黃芪在制備促進(jìn)IFN-γ分泌的藥物的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及黃巧的新用途，特別設(shè)及黃巧在制備具有促進(jìn)IFN-T分泌的藥物中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] IFN-丫是一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多 方面的功能，使許多常規(guī)藥物治療無效的疾病或體質(zhì)弱、免疫功能低下的病人使用IFN-T 治療后，收到良好的治療效果，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。由于外源性基因工程產(chǎn)品的半 衰期短，要達(dá)到治療水平必須持續(xù)大劑量注射，由此會產(chǎn)生一系列的毒副作用直接利 用外源性的IFN-丫有很大的風(fēng)險，而且進(jìn)入血液中的IFN-丫很難通過各種屏障作用到達(dá)組 織細(xì)胞。因此增加機(jī)體內(nèi)源性IFN-丫的含量具有更重要的意義。然而IFN-丫是誘生蛋白，正 常細(xì)胞一般不自發(fā)產(chǎn)生，只具有合成的潛能。
[0003] 有報道指出，電針刺激后被認(rèn)為不合成IFN- 丫的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)IFN- 丫樣免疫陽性反 應(yīng)物質(zhì)的表達(dá)顯著提高。Wei在老齡小鼠腦MVECs內(nèi)檢測到了 IFN-丫 mRNA的表達(dá)。運(yùn)些結(jié)果 為我們的研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。但至今未見中藥激活RIMVECs分泌IFN-丫的報道。因此，研 究誘導(dǎo)具有合成IFN-丫潛能的機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生IFN-丫的方法、尋找高效的中藥刺激物、尤其 探尋能使MVECs分泌IFN- 丫的方法和藥物，對相關(guān)疾病的防治具有十分重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明設(shè)及黃巧的新用途，特別設(shè)及黃巧在制備具有促進(jìn)IFN-T分泌的藥物中的 應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 黃巧在制備促進(jìn)IFN-丫分泌的藥物的用途，所述的黃巧的制劑為:水煎液或含有 黃巧甲巧或/和黃巧多糖的制劑黃琴水煎液或含有黃巧甲巧或/和黃巧多糖的制劑。
[0007] 所述的水煎液的制備方法為:加入黃巧重量8-10倍量的水，浸泡，煎煮0.5~化，過 濾既得。
[000引加入黃巧重量10倍量的水，浸泡，煎煮化，過濾，除菌既得。
[0009] 所述的促進(jìn)IFN- 丫分泌誘導(dǎo)是指通過所述的促進(jìn)IFN- 丫分泌誘導(dǎo)是指丫誘導(dǎo) RIMVECs產(chǎn)生IFN-丫。
[0010] 本發(fā)明的有益效果為：
[0011] 1、通過黃巧誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IFN-丫的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)黃巧藥液 濃度為25mg/L~3200mg/L時產(chǎn)生增殖效應(yīng)，增殖率從30.81 %~49.53 %，與對照組相比，濃 度為25mg/L和3200mg/L時增殖效果顯著(P<0.05)，當(dāng)濃度在400mg/L時增殖效果最佳。 [00 12] 2、通過黃巧甲巧和黃琴多糖誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN-丫的研究發(fā)現(xiàn):黃巧甲巧2扣g/ mL組和黃巧多糖25iig/mL組表現(xiàn)一致，在化、1化、2地時誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN- 丫量與空白對 照組相比較均有所增加，但化時誘導(dǎo)量差異不顯著（P〉〇. 05)，1化時誘導(dǎo)量差異顯著（P< 0.05)，24h時差異極顯著(P<0.01);黃巧甲巧50yg/mL組與對照組比較在化和12h檢測時能 顯著誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN-丫（P<0.05)，在2地能極顯著誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN-丫（P<0.01); 黃巧多糖50yg/mL組與對照組比較化和Mh檢測時能顯著誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN-丫（P< 0.05)，在1化能極顯著誘導(dǎo)RIMVECs分泌IFN- 丫（P<0.0 l)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為不同濃度黃巧藥液對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IFN-丫的影響（n = 5);
[0014] 圖姻2黃巧甲巧對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IFN-丫的影響(n = 5);
[001引圖3為黃巧多糖對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IFN-丫的影響（n = 5);
【具體實(shí)施方式】
[0016] W下實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)驗(yàn)例1:黃巧誘導(dǎo)大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌IFN-丫的研究
[0018] 1、黃巧水煎液的制備:采用實(shí)施例4制成的樣品。
[0019] 2、細(xì)胞分組與處理
[0020] MTT試驗(yàn):試驗(yàn)分為試驗(yàn)組(黃巧水煎液處理RIMVECs，共設(shè)11個濃度梯度，各劑量 段設(shè)6個平行孔)和對照組(未經(jīng)處理的RIMVECs，設(shè)6個平行孔）。細(xì)胞孔中加入含有黃巧藥 液的的DMEM維持培養(yǎng)液，使其終濃度依次為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6g/L、800、400、200、 100、50、25mg/L，對照組加入不含中藥藥液的維持培養(yǎng)基。
[0021] IFN- 丫檢巧U:取生長至匯合狀態(tài)的第二代RIMVECs，0.05 %膜蛋白酶-0.005 %邸TA 溶液消化吹打脫壁，調(diào)整密度為2X105cells/mL，接種于96孔板中，靜置培養(yǎng)至80%匯合， 將培養(yǎng)基更換為DMEM維持培養(yǎng)基，解育過夜，吸棄維持培養(yǎng)基，加入含有黃巧藥液的DMEM維 持培養(yǎng)液，使其終濃度依次為30、6、1、0.1111肖/111^空白對照組加入不含黃巧藥液的維持培養(yǎng) 基，每組五孔重復(fù)。解育化、1化、2地后檢測IFN- 丫。
[0022] 3、MTT法測定細(xì)胞增殖活性
[0023] 取經(jīng)不同濃度黃巧處理2地的細(xì)胞孔，加入5mg/mL的MTT 2化L，繼續(xù)培養(yǎng)地，各孔 加DMSOlO化L，室溫避光震蕩IOmin，使結(jié)晶充分溶解后于酶標(biāo)儀上測定490皿處每孔的吸光 度值。
[0024] 4、采樣
[0025] 將細(xì)胞置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，1化時采集細(xì)胞上清液。采集的樣品 經(jīng)3000r/min離屯、lOmin，將離屯、后的細(xì)胞上清液無菌分裝于0.6mL的離屯、管中，置于-80°C 保存?zhèn)溆谩?br>[00%] 5、IFN-丫的化ISA檢測
[0027] IFN-丫的測定(雙抗夾屯、化ISA法)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟簡述如 下：
[00%] (1)將所有樣品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)板取出，恢復(fù)至室溫后，每孔加入10化L樣品或 者標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中每一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液做2孔重復(fù)，最后另取2孔做空白顯色孔，不加任 何樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加完后用封板膠紙封住酶標(biāo)板，37°C溫箱解育90min。
[0029] (2)甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，用洗涂液浸洗4次。
[0030] (3)每孔加入10化L 37°C預(yù)熱的生物素化抗體工作液，空白顯色對照孔不加液體， 輕敲板壁混勻，用封板膠紙封住酶標(biāo)板，37°C溫箱解育60min。
[0031 ] (4)甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，用洗涂液浸洗4次。
[0032] (5)每孔加入10化L 37°C預(yù)熱的酶結(jié)合物工作液，空白顯色對照孔不加液體，輕敲 板壁混勻，用封板膠紙封住酶標(biāo)板，37°C溫箱解育30min。
[0033] (6)甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，用洗涂液浸洗4次。
[0034] (7)每孔加入100化37°C預(yù)熱的顯色劑，孔內(nèi)液體立即轉(zhuǎn)為藍(lán)色，37°C避光反應(yīng) 20min。
[0035] (8)每孔加入10化L 37°C預(yù)熱的終止液，輕敲板壁混勻，孔內(nèi)液體由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃 色。
[0036] (9)立即用酶標(biāo)儀測定A450值。
[0037] (10)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔樣品濃度值。
[0038] 6、數(shù)據(jù)處理
[0039] 根據(jù)測定A值，分別計(jì)算各檢測孔的濃度值，根據(jù)每一樣品重復(fù)孔的濃度，計(jì)算其 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)W靈±8表示，MTT試驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞增殖率，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)差異顯著 性分析。
[0040] 7、結(jié)果與分析
[0041 ] MTT結(jié)果見下表1。從表中可看出，當(dāng)黃巧藥液濃度為25mg/L~3200mg/L時產(chǎn)生增 殖效應(yīng)，增殖率從30.81 %~49.53 %，與對照組相比，濃度為25mg/L和3200mg/L時增殖效果 顯著(P<0.05)，當(dāng)濃度在400mg/L時增殖效果最佳;其后，隨著藥物濃度的繼續(xù)增加細(xì)胞增 殖率下降，但仍顯著高于對照組；當(dāng)黃巧藥液濃度為6400mg/L~25600mg/L時細(xì)胞的增殖率 為負(fù)數(shù)，在-15.09~-50.95%之間，即抑制細(xì)胞的增殖，其中6400mg/L濃度組與對照組相比 抑制效果顯著(P<0.05)，12800mg/L和25600mg/L濃度組與對照組相比抑制效果極顯著(P< 0.0 l)。該結(jié)果表明了黃巧在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)RIMVECs增殖的作用。
[0042]表1不同濃度黃巧藥液作用大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞2地的增殖效應(yīng)(n = 6)
[0044] 與對照組相比，沖<0.05，*沖<0.0 l
[0045] IFN- 丫的測定結(jié)果見圖1，可W看出，同對照組比較，黃巧0 . Img/mL組