90min，避光，每隔IOmin混勻一次，之后4°C，3000巧m離必2min，預冷的PBS洗 涂，重懸，檢測前加入IW Propidium iodide標記死細胞，采用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長 350皿，檢測波長675皿?？疾焖幬飳Ρ茄拾〤NE-2細胞SP細胞比例的影響。
[0040] 實施例6 SangA對鼻咽癌CNE2細胞形成腫瘤球的影響 無血清懸浮培養(yǎng)腫瘤細胞球（tumorspheres)富集了腫瘤干細胞，并反映了腫瘤干細胞 自我更新的關(guān)鍵特征，是腫瘤干細胞研究的重要技術(shù)之一，我們研究了不同濃度SangA對 鼻咽癌CNE-2細胞形成tumors地eres能力的影響。發(fā)現(xiàn)SangA能顯著抑制腫瘤球的形成， 其形成的腫瘤球數(shù)量及大小均明顯小于對照組（P<〇. 001)。陽性對照藥順笛對腫瘤球的大 小無明顯影響（P〉〇. 05)(圖6)，但能顯著減少腫瘤球數(shù)量（p<0. 001)(圖7)。表明SangA 具有抑制CSCs的活性。
[0041] 具體實驗方法為CNE-2細胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中，設(shè)DMSO組(溶劑對照組)、空 白對照組、陽性藥物順笛 1 U g/ml、順笛 2 y g/ml、SangA 0. 6mg/ml、SangA 0. 3mg/ml 組，生 長7d后，觀察腫瘤球數(shù)目及大小。
[0042] 實施例7 SangA對荷鼻咽癌裸鼠的藥效研究 我們建立了荷鼻咽癌裸鼠模型(皮下成瘤)，待模型動物腫瘤長至IOOmm3時，將模型動 物分為空白對照組、陽性藥物組(順笛組XSangA高、中、低劑量組(生藥濃度lOg/ml，5g/ml， 2. 5g/ml)每組8只動物。分別給藥治療，觀察腫瘤生長情況。模型對照組在治療后第4天， 體重稍有增加，達到初始體重的107%左右，稍后體重開始降低，在治療末期，逐漸趨于平 穩(wěn)，為初始體重的96%左右；SangA高、中、低劑量組體重趨勢與對照組基本相似，與對照組 無顯著性差異（P=O. 998,0. 956,1. 000 > 0. 05)，說明SangA高、中、低劑量對荷鼻咽癌裸鼠 的體重無明顯影響，無明顯毒副作用。順笛組在開始治療后，與對照組相比，裸鼠體重開始 顯著下降，在治療末期，體重下降為初始體重的75%左右，與對照組有顯著性差異（P=0.0 17 < 0. 05)，說明順笛顯著降低裸鼠的體重，表現(xiàn)出一定的毒副作用。
[0043] 在實驗觀察期內(nèi)，根據(jù)腫瘤生長曲線，可見隨著時間的延長，各組腫瘤體積都呈 逐步增大趨勢，與對照組相比，順笛組（P=O. Oll < 0. 05)，SangA高、中劑量組（P=0.0 36， 0. 041 < 0. 05)能抑制腫瘤的生長，SangA低劑量組與對照組無顯著性差異（P=0.0 68 > 0.05)。說明SangA在一定劑量下能顯著抑制腫瘤的生長，具有一定的抗腫瘤活性。各組腫 瘤相對增殖率見表7。結(jié)果表明SangA高、中劑量組能顯著抑制腫瘤生長（p<0.0 l )，與對照 組相比，對裸鼠體重無明顯影響（P〉〇. 05)，說明SangA具有體內(nèi)抑制腫瘤生長的活性，并且 毒性很?。▓D8)。
[0044] 表7各組相對腫瘤增殖率
具體實驗方法為：取對數(shù)生長期的C肥-2細胞，分別于裸鼠皮下接種3X106個細胞， 細胞接種2周后（皮下腫瘤基本長至IOOmm3左右)，隨機分為五組，即模型對照組、順笛組、 SangA高、中、低劑量組，每組8只裸鼠，模型對照組給予蒸傭水（200ul/只，灌胃，每天一 次），順笛組巧mg/kg，腹腔注射，每周一次），SangA高濃度（lOg/ml，200ul/只，灌胃，每 天一次)，SangA 中濃度（5g/ml，200ul/ 只，灌胃，每天一次)，SangA 低濃度（2. 5g/ml，200ul/ 只，灌胃，每天一次)，連續(xù)給藥33天，觀察腫瘤生長情況如下： 開始給藥治療后，每周2次稱量各組裸鼠體重，及用游標卡尺測量腫瘤大小，根據(jù)公式 V=l/2ab2 (V為腫瘤體積，a為長徑，b為短徑）計算腫瘤體積，繪制體重-時間變化曲線及 腫瘤生長曲線。
[0045] 實施例8 SangA對荷鼻咽癌裸鼠生存期的影響 各組從給藥治療之日起算，觀察生存周期，共觀察80天。如表8所示，在觀察期末，對 照組裸鼠生存率為42. 9%，順笛組裸鼠生存率為57. 1%，SangA高、低劑量組裸鼠生存率為 85. 7%，中劑量組為57. 1%。對照組平均生存期為62. 0天，中位生存期為57. 0天；順笛組平 均生存期為59. 7天，中位生存期>80天。SangA高、中、低劑量組平均生存期分別為78. 4 天、76天、75. 8天，中位生存期均>80天。結(jié)果表明SangA對荷鼻咽癌裸鼠的生存期有一定 的延長作用。
[0046] 表SSangA不同劑量對荷鼻咽癌裸鼠生存率的影響
W上實施例表明，本發(fā)明制備的桑枝葉提取物SangA對腫瘤干細胞表現(xiàn)出顯著抑制作 用，是制備抗腫瘤藥物的理想成分。
[0047] W上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。
【主權(quán)項】
1. 一種桑枝葉活性部位（SangA)的制備方法，包括如下步驟： (1) 桑枝葉粉碎后，以水或乙醇水溶液為提取溶媒，經(jīng)浸泡、煎煮、滲漉、超聲或回流方 法進行提取，提取液濃縮后加入乙醇沉淀多糖、鞣質(zhì)，收集濾液，進一步濃縮濾液得到桑枝 葉濃縮液； (2) 選擇非極性或弱極性大孔樹脂對上述桑枝葉濃縮液進行分離純化：將桑枝葉濃縮 液上樣到凈化好的大孔樹脂柱中，上樣量以生藥計與干樹脂質(zhì)量比為1 :3~20,吸附平衡 后，用水洗脫至無色，然后用20%~40%配比范圍的乙醇水溶液洗脫至無色，再用50%~ 100%配比范圍的乙醇水溶液洗脫至無色，收集該部分洗脫液，濃縮干燥，得到SangA粗提 物； (3) SangA粗提物進一步精制：用含乙腈的水溶液溶解SangA粗提物，上ODS柱分離， 以35%~100%配比范圍的乙腈水溶液洗脫，收集該部分洗脫液，濃縮干燥，獲得SangA精制 物； 以上" ％"均指體積百分比。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述提取溶媒的用量為桑枝葉體積 的2~30倍。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所得到的桑枝葉濃縮液為 0. 2 ~20g生藥/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述非極性大孔樹脂為 D101、HPD100、XAD-l、H-20 等，弱極性大孔樹脂為D101B、AB-8、CAD-40、D201、H-40、H-50 或 ΗΗΗΟΟ。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)所述乙腈水溶液的濃度為 35% ~100%。6. 權(quán)利要求1~5任一項所述的方法制備得到的SangA粗提物和/或SangA精制物在 制備抗腫瘤藥物、保健食品或抗腫瘤功能性食品中的應用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物、保健食品或抗腫瘤功能 性食品中還含有藥學上可接受的輔料或添加劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述輔料或添加劑為以下至少一種：蔗 糖、乳糖、糊精、淀粉、β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、微晶纖維素、微粉硅膠、羥丙基纖 維素、羧甲淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、阿斯帕坦、甜菊苷、香精、甘露醇、 山梨醇、硬脂酸、硬脂酸鎂、丙烯酸樹脂、半合成脂肪酸脂，凡士林、液狀石蠟、吐溫-20、吐 溫-80、卵磷脂、十二烷基硫酸鈉、甘油、明膠、聚乙二醇、聚維酮。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物、保健食品或抗腫瘤功能 性食品可以是片劑、膠囊劑、口服液、注射劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、泡騰劑、合劑、糖漿劑、 緩釋劑、控釋劑或祀向制劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、乳腺 癌、Η頸癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑枝葉活性部位的制備方法及其應用。所述制備方法包括溶劑提取桑枝葉總浸膏、醇沉去除多糖、鞣質(zhì)等成分，大孔樹脂吸附、分離純化、ODS柱精制等步驟。經(jīng)實驗證，本發(fā)明制備的桑枝葉提取物SangA對腫瘤干細胞表現(xiàn)出顯著抑制作用，是制備抗腫瘤藥物的理想成分。
【IPC分類】A61K127/00, A61P35/00, A61K36/605, A61K135/00
【公開號】CN105477068
【申請?zhí)枴緾N201410758109
【發(fā)明人】羅奇志, 戴開金, 肖廣惠
【申請人】南方醫(yī)科大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年12月10日