涉及mRNA轉(zhuǎn)染的治療組合物和方法
【專利說明】涉及mRNA轉(zhuǎn)染的治療組合物和方法
[00011 政府基金
[0002] 本發(fā)明在NIH/NIDCR資助的基金號1R01DE021206的政府支持下完成。政府享有本 發(fā)明的某些權(quán)利。
[0003] 相關(guān)申請的交叉引用
[0004] 本申請要求2013年1月11日提交的美國臨時專利申請系列號61/751,504的優(yōu)先 權(quán)，其通過引用納入本文。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一個方面，本公開內(nèi)容描述一種抑制細(xì)胞增殖的方法。一般而言，所述方法包 括:將參與抑制細(xì)胞增殖的多肽的編碼mRNA引入上皮細(xì)胞，并允許所述細(xì)胞足量表達(dá)所述 多肽到能有效降低所述細(xì)胞在錨著非依賴性環(huán)境中增殖的可能性。在一些實施方式中，所 述多肽可包括:鈣衛(wèi)蛋白（與S100A9復(fù)合的S100A8;S100A8/A9)、S100A8或S100A9。
[0006] 在另一個方面，本公開文本描述一種抑制細(xì)胞感染的方法。一般而言，所述方法包 括將參與先天免疫中的多肽的編碼mRNA引入細(xì)胞，并允許所述細(xì)胞足量表達(dá)所述多肽到能 有效降低所述細(xì)胞被病原體感染的可能性。在一些實施方式中，所述多肽可包括普抑素 (cathelicin)抗微生物蛋白（CAMP)、鈣衛(wèi)蛋白、S1OOA8、S1OOA9、0-防御素、S100A7、分泌性 白細(xì)胞抑制劑、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2或溶菌酶。
[0007] 在上文概述的某一方面的一些實施方式中，所述mRNA可包括穩(wěn)定化部分，例如，5' 帽或3 '延伸。在一些實施方式中，所述細(xì)胞可以是粘膜上皮細(xì)胞。
[0008] 在另一個方面，本公開內(nèi)容描述一種組合物，所述組合物一般包含編碼多肽的 mRNA和體內(nèi)遞送載劑。
[0009] 在一些實施方式中，所述多肽可抑制上皮細(xì)胞增殖。在這些實施方式的一些中，所 述多肽可包括鈣衛(wèi)蛋白、S100A8或S100A9。
[0010] 在其它實施方式中，所述多肽可參與先天免疫。在這些實施方式的一些中，所述多 肽可包括普抑素抗微生物蛋白（CAMP)、鈣衛(wèi)蛋白、S100A8、S100A9、f3-防御素、S100A7、分泌 性白細(xì)胞抑制劑、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2或溶菌酶。在一些實施方式中，所述mRNA可包括穩(wěn)定化部 分，例如，5'帽或3'延伸。
[0011]上述歸納并不意在描述本發(fā)明的各個公開的實施方式或各個實現(xiàn)方式。下文的說 明內(nèi)容更具體地例舉說明性實施方式。在貫穿本申請的一些內(nèi)容處，通過一系列示例來提 供指導(dǎo)，這些示例可以不同組合應(yīng)用。在每種情況中，所述的列表僅表示代表性的組，并不 應(yīng)被解釋為窮舉列表。
[0012] 附圖簡要說明
[0013] 圖1.用ARCA-加帽的CAMP mRNA或CE加帽的CAMP mRNA轉(zhuǎn)染后的KB細(xì)胞的CAMP蛋白 表達(dá)。(A)KB細(xì)胞用ARCA、CE帽0或帽1 -加帽的CAMP mRNA轉(zhuǎn)染后的CAMP蛋白表達(dá)。上圖，代表 性的Western印跡。下圖，定量說明，其中，八小時的ARCA帽表達(dá)設(shè)置為100。采用材料和方法 中描述的Quantity One分析法進(jìn)行分析之后，采用若干加帽法轉(zhuǎn)染后的蛋白質(zhì)表達(dá)以相對 于IOO的方式表示。（B)在用ARCA-加帽的CAMP轉(zhuǎn)染后，隨時間變化的CAMP蛋白表達(dá)。如圖(A) 中所示，ARCA-加帽的CAMP mRNA轉(zhuǎn)染之后的CAMP蛋白表達(dá)采用Wes tern印跡(上圖）檢測，并 在下圖中以相對于八小時的水平(設(shè)為100)的方式表示。圖(A)和(B)中，誤差線顯示3~6個 獨立實驗的平均值土SD。
[0014] 圖2. KB細(xì)胞用ARCA-加帽的S100A8、S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA轉(zhuǎn)染 后的S100A8和S100A9蛋白質(zhì)表達(dá)。（A)用S100A8 mRNA轉(zhuǎn)染后的KB細(xì)胞S100A8蛋白質(zhì)表達(dá)， 采用Western印跡檢測（顯示代表性圖像)并如圖1中那樣定量。進(jìn)行相同的實驗以確定：用 S100A8/S100A9 mRNA共轉(zhuǎn)染后的KB細(xì)胞的（B)S100A9蛋白；（C)S100A8和S100A9蛋白的表達(dá) 時程；用A8-IRES-A9mRNA轉(zhuǎn)染后的KB細(xì)胞的（D)S100A8和S100A9蛋白質(zhì)的表達(dá)時程；和用 A8-nIRES-A9 mRNA轉(zhuǎn)染后的(E)S100A8和S100A9蛋白的表達(dá)時程。將mRNA轉(zhuǎn)染后8小時的蛋 白質(zhì)表達(dá)設(shè)置為100。誤差線顯示3~6個獨立實驗的平均值土SD。
[0015] 圖3. CAMP和鈣衛(wèi)蛋白mRNA增加對李斯特菌(Listeria)和沙門氏菌(Salmonella) 侵入的抗性。單層細(xì)胞用mRNA轉(zhuǎn)染(A)8小時、（B)24小時，（C)48小時，然后用單核細(xì)胞增多 性李斯特菌（1^.111〇11〇〇71:〇861168)厶1'(^ 104033以]\101100:1或鼠傷寒沙門氏菌 (S.typhimurium)ATCC 14028以MOI 1:1孵育兩小時。在24-小時或48-小時轉(zhuǎn)染之后，在八 小時分傳細(xì)胞，并在32小時之后再次分傳細(xì)胞，然后再孵育16小時?；畹陌麅?nèi)細(xì)菌的報告表 示為相對用載劑(PBS)擬轉(zhuǎn)染的KB細(xì)胞中的CFU(設(shè)為100 % )的百分?jǐn)?shù)平均值土 SD。誤差線 表明3~6個獨立實驗相對于八小時載劑對照的平均值土 SD^pW. 05。
[0016] 圖4. mRNA遞送降低細(xì)胞活力，但不觸發(fā)凋亡。（A)將mRNA構(gòu)建體mRNA遞送至KB細(xì) 胞之后的三天里，在指示時刻采用MTT試驗測定細(xì)胞活力。采用I 3BS擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照， 其活力設(shè)為1。各實驗一式三份進(jìn)行，重復(fù)至少兩次。（B)在mRNA遞送mRNA構(gòu)建體之后采用 Western印跡分析凋亡細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)顯示膜聯(lián)蛋白-V-FITC染色呈陽性的細(xì)胞被視 為凋亡的。在組A和B中，誤差線顯示3~6個獨立實驗的平均值土SDjpW.05X.在遞送mRNA 構(gòu)建體之后對PARP切割的Western印跡分析。采用PBS擬轉(zhuǎn)染的（載劑)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 作為對照。
[0017]圖5. KB細(xì)胞中的抗微生物mRNA持續(xù)最長達(dá)32小時。RNA采用Triz〇 1試劑（加利福 尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司（Life Technologies Corp.))和RNeasy plus小試劑盒 (加利福尼亞州瓦倫西亞的凱杰公司（Qiagen))分離?？俁NA用Superscript III(加利福尼 亞卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司）逆轉(zhuǎn)錄。采用PrimeTime預(yù)設(shè)計的qRT-PCR試驗進(jìn)行定量實 時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR) (Hs. PT. 42.1073747 用于人 CAMP，Hs. PT. 42.3682141 用于人 S100A8，Hs · PT · 42 · 3080635用于人S100A9，Hs · PT · 45 · 227970 · g用于人ACTB;愛荷華州科拉 爾維爾的綜合DNA技術(shù)公司（Integrated DNA Technologies)) <XAMP、S100A8、S100A9A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9 mRNA的表達(dá)水平對ACTB(0-肌動蛋白）mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。（A)CAMP mRNA轉(zhuǎn)染。（B)S100A8/S100A9 mRNA(mol/mol = l:l)共轉(zhuǎn)染。（C)A8-IRES-A9 mRNA轉(zhuǎn)染。（D) A8-nIRES-A9 mRNA轉(zhuǎn)染。A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9 mRNA用S100A9引物檢測。mRNA轉(zhuǎn)染之 后4小時的mRNA豐度被指為選定值100%。短線顯示3~6個獨立實驗的平均值土SD。
[0018]圖6. mRNA轉(zhuǎn)染之后的蛋白質(zhì)表達(dá)。（A)EGFP mRNA轉(zhuǎn)染16小時的免疫熒光顯微鏡 圖像。（B)CAMP mRNA轉(zhuǎn)染16小時的免疫熒光顯微鏡圖像。（C)S100A8/S100A9 mRNA(mol/mol =1:1)共轉(zhuǎn)染16小時，（D)A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9 mRNA轉(zhuǎn)染40小時的免疫熒光顯微鏡 圖像。載劑，PBS。標(biāo)尺=1 ΟμΜ。實驗進(jìn)行三次，顯示代表性圖像。
[0019] 圖7.人頭頸組織和癌細(xì)胞系中的S100A8和S100A9的表達(dá)。（A)正常癌旁組織(NAT) 和HNSCC組織，和（B) TR146HNSCC和KB細(xì)胞中的S100Α8和S100Α9的mRNA表達(dá)水平由qRT-PCR 檢測，并對GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化;點線顯示檢測閾值。分別匯集自三位患者中每一位的匹配NAT 和HNSCC組織提取的總RNA，用于基因表達(dá)分析。在約70%融合度時收獲并分析標(biāo)準(zhǔn)條件下 培養(yǎng)的細(xì)胞系。數(shù)據(jù)以平均值±30表示(n = 2)。與野生型和陰性轉(zhuǎn)染對照做比較的（C)KB-S100A8/A9轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的S100A8和S100A9的代表性免疫印跡，和(D)TR146-shRNA-S100A8/ A9敲減細(xì)胞中的S100A8和S100A9的代表性免疫印跡。采用β-肌動蛋白作為上樣對照，用于 在10 % SDS-PAGE凝膠中分離的免疫印跡分析。
[0020] 圖8. S100A8/A9抑制KB細(xì)胞的錨著依賴性生長和錨著非依賴性生長。（A)與KB-EGFP和KB野生型對照細(xì)胞相比較的KB-S100A8/A9細(xì)胞的生長曲線。每三天使細(xì)胞在無熱原 聚苯乙烯組織培養(yǎng)瓶上于補(bǔ)充有10%FBS的新鮮MEM中生長。（B)KB、KB-EGFP和KB-S100A8/ A9細(xì)胞在軟瓊脂中的錨著非依賴性生長（平均值土 SEM，*p〈0.03，n = 4)。TR146-shRNAS100A8/A9KD細(xì)胞相比TR146WT和TR146-shRNA-對照細(xì)胞的（C)組織培養(yǎng)瓶的完全培 養(yǎng)基中的錨著依賴性生長(平均值土 SD，*p〈0.02，η = 3)和(D)軟瓊脂上的集落形成(平均值 土SEM，***p〈0.0005，n = 2)。
[0021] 圖9. S100A8/A9表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞周期和G2/M期的有絲分裂阻滯。(A)同步后的KB、 KB-EGFP和KB-S100A8/A9細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。使標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)歷血清饑餓過 夜，通過阿非迪霉素處理同步在G1/S，并刺激以重新進(jìn)入細(xì)胞周期。同步的細(xì)胞用碘化丙啶 DNA染色溶液染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析G1/S阻滯釋放后的DNA含量的變化。（B)同步的細(xì) 胞用磷酸化組蛋白H3(SerlO)染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析來進(jìn)行有絲分裂分析。（C)處于 G2/M期細(xì)胞的百分比。分析KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9細(xì)胞同步后隨時間的變化，并以平 均值土SEM報告;n = 2個獨立實驗（各分析一式兩份進(jìn)行）；郵〈0.05。（0)同步后的有絲分裂 細(xì)胞百分比，以兩個獨立重復(fù)實驗的平均值顯示。KB-S100A8/A9細(xì)胞顯示較少的有絲分裂 細(xì)胞，因為其顯示較低的磷酸化組蛋白H3(SerlO)染色。
[0022] 圖10. S100A8/A9在SCC中調(diào)節(jié)G2/M細(xì)胞周期檢驗點的調(diào)控分子。通過免疫印跡分 析顯示細(xì)胞周期調(diào)控子的表達(dá)和磷酸化(活化/失活)狀態(tài)。顯示的數(shù)據(jù)代表多個獨立重復(fù) 實驗。山羊抗β-肌動蛋白多克隆IgG用來檢測β-肌動蛋白作為蛋白質(zhì)上樣對照。（A)KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9中G1/S調(diào)控蛋白、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白E、p21和Rb、Chk2和 Cdc25B的表達(dá)。在有或沒有S100A8/A9表達(dá)的任何細(xì)胞中均未檢測到p-Chk2的磷酸化 (Thr68)(未顯示）。（8)62/]?調(diào)控子、Chkl/p-Chkl(Ser345)、有絲分裂活性p-Cdc25C (Thr48)、Cdc25C/p-Cdc25C(Ser216)、Cdc2/p-Cdc2(Thrl4/Tyrl5)和細(xì)胞周期蛋白 BI 的表 達(dá)和磷酸化狀態(tài)。（C)用兔抗14-3-3β多克隆IgG捕獲的與14-3-3β免疫共沉淀（IP)的Cdc25C 蛋白的免疫印跡(IB)。還顯示總14-3-3β蛋白的免疫印跡。（D)野生型TR146(TR146WT)、對照 shRNA 轉(zhuǎn)染子(TR146-shRNA-對照）和 shRNA-誘導(dǎo)的 S100A8/A9 敲減（TR146-shRNA-S100A8/ A9KD)細(xì)胞中的 S100A8、S100A9、Cdc2 和 Cdc2-(Thrl4/Tyrl5)的蛋白質(zhì)水平。
[0023] 圖11. S100A8/A9與PP2A磷酸酶的相互作用增加活性。（A)通過免疫印跡（IB)檢 測，ΡΡ2ΑΑα/β與S100A8/A9復(fù)合物免疫共沉淀（IP)(與27E10抗體IP)或與S100A9亞基免疫共 沉淀（IP)(左圖），和S100A9(用作S100A8/A9復(fù)合物標(biāo)志物蛋白）與ΡΡ2Α-Αα/β亞基免疫共沉 淀。（B)采用IB檢測的，KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9細(xì)胞中的PP2A亞基蛋白質(zhì)表達(dá)、磷酸化 和甲基化的比較。顯示的印跡是10%SDS-PAGE凝膠中分離總蛋白裂解物的多個重復(fù)(η 2 3) 的代表。采用肌動蛋白作為蛋白質(zhì)上樣對照。
[0024] (C)KB-EGFP和KB-S100A8/A9細(xì)胞中的PP2A-C磷酸酶活性對A中所示與S100A8/A9 (27Ε10抗體)免疫共沉淀的可檢測ΡΡ2Α-Αα/β進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后進(jìn)一步對KB-EGFP水平進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)顯示為平均值土 S E (η = 2)。
[0025] #表示誤差線不可見。（D)用IOnM岡田酸(OA)抑制S100A8/A9-依賴性的p-Cdc25C磷 酸化(Ser216)。由IB檢測的無 OA(左圖）和有OA(右圖）存在下的p-Cdc25C表達(dá)。
[0026]圖12.如本報告中歸納提出的S100A8/A9(鈣衛(wèi)蛋白）-介導(dǎo)的G2/M細(xì)胞周期檢驗點 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。實線表示直接調(diào)控;虛線表示未知機(jī)制。
[0027]圖13. S100A8/A9的穩(wěn)定表達(dá)能減少口底腫瘤的生長。如實施例3中所述，將表達(dá) S100A8/A9的KB癌細(xì)胞和僅表達(dá)EGFP的偽轉(zhuǎn)染的KB-細(xì)胞注入不同組的健康小鼠的口底。 (A)截至第17天，由KB-S100A8/A9細(xì)胞在口底上形成的原位腫瘤比表達(dá)EGFP的KB細(xì)胞小 65 % (p〈0.03)。（B)相較于KB-EGFP細(xì)胞腫瘤，由KB-S100A8/A9細(xì)胞在口底上形成的腫瘤顯 著較小，并且對周圍組織的侵入性較低。（C)相較于類似尺寸的KB-S100A8/A9細(xì)胞腫瘤，KB-EGFP細(xì)胞腫瘤在組織學(xué)上（用蘇木精和曙紅染色)去分化程度更高，并且具有較大面積的壞 死。顯示的數(shù)據(jù)來自三個單獨實驗，其中每組三只小鼠。
[0028]圖14. S100A8/A9的穩(wěn)定shRNA敲減與較大口底腫瘤生長相關(guān)聯(lián)。TR146口腔癌細(xì) 胞用shRNA轉(zhuǎn)染以穩(wěn)定敲減內(nèi)源性S100A8和S100A9的表達(dá)。相較于偽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Neg3)，敲 減導(dǎo)致S100A8/A9蛋白表達(dá)減少約70%(A8A8cl0細(xì)胞）（數(shù)據(jù)未顯示）。截至第17天，用shRNA 敲減S100A8/A9的TR146細(xì)胞(A8A8clO細(xì)胞)形成的常位腫瘤比偽轉(zhuǎn)染的(Neg3)細(xì)胞大20% (p〈0.2)。顯示的數(shù)據(jù)來自兩個單獨實驗，其中每組三只小鼠。
[0029] 圖15.唾液濃度和處理時間對EGFP mRNA遞送進(jìn)入KB細(xì)胞的作用。細(xì)胞在37°C用 10 %、50 %或90 %唾液孵育(A) 1分鐘，（B)3分鐘，或(C)5分鐘，用新鮮培養(yǎng)基清洗三次，然后 與包裝的、修飾的編碼EGFP的mRNA孵育。用50 %唾液處理但未遞送mRNA的細(xì)胞用作對照。
[0030] 圖16. EGFP mRNA遞送進(jìn)入KB細(xì)胞:清洗頻率對唾液處理的反作用的影響。細(xì)胞用 90 %唾液處理3分鐘，以指示頻率用新鮮培養(yǎng)基清洗，然后進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)染。
[0031] 說明性實施方式的詳述
[0032] 本公開內(nèi)容涉及的組合物和方法參與將mRNA引入細(xì)胞使得所述細(xì)胞表達(dá)一種或 多種多肽，所述一種或多種多肽能降低該細(xì)胞功能異常和/或易于受病原體感染的可能性 和/或程度。因此，所述方法和組合物能夠提供針對因感染所致的病癥(包括，例如，感染性 疾病和某些腫瘤)的治療。一旦被引入細(xì)胞，只有所述mRNA能在目標(biāo)細(xì)胞中被翻譯時所述多 肽才得以表達(dá)一一即，表達(dá)是瞬時的，不是永久的。如果所述細(xì)胞形成可被接觸的目標(biāo)組 織，則可重復(fù)地重新引入所述mRNA，以實現(xiàn)持續(xù)的治療益處。
[0033] 粘膜上皮細(xì)胞提供抵御微生物侵入的第一道防線?？谇缓推渌衬ど掀ぜ?xì)胞通過 細(xì)胞自發(fā)機(jī)制來提供抵抗侵入性細(xì)菌的保護(hù)，所述細(xì)胞自發(fā)機(jī)制利用兩種效應(yīng)子抗微生物 肽(AMP):胞漿中的鈣衛(wèi)蛋白（S100A8/S100A9雜二聚體)和內(nèi)含體中的普抑素抗微生物蛋白 (CAMP)。為了研究先天免疫是否有可能被良性增強(qiáng)，我們用優(yōu)化的mRNA構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染上 皮細(xì)胞，所述mRNA構(gòu)建體包含CAMP、S100A8和S100A9開放閱讀框，A8-IRES-A9(融合），或A8- nIRES-A9(融合，天然IRES)。為了維持mRNA的穩(wěn)定性，用抗反向帽類似物(ARCA)加帽的CAMP mRNA比加帽酶(CE)帽O(jiān)或CE 1更加有效。CAMP、S100A8和S100A9蛋白質(zhì)水平一般在mRNA轉(zhuǎn)染 后16小時成峰。相比地，用S100A8/S100A9共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的最大蛋白質(zhì)表達(dá)在24小時。在用串 聯(lián)mRNA(A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9)轉(zhuǎn)染之后，S100A8蛋白質(zhì)水平在16小時最大，而S100A9 在32小時~40小時成峰。用相應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)染之后，CAMP和鈣衛(wèi)蛋白各自顯著增加上皮細(xì)胞 抵御李斯特菌和沙門氏菌侵入的抗性長達(dá)48小時；S100A8/S100A9的共轉(zhuǎn)染比串聯(lián)構(gòu)建體 更為有效。所述轉(zhuǎn)染使細(xì)胞活力在48小時之后降低20%，其中僅有2%歸因于凋亡?？傮w來 看，這些結(jié)果表明，上皮細(xì)胞對于侵入性病原體的抵抗可通過瞬時轉(zhuǎn)染抗微生物mRNA進(jìn)入 上皮細(xì)胞來增強(qiáng)。
[0034] 人CAMP是表達(dá)于多個物種中的陽離子抗微生物肽的大家族中的成員，其針對細(xì) 菌、真菌和包膜病毒具有廣譜活性，并且還顯示免疫調(diào)節(jié)作用（Zanetti， 2004.J.Leukoc.Biol·75:39-48;Bucki等，2010.Arch.Tmmunol·Ther.Exp·(Warsz)·15-25; Strandberg等，2012 · Infect · Immun · 80: 3930-3938; Bur ton等，2009 .Nat · Prod · Rep · 26: 1572-1584)。在截除信號肽之后，由CAMP編碼的人CAP-18前體被儲存在嗜中性顆粒和上皮 細(xì)胞中，直到通過蛋白酶3(絲氨酸蛋白酶)切割而被激活（Sorensen等，2001 .Blood 2001， 97 :3951-3959)。該37個殘基的活性肽(LL-37)介導(dǎo)多種生物反應(yīng)，例如，微生物的直接殺 傷、趨化現(xiàn)象和趨化因子誘導(dǎo)、炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，以及佐劑、血管生成和創(chuàng)傷愈合作用 (Nijnik等，2009 .Curr .Opin .Hematol .16:41-47)。讓-37在嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞 噬溶酶體中，和急性炎癥位點處，看來具有直接抗微生物作用（N i j n i k等， 2009 · Curr · Opin · Hematol · 16:41-47 )，顯示具有針對以下微生物的廣譜抗微生物活性:單 核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes) (Turner等，1998 .Antimicrob .Agents Chemother .42:2206-2214)、鼠傷寒沙門氏菌（Sa lmonel la typhimurium) (Larrick 等， 1995 · Immunotechnology 1:65-72)，和A、13和(]組鏈球菌（Streptococcus) (Dorschner等， 2001. J. Invest. Dermatol. 117:91-97) XAMP表達(dá)可由如下因素誘導(dǎo)：1，25-二羥基維生素 D3(Wang 等，2004 · J. Immunol · 173 : 2909-2912)、病原體（Midorikawa 等， 2003. Infect. Tmmun · 71:3730-3739;Ni jnik等，2009 · Curr · Opin .Hematol · 16:41-47)，或脂 多糖（LPS) (Nel 1等，2004·FEMS Immunol ·Med·Microbiol · 42:225-231) XAMP/LL-37生成的 減少伴以疾病中上皮細(xì)胞中病原體的侵入和定殖增加，所述疾病例如，疾病性科氏和帕-勒 氏綜合征（Carlsson等，2006 .J.Periodontol · 77 : 744-751 ;de Haar 等， 2006 . Infect. Tmmun · 74: 5284-5291 )、克羅恩氏病（Schauber等，2006. Mol. Nutr .Food Res .50:1006-1012)和特應(yīng)性皮炎(Ong 等，2002. N.Engl. J.Med. 347:1151-1160)。
[0035] 鈣衛(wèi)蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100A8(MRP8或鈣粒蛋白A，10.8kDa)和S100A9(MRP14或鈣 粒蛋白B，13 · 2kDa)的異質(zhì)二聚體復(fù)合物（Champaiboon等，2009 · J·Biol · Chem. 284: 7078-90)<^100Α8和S100A9是蛋白質(zhì)SlOO家族的成員。家族成員包含兩個EF-手型鈣結(jié)合基序，并 且所述蛋白質(zhì)參與細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞存活、蛋白質(zhì)磷酸化、轉(zhuǎn)錄、癌 癥發(fā)展和炎性疾?。―onato，2001 · Int · J·Biochem. Cell Biol · 33:637-668; Santamaria-Kisiel等，2006.Biochem.J.396:201-14;Khammanivong等，2013.PL〇S One 8:e 69395)。所 述媽結(jié)合基序看來參與上皮細(xì)胞對細(xì)菌侵入的抵抗（Champaiboon等， 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90)。鈣衛(wèi)蛋白顯示針對粘膜和表皮的白色念珠菌（Candida a Ibi cans)和細(xì)菌的廣譜抗微生物活性，所述細(xì)菌包括：生痰二氧化碳噬纖維菌 (Capnocytophaga sput i gena )、大腸桿菌（Escher i ch ia coli)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermis)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes)、鼠 傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)和牙銀B卜啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)(Champaiboon等，2009.J.Biol.Chem.284:7078-90;Miyasaki等， 1993·J.Dent·Res·72:517-523;SohnIe等，199l.J.Infect.Dis.163:187-192;Steinbakk 等，1990·Lancet 336:763-765;Nisapakultorn等，2001