無(wú)腦回癥
[0151] 嗜中性粒細(xì)胞免疫缺乏綜合征
[0152] I型糖尿病
[0153] Tourette 綜合征
[0154] 18p染色體四體性(Tetrasomy 18p)
[0155] 高IgE綜合征
[0156] Ange Iman 綜合征
[0157] I型糖尿病
[0158] Rett 綜合征
[0159] 脆性X染色體
[0160] Marf an 綜合征 [0161 ] Waardenburg 綜合征
[0162] 谷胱甘肽合成酶缺陷
[0163] I型糖尿病
[0164] Rubinstein-Tayb
[0165] Ange Iman 綜合征
[0166] Klinefelter 綜合征
[0167] 出生時(shí)腦出血(Brain bleed at birth)
[0168] Turner 綜合征
[0169] 甲狀腺機(jī)能減退
[0170] I型糖尿病
[0171] 早產(chǎn)兒的腦損傷（Brain damage of prematurity)
[0172] -個(gè)方面中，可使用糞胰凝乳蛋白酶水平測(cè)試來(lái)進(jìn)行酶缺陷的確定。方法例如PCR 或其他擴(kuò)增、SNP檢測(cè)、測(cè)序和/或DNA梳可用于檢測(cè)突變的存在或干擾編碼消化酶的一種或 多種基因的表達(dá)的短RNA序列的存在。例如，突變可以存在于編碼消化酶的基因中，其降低 或消除酶活性。作為另一個(gè)實(shí)例，突變可以是MET基因中的突變，所述MET基因是編碼多效性 MET受體酪氨酸激酶的基因，參見(jiàn)Campbell等，PNAS 103(46) ,16834-39(2006)。這些突變例 如可以包括MET啟動(dòng)子變異體rsl858830C等位基因，和或MET信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如SERPINE 1 基因的單體型)或rs 344781PLAUR啟動(dòng)子變異體T等位基因中的突變。
[0173] 本發(fā)明的酶制劑適合用于將消化酶遞送給患有孤獨(dú)癥、ADD、ADHD、帕金森氏病及 需要酶治療的其他神經(jīng)疾病或病癥的個(gè)體。Fallon描述了用于治療患有孤獨(dú)癥、ADD、ADHD、 帕金森氏病及其他神經(jīng)疾病或病癥的兒童及其他個(gè)體的某些方法和酶組合物，例如美國(guó)專 利如.7，138，123、6,660,831、6,632,429、6,534,063，其以引用方式合并于此，好像以全文 公開(kāi)于此一樣。
[0174] 現(xiàn)在參考附圖和實(shí)施例更完整地描述本發(fā)明，所述附圖和實(shí)施例旨在結(jié)合發(fā)明內(nèi) 容、發(fā)明詳述和具體討論或另外公開(kāi)的任何優(yōu)選和/或特定實(shí)施方式一起閱讀。然而，本發(fā) 明可以許多不同形式實(shí)施，并不應(yīng)視為限于本文所給出的實(shí)施方式;相反，這些實(shí)施方式僅 以舉例方式提供，因此本發(fā)明是全面和完整的，并將將本發(fā)明全部范圍完全傳達(dá)給本領(lǐng)域 技術(shù)人員。
[0175] 在本文所描述的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)若干因素提供意外提高/增強(qiáng)的功效和性能。例如， 發(fā)現(xiàn)包含大豆油的特定包封酶制劑顯示某些令人驚訝的特征，所述特征導(dǎo)致位點(diǎn)-特異性 的活性、釋放/溶解分布以及易于制備、包裝和貯存。不束縛于具體操作原理，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)理解，本發(fā)明還包括也能產(chǎn)生這些有利參數(shù)的樣品制備和/或配制的其他方法。
[0176] 以下實(shí)驗(yàn)描述了本發(fā)明的典型過(guò)程。應(yīng)理解，這些實(shí)驗(yàn)和相應(yīng)結(jié)果僅以舉例形式 闡明，且其中的任何內(nèi)容不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明總體范圍的限制。通過(guò)舉例形式，這些研究證明 通過(guò)本發(fā)明的示例性包封酶制劑實(shí)現(xiàn)的一些出人意外的進(jìn)步。
[0177] 實(shí)施例1:示例的包封消化酶制劑的更高流動(dòng)性和傾倒性
[0178] 使用本發(fā)明的示例性方法和制劑之前，未加工的粗酶制劑(Scientific Protein Laboratories(SPL)of Wanakee，WI)的檢驗(yàn)顯示其在粒徑和不規(guī)則形態(tài)方面包含明顯的變 異性，如圖1所顯示的顆粒電子顯微照片所示。也可見(jiàn)一些晶體鹽顆粒。粗酶無(wú)法傾倒，因?yàn)?其結(jié)塊且由于不平坦的表面和鋸齒狀邊緣而難以測(cè)量。不經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工，粗制劑也不適 合于脂質(zhì)包封，因?yàn)榇之a(chǎn)品同時(shí)包含對(duì)于適當(dāng)包封而言太大和太小的顆粒。篩分的酶(盡管 粒徑更均勻)繼續(xù)顯示不平坦的表面以及傾倒時(shí)結(jié)塊。
[0179]圖2顯示過(guò)篩且用脂質(zhì)包覆原料后制備的包衣的酶制劑。該實(shí)施例中，顆粒的形態(tài) 明顯改善，具有更圓形的表面。這形成具有良好流動(dòng)性和感官性能的非粉末狀產(chǎn)物。
[0180] 由于表面的圓化，酶的形態(tài)目前極大地改善，這形成較少粉末性的、不霧化且具有 良好流動(dòng)性和改善的感官性能的產(chǎn)物。
[0181] 粗酶制劑的粒徑分布顯示于圖3的曲線圖中。通常，較大顆粒(MO目）和極小顆粒 (〈140目）不適于適當(dāng)包封。為了增加包封的胰酶制劑的流動(dòng)性，可使粗酶顆粒過(guò)篩，以僅包 括粒徑為40-140目，或約106到425微米的顆粒。
[0182] 實(shí)施例2:示例性包封消化酶制劑的穩(wěn)定性:溫度儲(chǔ)存
[0183] 在另一示例性實(shí)施方式中，多種類型和重量百分比的脂質(zhì)用于包覆過(guò)篩的酶核 心。當(dāng)選擇用于胰酶的適當(dāng)脂質(zhì)包衣時(shí)，考慮了包括機(jī)械強(qiáng)度、熔點(diǎn)和疏水性的性質(zhì)。以下 檢驗(yàn)了脂質(zhì)包衣的多個(gè)實(shí)例，且在25°C和40°C下檢驗(yàn)其物理外觀。因此，評(píng)估具有多種物理 性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、熔點(diǎn)和疏水性的脂質(zhì)用于胰酶的包覆。在該實(shí)施例中，據(jù)發(fā)現(xiàn)包衣的熔點(diǎn) 降低或親水性增加不適合用于包封，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致在加速儲(chǔ)存穩(wěn)定性條件下結(jié)塊的產(chǎn)物。 使用氫化大豆油、氫化蓖麻蠟和棕櫚蠟制備的過(guò)篩和包封的酶制劑全部顯示良好的傾倒性 且不發(fā)生結(jié)塊。
[0184] 表1提供在25°C和40°C下出現(xiàn)的可見(jiàn)物理變化的結(jié)果：
[0185]
[0186] 氫化單酸甘油酯和大豆油/單酸甘油酯混合物在較高溫度下都顯示結(jié)塊。因此很 明顯，熔點(diǎn)較低或親水性較高的包衣不適于包封，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致在延期儲(chǔ)存條件下結(jié)塊的 產(chǎn)物，如我們的在40攝氏度下的加速儲(chǔ)存條件測(cè)試所證實(shí)的。
[0187] 氫化單酸甘油酯和大豆油/單酸甘油酯混合物在較高溫度下都顯示結(jié)塊。因此很 明顯，降低包衣的熔點(diǎn)或提高親水性不適于包封，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致在延期儲(chǔ)存條件下結(jié)塊的 產(chǎn)物，如我們的在40攝氏度下的加速儲(chǔ)存條件測(cè)試所證實(shí)的。
[0188] 實(shí)施例3:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:隨穩(wěn)定性變化測(cè)定的酶活性。
[0189] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，按照以下方法測(cè)定酶穩(wěn)定性：對(duì)于加速試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn) ICH指南:將包衣制劑置于儲(chǔ)存在40°C和75%相對(duì)濕度的濕度控制箱中的塑料容器中。通過(guò) 研磨包衣的酶制劑、分散在適當(dāng)?shù)木彌_液中并測(cè)試脂肪酶活性來(lái)測(cè)定酶活性。
[0190] 表2:當(dāng)在40°C/75 % RH的密閉容器中儲(chǔ)存時(shí)包封酶的百分穩(wěn)定性
[0192]如上表2所概括的數(shù)據(jù)所表明的，所有脂質(zhì)中，大豆油80%似乎賦予最高的穩(wěn)定 性，意外地，儲(chǔ)存在加蓋容器中的酶制劑的效果高于儲(chǔ)存在未加蓋容器中的酶制劑。儲(chǔ)存在 40°C的敞開(kāi)盤中的酶制劑的75%相對(duì)濕度穩(wěn)定性測(cè)試在包衣和未包衣制劑之間未顯示顯 著的穩(wěn)定性差異。
[0193] 實(shí)施例4:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:多種大豆油包封的胰酶的酶活性和 釋放速率
[0194] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，按照如下所述方法制備包封物。使粗酶原料過(guò)篩以獲得 小于40目但大于140目的顆粒，從而去除極細(xì)顆粒，并獲得更適于腸溶包衣的更加均勻的混 合物。
[0195] 制備了以下制劑：
[0196] 70 %重量活性酶，具有標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定的大豆油包衣；
[0197] 80%重量活性酶，具有標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定的大豆油包衣;和
[0198] 90%重量活性酶，具有標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定的大豆油包衣。
[0199] 通過(guò)研磨包封物、將磨碎的材料分散在適當(dāng)?shù)木彌_液中并測(cè)試脂肪酶活性來(lái)測(cè)定 各包封酶制劑的活性。
[0200] 如圖4所示，在包覆后的包衣制劑中的酶活性沒(méi)有顯示任何明顯的活性損失（從 110降低到100%，相對(duì)于粗酶原料規(guī)定的酶活性標(biāo)準(zhǔn)化）。
[0201 ] 通過(guò)將各包封物懸浮在pH 6.0緩沖液的溶解裝置中30、60和90分鐘（IOOrpm，按照 USP指南)來(lái)測(cè)定酶釋放。如圖5所示，所有的包封物在30和60分鐘顯示80-90 %的釋放。在90 分鐘，由這些制劑得到的測(cè)量酶活性降低。
[0202]實(shí)施例5:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:多種大豆油包封的胰酶的粒徑 [0203]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，用大豆油包封的含有70%或80%重量活性胰酶的制劑與 粗胰酶原料進(jìn)行粒徑比較，如圖6所示。
[0204] 所有水平的脂質(zhì)顯示對(duì)粒徑的影響。80%PEC顯示為最均勻，因?yàn)闆](méi)有出現(xiàn)在200 目水平。
[0205]實(shí)施例6:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:氣味和味道 [0206] 對(duì)含有70%、80%和90%重量酶的示例性包封酶制劑進(jìn)行檢測(cè)，以確定其與 Sucanat?和紅糖相比、以及與粗酶相比的味道和氣味。結(jié)果顯示于下表4中。Sucanat?是有 機(jī)全食品甜味劑。
[0207]表4:
[0209] 實(shí)施例7 :適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:制備
[0210] 概括了用于制備本發(fā)明酶制劑的制備過(guò)程的流程圖顯示于圖7中。
[0211] 用于制備一批示例性包封胰酶制劑的組分包括20.0 lb.的過(guò)篩胰酶和5. Olb.的氫 化植物油，例如大豆油。
[0212] 胰酶濃縮物首先通過(guò)40USSS目篩過(guò)篩，并保留通過(guò)該篩的原料。然后所保留的原 料通過(guò)140USSS目篩(或相當(dāng)?shù)模┖Y選，并保留沒(méi)有通過(guò)該篩的原料作為過(guò)篩的胰酶原料或 顆粒。
[0213] 在包封過(guò)程中，將適當(dāng)?shù)陌虏牧涎b入熔融鍋中，升溫并保持在110°F用于噴涂過(guò) 程。可以使用在噴涂過(guò)程中提供適當(dāng)稠度的任何溫度。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步基于用于 包衣中的脂質(zhì)的熔點(diǎn)選擇溫度，和/或以使在與過(guò)篩胰酶原料或顆粒與包衣接觸后，酶制劑 活性保持大致相同。
[0214] 稱重液化的包衣材料并轉(zhuǎn)移到噴涂鍋。將過(guò)篩胰酶添加到包封制備容器中。用包 衣材料包封胰酶顆粒達(dá)到選定的包覆水平。
[0215] 包封的材料用14USSS目篩(或相當(dāng)?shù)模┖Y選，并保留通過(guò)該篩的材料。過(guò)篩后，收集 該材料，并聚樣品用于QC。
[0216] 如果混合兩個(gè)子批次產(chǎn)物，則將加載的過(guò)篩材料添加至適當(dāng)?shù)幕旌掀髦胁⒒旌? 到10分鐘。獲得用于成品測(cè)試的樣品。包封原料散裝并隔離放置等待測(cè)試結(jié)果(quarantine pending test results)。一旦達(dá)到認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)，成品由質(zhì)量組釋放。然后，可以如所指示的運(yùn) 送產(chǎn)品。
[0217] 收集樣品用于成品測(cè)試，包括分析測(cè)試和微生物分析，其可以隨時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。
[0218] 實(shí)施例8:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:包裝
[0219]在又另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，酶穩(wěn)定性部分地由于包封，部分地由于三層箱 包裝。以下顯示用于單劑量扁囊/藥袋的包裝過(guò)程。
[0220]首先，制備之后，產(chǎn)品送入雙重內(nèi)襯食品級(jí)聚乙烯袋的干凈圓筒中，且密封所述圓 筒。如果滿足規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，則從隔離釋放該批產(chǎn)品，然后該材料運(yùn)送到適當(dāng)?shù)陌b機(jī)用于裝入 扁囊中，從而用于以單獨(dú)劑量給予患者。
[0221] 例如，使用由26#C1S紙/7.5#LDPE/.0007〃鋁箱/15#組成的具有Surlyn內(nèi)襯的H)-73272 Printed Child Resistant(CR)小袋進(jìn)行包裝。優(yōu)選預(yù)印的薄膜/箱，外部印刷使用 白底上的1種顏色視覺(jué)標(biāo)記(eye-mark)，而批號(hào)、有效日期和產(chǎn)品碼的在線印刷也使用1種 顏色，黑色?？傮w扁囊尺寸是:W 2.50"x H 3.50"。扁囊尺寸適于容納900mg的胰脂肪酶脂 質(zhì)-包封藥品產(chǎn)物的顆粒到單位劑量小袋/扁囊中，容差為± 10%。成品具有不低于156USP 單位/mg的蛋白酶活性。
[0222] 實(shí)施例9:適合胰酶的示例性包封消化酶制劑:溶出
[0223] 使用具有不同脂質(zhì)包衣水平（表示為％脂質(zhì)包衣/總顆粒重量）的顆粒研究胰酶 (Pancreatase)從大豆油的脂質(zhì)包封顆粒中釋放的效果。包衣水平從10 %到30 %。在該范圍 內(nèi)脂質(zhì)包衣對(duì)60分鐘時(shí)間內(nèi)在水性環(huán)境中胰酶從顆粒的釋放沒(méi)有明顯作用。開(kāi)始溶出后所 有制劑在前30分鐘內(nèi)釋放超過(guò)80%的酶。90%、80%和70%顆粒的60分鐘最大釋放量分別 為 85%、88% 和 83%。
[0224] 實(shí)施例10:用于治療孤獨(dú)癥的示例性酶遞送系統(tǒng)
[0225] 基于其釋放曲線選擇70 %-90 %包封的胰酶制劑(活性酶重量），為適于酶在其中 發(fā)生蛋白酶成分的蛋白消化的近端小腸中釋放。
[0226] 選擇大豆油作為脂質(zhì)包衣，因?yàn)槠淙鄙俚鞍壮煞郑蚁鄳?yīng)缺少抗原性，從而減少或 消除患有孤獨(dú)癥的治療患者和兒童對(duì)脂質(zhì)包衣發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的可能性。
[0227] 70-90%制劑的使用提高了可傾倒性和流動(dòng)性，同時(shí)減少霧化，這使得可以使用扁 囊或藥袋遞送系統(tǒng)。
[0228]三層箱外殼的添加確保噴淋制劑是穩(wěn)定、可運(yùn)輸?shù)模覍⑼ㄟ^(guò)單一單位劑量機(jī)制 遞送。
[0229] 低脂肪酶制劑也通過(guò)降低結(jié)腸狹窄的可能性使其更安全，并增強(qiáng)酶的蛋白酶部分 的利用。
[0230] 表5: LUMINENZ-AT包封消化酶制劑的組成，900mg扁囊
[0232]藥物物質(zhì)、胰酶濃縮物(豬源)從適當(dāng)?shù)墓?yīng)商處購(gòu)買。適合用于本發(fā)明產(chǎn)品中的 胰酶濃縮物(胰酶/胰脂肪酶)的性質(zhì)描述于下表中。
[0234] *如果蛋白酶低于75U/mg，脂肪酶低于6U/mg或淀粉酶低于75U/mg，則規(guī)格是NMT 3.0%〇
[0235] 表 6
[0236] 氫化植物油(大豆油）的規(guī)格
[0237] 物理外觀和感官特征：
[0238] 原料以薄片或粉末形式提供，不含異物和令人討厭的氣味。

[0241] 表 7
[0242] 工作標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋劑、流動(dòng)相B和安慰劑的色譜圖顯示對(duì)標(biāo)準(zhǔn)峰無(wú)干擾(參見(jiàn)色譜 圖，圖9)。分析安慰劑和活性片劑組成在表8中給出。
[0244] 表 8
[0245] 通過(guò)在安慰劑基質(zhì)存在下分析標(biāo)準(zhǔn)濃度的若干樣品水平來(lái)評(píng)估方法線性。這些水 平是50 %、70 %、100 %、130 %和150 %。各樣品的三個(gè)注射用于計(jì)算該水平的平均響應(yīng)(面 積/濃度）。然后計(jì)算產(chǎn)生的響應(yīng)比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及平均峰面積相對(duì)濃度的最小二乘線 性回歸統(tǒng)計(jì)(參見(jiàn)表9和10)。圖10給出帶有線性回歸線的平均峰面積相對(duì)濃度的曲線圖。
[0246] 表 9
[0247]
[0250] 實(shí)施例11:孤獨(dú)癥的生化生物標(biāo)志物以及行為核心和非核心癥狀
[0251] 孤獨(dú)癥兒童中消化酶缺陷之間的相關(guān)性在基于臨床(行為)癥狀診斷為患孤獨(dú)癥 的兒童中確定。這一相關(guān)性也在診斷為患孤獨(dú)癥和遺傳共病的兒童中研究。最初發(fā)現(xiàn)孤獨(dú) 癥兒童顯示自我強(qiáng)加的蛋白質(zhì)飲食限制后，進(jìn)行了表明糞胰凝乳蛋白酶(FCT)的異常低水 平用作孤獨(dú)癥的生物標(biāo)志物的研究。
[0252] 另外，也基于生物標(biāo)志物測(cè)量和臨床癥狀確定對(duì)胰酶替代作出響應(yīng)的孤獨(dú)癥患者 的數(shù)目。檢測(cè)了胃腸系統(tǒng)的變化以及孤獨(dú)癥核心癥狀的變化。下表提供多個(gè)基于醫(yī)師的位 置進(jìn)行的研究的綜述。
[0253] 表11 研究號(hào) 受試者總數(shù) 孤獨(dú)癥 非孤獨(dú)癥 1 9 9 2 26 26 3 46 25 21 4 54 54 Γ ? 5 463 266 197
[0254] 6 320 64 256 7 33 33 8 42 25 17 9 68 68 10 225 225 11 175 175
[0255] 初步觀察是基于觀察到幾乎所有患孤獨(dú)癥兒童的自我強(qiáng)加的飲食限制。然后進(jìn)行 了多個(gè)研究以評(píng)估孤獨(dú)癥兒童消化蛋白質(zhì)的能力。蛋白質(zhì)消化的生理學(xué)研究引起對(duì)胃腸系 統(tǒng)的消化酶級(jí)聯(lián)的檢測(cè)，