一種桑枝葉活性部位的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種桑枝葉活性部位的制備方法及其在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的重大疾病，已經(jīng)成為人類(lèi)死亡的第一位或第二位的原 因，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界尚未攻克的難題。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的病理過(guò)程，涉及到 一系列的分子變化過(guò)程，其本質(zhì)表現(xiàn)為細(xì)胞不受控制的異常增殖，送種異常生長(zhǎng)的能力除 了表現(xiàn)為腫瘤本身的持續(xù)生長(zhǎng)之外，還表現(xiàn)為對(duì)鄰近正常組織的侵犯及經(jīng)血管、淋己管等 轉(zhuǎn)移到身體其它部位的能力，90% W上由惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡歸咎于送種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn) 移。
[0003] 手術(shù)治療、放射治療及藥物治療是目前腫瘤治療的H大主要方法，對(duì)于不適于手 術(shù)治療及放射治療的患者，藥物治療仍是首選，傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的著眼點(diǎn)是殺滅腫瘤細(xì)胞， 雖然取得了一些積極的治療效果，但在化療過(guò)程中出現(xiàn)的耐藥性及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，導(dǎo) 致治療的最終失敗。為什么在臨床上認(rèn)為已得到徹底殺滅的腫瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移， 是科學(xué)界一直在不斷探索的問(wèn)題。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為在腫瘤組織中，存在著占腫瘤細(xì)胞 總量很小的一部分細(xì)胞（0. 1%~4%左右)，稱(chēng)之為腫瘤干細(xì)胞，它們具有無(wú)限自我更新和產(chǎn) 生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的能力，能促使腫瘤組織的形成和無(wú)限生長(zhǎng)，對(duì)化療和放療具有很強(qiáng)的 抗藥性，是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐受性的根本原因。目前臨床抗腫瘤治療，主要 殺滅的是增殖腫瘤細(xì)胞，而不能清除腫瘤干細(xì)胞，由于腫瘤干細(xì)胞的無(wú)限自我更新和分裂， 會(huì)迅速出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致臨床腫瘤治療的失敗。因此，根除腫瘤干細(xì)胞是治 愈腫瘤的關(guān)鍵。W腫瘤干細(xì)胞為祀點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。
[0004] 目前在許多人類(lèi)惡性腫瘤中，人們證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在，如乳腺癌、腦腫 瘤、宮頸癌、肝癌、肺癌、結(jié)(直）腸癌、前列腺癌、鼻咽癌等。腫瘤干細(xì)胞具有3個(gè)主要特 點(diǎn)：無(wú)限自我更新能力、多向分化潛能和高致瘤性，近年來(lái)，研究者們報(bào)道了一些特異性 革己向腫瘤干細(xì)胞的活性化合物，如中藥青黛中活性成分說(shuō)玉紅，中藥黎蘆中的醬體生物堿 eyeIopamine，小白菊中活性成分小白菊內(nèi)醋，葡萄中的活性成分白黎蘆醇，西蘭花中的萊 釀硫焼等。
[0005] 桑枝葉為?？粕僦参锷化a Z.)的枝及葉子，其藥用始載于《神農(nóng)本草 經(jīng)》，具有疏風(fēng)散熱，益肝通氣之功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種桑枝葉活性部位的制備方法及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種桑枝葉活性部位（SangA)的制備方法，包括如下步驟： (1)桑枝葉粉碎后，W水或己醇水溶液為提取溶媒，經(jīng)浸泡、煎煮、滲漉、超聲或回流方 法進(jìn)行提取，提取液濃縮后加入己醇沉淀多糖、躁質(zhì)，收集濾液，進(jìn)一步濃縮濾液得到桑枝 葉濃縮液； (2) 選擇非極性或弱極性大孔樹(shù)脂對(duì)上述桑枝葉濃縮液進(jìn)行分離純化；將桑枝葉濃縮 液上樣到凈化好的大孔樹(shù)脂柱中，上樣量W生藥計(jì)與干樹(shù)脂質(zhì)量比為1 ;3~20,吸附平衡 后，用水洗脫至無(wú)色，然后用20%~40%配比范圍的己醇水溶液洗脫至無(wú)色，再用50%~ 100%配比范圍的己醇水溶液洗脫至無(wú)色，收集該部分洗脫液，濃縮干燥，得到SangA粗提 物； (3) SangA粗提物進(jìn)一步精制；用含己臘的水溶液溶解SangA粗提物，上ODS柱分離， W 35%~100%配比范圍的己臘水溶液洗脫，收集該部分洗脫液，濃縮干燥，獲得SangA精制 物； W上"％"均指體積百分比。
[0008] 作為優(yōu)選的，所述提取溶媒的用量為桑枝葉體積的2~30倍。
[0009] 作為優(yōu)選的，步驟（1)所得到的桑枝葉濃縮液為0. 2~20g生藥/mL。
[0010] 作為優(yōu)選的，步驟（2)所述非極性大孔樹(shù)脂為D101、HPD100、XAD-l、H-20等，弱極 性大孔樹(shù)脂為 D101B、AB-8、CAD-40、D201、H-40、H-50 或 HPD100。
[0011] 作為優(yōu)選的，步驟（3)所述己臘水溶液的濃度為35%~100%。
[0012] W上所述的方法制備得到的SangA粗提物和/或SangA精制物在制備抗腫瘤藥 物、保健食品或抗腫瘤功能性食品中的應(yīng)用。
[0013] 所述抗腫瘤藥物、保健食品或抗腫瘤功能性食品中還含有藥學(xué)上可接受的輔料或 添加劑 所述輔料或添加劑為W下至少一種；藏糖、乳糖、糊精、淀粉、目-環(huán)糊精、居丙 基-目-環(huán)糊精、微晶纖維素、微粉硅膠、居丙基纖維素、駿甲淀粉鋼、交聯(lián)聚維麗、交聯(lián)聚己 帰化咯焼麗、阿斯帕坦、甜菊巧、香精、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸鎮(zhèn)、丙帰酸樹(shù)脂、半合 成脂肪酸脂，凡±林、液狀石蠟、吐溫-20、吐溫-80、卵磯脂、十二烷基硫酸鋼、甘油、明膠、 聚己二醇、聚維麗等。
[0014] 所述抗腫瘤藥物、保健食品或抗腫瘤功能性食品可W是片劑、膠囊劑、口服液、注 射劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、泡騰劑、合劑、糖漿劑、緩釋劑、控釋劑或祀向制劑等。
[0015] 所述腫瘤為各種腫瘤包括鼻咽癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌、大腸癌、卵巢 癌等。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 由本發(fā)明方法制備得到的SangA,經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定總黃麗重量百分含量為 30%-60%，重量為藥材重量的0. 5%-5%。經(jīng)系統(tǒng)分離后收集的各個(gè)分離條帶進(jìn)行稱(chēng)重，并進(jìn) 行質(zhì)譜及高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析，鑒定SangA的化學(xué)成分組成及化合物結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)SangA的主要成份組成為；桑辛素 D、桑辛素 E、桑辛素 G重量百分含量約0. 1%-7% ;桑 查耳麗B重量百分含量約0. 1%-3% ;桑辛素 P、桑辛素0重量百分含量約0. 1%-4% ;桑辛素 A 重量百分含量約0. 1%-6% ;桑辛素 C、桑辛素 S重量百分含量約0. 1%-2%。
[0017] 我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)SangA在較低濃度下即能顯著降低鼻咽癌、肺癌細(xì)胞中側(cè)群細(xì) 胞比例，說(shuō)明SangA具有顯著的抗腫瘤干細(xì)胞活性。通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞球技術(shù)， 我們發(fā)現(xiàn)SangA能明顯抑制腫瘤球的形成，形成的腫瘤球明顯小于對(duì)照組，而且形成的腫 瘤球數(shù)量也明顯減少，再次證明了 SangA具有顯著的抗腫瘤干細(xì)胞活性。體內(nèi)高致瘤能力 是判斷腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)，我們通過(guò)荷瘤裸鼠模型，評(píng)價(jià)了 SangA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的 抑制作用，發(fā)現(xiàn)SangA高、中劑量組能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)裸鼠的體重、活動(dòng)狀態(tài)等 無(wú)影響，未表現(xiàn)出任何毒副作用。將對(duì)照組、SangA治療組動(dòng)物腫瘤剝離，制成活細(xì)胞懸液， 再次接種在二代裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SangA治療組需要的成瘤時(shí)間更長(zhǎng)，腫瘤體積也更小。說(shuō) 明SangA在體內(nèi)也具有顯著抗腫瘤干細(xì)胞活性。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的研究，我們證明SangA具 有顯著的抗腫瘤干細(xì)胞的作用，可作為新的作用祀點(diǎn)藥物在抗腫瘤治療中發(fā)揮重大作用。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1 ;不同濃度SangA對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖的影響； 圖2 ;不同濃度SangA對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖的影響； 圖3 ;不同濃度SangA對(duì)宮頸癌化Ia細(xì)胞增殖的影響； 圖4 ;不同濃度SangA對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響； 圖5 =SangA對(duì)CNE-2中SP細(xì)胞比例的影響； 圖6 =SangA對(duì)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞形成腫瘤球的影響； 圖7 =SangA對(duì)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞形成腫瘤球數(shù)量的影響； 圖8 ;SangA不同劑量對(duì)荷鼻咽癌裸鼠腫瘤體積及體重的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。如無(wú)特殊說(shuō)明，W下 實(shí)施例中的"％"均指體積百分比。
[0020] 實(shí)施例1 桑枝葉活性部位的制備方法，步驟如下： (1)桑枝葉4kg，加20倍體積30%的己醇水溶液，浸潰化后，加熱回流提取2次，每次 1. 5h，過(guò)濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至原體積的1/10,加入75%己醇至含醇量50%，靜置過(guò) 夜，過(guò)濾，濾液再加入95%己醇至含醇量60%，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，減壓濃縮至IOg生藥/mL。
[0021] (2)利用DlOl大孔樹(shù)脂對(duì)桑枝葉濃縮液進(jìn)行分離純化。具體步驟為：取該桑枝 葉濃縮液適量，加入到已凈化好的大孔樹(shù)脂柱中，上樣量W生藥計(jì)與干樹(shù)脂質(zhì)量比例為1 ; 10,吸附平衡12h，用40%的己醇水溶液洗脫至無(wú)色，然后用100%己醇洗脫至無(wú)色，收集該部 分洗脫液，減壓濃縮干燥，得SangA粗提物約120g。
[002引（3)將SangA粗提物用50%己臘水溶液溶解，上ODS柱分離，然后用不同比例的己 臘水溶液進(jìn)行梯度洗脫：先W 35%的己臘水溶液洗脫，收集第2-8個(gè)條帶；然后W 50%的己 臘水溶液