一種新型生物醫(yī)用粘合劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有良好生物相容性、生物降解性和強(qiáng)粘合力，兼具填充、密封、止血功能的醫(yī)用傷口粘合劑及其制備和使用方法，屬于生物醫(yī)用材料制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]多年來(lái)，臨床上最常用的傷口縫合方法是采用縫合線、鉚釘?shù)炔牧匣蚱餍悼p合，這種方法保證了拉伸強(qiáng)度，但是會(huì)增加病人痛苦、創(chuàng)面愈合后留有疤痕而且操作麻煩。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，臨床上對(duì)傷口粘合的要求越來(lái)越高，不僅要求最大限度地減少患者傷痛，縮短愈合時(shí)間，而且要求在恢復(fù)功能的同時(shí)，外觀也能完美地恢復(fù)。而組織粘合劑因具有粘合時(shí)間短、用法簡(jiǎn)單、可體內(nèi)降解等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于臨床。目前，在臨床上使用最多的粘合劑有氰基丙烯酸酯衍生物、纖維蛋白膠和明膠-戊二醛衍生物類組織粘合劑，但這些粘合劑仍存在很多缺陷，如氰基丙烯酸酯衍生物雖粘合力大，但生物相容性差，纖維蛋白膠粘合力不足，并具有攜帶病毒的風(fēng)險(xiǎn)，明膠-戊二醛類粘合劑易產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)。為了解決這些問(wèn)題，人們開始對(duì)貽貝足絲具有強(qiáng)粘附力的原因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正是足絲蛋白中的一種酪氨酸衍生氨基酸L-3，4_ 二羥基苯丙氨酸(D0PA)賦予了貽貝在水下環(huán)境中仍具有超強(qiáng)粘附力的功能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與D0PA結(jié)構(gòu)相似的多巴胺(L-3，4-二羥基苯丙氨)也具有在水相中粘附物體的性能，得到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。
[0003]多巴胺結(jié)構(gòu)中的兒茶酚基團(tuán)與其粘附性能息息相關(guān)，通過(guò)多巴胺的氨基與材料的羧基酰胺化反應(yīng)來(lái)接枝多巴胺，也可賦予材料優(yōu)良的粘附性能，尤其在濕潤(rùn)環(huán)境中仍然具有強(qiáng)粘附力。大量研究證明，多巴胺具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖(Shin J, Lee JS, Lee C, Park H-J, Yang K, Jin Y, et al.Tissue AdhesiveCatechol-Modified Hyaluronic Acid Hydrogel for Effective, Minimally InvasiveCell Therapy.Advanced Funct1nal Materials 2015 ; 25:3814-24.)。已有一些以多巴胺為原料制備生物粘合劑的報(bào)道，如中國(guó)發(fā)明專利CN104623725A報(bào)道了使用多巴胺與丙烯酸酯和一些高分子物質(zhì)接枝聚合制得的生物粘合劑;專利CN104056300A報(bào)道了使用多糖與多巴胺接枝構(gòu)建的復(fù)合生物膠粘合劑。然而，前者采用了一些有機(jī)溶劑，這無(wú)疑增加了粘合劑的細(xì)胞毒性，后者構(gòu)建的生物膠主要用于軟骨損傷的修復(fù)，粘合強(qiáng)度不高。海藻酸鈉和I型膠原都是天然生物質(zhì)材料，具有良好的生物相容性和可生物降解性，均能促進(jìn)組織愈合，同樣受到廣泛的研究和應(yīng)用。經(jīng)氧化制得的氧化海藻酸鈉由于分子內(nèi)含有活性基團(tuán)醛基，可與組織的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，從而產(chǎn)生粘合，但是其降解快，很少單獨(dú)使用，往往是與其它材料復(fù)合制作粘合劑。如中國(guó)發(fā)明專利CN101716366A采用氧化海藻酸鈉與明膠交聯(lián)構(gòu)建生物膠型止血?jiǎng)?，粘合?qiáng)度高于纖維蛋白膠，但是在體內(nèi)濕潤(rùn)環(huán)境下粘合強(qiáng)度仍達(dá)不到要求，而且明膠在生物活性、低免疫原性和促進(jìn)傷口愈合方面遠(yuǎn)不及I型膠原突出。
[0004]因此，開發(fā)出一種生物相容性好，體內(nèi)濕潤(rùn)環(huán)境下粘合強(qiáng)度高的醫(yī)用組織粘合劑顯得尤為必要，且需要盡可能滿足如下條件:
1.使用安全、無(wú)毒、具有良好的生物相容性，不妨礙人體組織的自身愈合； 2.在生理?xiàng)l件下能夠快速地粘合組織，具有良好的粘合強(qiáng)度和持久性；
3.兼具一定的止血和促進(jìn)組織再生功能，并且能夠抑制細(xì)菌感染；
4.在合理時(shí)間內(nèi)可降解和被機(jī)體吸收，降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用；
5.使用方便，容易保存，價(jià)格低廉，原料易得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有粘合劑生物相容性低、體內(nèi)濕潤(rùn)環(huán)境粘合強(qiáng)度不足而提供的一種能夠與傷口產(chǎn)生原位交聯(lián)的生物醫(yī)用粘合劑及其制備和使用方法，該粘合劑生物相容性好，可被機(jī)體完全降解吸收，體內(nèi)濕潤(rùn)條件下粘合強(qiáng)度大，又兼具填充、密封和止血功能，同時(shí)可以促進(jìn)組織愈合和修復(fù)，可作為一種醫(yī)用組織粘合劑、密封劑或止血?jiǎng)┯糜谂R床創(chuàng)傷修復(fù)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
(1)氧化海藻酸鈉的制備:稱取10g海藻酸鈉，分散于25?100mL無(wú)水乙醇中，再避光稱取2?6g的高碘酸鈉溶于25?100mL蒸餾水中，兩者混合，在20?40°C條件下避光磁力攪拌反應(yīng)2?10h，加入10?30mL乙二醇終止反應(yīng)0.5?2h，最后用蒸餾水透析1?3天，將截留物在10000?20000rmp下離心10~30min，除去沉淀，將上清液在壓力0?20Pa、溫度-100~-30°C條件下冷凍干燥48?72h，即制得氧化海藻酸鈉；
(2)多巴胺接枝氧化海藻酸鈉溶液的制備:稱取一定質(zhì)量的氧化海藻酸鈉，溶于MES緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為2%?10%的氧化海藻酸鈉溶液;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將一定質(zhì)量比例的Ι-Ο-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 溶于上述氧化海藻酸鈉溶液中，20?40°C下反應(yīng)10?40min，再加入一定質(zhì)量比例的多巴胺，20?40°C繼續(xù)反應(yīng)8?24h，制得多巴胺接枝氧化海藻酸鈉中間體，裝入截留分子量為3000?3500Da或8000?14000Da的透析袋中，用蒸饋水透析1?3天后，取截留液在壓力0?20Pa、溫度-100?-30°C條件下冷凍干燥48?72h，然后將凍干產(chǎn)物溶于PBS或硼酸鈉溶液中，配成質(zhì)量濃度為5%?20%的溶液，即得A液；
(3)1型膠原溶液的制備:將一定質(zhì)量的I型膠原粉劑溶解在一定濃度的無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸溶液中，在4?20°C下攪拌使之完全溶解，然后用0.2?0.5mol/L的氫氧化鈉溶液中和pH至5.0?8.0，最終配成濃度為5?15mg/mL的I型膠原溶液，即得B液；
(4)使用前首先用質(zhì)量濃度為3%?30%的雙氧水或酶活性單位為10?40U/mL的辣根過(guò)氧化物酶清洗傷口，然后將上述A、B兩液按照1:1?2的體積比均勻混合后立即涂覆到傷口處，30?120s內(nèi)即可形成凝膠，可牢固粘附于傷口表面。
[0007]進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的海藻酸鈉粘均分子量為200~350kDa;氧化后的海藻酸鈉糖醛基單元占海藻酸鈉總糖醛酸單元的摩爾百分?jǐn)?shù)為10%?70%。
[0008]步驟(2)中所述的MES緩沖溶液的pH為4.5-6.5，PBS緩沖液pH為7.0-8.0,硼酸鈉溶液濃度為0.1-0.5mol/L，pH為7.0-8.0；所述氧化海藻酸鈉與EDC和NHS的投料質(zhì)量比為1.0:
0.8?3.0:0.2?1.0，氧化海藻酸鈉與多巴胺投料質(zhì)量比為1.0:0.3?1.0，產(chǎn)物中多巴胺接枝率為5%?40%。
[0009]步驟(3)中所述I型膠原粉劑來(lái)源于豬皮、牛皮、豬腱或牛腱之一種，分子量30萬(wàn)道爾頓以上，具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，羥脯氨酸含量不小于總蛋白含量的9%(m/m)，溶解I型膠原時(shí)所用酸液為甲酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液或鹽酸溶液之一種，酸液濃度為0.Ι-Ο.5mol/L。
[°01°] 步驟(4)中所述粘合劑涂覆到傷口的涂覆量為0.1?0.3mL/mm2。
[0011]本發(fā)明所得原位交聯(lián)生物醫(yī)用粘合劑滿足以下關(guān)鍵性能指標(biāo):
外觀:紅褐色或紅橙色，凝膠狀物；
重金屬含量:< 10yg/g(m/m)；
水蒸氣透過(guò)率:37°C，35%相對(duì)濕度條件下粘合劑的水蒸氣透過(guò)率為1000?2500g/m2.24h；
平衡溶脹率:<2g/g濕膠；
粘合力:豬皮搭接剪切強(qiáng)度不低于50kPa;
細(xì)胞毒性:細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于I級(jí)；
無(wú)菌試驗(yàn):無(wú)菌；
致敏試驗(yàn):無(wú)遲發(fā)型超敏反應(yīng)；
皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn):原發(fā)性刺激指數(shù)PII <0.4。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:(1)所制醫(yī)用粘合劑具有良好的生物相容性和體內(nèi)濕潤(rùn)環(huán)境下強(qiáng)粘附力，粘附效果優(yōu)于臨床上廣泛使用的纖維蛋白膠；(2)溶脹率低，透水透氣性良好，可使傷口保持濕潤(rùn)環(huán)境，能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和傷口愈合；
(3)可生物降解，降解產(chǎn)物能被機(jī)體完全吸收；(4)原位交聯(lián)粘合時(shí)間短，效果好，也可作為密封劑或止血?jiǎng)┯糜谂R床。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過(guò)實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
[0014]實(shí)施例1
(1)氧化海藻酸鈉的制備:稱取10g海藻酸鈉，分散于25mL無(wú)水乙醇中，再避光稱取2g的高碘酸鈉溶于25mL蒸餾水中，兩者混合，在20°C條件下避光磁力攪拌反應(yīng)2h，加入10mL乙二醇終止反應(yīng)0.5h，最后用蒸餾水透析1天，將截留物在lOOOOrmp下離心lOmin，除去沉淀，將上清液在壓力OPa、溫度-100°C條件下冷凍干燥48h，即制得氧化海藻酸鈉；
(2)多巴胺接枝氧化海藻酸鈉溶液的制備:稱取一定質(zhì)量的氧化海藻酸鈉，溶于pH為4.5的MES緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為2%的氧化海藻酸鈉溶液;在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將一定質(zhì)量比例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于上述氧化海藻酸鈉溶液中，使得氧化海藻酸鈉與H)C和NHS的投料質(zhì)量比為1.0:0.8:0.2，20°C下反應(yīng)lOmin，再加入一定質(zhì)量比例的多巴胺，使得氧化海藻酸鈉與多巴胺投料質(zhì)量比為1:
0.3，20°C繼續(xù)反應(yīng)8