葉乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)。因此，對(duì)乙酸乙酯部位進(jìn)行了進(jìn)一 步分離純化。取乙酸乙酯部位l〇g，用硅膠IOg拌樣，上100g硅膠柱，依次用石油醚300mL，石 油醚：丙酮（100 :1)溶液300mL，石油醚：丙酮（50:1)溶液300mL，石油醚：丙酮（10:1)溶液 500mL，石油醚：丙酮（2:1)溶液300mL，石油醚:丙酮（1:1)溶液300mL，丙酮IOOmL洗脫，通過(guò) 薄層色譜分析比較，合并相似組分，得A-H 8個(gè)組分。對(duì)其中組分D進(jìn)行多次連續(xù)的硅膠柱層 析分離，利用葡聚糖凝膠進(jìn)行純化，重結(jié)晶得到化合物芒柄花素。對(duì)其中組分E進(jìn)行多次連 續(xù)的硅膠柱層析分離，利用葡聚糖凝膠進(jìn)行純化，得到化合物染料木素。
[0033]利用核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜，鑒定這兩個(gè)活性成分分別為芒柄花素(Formononetin) 和染料木素(Genistein)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0035]其波譜結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下：
[0036] 芒柄花素：無(wú)色針狀晶體。ESI-MS給出[M+H]+m/z 269.0805</Η-MMR(400M，DMS0-d6)S:8.34(lH，s，H-2)，7.97(lH，d，J = 8.0Hz，H-5)，7.51(2H，d，J = 8.0Hz，H-2'，H-6'）， 6.98(2H，d，J = 8 .OHz，H-3'，H-5'），6.93( lH，dd，J = 8.0,4 .OHz，H-6) ,6.87( lH，d，J = 4.0Hz，H-8)，3.79(3H，s，4'-0CH3)。
[0037] 染料木素：無(wú)色針狀晶體。ESI-MS給出[M+H]+m/z 271.0440</Η-MMR(400M，DMS0-d6)S:12.96(lH，s，5-OH)，10.88(lH，s，7-OH)，9.58(lH，s，4'-OH)，8.32(lH，s，H-2),7.38 (2H，d，J=12.0Hz，H-2'，H-6'），6.82(2H，d，J = 12.0Hz，H-3'，H-5'），6.39(lH，brs，H-8)， 6.23(lH，brs，H-6)。
[0038] 將活性化合物進(jìn)行降糖活性測(cè)試，方法同實(shí)例2,活性結(jié)果見(jiàn)表2。
[0039]表2活性化合物抑制α-葡萄糖苷酶1(：50值
[0041]飲食中的碳水化合物在葡萄糖苷酶的作用下，釋放葡萄糖并經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血 液，是餐后血糖升高的主要原因。餐后血糖升高可引起胰島素敏感性降低并導(dǎo)致嚴(yán)重的并 發(fā)癥。因此，α-葡萄糖苷酶活性的調(diào)節(jié)控制，可延緩碳水化合物的消化和吸收，起到降低餐 后血糖和糖化血紅蛋白，降低血糖波動(dòng)，防治糖尿病并發(fā)癥的作用。
[0042]從表1中可知，本發(fā)明所制備的紅三葉不同提取物均具有明顯的抑制α-葡萄糖苷 酶活性。其中乙酸乙酯部位活性最高。通過(guò)活性跟蹤分離發(fā)現(xiàn)，紅三葉降糖活性成分為芒柄 花素和染料木素(表2)，其中染料木素的活性高于對(duì)照20倍以上。
[0043]本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，所利用的植物資源豐富，開(kāi)發(fā)成本低，而且效果明顯好于對(duì)照， 不易產(chǎn)生抗藥性，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0044]最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種紅三葉提取物的制備方法，包括將紅三葉組織用有機(jī)溶劑超聲或加熱回流提 取。其特征在于，紅三葉提取物的制備方法由以下步驟完成： 1) 紅三葉提取物的制備； 采集新鮮紅三葉植物組織，陰干粉碎后，加入乙醇水溶液，超聲或加熱回流提取，重復(fù) 提取2-4次，提取液減壓濃縮，然后在通風(fēng)避光處風(fēng)干，制得紅三葉提取物。 2) 紅三葉不同活性部位的制備 a. 紅三葉石油醚部位萃取物的制備:將紅三葉提取物用水溶解，再加入石油醚，劇烈振 蕩，靜置分層，上清液為石油醚層，下層水溶液用石油醚重復(fù)萃取2-5次，合并石油醚層，減 壓濃縮，制得紅三葉石油醚部位； b. 紅三葉乙酸乙酯部位萃取物的制備：石油醚萃取后的水溶液中加入乙酸乙酯，劇烈 振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層水溶液用乙酸乙酯重復(fù)萃取2-5次，合并乙酸乙 酯層，減壓濃縮，制得紅三葉乙酸乙酯部位。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅三葉提取物的制備方法，其特征在于，所述乙醇水溶 液，加入量是干粉體積的5-50倍，乙醇水溶液濃度為20-lOOwt%;超聲或加熱回流提取10-90分鐘。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅三葉提取物的制備方法，其特征在于： 所述步驟2)的步驟a中，紅三葉提取物用其2-50倍體積的蒸餾水溶解;加入紅三葉提取 物溶液2-10倍體積的石油醚。 所述步驟2)的步驟b中，石油醚萃取后的水溶液中加入該溶液2-10倍體積的乙酸乙酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅三葉提取物的制備方法，其特征在于，減壓濃縮時(shí)溫度 低于40°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅三葉提取物的應(yīng)用，其特征在于:該提取物對(duì)于糖尿病 防治有效。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種紅三葉提取物的應(yīng)用，其特征在于:該提取物降糖活性成 分為芒柄花素和染料木素。7. 根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的一種紅三葉提取物的應(yīng)用，其特征在于：降糖活性成分主 要存在于乙酸乙酯部位。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種紅三葉降糖成分的提取制備方法，具有明顯降低葡萄糖苷酶活性，有望應(yīng)用在糖尿病的預(yù)防和治療中。本發(fā)明所制備的紅三葉提取物作為植物源藥物，有效降低葡萄糖苷酶活性的同時(shí)，副作用小，為高血糖和糖尿病患者提供了新的治療手段。本發(fā)明還對(duì)主要功能成分進(jìn)行了分離鑒定，確定其為異黃酮類(lèi)化合物，為進(jìn)一步高附加值開(kāi)發(fā)利用提供了前提。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)捷環(huán)保，加之植物資源豐富，開(kāi)發(fā)成本低且可持續(xù)開(kāi)發(fā)，經(jīng)濟(jì)效益明顯。
【IPC分類(lèi)】A61P3/10, A61K36/48
【公開(kāi)號(hào)】CN105434509
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510991333
【發(fā)明人】劉權(quán), 李曉蓓
【申請(qǐng)人】蘭州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月25日