用于抑制和/或治療神經(jīng)纖維瘤及相關(guān)腫瘤的材料和方法
【專利說明】
[00011本申請是申請?zhí)枮?00980123474.2、發(fā)明名稱為"用于抑制和/或治療神經(jīng)纖維瘤 及相關(guān)腫瘤的材料和方法"的申請的分案申請，該母案申請是2009年6月25日提交的PCT申 請PCT/US2009/048554進(jìn)入中國國家階段的申請。
[0002] 政府權(quán)利聲明
[0003] 本發(fā)明的部分研發(fā)在NIH(資助號NS 052606)和國防部（資助號W81XWH-05-1-0185)給予的政府支持下進(jìn)行。美國政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)力。
[0004] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0005] 本申請要求2008年6月27日提交的美國臨時(shí)專利申請61/076,185和2008年10月8 日提交的美國臨時(shí)專利申請61/103,650的優(yōu)先權(quán)，這兩個(gè)臨時(shí)專利申請均通過引用全文并 入本文，如同其單獨(dú)通過引用全文并入本文一樣。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本文所公開的不同方面和實(shí)施方案一般涉及對于以腫瘤形成為特征的疾病(例如 神經(jīng)纖維瘤)的建模、治療、預(yù)防和診斷。
【背景技術(shù)】
[0007] NF1腫瘤抑制基因的突變引起1型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)，其為一種常見的廣泛分布 的人遺傳疾病，僅在美國、歐洲和日本就影響了約250，000名患者。NF1基因編碼神經(jīng)纖維瘤 蛋白（320千道爾頓的蛋白），其至少部分地起到p21ras的GTP酶激活蛋白（GTPase activating protein,GAP)的功能。神經(jīng)纖維瘤蛋白在脊椎動物中高度保守，并與其在酵母 和果蠅中的對應(yīng)物有高同源性。
[0008] 患NF1的個(gè)體有多種多樣的惡性和非惡性表現(xiàn)，包括叢狀神經(jīng)纖維瘤，其總共影響 25-40%的NF1患者;這些神經(jīng)纖維瘤為終生致病和死亡的主要根源?？紤]到該病癥對攜帶 該突變的人的不利影響以及對該病癥和相關(guān)病癥的有效治療的缺乏，迫切需要該病癥的其 它治療療法。本文公開的多個(gè)方面和實(shí)施方案解決這一需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] -些實(shí)施方案包括治療患有某形式的神經(jīng)纖維瘤?。ɡ鐓矤钌窠?jīng)纖維瘤）的患 者的方法，包括以下步驟:提供至少一種治療有效劑量的式1化合物：
[0011] 或具有至少一個(gè)成鹽基團(tuán)的該化合物的鹽，
[0012] 其中，心為4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基;氨基取代的或氨基-低級烷基取代的苯 基，其中在每種情況下所述氨基為游離的、烷基化的或?；?；在五元環(huán)碳原子上鍵合的 1H-吲哚基或1H-咪唑基;或者在環(huán)碳原子上鍵合的吡啶基，其未被取代或被低級烷基取代， 并且所述氮原子被氧取代或未被取代;辦和此各自獨(dú)立地為氫或低級烷基；
[0013] 基團(tuán)1?4、1?5、1?6、1?7和1?8中的一個(gè)或兩個(gè)各自為硝基、氟取代的低級烷氧基或式11基 團(tuán)：N(R9)-C(=X)-(Y)n-R1() (II)，
[0014] 其中，R9為氫或低級烷基，X為氧、硫、亞氨、N-低級烷基-亞氨、肟或ο-低級烷基-肟，Y為氧或NH基團(tuán)，η為0或1，并且R 1Q為含至少5個(gè)碳原子的脂肪族基團(tuán)，或芳族、芳族-脂肪 族、脂環(huán)族、脂環(huán)族-脂肪族、雜環(huán)或雜環(huán)-脂肪族基團(tuán)，并且其余基團(tuán)1?4、1? 5、1?6、關(guān)碰8各自獨(dú) 立地為氫、未取代或被以下基團(tuán)取代的低級烷基，所述基團(tuán)為游離的或烷基化的氨基、哌嗪 基、哌啶基、吡咯烷基或嗎啉基，或者為低級烷?；?，三氟甲基，游離、醚化或酯化的羥基，游 離、烷基化或?；陌被?，或者游離或酯化的羧基。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述化合物為式1的可藥用鹽，在一些實(shí)施方案中，所述式1的 可藥用鹽為甲磺酸鹽。
[0016] 另一些實(shí)施方案還包括以下步驟:診斷患有叢狀神經(jīng)纖維瘤或類似病癥的患者。 而另一些實(shí)施方案則包括鑒定患者有發(fā)生叢狀神經(jīng)纖維瘤或類似病癥之風(fēng)險(xiǎn)的步驟。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述式1化合物的所述治療有效劑量為約200mg至約500mg，且 所述劑量的所述化合物每日至少一次施用給患者。在另一些實(shí)施方案中，所述式1化合物的 治療有效劑量為約350mg至約450mg，且所述劑量的所述化合物每日至少一次施用給患者。 在一些實(shí)施方案中，每日兩次給患者施用治療有效劑量(約400mg)的式1化合物。
[0018] -些實(shí)施方案包括對患有某種形式的神經(jīng)纖維瘤(例如，叢狀神經(jīng)纖維瘤）的患者 的治療，包括以下步驟:提供至少一種治療有效劑量的式2化合物：
[0020] 另一些實(shí)施方案包括治療患有某種形式的神經(jīng)纖維瘤(例如，叢狀神經(jīng)纖維瘤）的 患者的方法，包括以下步驟:提供至少一種治療有效劑量的式3化合物：
[0021] 另一些實(shí)施方案包括式（1)、（2)或（3)的至少一種化合物或其可藥用鹽在制備用 于治療患有某種形式的神經(jīng)纖維瘤(例如，叢狀神經(jīng)纖維瘤)之患者的藥物中的用途。
【附圖說明】
[0022] 通過參考以下對于本公開內(nèi)容實(shí)施方案的描述，并結(jié)合附圖、圖、表格、式等，將更 好地理解本公開內(nèi)容的上述方面和獲得它們的方式，其中：
[0023] 圖1A.用于考察造血微環(huán)境之作用的策略的示意圖。
[0024] 圖1B.利用熒光細(xì)胞分析生成的圖。在Krox20;Nflfl°x/fl° x和Krox20;Nflfl°x/-小鼠 中，ΝΠ +Λ骨髓為神經(jīng)纖維瘤形成所必需的。
[0025]圖2Α.顯示了存活百分?jǐn)?shù)(y軸）作為時(shí)間（X軸）的函數(shù)的Kaplan-Meier圖。對移植 了Nf 1+/-或野生型骨髓的Krox20; Nf lf lQx/f lQX和Krox20; Nf lf lQx/-小鼠進(jìn)行隨訪直到1歲齡。
[0026] 圖2Β·移植了野生型骨髓（1)或ΝΠ +/-骨髓(2-3)的Krox20;NflfWfl°x小鼠的照片。
[0027] 圖2C.移植了野生型或ΝΠ +Λ骨髓的Kr〇X20;Nflfl°xm° x小鼠的背根神經(jīng)節(jié)和外周 神經(jīng)的解剖照片。箭頭指示背根神經(jīng)節(jié)和外周神經(jīng)中的腫瘤。
[0028]圖3A.背根神經(jīng)節(jié)和近端外周神經(jīng)的蘇木精和伊紅(H&E)切片。
[0029]圖3B.用Masson三色法染色之切片的200倍放大照片。已標(biāo)出了供體骨髓和接受者 小鼠的基因型。
[0030]圖3C.阿爾新藍(lán)染色之切片的200倍放大。區(qū)域2和3中的小箭頭指示肥大細(xì)胞。區(qū) 域3中的大箭頭指示血管。
[0031] 圖3D.顯示不同基因型間肥大細(xì)胞數(shù)目差異的柱形圖。所述譜系通過FACS分離自 移植了 Nf 1+/-骨髓的 Krox20; Nf lf lQx/f lQX小鼠。
[0032] 圖3E.利用熒光細(xì)胞分析進(jìn)行的多種骨髓源譜系之表型評估數(shù)據(jù)的圖示。將骨髓 (區(qū)域1)與腫瘤細(xì)胞（區(qū)域2)分離并分選出EGFP+CD45.2陽性群。進(jìn)一步分離了腫瘤相關(guān)的 ⑶45.2細(xì)胞以鑒定肥大細(xì)胞（區(qū)域3)、巨噬細(xì)胞（區(qū)域4)、B淋巴細(xì)胞（區(qū)域4)和T淋巴細(xì)胞 組。標(biāo)出了腫瘤中各造血細(xì)胞群的比例。
[0033] 圖3F.顯示通過FACS從移植了ΝΠ +/-骨髓之Krox20;Nflfl°x/fl°x小鼠的腫瘤中分離 出的譜系的基因分型的凝膠圖。箭頭指示來自各表型譜系的所標(biāo)注等位基因的DNA擴(kuò)增產(chǎn) 物。
[0034]圖4A.顯示存活百分?jǐn)?shù)(y軸)作為時(shí)間（X軸)之函數(shù)的Kaplan-Meier圖。
[0035] 圖4B.移植了野生型骨髓（區(qū)域1)或Nf 1+Λ骨髓（區(qū)域2)之Kr〇x20 ;Nflfl°xm°x小鼠 的脊髓和背根的照片。箭頭指示近端神經(jīng)中的腫瘤。
[0036] 圖4C.圖示針對不同基因型的供體細(xì)胞所測量的背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglia, DRG)尺寸的圖。
[0037] 圖4D.移植了 ΝΠ+/-或ΝΠ+/-;W/W突變骨髓之Krox20;Nflfl° x/fl°x小鼠的背根神經(jīng)節(jié) 和近端脊神經(jīng)的代表性組織切片的照片。
[0038] 圖5A.示意用甲磺酸伊馬替尼處理Krox20;Nflfl°x/-小鼠之效果的PET圖。
[0039]圖5B.用甲磺酸伊馬替尼或PBS處理12周后平均FDG-PET強(qiáng)度的變化的圖示總結(jié)。 [0040]圖5C.通過解剖某些外周神經(jīng)而采集的數(shù)據(jù)的圖示。
[0041 ]圖顯示用甲磺酸伊馬替尼或安慰劑處理之ΚΓ〇Χ20;ΝΠη°χ/^Κ1的組織學(xué)分析 的照片。
[0042]圖5Ε.顯示將肥大細(xì)胞數(shù)/HPF繪制為甲磺酸伊馬替尼處理或未處理之函數(shù)的柱形 圖。
[0043] 圖5F.顯示將Tunnel陽性細(xì)胞數(shù)/HPF繪制為甲磺酸伊馬替尼處理或未處理的函數(shù) 的柱形圖。
[0044]圖6.患有叢狀神經(jīng)纖維瘤的患者用甲磺酸伊馬替尼治療之前和之后的MRI掃描。 [0045]圖7.用透射電子顯微鏡法對背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析。區(qū)域1-4,750倍;區(qū) 域5-8，1500倍。區(qū)域1-2的近端脊神經(jīng)來自移植了野生型骨髓的Kr 〇x20 ;Nflfl°xm°x小鼠；區(qū) 域3-8的近端神經(jīng)來自移植了Nfl+/-t髓的接受者。（U)無髓的軸突；（S)標(biāo)示神經(jīng)內(nèi)空間擴(kuò) 大。箭頭指示膠原束；（M)標(biāo)示肥大細(xì)胞浸潤腫瘤。
[0046]圖8.取自小鼠的組織樣本的顯微照片。這些圖片示意用TOG-PET對叢狀神經(jīng)纖維 瘤進(jìn)行鑒定。在9月齡時(shí)獲取的&(?20;財(cái)戶°#1°"小鼠和&(?20;財(cái)戶°+小鼠的脊神經(jīng)解 剖和FDG-PET圖。
[0047]圖9.用甲苯胺藍(lán)染色的組織樣本的顯微照片，且以100倍和600倍的放大倍數(shù)顯 示，箭頭指示肥大細(xì)胞。
[0048] 圖10.顯示了從移植了Nf 1+Λ;Wv/Wv骨髓的經(jīng)輻照的Krox20 ;Nflfl°xm°x接受者的 骨髓中分離出的單個(gè)骨髓祖細(xì)胞的DNA的基因型鑒定的凝膠。
[0049] 圖11A.用n)G-PET鑒定叢狀神經(jīng)纖維瘤。在9月齡時(shí)獲取的Krox20;Nflfl°x/fl° x小鼠 和Krox20; Nf lf w-小鼠的脊神經(jīng)的FDG-PET解剖圖。
[0050] 圖1 IB ·顯示Krox20;Nf lfl°x/-和Krox20 ;Nf lfl°x/fl°x小鼠的目標(biāo)坐骨神經(jīng)區(qū)域的 FDG-PET平均強(qiáng)度的圖。
[0051 ]圖 llC.Krox20 ;Nflfl°x/fl°x小鼠（區(qū)域 1)和患有PET陽性腫瘤的Krox20 ;Nflfl°x/-小鼠 (區(qū)域2-4)的背根神經(jīng)節(jié)的代表性解剖圖。
[0052]圖12.在甲磺酸伊馬替尼或安慰劑處理后用TUNEL評估叢狀神經(jīng)纖維瘤的凋亡。用 安慰劑對照(左圖）或甲磺酸伊馬替尼(右圖）處理叢狀神經(jīng)纖維瘤而得的代表性切片。箭頭 指示TUNEL陽性細(xì)胞。
[0053] 圖13A.MRI圖像，頭部和頸部。
[0054]圖13B.區(qū)域C、D:軸位MRI T2加權(quán)序列圖像;分別為用甲磺酸伊馬替尼處理前和處 理6個(gè)月后。
[0055] 使用相應(yīng)的附圖標(biāo)記來標(biāo)明各圖中的相應(yīng)部分。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 以下給出的和/或描述的實(shí)施方案并非旨在是窮盡性的或限定到以下詳細(xì)描述中 所公開的精確形式。相反，對實(shí)施方案進(jìn)行選擇和描述，使得本領(lǐng)域其他技術(shù)人員可領(lǐng)會和 理解本文所述的不同方面和實(shí)施方案的原則和實(shí)施。
[0057]已證明多種疾病的動物模型是建立對于所述建模疾病(modeled disease)的理解 的非常有效的工具，并且也許同樣重要的，還是開發(fā)和測試用于診斷、治療和/或預(yù)防所述 建模疾病的新材料和/或方法的非常有效的