常包含在蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)氨基酸與另一個(gè)氨基 酸的替換，并且可被設(shè)計(jì)用來調(diào)節(jié)多膚的一種或多種性質(zhì)，并伴隨其他功能或性質(zhì)的保留 或喪失。取代可W是保守性的，即，一個(gè)氨基酸被具有相似形狀和電荷的氨基酸替代。保守 性取代在本領(lǐng)域是熟知的，包括例如W下改變:丙氨酸到絲氨酸;精氨酸到賴氨酸;天冬酷 胺到谷氨酷胺或組氨酸;天冬氨酸到谷氨酸;半脫氨酸到絲氨酸;谷氨酷胺到天冬酷胺;谷 氨酸到天冬氨酸;甘氨酸到脯氨酸;組氨酸到天冬酷胺或谷氨酷胺;異亮氨酸到亮氨酸或鄉(xiāng) 氨酸;亮氨酸到鄉(xiāng)氨酸或異亮氨酸;賴氨酸到精氨酸;蛋氨酸到亮氨酸或異亮氨酸;苯丙氨 酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸;絲氨酸到蘇氨酸;蘇氨酸到絲氨酸;色氨酸到酪氨酸;酪氨酸 到色氨酸或苯丙氨酸；W及鄉(xiāng)氨酸到異亮氨酸或亮氨酸。可替換地，取代可W是非保守的， 因而多膚或膚的功能或活性受到影響，例如對(duì)細(xì)胞受體的親合力或親和性受到影響。非保 守性變化通常設(shè)及W化學(xué)上不相似的殘基來取代一個(gè)殘基，例如極性或帶電荷的氨基酸對(duì) 非極性或不帶電荷的氨基酸的取代，W及相反的情況。
[0128] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)可W是重組的，或在體外合成的?？商娲?，重組蛋白可從細(xì)菌或 其它宿主細(xì)胞中分離出來。
[0129] 還要理解的是，氨基酸和核酸序列可包括額外的殘基，例如分別是額外的N-或C- 末端氨基酸，或5'或3'的核酸序列，但仍然基本上是如本文所公開的其中一個(gè)序列的序列， 只要該序列符合如上所述的條件，包括生物學(xué)蛋白活性(例如免疫原性）的維持。添加末端 序列特別適用于核酸序列，其可例如包括在5 '或3 '編碼區(qū)的側(cè)翼的各種非編碼序列。
[0130] 預(yù)期的是，在本發(fā)明的組合物中，每ml含有約0.001 mg至約10 mg的總蛋白質(zhì)。因 此，組合物中的蛋白質(zhì)的濃度可為約、至少約或至多約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100 pg/ml或mg/ml或更高(或由此衍生的任何范圍值）。其 中，約、至少約或至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100%可W是抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物。
[0131] 另外，美國(guó)專利4,554,101號(hào)化OPP)教導(dǎo)了表位的識(shí)別W及基于親水性由主要氨 基酸序列制備表位，該專利通過引用合并至本文中。通過化PP公開的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員 能夠從氨基酸序列中識(shí)別出潛在的表位，并確認(rèn)它們的免疫原性。許多科技文獻(xiàn)也設(shè)及到 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)W及根據(jù)氨基酸序列的分析來識(shí)別表位（Chou & Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978; Chous and Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276, 1978, Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974; Chau and Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou and Fasman, Biophys. J., 26(3):385- 399，1979)。如果期望的話，任何運(yùn)些文獻(xiàn)都可被用來補(bǔ)充化pp在美國(guó)專利4,554,101號(hào)中 的教導(dǎo)。
[0132] 對(duì)于任何特定的自身免疫性疾病，可W使用本領(lǐng)域已知的方法識(shí)別和預(yù)選擇抗原 復(fù)合物。算法存在-來源于已知會(huì)結(jié)合至特定的血1C分子的一組對(duì)齊的膚，其可W被用作 膚-MHC結(jié)合和T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)器。
[0133] 非膚分子可作為抗原或抗原片段而與MHC分子復(fù)合，運(yùn)樣的分子包括，但不限于， 碳水化合物、脂質(zhì)、小分子等。碳水化合物是多種細(xì)胞的外表面的主要成分。某些碳水化合 物是不同分化階段的特征，并且很多時(shí)候運(yùn)些碳水化合物被特異性抗體識(shí)別。獨(dú)特的碳水 化合物的表達(dá)可被限制至特定的細(xì)胞類型。
[0134] 底物/納米顆粒 在某些方面，抗原/ 復(fù)合物被可操作地連接至基底(底物），它可被共價(jià)或非共價(jià)地 結(jié)合至基底。基底可W是納米顆粒的形式，其任選地包括生物相容性的和/或生物可吸收材 料。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒是生物相容性的和/或生物可吸收的。在另一個(gè) 方面，所述納米顆粒具有固體核屯、和/或并非是脂質(zhì)體。基底也可W是例如那些在美國(guó)專利 公開2009/0155292號(hào)中所述的納米顆粒的形式。納米顆粒的結(jié)構(gòu)的尺寸可變，已知的有納 米球、納米顆?；蛏锵嗳菪缘纳锟山到獾募{米球或生物相容性的生物可降解的納米顆 粒。含有抗原/ MHC復(fù)合物的運(yùn)種粒狀制劑可通過該復(fù)合物與納米顆粒的共價(jià)或非共價(jià)結(jié) 合而形成。
[0135] 納米顆粒通常由實(shí)質(zhì)上球形的核構(gòu)成，并且任選地包含一個(gè)或多個(gè)層。該核的尺 寸和成分可變化。除了核之外，納米顆?？删哂幸粋€(gè)或多個(gè)層W提供適合應(yīng)用目的的功能 性。如果存在層的話，層的厚度可根據(jù)具體的應(yīng)用需要而變化。例如，層可賦予有用的光學(xué) 性質(zhì)。
[0136] 層也可賦予化學(xué)或生物學(xué)功能性，在本文運(yùn)稱為化學(xué)活性層或生物學(xué)活性層，并 且對(duì)于運(yùn)些功能性而言，該層或運(yùn)些層通常的厚度為約0.001微米(1納米)至約10微米或更 大(取決于期望的納米顆粒直徑），運(yùn)些層通常被施用在納米顆粒的外表面。
[0137] 核和層的成分可不同。顆?；蚝说暮线m材料包括，但不限于，聚合物、陶瓷材料、玻 璃、礦物質(zhì)等。例子包括，但不限于，標(biāo)準(zhǔn)和特種玻璃、二氧化娃、聚苯乙締、聚醋、聚碳酸醋、 丙締酸聚合物、聚丙締酷胺、聚丙締臘、聚酷胺、含氣聚合物、有機(jī)娃、纖維素、娃、金屬（例 如，鐵、金、銀）、礦物質(zhì)(例如紅寶石）、納米顆粒(例如，金納米顆粒、膠體粒子、金屬氧化物、 金屬硫化物、金屬砸化物和磁性材料(如鐵的氧化物）），W及它們的復(fù)合材料。核可W為同 質(zhì)成分，或根據(jù)期望的性質(zhì)可為兩種或更多種材料的復(fù)合材料。在某些方面，會(huì)使用金屬納 米顆粒。運(yùn)些金屬顆?；蚣{米顆?？捎葾u、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、P;r、Gd、Ti、 化、Si、和In、前體、它們的二元合金、它們的Ξ元合金W及它們的金屬間化合物形成。參見 美國(guó)專利6,712,997號(hào)。在某些實(shí)施方式中，如果納米顆粒是生物相容性的和生物可吸收 的，核和層的成分可不同。核可為同質(zhì)成分，或根據(jù)期望的性質(zhì)可為兩種或更多種材料的復(fù) 合材料。在某些方面，會(huì)使用金屬納米球。運(yùn)些金屬納米顆粒可由化、Ca、Ga等形成。在某些 實(shí)施方式中，所述納米顆粒包括的核包括金屬或金屬氧化物，例如金或氧化鐵。
[0138] 如前所述，納米顆粒除包括核之外還可包括一個(gè)或多個(gè)層。納米顆?？砂ㄓ缮?物可降解糖或其他聚合物構(gòu)成的層。生物可降解層的例子包括但不限于葡聚糖；聚（乙二 醇）；聚（環(huán)氧乙燒）；甘露醇;基于聚丙交醋(PLA)、聚乙交醋(PGA)、聚己內(nèi)醋(P化)的聚醋； P皿-PHV類的聚徑基鏈燒酸醋；和其它改性的聚糖，例如淀粉、纖維素和殼聚糖。此外，納米 顆粒可包括具有用于附接化學(xué)功能性W實(shí)現(xiàn)化學(xué)鍵合或結(jié)合位點(diǎn)的合適表面的層。
[0139] 層可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式產(chǎn)生于納米顆粒上。例子包括溶膠-凝 膠化學(xué)技術(shù)，例如Iler,化emistiT of Silica, John Wiley & Sons, 1979; linker and Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990)所描述的。其他在納米顆粒上 產(chǎn)生層的途徑包括表面化學(xué)和包封技術(shù)，例如在化dch and化own, J. A化esion, 67: 259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, (1998) W及其中所引用的文獻(xiàn)中所描述的。也可W使用蒸汽沉積技術(shù)，參見例如Golman and Siinohara，Trends Chem. Engin.，6:1-6，（2000);和美國(guó)專利6,387,498號(hào)。其他 途徑包括逐層自組裝技術(shù)，例如在Suldlo;rukovetal.,PolymersAdv.Tech.,9(10- 11):759-767, (1998); Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998); Caruso et al., J.Amer. Qiem. Soc., 121(25):6039-6046, (1999);美國(guó)專利 6,103, 379號(hào)W及其中所引用的文獻(xiàn)中所描述的。
[0140] 如在美國(guó)專利4，589，330號(hào)或4，818，542號(hào)中所教導(dǎo)的，納米顆?？赏ㄟ^接觸含有 抗原/MHC/共刺激分子復(fù)合物的水相、聚合物和非水相，隨后蒸發(fā)非水相W導(dǎo)致顆粒從水相 聚結(jié)而形成。用于此制備的優(yōu)選聚合物是選自W下物質(zhì)的天然的或合成的共聚物或聚合 物：明膠瓊脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、膠原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交醋-L(-)丙 交醋聚（ε己內(nèi)醋）、聚（ε-己內(nèi)醋-共聚-乳酸）、聚（ε-己內(nèi)醋-共聚-乙醇酸）、聚（β徑基下 酸）、聚環(huán)氧乙燒、聚乙締、聚(烷基-2-氯基丙締酸醋）、聚（甲基丙締酸徑乙醋）、聚酷胺、聚 (氨基酸）、聚（2-徑乙基化-天冬酷胺）、聚（醋脈）、聚化-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二異氯酸 醋）和聚（甲基丙締酸甲醋）。特別優(yōu)選的聚合物是聚醋，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交醋-U-) 丙交醋聚（ε己內(nèi)醋）、聚（ε-己內(nèi)醋-共聚-乳酸)和聚（ε-己內(nèi)醋-共聚-乙醇酸）。用于溶 解聚合物的溶劑包括:水、六氣異丙醇、二氯甲燒、四氨巧喃、己燒、苯或六氣丙酬倍半水合 物。
[0141] 納米顆粒的尺寸可在約1 nm至約1皿之間變化。在某些實(shí)施方式中，納米顆粒的 直徑小于約1 μπι。在其他實(shí)施方式中，納米顆粒的直徑小于約500 nm、小于約400 nm、小于 約300 nm、小于約200 nm、小于約100 nm、或小于約50 nm。在另外的實(shí)施方式中，納米顆粒 的直徑為約 1 nm至約 10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或 100 nm。在 具體的實(shí)施方式中，納米顆粒為約1皿至約100 nm、約1 nm至約50 nm、約1 nm至約20 nm、 或約5 nm至約20 nm。
[0142] 復(fù)合物的尺寸可在約5 nm至約1皿之間變化。在某些實(shí)施方式中，復(fù)合物的直徑 小于約1 ym或小于100 nm。在其他實(shí)施方式中，復(fù)合物的直徑小于約500 nm、小于約400 皿、小于約300皿、小于約200皿、小于約100皿、或小于約50皿。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 復(fù)合物為約10皿至約50皿、或約20皿至約75 nm、或約25皿至約60 nm、或約30皿至約 60 nm,或者在一個(gè)方面為約55 nm。
[0143] 抗原-MHC復(fù)合物與納米顆粒的結(jié)合 為了將底物或納米球結(jié)合至抗原復(fù)合物，可使用W下技術(shù)。
[0144] 該結(jié)合可通過化學(xué)改性底物或納米顆粒而實(shí)現(xiàn)，改性通常設(shè)及在表面上生成"功 能基團(tuán)"，所述功能基團(tuán)能夠結(jié)合至抗原-MHC復(fù)合物，和/或?qū)⒌孜锘蚣{米顆粒的可選的化 學(xué)改性的表面與共價(jià)或非共價(jià)鍵合的所謂"連接分子"連接，隨后使抗原-MHC復(fù)合物與所獲 得的納米顆粒反應(yīng)。
[0145] 術(shù)語(yǔ)"連接分子"是指能夠與底物或納米顆粒連接并且能夠連接至抗原-MHC復(fù)合 物的物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，抗原-MHC復(fù)合物通過接頭/連接物(linker)被結(jié)合至納米顆 粒。合適的連接物的非限制性例子包括多己胺(DPA)-聚乙二醇(PEG)連接物，例如DPA-PEG- NHS醋、DPA-PEG-鄰化晚基-二硫化物(0PSS)和/或DPA-PEG-疊氮化物。其他連接物包括膚連 接物、乙二醇、生物素和鏈霉親和素。
[0146] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"功能基團(tuán)"并不限于形成共價(jià)鍵的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，而且包括導(dǎo) 致與抗原復(fù)合物形成離子相互作用或氨鍵的化學(xué)基團(tuán)。而且，要注意的是，無法嚴(yán)格區(qū) 別在表面上生成的"功能基團(tuán)"W及含有"功能基團(tuán)"的連接分子，因?yàn)橛行r(shí)候表面的改性 需要較小的連接分子(例如乙二醇)與納米球表面反應(yīng)。
[0147] 功能基團(tuán)或含有功能基團(tuán)的連接分子可選自氨基、碳酸基、硫醇、硫酸、二硫化物、 脈基、徑基、胺基、鄰二醇、醒、α-面代乙酷基、隸官能(mercu巧OTgany 1 eS)、醋基、酷基面、 酸硫醋、酸酢、異氯酸醋、異硫氯酸醋、橫酸面化物、亞氨酸醋、重氮乙酸醋、重氮鹽、1,2-二 酬、麟酸、憐酸醋、橫酸、挫化物、咪挫、嗎I噪、N-馬來酷亞胺、α-β-幾基化合物、芳基面化物或 其衍生物。
[0148] 其他具有較高分子量的連接分子的非限制性例子是核酸分子、聚合物、共聚物、可 聚合連接劑、二氧化娃、蛋白質(zhì)和相對(duì)于底物或納米顆粒具有相反極性的表面的鏈樣分子。 核酸雖然對(duì)于連接分子來說具有互補(bǔ)序列，但其可為含有自身核酸分子的親和分子提供連 接。
[0149] 共價(jià)連接物的具體例子包括聚乙二醇(PEG)，例如功能化的PEG。如本文使用的， "功能化的PEG"是指包含末端官能團(tuán)的PEG基團(tuán)，運(yùn)些官能團(tuán)的非限制性例子包括氨基、琉 基、硫酸基、簇基等。在本文的表1和2中提供了多種納米顆粒上的功能化的PEG連接物的非 限制性例子，例如，PEG連接物是琉基-PEG- N出連接物。
[0150] 在某些實(shí)施方式中，本文所述的連接物具有確定的尺寸。在一些實(shí)施方式中，連接 物小于約10 kD、小于約5 kD、小于約4.5 kD、小于約4 kD、小于約3.5 kD、小于約3 kD、小于 約2.5 kD、小于約2 kD、或小于約1 kD。在另外的實(shí)施方式中，連接物為約0.5 kD至約5、 4.5、 4、3.5、3、2.5、2、1.5或11^)。在另外的實(shí)施方式中，連接物為約11^)至約4.5、4、3.5、3、 2.5、 2或1.51^)。
[0151] 可聚合連接劑的例子可為下二烘、苯乙締下二締、乙酸乙締醋、丙締酸醋、丙締酷 胺、乙締基化合物、苯乙締、氧化娃、氧化棚、憐氧化物、棚酸醋、化咯、聚化咯和憐酸醋。
[0152] 底物或納米顆粒的表面可被化學(xué)修飾，例如通過結(jié)合具有功能性反應(yīng)基團(tuán)的麟酸 衍生物而改性。運(yùn)些麟酸或麟酸醋衍生物的一個(gè)例子是亞氨基-二(亞甲基麟簇基)碳酸，其 可通過"Mannich-Moe化itzer"反應(yīng)合成。運(yùn)種結(jié)合反應(yīng)可與直接從制備工藝獲得的或經(jīng)預(yù) 處理（例如用Ξ甲基漠硅烷預(yù)處理）的底物或納米球進(jìn)行。在第一種情況下，麟酸（醋）衍生 物可例如置換仍結(jié)合至表面的反應(yīng)介質(zhì)的成分。運(yùn)種置換可在較高溫度下被增強(qiáng)。另一方 面，Ξ甲基漠硅烷被認(rèn)為用來對(duì)含烷基的、基于憐酸的偶聯(lián)劑進(jìn)行脫烷基化，從而為麟酸 (醋)衍生物產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)。麟酸(醋)衍生物或結(jié)合至其上的連接分子可表現(xiàn)出與W上 給出的相同的功能基團(tuán)。底物或納米球的表面處理的另一個(gè)例子設(shè)及在二元醇(例如乙二 醇）中加熱。應(yīng)注意的是，如果合成已在二元醇中進(jìn)行的話，那么運(yùn)種處理是多余的。在運(yùn)些 情況下，直接獲得的合成產(chǎn)物可能顯示出所需要的功能基團(tuán)。但是，運(yùn)種處理適用于在含N- 或P-偶聯(lián)劑中產(chǎn)生的底物或納米顆粒。如果運(yùn)樣的底物或顆粒經(jīng)受使用乙二醇的后處理， 那么仍結(jié)合至底物的反應(yīng)介質(zhì)(例如偶聯(lián)劑)的成分可被該二元醇取代和/或被脫烷基化。
[0153] 還可W通過具有第二功能基團(tuán)的伯胺衍生物來取代仍結(jié)合至顆粒表面的含N偶 聯(lián)劑。底物或納米顆粒的表面也可涂布有二氧化娃。二氧化娃可實(shí)現(xiàn)相對(duì)簡(jiǎn)單的有機(jī)分子 的化學(xué)結(jié)合，因?yàn)槎趸奕菀着c有機(jī)連接物(例如Ξ乙氧基硅烷或氯硅烷)反應(yīng)。納米顆 粒表面也可涂布有均聚物或共聚物。可聚合偶聯(lián)劑的例子是N-(3-氨基丙基)-3-琉基苯甲 脈、3-(Ξ甲氧基甲娃烷基）丙基酷阱和3-Ξ甲氧基甲娃烷基）丙基馬來酷亞胺?？删酆吓?聯(lián)劑的其他非限制性例子在本文有提及。運(yùn)些偶聯(lián)劑可單獨(dú)使用或組合使用，運(yùn)取決于要 生成為涂層的共聚物的類型。
[0154] 另一種可用于含有氧化過渡金屬化合物的底物或納米顆粒的表面改性技術(shù)是通 過氯氣或有機(jī)氯化劑將氧化過渡金屬化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的氧氯化物。運(yùn)些氧氯化物能夠與 親核試劑反應(yīng)，例如通常在生物分子中找到的徑基或氨基基團(tuán)。運(yùn)種技術(shù)使得產(chǎn)生于蛋白 質(zhì)的直接結(jié)合(例如通過賴氨酸側(cè)鏈的氨基基團(tuán)而結(jié)合）。在用氧氯化物進(jìn)行表面改性后與 蛋白質(zhì)的結(jié)合也可利用雙功能連接物(例如馬來酷亞胺基丙酸酷阱)來實(shí)現(xiàn)。
[0155] 對(duì)于非共價(jià)連接技術(shù)，特別合適的是具有與底物或納米球表面的極性或電荷相反 的極性或電荷的鏈型分子?？杀环枪矁r(jià)地連接至核/殼納米球的連接分子的例子包括陰離 子、陽(yáng)離子或兩性離子表面活性劑、酸性或堿性蛋白質(zhì)、聚胺、聚酷胺、聚諷或聚簇酸。底物 或納米球與具有功能性反應(yīng)基團(tuán)的兩親性試劑之間的輸水相互作用可產(chǎn)生所需的連接。特 別地，具有兩親性特征的鏈型分子(例如憐脂或可相互交聯(lián)的衍生多糖)是有用的。運(yùn)些分 子在表面上的吸附可通過共培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。親和分子和底物或納米顆粒之間的結(jié)合也可基于 非共價(jià)自組裝鍵來實(shí)現(xiàn)。其一個(gè)例子包括作為連接分子的具有生物素的簡(jiǎn)單探針和連接有 抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的分子。
[0156] 功能基團(tuán)與生物學(xué)分子的偶聯(lián)反應(yīng)的方案可在文獻(xiàn)中找到，例如"Biocon jugate Techniques" (Greg Τ. Hermanson, Academic Press 1996)。生物學(xué)分子（例如MHC分子或 其衍生物)可根據(jù)有機(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)程序共價(jià)地或非共價(jià)地偶聯(lián)至連接分子，運(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)程序 例如是氧化、面化、烷基化、酷化、添加、取代或酷胺化。偶聯(lián)所述共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合的 連接分子的運(yùn)些方法可在將連接分子偶聯(lián)至底物或納米球之前或之后進(jìn)行。而且，通過溫 育可影響分子向相應(yīng)的預(yù)處理的底物或納米顆粒(例如通過Ξ甲基漠硅烷預(yù)處理）的直接 結(jié)合，由于該預(yù)處理其表現(xiàn)出改性的表面(例如更高的電荷或極性的表面）。
[0157] 蛋白質(zhì)生產(chǎn) 本發(fā)明描述了用于本發(fā)明的各種實(shí)施方式的多膚、膚和蛋白質(zhì)。例如，特定的膚和它們 的復(fù)合物被分析了它們的引起或調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的能力。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的膚 或蛋白質(zhì)的全部或部分也可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中合成或在固體載體上合成。各種自動(dòng)合 成儀在商業(yè)上是可獲得的，并且可根據(jù)已知的方案使用。參見例如Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2"*^. Ed. , Pierce Chemical Co. 1, (1984); Tam et al., J. Am. Qiem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232(4748):341- 347, (1986); l^^Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meinhofer 化ds.)，Academic Press, NY, 1-284，（1979)，通過引用將各篇合并至本文中。替代地， 重組DNA技術(shù)可被使用，其中編碼本發(fā)明的膚的核巧酸序列被插入到表達(dá)載體中，并被轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)染至合適的宿主細(xì)胞，并在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)。
[0158] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括使用向細(xì)胞(包括微生物）的基因轉(zhuǎn)移，從而生產(chǎn)蛋白 質(zhì)。感興趣的蛋白質(zhì)的基因可被轉(zhuǎn)移至合適的宿主細(xì)胞，隨后在合適條件下培養(yǎng)細(xì)胞。編碼 幾乎任何多膚的核酸都可被使用。重組表達(dá)載體的產(chǎn)生W及其中包括的元件對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是已知的，并在本文簡(jiǎn)要描述。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括，但不限于，ero 和化la細(xì)胞，其他B細(xì)胞系和T細(xì)胞系（例如CEM、721.221、朋、Jurkat、Raji)W及中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢細(xì)胞系（C冊(cè)）、胖138、8服、〇35-7、293、胎962、3了3、1?1巧隨0〇(細(xì)胞。此外，可選擇調(diào)節(jié)被插 入序列的表達(dá)或W期望的方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的運(yùn)種修飾 (例如糖基化)和加工(例如剪切)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有特征性 的和特定的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)W確保所表達(dá) 的外源蛋白的正確的修飾和加工。
[0159] 許多選擇系統(tǒng)可被施用，包括但不限于，HSV胸巧激酶基因、次黃嚷嶺鳥嚷嶺憐酸 核糖轉(zhuǎn)移酶基因和腺嚷嶺憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因，分別在tk細(xì)胞、hgpd細(xì)胞或曰口的細(xì)胞中。 而且，抗代謝物耐藥性可被用作選擇的基礎(chǔ):對(duì)于化打，其賦予甲氧節(jié)氨喀晚和氨甲蝶嶺耐 藥性;gpt，其賦予霉酪酸耐藥性;neo，其賦予氨基糖巧G418耐藥性;和hygro，其賦予潮霉素 耐藥性。
[0160] 核酸 本發(fā)明可包括編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多膚、膚的重組多核巧酸，例如編碼抗原膚的多核 巧酸。
[0161] 在特別的實(shí)施方式中，本發(fā)明設(shè)及分離的核酸片段W及含有編碼自身抗原和/或 MHC分子的核酸序列的重組載體。術(shù)語(yǔ)"重組"可與多膚或具體多膚的名稱結(jié)合施用，它通常 是指由核酸分子產(chǎn)生的多膚，該核酸分子在體外被操作或者是運(yùn)種分子的復(fù)制產(chǎn)物。
[0162] 用在本發(fā)明中的核酸片段，無論編碼序列本身的長(zhǎng)度如何，都可與其他核酸序列 結(jié)合，因而它們的總體長(zhǎng)度可有很大變化，所述其他核酸序列例如是啟動(dòng)子、多腺巧酸化信 號(hào)、其他限制酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼片段等。因此，本發(fā)明預(yù)期可使用幾乎任何長(zhǎng) 度的核酸片段，總長(zhǎng)度優(yōu)選受限于制備的容易程度W及在預(yù)期重組核酸方案中的用途。在 一些情況下，核酸序列可與其他異源編碼序列一起編碼多膚，從而例如可純化出多膚、運(yùn) 輸、分泌、翻譯后修飾，或用于實(shí)現(xiàn)治療利益(例如祀定或功效）。標(biāo)簽或其他異源多膚可被 添加至經(jīng)改性的多膚編碼序列，其中"異源的"是指不與經(jīng)改性的多膚相同的多膚。
[0163] 藥物組合物和施用 本發(fā)明提供用于治療疾病的藥物組合物。
[0164] 藥物組合物 抗原納米顆粒復(fù)合物可W被單獨(dú)地施用或與組合物中的載體(例如藥學(xué)上可接受 的載體)聯(lián)合施用。本發(fā)明的組合物可通過注射而不經(jīng)腸道地常規(guī)施用，例如靜脈內(nèi)、皮下 或肌內(nèi)注射。適合其他施用模式的其他制劑包括口服制劑。口服制劑包括那些通常使用的 賦形劑，例如藥學(xué)等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸儀、糖精鋼、纖維素、碳酸儀等。運(yùn)些組 合物的形式有溶液、懸浮液、片劑、藥片、膠囊、緩釋制劑或粉末，并且含有約10%至約95%的 活性組分，優(yōu)選為約25%至約70%。含有改變對(duì)象的免疫狀態(tài)的抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的 水性組合物的制備，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是熟知的。在某些實(shí)施 方式中，組合物可被吸入(例如，美國(guó)專利6,651，655號(hào)，通過引用將其全部?jī)?nèi)容合并至本文 中）。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物被全身性施用。
[0165] 通常，本發(fā)明的組合物W與給藥制劑相容的方式施用，并且施用的量使得是治療 上有效的和免疫上改變的。施用的量取決于要被治療的對(duì)象。需要施用的活性組分的精確 的量取決于操作者的判斷。但是，合適的劑量范圍是每次施用給予十至幾百納克或微克的 級(jí)別的抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物。合適的初始施用和加強(qiáng)方案也是變化的，但是典型的是 先進(jìn)行初始施用，接下來進(jìn)行后續(xù)施用。
[0166] 在許多情況下，期望的是多次施用膚-MHC-納米顆粒復(fù)合物，約、至多約或至少約 3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用間隔時(shí)間通常為2天至十二周，更常見的是一至兩周間 隔。間隔0.25-5年(通常2年)的周期性加強(qiáng)對(duì)于維持免疫系統(tǒng)的狀態(tài)是合乎需要的。施用過 程之后可進(jìn)行發(fā)炎免疫響應(yīng)實(shí)驗(yàn)和/或自身調(diào)節(jié)抗炎T細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。
[0167] 在一些實(shí)施方式中，藥物組合物被施用至對(duì)象。本發(fā)明的不同方面設(shè)及向?qū)ο笫?用有效量的抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物組合物。此外，運(yùn)種組合物可與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑結(jié) 合施用。運(yùn)種組合物通常被溶解于或分散于藥學(xué)上可接受的載體或水性介質(zhì)中。
[0168] 術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"或"藥理學(xué)上可接受的"是指當(dāng)施用至動(dòng)物或人時(shí)不會(huì)產(chǎn) 生負(fù)面的、過敏性的或其他不良反應(yīng)的分子實(shí)體和成分。如本文所使用的，"藥學(xué)上可接受 的載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑 等。運(yùn)些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)上有活性的物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域是熟知的。除非任何常規(guī)介 質(zhì)或試劑不與活性成分相容，預(yù)期其可用于免疫原性組合物和治療性組合物中。
[0169] 合適注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體;制劑，包括芝麻油、花生油或 水性丙二醇；W及用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。無論如何，該藥物形式 都必須是無菌的，并且必須是流體從而它能夠容易注射。它還應(yīng)當(dāng)在制造和存儲(chǔ)條件下是 穩(wěn)定的，并且被保存得不受微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染。
[0170] 組合物可被配制成中性形式或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽（與蛋白 質(zhì)的游離氨基酸一起形成），它們是用無機(jī)酸形成的，無機(jī)酸例如是鹽酸、憐酸，或是用有機(jī) 酸形成，例如是乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。W游離簇酸基形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿， 例如氨氧化鋼、氨氧化鐘、氨氧化錠、氨氧化巧或氨氧化鐵，或衍生自有機(jī)堿，例如是異丙 胺、Ξ甲胺、組氨酸、普魯卡因等。
[0171] 載體可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、乙二醇和液態(tài)聚乙二醇等）、它們 的合適的混合物W及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。例如，可利用涂層(例如卵憐脂）、如果是分 散體的情況下通過維持所需的顆粒尺寸、W及通過利用表面活性劑，可維持合適的流動(dòng)性。 可通過各種抗菌劑和抗真菌劑來防止微生物的作用，例如對(duì)徑基苯甲酸醋類、氯代下醇、苯 酪、山梨酸、硫隸撒等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鋼。使用試劑延遲吸 收成分，例如單硬脂酸侶和明膠，可為注射組合物帶來延長(zhǎng)的吸收效果。
[0172] 無菌注射溶液通過將所需量的活性化合物加入具有各種其他W上所列成分(按需 要）的合適溶劑中，隨后滅菌而制備。溶液的滅菌方式不應(yīng)減少抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物 的治療性質(zhì)。通常，分散體通過將各種滅菌的活性組分加入到無菌載體中而制備，所述無菌 載體含有堿性分散介質(zhì)W及所需的來自W上列出的其他組分。如果是利用無菌粉末來制備 無菌注射液，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生了活性組分的W及來自 之前滅菌溶液的任何額外的期望組分的粉末。溶液滅菌的一種運(yùn)樣的方法是無菌過濾，但 是，本發(fā)明意在包括不顯著降低抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的治療性質(zhì)的任何滅菌方法。設(shè) 及高熱高壓的滅菌方法(例如高壓蒸汽滅菌法)可能會(huì)損害復(fù)合物的Ξ級(jí)結(jié)構(gòu)，因而顯著降 低抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的治療性質(zhì)。
[0173] 治療組合物的有效量是基于預(yù)期的目的而確定的。術(shù)語(yǔ)"單位劑量"或"劑量"是指 適合用于對(duì)象的物理上分散的單元，每個(gè)單元含有預(yù)定量的組合物，該預(yù)定量被計(jì)算出來 W產(chǎn)生W上關(guān)于其施用所述的期望響應(yīng)，即，合適的施用途徑和方案。施用的量(根據(jù)治療 次數(shù)和單位劑量)取決于期望的結(jié)果和/或保護(hù)。組合物的精確的量還取決于醫(yī)師的判斷并 且對(duì)于每個(gè)個(gè)體都是特有的。影響劑量的因素包括對(duì)象的身體和臨床狀態(tài)、施用途徑、預(yù)期 的治療目的(減輕癥狀或治愈）W及特定組合物的效力、穩(wěn)定性和毒性。配制后，溶液將W與 劑量制劑相容的方式施用，并且施用的量使得其是治療上或預(yù)防上有效的。制劑可容易W 各種劑量形式施用，例如上述的注射液的類型。
[0174] 聯(lián)合療法 本發(fā)明的組合物和相關(guān)方法(特別是抗原-MHC-納米顆粒復(fù)合物的施用)也可與傳統(tǒng)療 法的施用結(jié)合進(jìn)行。運(yùn)些療法包括但不限于阿沃納斯（Avonex，干擾素 β-la)、倍泰龍 (Be1:ase;ron，干擾素 β-化）、克帕松（Copaxone，醋酸格拉替雷）、諾安托(No vantrone，米托蔥 釀）、利比（Rebif，干擾素 i3-la)、Tysabri (那他珠單抗）、Gilenya(芬戈莫德）、格拉默 (Glatiramer)、類固醇、環(huán)憐酷胺、依木蘭（Imuran)、己氯芬（Baclofen)、深部腦刺激， Ampy ra (達(dá)伐化晚）、針灸和物理治療。
[0175] 當(dāng)使用聯(lián)合療法時(shí)，可使用各種組合，例如抗原-M肥-納米顆粒復(fù)合物施用是"A"， 其他試劑是"B":
[0176] 本發(fā)明的膚-MHC-復(fù)合物組合物向患者/對(duì)象的施用，會(huì)根據(jù)運(yùn)類化合物的一般性 施用方案進(jìn)行，并考慮毒性（如有）。預(yù)期的是，如果需要的話，會(huì)重復(fù)治療循環(huán)。還預(yù)期的 是，各種標(biāo)準(zhǔn)療法(例如水合)可與所述療法結(jié)合施用。
[0177] 體外或間接體內(nèi)施用 本文使用的術(shù)語(yǔ)體外施用是指在從患者移出或在患者體外的細(xì)胞上進(jìn)行的操作，包括 但不限于培養(yǎng)物中的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)間接體內(nèi)施用是指已在體外被操作并隨后施用給對(duì)象的細(xì) 胞。術(shù)語(yǔ)體內(nèi)施用包括所有在對(duì)象體內(nèi)進(jìn)行的操作(包括施用）。
[0178] 在本發(fā)明的某些方面，所述組合物可被體外、間接體內(nèi)或體內(nèi)施用。在某些體外實(shí) 施方式中，自體T細(xì)胞被與本發(fā)明的組合物一起培養(yǎng)。該細(xì)胞或組織隨后可被用于體外分析 或間接體內(nèi)施用。
[0179] 實(shí)施例 w下實(shí)施例是為解釋本發(fā)明的各種實(shí)施方式而給出，并不w任何方式限制本發(fā)明。本 領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易意識(shí)到，本發(fā)明易于被改造而實(shí)現(xiàn)所提及的目的并獲得所提及的優(yōu) 勢(shì)，W及可從本文隱含得到的其他目的和優(yōu)勢(shì)。運(yùn)些實(shí)施例W及所述方法是實(shí)施方式的當(dāng) 前代表，并且是示例性的，并不用于限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可對(duì)運(yùn) 些實(shí)施例做出變化并且可將其用于其他用途，但運(yùn)些都屬于權(quán)利要求的范圍定義出的本發(fā) 明的實(shí)質(zhì)。
[0180] 實(shí)施例1. pMHC納米顆粒的制備和分析 pM肥制造 使用了兩種不同的方法來表達(dá)重組的I類pMHC復(fù)合物。第一種方法設(shè)及在存在膚的情 況下重新折疊在細(xì)菌中表達(dá)的I類MHC重鏈和輕鏈，然后通過凝膠過濾和離子交換層析進(jìn)行 純化，如（Garboczi, D.N. et al. (1992) Proc Natl. Acad Sci USA 89:3429-3433; Altman, J.D. et al. (1996) Science 274:94-96)所述。第二種方法設(shè)及作為單鏈構(gòu)建 體在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的freestyle C冊(cè)細(xì)胞中W高收率表達(dá)I類MHC復(fù)合物，其中通過柔性的GS 接頭(Yu, Y.Y. et al. (2002) J Immunol 168:3145-3149)、編碼BirA位點(diǎn)游離的切S 結(jié)束的6x化S標(biāo)簽)的簇基末端接頭依次連接編碼膚的序列、I類MHC輕鏈和重鏈。使用儀柱 和陰離子交換色譜從培養(yǎng)基上清液純化分泌的蛋白，并將其直接用于NP涂布或?qū)ζ渖锼?化，W使用巧光染料結(jié)合的的鏈霉制造 pMHC四聚體。如通過流式細(xì)胞儀測(cè)定的，使用代表性 單鏈pMHC復(fù)合物(其編碼IGRP206-214自身抗原膚或其模擬物NRP-V7)制造的四聚體高效地結(jié) 合至同源的單克隆自身反應(yīng)性CD8+ T-細(xì)胞，但是不結(jié)合至它們的多克隆副本(未示出）。
[0181] 最初從使用構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的果蛹SC2細(xì)胞純化重組的II類pMHC單體，所述構(gòu)建物編 碼分別帶有C-化η或c-Fos亮氨酸拉鏈的Ι-Αβ和Ι-Αα鏈、W及前述的BirA和6扯is標(biāo)簽 (Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225, Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225)。因?yàn)樵摲椒ǖ氖章释ǔ］^低并且耗時(shí)，申請(qǐng) 人開發(fā)了在freestyle 010細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)，該(?0細(xì)胞使用編碼單順反子信息的慢病毒 轉(zhuǎn)染，其中復(fù)合物的膚-ΙΑβ和ΙΑα鏈被核糖體跳越P2A序列分開（Holst, J. et al. (2006)化t Protoc 1:406-417)。如前述的單鏈I類pMHC構(gòu)建體一樣，將編碼BirA位點(diǎn)、 6xHis標(biāo)簽和游離的切S的接頭加入至構(gòu)建體的簇基末端。先后通過儀層析陰離子交換從細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液分離自組裝的II類復(fù)合物，并將其用于涂布在NP上或進(jìn)行處理W用于 生物素化和四聚體形成。如通過流式細(xì)胞儀測(cè)定的，使用編碼2.5mi自身抗原膚的代表性II 類pMHC復(fù)合物生成的II類pMHC四聚體特別地并且有效地被同源的單克隆自身反應(yīng)性CD4 + T細(xì)胞結(jié)合。
[0182] 四聚體染色 使用所述的生物素化的pMHC單體制備結(jié)合有PE的TUM-H-2Kd、NRP-V7-H-2Kd、 IGRP2〇6-2i4-H-2Kd、肥Li4-22/IAg7和抓C2.5mVlAg7四聚體（Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225; Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214- 3225; Amrani, A. et al. (2000) NaUire 406:739-742)。在4°(：下在。4〔5緩沖液（在口88 中的0.1%疊氮化鋼和1% FBS)中使用四聚體(5 ug/mL)對(duì)外周血單核細(xì)胞、脾細(xì)胞和淋己結(jié) CD8+或CD4 + T細(xì)胞進(jìn)行染色1小時(shí)，洗涂，并在4°C下使用結(jié)合有FITC的抗CD8a或抗CD4 (5 pg/mL)和結(jié)合有化rCP的抗B220(2 pg/mL作為"?。╠umb)"n)培育30分鐘。將細(xì)胞進(jìn)行洗 涂，固定在1% PFA/PBS中并用FACS分析。
[0183] 合成 如前所述地使用巧樣酸鋼化學(xué)還原氯化金來合成金納米顆?；疦P)^errault，S.D. et al. (2009) Nano Lett 9:1909-1915)。簡(jiǎn)單來說，在劇烈的攬拌之下將2 mL的1%的 HAuCU (Sigma Aldrich)加入至100 mL此0,并在油浴中加熱溶液。將6 mL(對(duì)于14 nm GNP)或2 mL(對(duì)于40皿GNP)的1%巧樣酸鋼加入至煮沸的HAu(n4溶液，將其額外攬拌10分 鐘，然后冷卻至室溫。通過加入1 uMo 1的使用-C00H或-NH2基團(tuán)功能化的琉基-PEG接頭 (Nanocs，M)(表1和表2)使GNP穩(wěn)定化W作為pM肥的受體。用水洗涂聚乙二醇化的GNPW除 去游離的琉基-PEG,濃縮，并儲(chǔ)存于水中W用于進(jìn)一步的分析。通過分光光度法并根據(jù)比爾 定律(Beer's law)計(jì)算NP密度。
[0184] 通過在存在表面活性劑的情況下在有機(jī)溶劑中乙酸鐵的熱分解，制造 SFP系列氧 化鐵NP(SFP I0NP)，然后通過聚乙二醇化使溶劑在水性緩沖液中。簡(jiǎn)單來說，將2 mMol Fe (acac)3 (Sigma Al化ich, Oakville, ON)溶解在10 mL芐基酸和油胺的混合物中，并加熱 至100°C持續(xù)1小時(shí)，然后在300°C加熱2小時(shí)，同時(shí)在氮?dú)鈱拥谋Ｗo(hù)下回流。通過加入乙醇沉 淀出合成的NP，并重懸于已燒中。為了I0NP的聚乙二醇化，將100 mg不同的3.5 kDa DPA- 陽(yáng)G接頭（表1中的Sl-S5;Jenkem Tech USA)溶解在CHCI3和HC0N(C出）2 (DMF)的混合物中。 然后將NP溶液(20 mg Fe)加入至DPA-PEG溶液并在室溫下攬拌4小時(shí)。通過加入已燒過夜沉 淀出聚乙二醇化的SFP NP，然后重懸于水中。通過高速離屯、（20，000 xg，30 min)除去微量 的聚集體，并將單分散的SFP NP儲(chǔ)存在水中W用于進(jìn)一步的表征和pMHC結(jié)合。通過在2N Η化中在A410的分光光度法測(cè)定10NP產(chǎn)物中鐵的濃度。根據(jù)SFP NP的分子結(jié)構(gòu)和直徑 (Fe3〇4;直徑8±1 nm) (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006)化reAppl.Chem.78:1003-1014)，
【申請(qǐng)人】估計(jì)，含有l(wèi)mg鐵的SFP溶液含有5xl0l4個(gè)NP。
[0185]
【申請(qǐng)人】隨后開發(fā)了新的lONP設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)使得能夠在完全沒有表面活性劑的情況 下，同樣通過熱分解，但是在一個(gè)步驟中，形成聚乙二醇化的I〇NP(PF系列I0NP)。在該新穎 的設(shè)計(jì)中，PEG分子同時(shí)被用作還原劑和表面活性劑。在典型的反應(yīng)中，在100°C下將3 g 陽(yáng)G (2 kDa)緩慢地融化在50血圓底燒瓶中，然后與7 mL的芐基酸和2 mMol Fe(acac)3混 合。劇烈地?cái)埌璺磻?yīng)1小時(shí)，然后伴隨著回流加熱至260°C持續(xù)額外的2小時(shí)。將反應(yīng)混合物 冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至離屯、管并與30 mL水混合。通過在2, OOOxg離屯、30分子，除去不溶性物 質(zhì)。通過穿過Amicon-15過濾器(MWC0 100 kDa, Millipore, Billerica, MA)的超濾，除去 游離的PEG分子。
【申請(qǐng)人】能夠產(chǎn)生I0NP，其中盡管不是所有的PEG分子都進(jìn)行了測(cè)試，但測(cè)試 了大部分的PEG分子(表1，P1-P5)dI0NP的尺寸根據(jù)在熱分解反應(yīng)中使用的PEG接頭的官能 團(tuán)（表1和2)而變化?？蒞使用磁性(MACS)柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)或IMag細(xì)胞 分離系統(tǒng)（BD BioSciences, Mississauga, ON)容易地純化NP。在室溫下或在4°C下將純化 的I0NP儲(chǔ)存在水中或各種緩沖液(pH 5-10)中，其中檢測(cè)不到任何聚集體。如上用于SFP NP 的描述地計(jì)算NP密度。
[0186] 的 pMHC 結(jié)合 通過在存在1-乙基-3- [3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的情況下酷胺鍵的形 成，實(shí)現(xiàn)將pMHC結(jié)合至用帶有遠(yuǎn)端-N此或C00H基團(tuán)的陽(yáng)G接頭制造的NP。首先將帶有-C00H 基團(tuán)的NP (GNP-C、SFP-C和PF-C，表2)溶解在20 ml MES緩沖液(pH 5.5)中。將N-徑基硫代 班巧酷亞胺（橫基-NHS，Thermo scientific,Waltham,ΜΑ，終濃度 10 mM)和抓C(Thermo scientific, Waltham, M，終濃度1 mM)加入至NP溶液。在室溫下攬拌20分鐘之后，將NP溶液 逐滴加入至含有溶解在20 mM棚酸鹽緩沖液(pH 8.2)中的pMHC單體的溶液。將混合物攬拌 額外的4小時(shí)。為了將pM肥結(jié)合至N出-功能化的NP(GNP-N、SFP-N和PF-N，表2)，首先將pMHC 復(fù)合物溶解在20 mM MES緩沖液(pH 5.5,含有100 ml化Cl)中。然后將橫基-N服（10 ml)和 抓C (5 mM)加入至pMHC溶液。然后將活化的pMHC分子加入至在20 mM棚酸鹽緩沖液（pH 8.2)中的NP溶液，并在室溫下攬拌4小時(shí)。
[0187] 為了將pMHC結(jié)合至馬來酷亞胺-功能化的NP(SFP-M和PF-M,表巧日?qǐng)D1C)，首先在 室溫下通過Ξ下基麟(TBP, 1 ml)解育pMHC分子4小時(shí)。然后將被工程化W編碼自由的簇基 末端Cys殘基的pMHC與在40 mM憐酸鹽緩沖液（pH 6.0,含有2 mM EDTA)中的NPU50 mM 化Cl混合，并在室溫下解育過夜。通過馬來酷亞胺基團(tuán)和切S殘基之間形成的碳-硫鍵共價(jià) 地將pM肥與NP結(jié)合。
[0188] 使用點(diǎn)擊化學(xué)來將pMHC或親和素結(jié)合至通過酷胺基團(tuán)功能化的NP( SFP-Z，表2)。 對(duì)于該反應(yīng)，首先通過二苯并環(huán)辛締（dibenzoc^yclooctyl , DBC0, Click畑emistiT Tools, Scottdale，AZ)試劑在室溫下解育pMHC或親和素分子2小時(shí)。通過過夜透析除去游 離的DBC0分子。然后通過SFP-Z解育pMHC-DBCO或親和素-DBC0結(jié)合體2小時(shí)，導(dǎo)致形成pMHC 或親和素分子與NP之間的Ξ挫鍵。
[0189] 通過大量的透析（針對(duì)PBS，pH 7.4,在4°C穿過300 kDa分子量截止膜（Spectrum 1 abS ))，除去在不同的pMHC-NP結(jié)合反應(yīng)中未結(jié)合的pMHC復(fù)合物。替代地，通過磁力分離純 化結(jié)合有pM肥的I0NP。通過穿過Amicon叫tra-15單元（100 W)a MWC0)的超濾，濃縮結(jié)合的 NP，并儲(chǔ)存在PBS中。
[0190]電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射、DLS和小角度電子束衍射 首先通過透射電子顯微鏡(TEM, Hitachi H7650)估算未結(jié)合的和結(jié)合有pM肥的NP的 核尺寸和分散度。使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)來確定pMHC-NP的流體力學(xué)尺寸、zeta電位和單分 散性，其中使用Ze化Sizer儀器（Malvern, UK)。使用小角度電子束衍射(SE抓)評(píng)估NP的PF 系列的氧化鐵核屯、的化學(xué)性質(zhì)。
[0191] 傅里葉變換紅外光譜 使用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)評(píng)估PF系列I0NP設(shè)計(jì)的表面化學(xué)性質(zhì)。使用ATR(衰減 全反射)模式上的Nicolet FTIR分光光度計(jì)，得到錯(cuò)定在PF-NP表面的對(duì)照陽(yáng)G和陽(yáng)G的FTIR 光譜。在4 cm-i光譜分辨率、平均256次掃描，記錄每個(gè)光譜。識(shí)別PEG骨架C-0-C基團(tuán)及其遠(yuǎn) 端pMHC-受體官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)特征。
[0192] 瓊脂糖凝膠電泳 為了快速評(píng)估NP電荷隨著聚乙二醇化或pMHC涂層的變化，將NP在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn) 行電泳。根據(jù)整體表面電荷，聚乙二醇化的NP遷移到負(fù)極或正極。進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色來確 認(rèn)NP和pMHC的共同遷移。
[0193] 天然和變性的聚丙締酷胺凝膠電泳 將結(jié)合有pMHC的NP進(jìn)行天然-PAGE (10%)和SDS-PAGE (12%)分析，W確認(rèn)在pMHC-NP制 劑中不存在游離的(未結(jié)合的)pM肥，并確認(rèn)在NP的表面上存在完整的Ξ分子pM肥復(fù)合物。
[0194] 效價(jià)測(cè)量 為了評(píng)估結(jié)合至單個(gè)NP上的pMffi：?jiǎn)误w的數(shù)量(pMffi：效價(jià)），我們使用不同的方法測(cè)量了 pMHC-NP制劑的pM肥濃度，運(yùn)些方法包括化a壯ord測(cè)定(Thermo Scientific)、氨基酸分析 (在水解的pMHC-NP制劑中17個(gè)不同的氨基酸的基于HPLC的量化）（化iversity of Toronto )、通過質(zhì)譜W及轉(zhuǎn)換為pM肥分子數(shù)量和NP數(shù)量的比例的值進(jìn)行的斑點(diǎn)化ISA和簽 名膚分析。簡(jiǎn)單來說，在"斑點(diǎn)化ISA"方法中，依次將結(jié)合了pMHC的NP和未結(jié)合的NPW及 pMHC單體溶液（作為標(biāo)準(zhǔn)）稀釋在PBS中，然后吸收至在多孔過濾板中的PVDF膜（PALL Corporation)。使該平板在室溫下部分干燥，然后使用pMHC特異性一級(jí)抗體（即，用于涂布 有I類pMHC的NP的抗-β2Μ和抗-Kd抗體，2M2和SF1-1.1 克隆，BioLegend, San Diego, CA) 解育，然后使用結(jié)合有皿P或AP的二級(jí)抗體解育。在進(jìn)行酶顯色反應(yīng)時(shí)，將孔的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移 至常規(guī)的化ISA板的孔中，然后使用平板讀數(shù)儀在450 nm測(cè)量它們的吸收。對(duì)于簽名膚質(zhì)譜 方法，通過質(zhì)譜鑒別pMHC特異性的膜蛋白酶膚(對(duì)于Kd復(fù)合物，簽名膚為TWTAADTAAUTR，對(duì) 于Ι-Α?7復(fù)合物，簽名膚為AQNSELASTA匪LR)。使用穩(wěn)定同位素（AQUA膚合成，Sigma A1化ich)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的合成膚。然后將同位素標(biāo)記的膚依次稀釋至既定的濃度，然后和結(jié)合 有pMHC的NP混合W用于膜酶消化。將該混合物進(jìn)行質(zhì)譜(Agilent QT0F6520)W量化標(biāo)記有 同位素的簽名膚與未標(biāo)記的簽名膚的比例，其作為pMHC濃度的讀出。因?yàn)橛蛇\(yùn)些不同的方 法生成的值是相似的，出于簡(jiǎn)單和方便，所W化a壯ord測(cè)定(使用未結(jié)合的NP作為空白）成 為所選的方法。
[01M] 體外pMHC-NP的激動(dòng)活性 在37° C下使用連續(xù)稀釋的結(jié)合了pMHC的NP或?qū)φ誑P解育來自TCR-TG小鼠的FACS分選 的脾CD8 +細(xì)胞(2.5 xlO5個(gè)細(xì)胞/mL)24-48小時(shí)。通過化ISA檢測(cè)上清液的WN 丫。用1 mCi 的[3H]-胸巧對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行脈沖，在24小時(shí)之后收割W測(cè)量[3扣結(jié)合。
[0196] 治療 使用在PBS中的涂布有pMHC的NP靜脈注射一組10周齡的雌性NOD小鼠，每周兩次并持續(xù) 5周（總共10次劑量）。通過所述的流式細(xì)胞儀（Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32: 568-580) (W及Clemente-hsares et al., submitted)評(píng)估血、脾、淋己結(jié)和/或骨髓中 四聚體+ CD8+或CD4+ T-細(xì)胞群的尺寸的增加 W及它們的表型特征。在其他實(shí)驗(yàn)中，使用 pMHC-NP每周兩次地靜脈注射顯示出血糖水平〉11 ml 2天的小鼠，并監(jiān)控血糖升高，直至血 糖正常穩(wěn)定(4周）。每日評(píng)估動(dòng)物的糖尿，并在3+時(shí)皮下注射給予人膜島素低精蛋白（每日1 IU)。
[0197] 統(tǒng)計(jì)分析 通過雙尾5化(16]11:'8 1:,]\1日]1]1-胖11；[1：]167 1],化;[-5911日'6或雙向4側(cè)￥4測(cè)試比較數(shù)據(jù)。統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著性假設(shè)P < 0.05。
[019引小鼠 NOD/Lt小鼠來自化ckson Lab (Bar Harbor, ME). 17.4日/8.3 (8.3-N0D), 17.6α/ 8.3α(17.6-N0D)，抓C2-5-N0D小鼠已經(jīng)有描述化atz，J.D.etal.α993)Cell74: 1089-1100; Verdaguer, J. et al. (1997) J E邱 Med 186:1663-1676; Han, B. et al. (2005) J Clin Invest 115:1879-1887)。
[0199] 實(shí)施例2. TID-相關(guān)的II類pM肥的制造 在真核細(xì)胞(S2或(?Ο細(xì)胞)中制造幾種不同的TID相關(guān)和不相關(guān)(即陰性對(duì)照)的膚/Ι? α?7 復(fù)合物。使用由運(yùn)些單體制劑產(chǎn)生的四聚體的研究證實(shí)了運(yùn)些單體作為正確地折疊的 pMffi：復(fù)合物被分泌進(jìn)上清液。圖2提供了例子。
[0200] 通過使用T1D相關(guān)的II類pMHC-NP進(jìn)行處理的NOD小鼠中的高血糖的逆轉(zhuǎn) 使用7.5 yg的涂布了 II類pMHC的NP每周兩次地處理糖尿病NOD小鼠。在正常血糖4周 時(shí)，認(rèn)為小鼠被治愈，在該點(diǎn)停止處理。如圖3所示，雖然在90-100%的小鼠（n=29只小鼠）中 2.5mi/I-Ag7-、IGRPi28-i45/I-Ag7-和IGRP4-22/I-Ag7-NP逆轉(zhuǎn)了 高血糖，但是使用皿L14-22/I- AW-NP(-種外來pMHC)的處理沒有效果。在停止處理之后>30周的被治愈的小鼠中的腹腔葡 萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT)得出的曲線，與年齡匹配的非糖尿病的未處理的對(duì)照非常相似，并且 和在未經(jīng)處理的急性糖尿病NOD小鼠中得到的曲線顯著不同（圖4)。因此，涂布有T1D相關(guān)的 II類pMHC的NP在糖尿病小鼠中恢復(fù)了葡萄糖穩(wěn)態(tài)。
[0201] 相關(guān)的II類pMHC-NP擴(kuò)增同源記憶TR1自身調(diào)節(jié)性CD4+ T細(xì)胞 與對(duì)糖尿病發(fā)病或年齡匹配的非糖尿病的未處理的動(dòng)物的研究相比，通過使用2.5mi/ I-AsLnP進(jìn)行處理的已經(jīng)血糖正常的50周齡糖尿病小鼠的血、脾、膜淋己結(jié)(PLN)、腸系膜淋 己結(jié)(MLN)和骨髓的研究，顯示了 2.5mi/I-Ag7四聚體+ CD4+細(xì)胞的百分比顯著升高（圖5)。 CD4+ T-細(xì)胞擴(kuò)增是抗原特異性的（圖5)。擴(kuò)增的節(jié)奏、大小和分布與被測(cè)試的Ξ種T1D相關(guān) 的II類pMHC-NP相似（圖6)。在所有運(yùn)些群體中的NP擴(kuò)增的四聚體+細(xì)胞對(duì)比四聚體+細(xì)胞的 表型分析顯示了記憶樣TR1表型（圖7,上），其具有近期描述(Gagliani，N. et al. (2013) Nature Medicine 19:739-746) (FIG. 7，bottom)的 TRl-特異性標(biāo)記物的共表達(dá)： CD62i?/CD44high/ ic〇s7CD257FoxP37表面TG邱7 CD49bVLAG3+。在表達(dá)化xP3啟動(dòng)子- eGFP的NOD小鼠中，確認(rèn)了運(yùn)些細(xì)胞不是化xP3+，其中所有pMHC-NP-擴(kuò)增的細(xì)胞都是eGFP- 陰性的(未示出）。
[0202] 與運(yùn)些表型數(shù)據(jù)一致，從經(jīng)pMHC-NP處理的小鼠分選的四聚體+ CD4+細(xì)胞，通過幾 乎完全分泌IL-10并且較低程度地分泌IFN 丫，對(duì)同源膚脈沖的DC進(jìn)行響應(yīng)（圖8W及未示出 的）。重要地，來自經(jīng)pMHC-NP處理的供體的純化的CD4+而非CD8+ T細(xì)胞抑制NOD中的T1D。 使用II類pMHC-NP處理轉(zhuǎn)移有糖尿病性脾的scid小鼠和的宿主被100%保護(hù)>100天（未示 出）。
[0203] 與其四聚體副本不同，運(yùn)些II類pMHC-NP擴(kuò)增的四聚體+細(xì)胞抑制非同源T細(xì)胞向 膚脈沖的DC繁殖(提呈由響應(yīng)子和四聚體+ TR1細(xì)胞祀定的膚）。相對(duì)于接收抗-IFN 丫或鼠 - IgG(未示出）的培養(yǎng)物，向培養(yǎng)物加入抗-IL10或抗-TGF0 mAb，部分地阻止了該抑制。最重 要地，使用IGRP4-22或2.5mi/I-Ag7-NP和阻斷的抗-化-10、抗-TG邱或抗-IFN 丫 mAb或鼠 - IgG處理的糖尿病小鼠的研究（圖9)顯示，通過II類pMHC-NP的正常血糖的恢復(fù)需要IL-10和 TG邱但不需要IFN 丫。但是，在自發(fā)性糖尿病NOD. 111〇-/--和NOD. Ifng-/-小鼠中的研究顯示， 比-10和IFN 丫的表達(dá)對(duì)于響應(yīng)于II類pMHC-NP而擴(kuò)增的TR1細(xì)胞的發(fā)展來說是必須的；在運(yùn) 些小鼠中，pMHC-NP治療擴(kuò)增了Th2樣細(xì)胞（NOD. Ifng-/-)或IFN 丫 +/化-47lLl〇-細(xì)胞 (NOD. 11小鼠）。在糖尿病IGRP-/- NOD小鼠（不能誘導(dǎo)(prime)IGRP-反應(yīng)性T細(xì)胞）中的 研究顯示，運(yùn)些小鼠不響應(yīng)IGRP4-22/I-As7-NP(沒有T細(xì)胞擴(kuò)增或正常血糖的恢復(fù))是因?yàn)檫\(yùn) 些小鼠缺少被誘導(dǎo)163?4-22的細(xì)胞。相反地，使用2.5111^1-487-肥處理的所有糖尿病161?口 N孤小鼠都被治愈(未示出）。所W，與I類pMHC-NP相似，Π 類pMHC-NP通過擴(kuò)增疾病誘導(dǎo)的調(diào) 節(jié)記憶而發(fā)揮作用，但是不能重新開始（de novo)誘導(dǎo)運(yùn)些響應(yīng)，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙俟泊碳ば?號(hào)。
[0204] 最后，使用牛痘病毒(rW)的研究顯示，通過II類pM肥-NP處理的NOD小鼠能夠容易 地清除急性病毒感染(圖10A)。與此一致，被處理的小鼠能夠?qū)χ鷦┲械哪Ｐ涂乖a(chǎn)生抗體 反應(yīng)(圖10B)。
[02化]實(shí)施例3.單特異性II類pMHC-NP減少EAE的嚴(yán)重程度。
[0206]
【申請(qǐng)人】然后測(cè)試了基于II類pMHC-NP的納米藥物在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 (EAE)中的治療潛力。該模型被用在盡可能嚴(yán)格的測(cè)試中：從而研究相對(duì)于防止或阻斷EAE 的發(fā)展，pMHC-NP是否能夠逆轉(zhuǎn)已經(jīng)建立的EAE。運(yùn)并非小問題。EAE中的介入的近期綜述表 明，超過400次研究的<1%在EAE誘導(dǎo)之后的21日開始治療化olst，J. et al. (2006)化t Protoc 1:406-417);報(bào)道的數(shù)據(jù)是在小鼠中獲得的，其中在EAE誘導(dǎo)之后21日開始治療，并 且被改善的疾病W劑量依賴的方式來打分(圖11)。
[0207] 實(shí)施例4.涂布有II類pMHC的NP的合成和質(zhì)量控制
【申請(qǐng)人】開發(fā)了最佳的氧化鐵NP設(shè)計(jì)，它不采用表面活性劑來進(jìn)行合成，并且得到高度 穩(wěn)定的、單分散的制劑，它能夠W最佳的pMHC負(fù)載進(jìn)行裝載。雖然可W使用數(shù)種不同的pMHC 涂布化學(xué)方法（圖12A)，但是
【申請(qǐng)人】經(jīng)常使用通過結(jié)合了馬來酷亞胺的PEG來功能化的NP， 它接收高效價(jià)的pMHC(高達(dá)多于60個(gè)pMHC/NP)，運(yùn)些pMHC被工程化來編碼在其簇基末端的 游離的Cys。通過數(shù)種質(zhì)量控制檢查來處理運(yùn)些II類pMHC-NP，W確定每個(gè)NP的pMHC效價(jià)(斑 點(diǎn)化ISA、氨基酸分析）、NP密度、NP電荷和NP尺寸(如由??Μ確定的金屬核；W及如通過動(dòng)態(tài) 光散射(DLS)確定的流體動(dòng)力學(xué)直徑）。圖12B示出了代表性的TEM圖像，圖12C示出了未涂布 pMHC的NP和涂布了pMHC的NP的DLS圖。典型的劑量方案設(shè)及每次劑量施用1-50 yg的總pMHC (涂布NP)(約2 uL的制劑稀釋在100 uL的PBS中）。
[020引實(shí)施例5.使用涂布了II類pMHC的NP進(jìn)行治療 上述數(shù)據(jù)與
【申請(qǐng)人】先前在使用I類pMHC-NP治療的小鼠中得到的數(shù)據(jù)一致：II類pMHC- NP擴(kuò)增同源的記憶調(diào)節(jié)T細(xì)胞(在該實(shí)施例中為TR1)，運(yùn)些T細(xì)胞通過局部的裝載了自身抗 原的AP巧Φ制其他自身抗原膚的提呈(Amrani, A. et al. (2000) NaUire 406:739-742)。
[0209] 已經(jīng)報(bào)道，人類TRl CD4+ Τ細(xì)胞克隆殺死專業(yè)的APC的一些亞型（例如樹突狀細(xì) 胞KAmrani, A. et al. (2000)化Uire 406:739-742)。因此，
【申請(qǐng)人】研究了響應(yīng)于II類 MHC-NP治療而擴(kuò)增的抗原特異性TR1細(xì)胞是否通過殺死裝載了自身抗原的APC而抑制自身 免疫。通過將經(jīng)2.5mi或GPI膚脈沖并且標(biāo)記有PK肥6(經(jīng)2.5mi脈沖的DC)或CF沈(經(jīng)GPI脈沖 的DC)的DC的1:1混合物灌注進(jìn)在之前5周內(nèi)已經(jīng)接受了 10次劑量的2.5mVlAg7-NP的NOD小 鼠或沒有接受任何處理的NOD小鼠，來進(jìn)行W上研究。7天后殺死宿主，W比較在兩種不同的 宿主中PKH26+細(xì)胞與CFSE+細(xì)胞的比例。如圖13A所示(上部），沒有觀察到任何差異，運(yùn)表明 響應(yīng)于pMHC-NP治療而擴(kuò)增的TR1 CD4+ T-細(xì)胞不殺死表達(dá)抗原的DC。
[0210] 為了研究運(yùn)是所用的APC類型(一種DC)的特性還是其他APC類型的一般特征，重復(fù) W上實(shí)驗(yàn)，但是相對(duì)于DC，使用脾B細(xì)胞。出乎意料地，
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2.5mi脈沖的B細(xì)胞的 數(shù)量在已經(jīng)使用涂布了 2.5mi/IAg7-NP的NP處理的宿主中擴(kuò)增(而非減少）（圖13A，下部）。運(yùn) 是意料之外的，因?yàn)楦鶕?jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，預(yù)期的是相反的結(jié)果(與其經(jīng)GPI脈沖的副本 相比，經(jīng)2.5mi脈沖的B細(xì)胞選擇性和特異性地減少）。
[02川然后通過比較經(jīng)2.5mi/IAg7-NP處理的小鼠與未經(jīng)處理的對(duì)照的膜腺癌(PLN)和腸 系膜(MLN)淋己結(jié)中的B細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量和百分比，
【申請(qǐng)人】查明了是否能夠報(bào)導(dǎo)II類pMHC- NP處理的運(yùn)種B細(xì)胞擴(kuò)增效果。如圖13B所示，經(jīng)II類pMHC-NP處理的NOD小鼠的化N中的B細(xì) 胞的百分比顯著增加，但在MLN中缺沒有。在未經(jīng)處理的NOD小鼠中沒有觀察到PLN與MLN的 運(yùn)些差異，運(yùn)表明，運(yùn)些效果是pMHC-NP治療的結(jié)果?？蒞注意到，在單個(gè)小鼠的化N中的 2.5mi-特異性的TR1 CD4+ T-細(xì)胞的頻率和PLN相關(guān)的B細(xì)胞的頻率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 的相關(guān)性，運(yùn)表明，經(jīng)pMHC-NP處理的NOD小鼠的B細(xì)胞向化N的招募的增加，是由響應(yīng)于MHC- NP治療而擴(kuò)增的2.5mi-特異性TR1 CD4+ T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的。
[0212] 總體上，運(yùn)些數(shù)據(jù)提出了運(yùn)樣的可能性，即響應(yīng)于Μ肥-NP治療而擴(kuò)增的B細(xì)胞可能 是Β調(diào)節(jié)細(xì)胞，它是獲得了響應(yīng)于與被pMHC-NP擴(kuò)增的TR1 CD4+ Τ細(xì)胞的同源相互作用而產(chǎn) 生IL-10的能力的B細(xì)胞。運(yùn)種情況假定，2.5mi-特異性TR1 CD4+ T細(xì)胞誘導(dǎo)未分化的嗜銘 粒蛋白A-特異性B細(xì)胞(嗜銘粒蛋白A是2.5mi表位的天然抗原來源）向產(chǎn)生化-10的化eg細(xì) 胞的分化和擴(kuò)增，所述特異性B細(xì)胞已經(jīng)捕獲了嗜銘粒蛋白A并因此在其表面上提呈對(duì)應(yīng)的 2.5mi/IAg7 pMHC復(fù)合物。
[0213] 為了檢驗(yàn)該假設(shè)，
【申請(qǐng)人】將來自一株NOD小m其兩個(gè)IL10基因位點(diǎn)中的一個(gè)攜帶 在終止密碼子和外顯子5的多聚腺巧酸化信號(hào)（11)之間的異種基因包IRES-eGFP的定向插 入）的經(jīng)2.5mi脈沖的或經(jīng)GPI脈沖的B細(xì)胞(標(biāo)記有PKH26)灌注進(jìn)經(jīng)2.5mi/IAg7-NP處理的 NOD宿主或未經(jīng)處理的NOD宿主。
[0214] 在轉(zhuǎn)移之后屯天，測(cè)定了宿主中供體PKH26+ B-細(xì)胞的流式細(xì)胞儀表型（圖13C，上 部面板）。如圖13C所示（中部和下部面板），相當(dāng)一部分的供體B細(xì)胞表達(dá)編碼IL10的eGFP并 且CD5+和CDld都高。運(yùn)是化eg細(xì)胞的Ξ個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)記物（Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006)化re Appl. Chem. 78:1003-1014)。運(yùn)僅在經(jīng) 2.5mi脈沖的Β細(xì)胞中觀察到，而在經(jīng)陰性對(duì)照膚(GPI)脈沖的Β細(xì)胞中觀察不到，并且僅在 經(jīng)pMHC-NP處理的小鼠中發(fā)生。重要地，該效果是（至少部分是）由化-10 pMHC-NP-擴(kuò)增的 TR1 CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)樵谌狈L-10的NOD宿主中觀察不到運(yùn)種響應(yīng)。
[0215]綜上所述，運(yùn)些數(shù)據(jù)證明了，II類pMHC-NP治療誘導(dǎo)抗原特異性的B細(xì)胞分化和擴(kuò) 增為B調(diào)節(jié)細(xì)胞。
[0216] 顯示了具有調(diào)節(jié)特性的B淋己細(xì)胞的存在的數(shù)據(jù)的描述可W在追溯到1974年的文 獻(xiàn)中找到。與響應(yīng)于II類pMHC-NP治療而擴(kuò)增的TR1 CD4+ T細(xì)胞相似，Breg細(xì)胞表達(dá)免疫抑 制性細(xì)胞因子，其包括IL-10和TGFb，W及能夠通過同源的、由II類pM肥驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞間相互 作用并W抗原依賴性和高度特異性的方式抑制致病的自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的其他分 子（Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826)。雖然已經(jīng)顯示了不同 的刺激能夠在體外W及在小得多的程度上在體內(nèi)誘導(dǎo)Breg形成，但是盡
【申請(qǐng)人】所知，目前 沒有治療方法能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)和擴(kuò)增抗原特異性的化eg細(xì)胞。通過誘導(dǎo)高度疾病特異性的 TR1 CD4+ T-細(xì)胞，
【申請(qǐng)人】證明了基于II類pMHC的納米藥物也誘導(dǎo)疾病特異性的化eg細(xì)胞。 因?yàn)榛痚g細(xì)胞也能促進(jìn)效應(yīng)子分化為TR1 CD4+ T-細(xì)胞，基于II類pMHC的納米藥物釋放深 厚和持久的免疫抑制性反應(yīng)，該反應(yīng)是高度抗原特異性的并因此能夠選擇性地抑制自身免 疫反應(yīng)而不損害全身免疫。
[0217] 實(shí)施例6.通過乙酷丙酬鐵的熱分解及其生物結(jié)合而合成表面功能化的氧化鐵納 米顆粒 烙化PEG。加入芐基酸和乙酷丙酬鐵。在105°切日熱1小時(shí)之后，將溫度升高至260?并回 流。約2小時(shí)之后，鐵納米顆粒形成并且溶液的顏色變黑。將反應(yīng)冷卻至室溫并加入一些水 來從反應(yīng)容器提取納米顆粒。通過Miltenyi Biotec LS磁性柱純化納米顆粒。在6.2-6.5的 緩沖pH(0.15M化α和2mM抓TA)下加入蛋白質(zhì)和鐵納米顆粒，在室溫下攬拌12-14小時(shí)，并 通過Miltenyi Biotec LS磁性柱純化結(jié)合了蛋白質(zhì)的顆粒，從而制備氧化鐵納米顆粒蛋白 質(zhì)結(jié)合物。
[0218] 要理解的是，雖然本發(fā)明已通過優(yōu)選實(shí)施方式和任選的特征進(jìn)行具體公開，但本 領(lǐng)域技術(shù)人員可想象到對(duì)所具體描述的發(fā)明做出修改、改進(jìn)和變化，并且運(yùn)些修改、改進(jìn)和 變化被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文提供的材料、方法和實(shí)施例是優(yōu)選實(shí)施方式的代 表，是示例性的，并且并非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0219] 本發(fā)明已在本文進(jìn)行寬泛和概括性的描述。落入所公開的上位概念的較窄的種類 和下位群體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。運(yùn)包括對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一般性描述，但設(shè)定前提或消極 限制W從種類物中移除任何主題內(nèi)容，而不論陪排除的內(nèi)容是否明確地在本文提及。
[0220] 此外，當(dāng)W馬庫(kù)什群組的形式描述本發(fā)明的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意 識(shí)到，本發(fā)明也據(jù)此W該馬庫(kù)什群組的任何單個(gè)成員或成員的子群組的形式描述。
[0221] 權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)"或"，除非另有明確說明僅指擇一方案或運(yùn)些替代方案相 互排斥之外，是指"和/或"，即使公開的內(nèi)容支持指代擇一方案和"和/或"的定義。
[0222] 如在本說明書和權(quán)利要求書中使用的，術(shù)語(yǔ)"包括"（W及任何語(yǔ)法形式的包括）、 "具有"（W及任何語(yǔ)法形式的具有）、"包含"（W及任何語(yǔ)法形式的包含)或"含有"（W及任 何語(yǔ)法形式的含有)是包容性和開放性的，并且不排除其他的、未列舉的元素或方法步驟。
[0223] 在本文的全文中，通過標(biāo)識(shí)引用來引用了多種公開文獻(xiàn)、專利和公開的專利說明 書。所有本文提及的公開文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和其他文獻(xiàn)都明確地通過引用W其整體合并 至本文中，如同每個(gè)都單獨(dú)通過引用合并到本文中一樣。如果存在沖突，則W本發(fā)明的說明 書(包括定義)為準(zhǔn)。
[0224] 表1.功能化的陽(yáng)G接頭
表2.納米顆粒設(shè)計(jì)和pMHC結(jié)合能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于擴(kuò)增和/或發(fā)展對(duì)象中的Trl細(xì)胞和/或B調(diào)節(jié)細(xì)胞的群體的復(fù)合物，所述復(fù) 合物包括納米顆粒和疾病相關(guān)的抗原-MHCII復(fù)合物，其中所述納米顆粒的直徑選自：從約1 nm至約100 nm的直徑；從約I nm至約50 nm的直徑或從約Inm至約20 nm或從約5nm至約100 nm的直徑，并且其中抗原-MHCII復(fù)合物與納米顆粒的數(shù)量的比例是從約10:1至約1000:1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的抗原-MHCII密度為從約0.05 pMHC/100 nm2的納米顆粒的表面積至約25 pMHC/100 nm2的納米顆粒的表面積。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合物，其中所述抗原來源于涉及自身免疫反應(yīng)的自身抗 原或其模擬物，并且任選地其中所述自身抗原是來自由胰腺辟田胞、IGRP、胰島素、GAD、IA-2 或髓鞘少突膠質(zhì)蛋白（MOG)表達(dá)的抗原的表位。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述納米顆粒是非脂質(zhì)體的和/或具 有固體核心，所述核心優(yōu)選是金核心或氧化鐵核心。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述抗原-MHCII被共價(jià)地或非共價(jià) 地連接至所述納米顆粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述抗原-MHCII通過尺寸小于5 kD 的接頭被共價(jià)地連接至所述納米顆粒。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述納米顆粒是生物可吸收的和/或 生物可降解的。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中納米顆粒復(fù)合物包含的抗原-MHCII 復(fù)合物與納米顆粒的比例為從約10:1至約100:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合物，其中所述接頭包括聚乙二醇。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述抗原-MHCII復(fù)合物是相同的或 不同的。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的復(fù)合物，其中所述接頭是相同的或不同的。12. -種組合物，其包含治療有效量的任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的復(fù)合物、以及載體。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述載體是藥學(xué)上可接受的載體。14. 一種制造、制備或獲得任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的復(fù)合物的方法，所述方法包括將 抗原-MHCII復(fù)合物涂布或復(fù)合至納米顆粒上。15. -種在有需要的對(duì)象中以抗原特異性的方式促進(jìn)Trl細(xì)胞和/或B調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成、 擴(kuò)增和招募的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的 復(fù)合物或權(quán)利要求12或13所述的組合物。16. -種在有需要的對(duì)象中治療或防止病毒感染或自身免疫性疾病的方法，所述方法 包括向所述對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求1 -11的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或權(quán)利要求12或13所 述的組合物，前提條件是所述抗原是自身免疫相關(guān)的自身抗原。17. 根據(jù)權(quán)利要求14-16的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。18. 根據(jù)權(quán)利要求15或17所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自糖尿病、糖尿病前 期、多發(fā)性硬化或多發(fā)性硬化相關(guān)的疾病，前提條件是所述抗原與將要被治療的自身免疫 性疾病相關(guān)。19. 一種試劑盒，其包括權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的復(fù)合物或權(quán)利要求11或12所述 的組合物、以及使用說明。20. -種制造氧化鐵納米顆粒的方法，所述方法包括熱分解乙酰丙酮鐵。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述氧化鐵納米顆粒是可溶于水的。22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述熱分解包括單一步驟的反應(yīng)。23. 根據(jù)權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熱分解在存在功能化的PEG分 子的情況下發(fā)生。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述熱分解在存在芐基醚的情況下進(jìn)行。25. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中用于所述熱分解的溫度為約80°C至約300 。(：、或約80°C至約200°C、或約80°C至約150°C、或約100°C至約250°C、或約100°C至約200°C、 或約150°C至約250°C、或約150°C至約250°C。26. 根據(jù)權(quán)利要求20-25的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熱分解進(jìn)行約1小時(shí)至約2小 時(shí)。27. 根據(jù)權(quán)利要求20-26的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述納米顆粒在PBS中在約4°C下是 穩(wěn)定的，沒有任何可檢測(cè)的降解或聚集。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述納米顆粒能夠穩(wěn)定至少6個(gè)月。29. 根據(jù)權(quán)利要求20-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括通過磁性柱純 化所述納米顆粒。30. -種制造納米顆粒復(fù)合物的方法，所述方法包括將pMHC與由權(quán)利要求20-29的任一 項(xiàng)所述的方法獲得的氧化鐵納米顆粒接觸，從而提供納米顆粒復(fù)合物。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括通過磁性柱純化所述納米顆粒。
【文檔編號(hào)】C12N5/0781GK105899229SQ201480071440
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年11月3日
【發(fā)明人】佩德羅·圣塔馬尼亞
【申請(qǐng)人】Uti有限合伙公司