紅三葉提取物制備方法及在降糖方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅三葉提取物及其制備方法和在糖 尿病治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種與胰島素產(chǎn)生和作用異常相關(guān)、以高血糖癥為主要特征的代謝性疾 病，尚無根治辦法。近來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病發(fā)過程往往先出現(xiàn)餐后高血糖，而后發(fā)展成糖 尿病，即前者是后者的先期征兆。對于糖尿病患者，特別是Π 型病人，餐后高血糖對機體的 危害遠遠超過空腹高血糖，餐后高血糖的出現(xiàn)刺激胰腺大量分泌胰島素，可引起多種代謝 異常和血管病變，同時使胰腺功能進一步受到損害。因此，降低餐后血糖對于治療Π 型糖尿 病和預(yù)防該病，減少并發(fā)癥和降低死亡率的重要措施之一。
[0003] α-葡萄糖苷酶抑制劑是二十世紀八十年代出現(xiàn)的一類新的抗糖尿病藥物，它通過 抑制小腸絨毛膜上的糖苷酶的作用來減少糖類的降解，延緩糖類的消化和吸收，從而有效 地降低糖尿病人餐后血糖濃度的峰值。該抑制劑已被第三次亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南 推薦為降餐后血糖的一線藥物，被醫(yī)學(xué)界列為第3類口服降糖藥。然而目前已上市的該產(chǎn)品 如阿卡波糖、伏格列波糖等多為合成產(chǎn)品，雖藥效好但對人體毒副作用較大，如胃腸道反 應(yīng)、過敏反應(yīng)等。以中草藥為原料，尋找服用安全對于治療和預(yù)防糖尿病具有重要意義，也 是目前國內(nèi)外研究α-葡萄糖苷酶抑制劑的一個熱點。
[0004] 紅三葉（Trifolium pratense Linn)又名紅車軸草、紅花苜蓿、紅荷蘭翹搖，是集 生態(tài)、飼用和藥用價值于一體的多功能優(yōu)良牧草。該植物具有廣泛的適應(yīng)性，分布于全球大 部分國家和地區(qū)，資源十分豐富。本專利對于紅三葉降糖功能進行深入研究，且工藝簡單， 生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)化，對于全球糖尿病的預(yù)防和治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種紅三葉提取物的制備方法。紅三葉作為豆科主要牧草之一，在 全球分布廣泛，資源豐富。本發(fā)明技術(shù)原料充足，工藝簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化。
[0006] 本發(fā)明的另外一個目的是提供紅三葉提取物在治療和預(yù)防糖尿病中的應(yīng)用，為尋 找安全可靠的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論基礎(chǔ)，對于科學(xué)綜合地開發(fā)紅三葉資源具有非 常重要的意義。經(jīng)過驗證，該提取物能夠有效地降低葡萄糖苷酶的活性，從而對于糖尿病 的治療有積極意義。
[0007] 同時利用活性跟蹤分離方法和波譜鑒定等手段，明確降糖主要活性成分為芒柄花 素染料木素。
[0008] 上述以紅三葉萃取物的制備工藝，包括如下步驟：
[0009] 1)紅三葉提取物的制備；
[0010] 采集新鮮紅三葉植物組織(葉片、或者根、或者花），陰干粉碎后，加入乙醇水溶液， 超聲或加熱回流提取，重復(fù)提取2-4次，提取液減壓濃縮，然后在通風(fēng)避光處風(fēng)干，制得紅三 葉提取物。
[0011] 優(yōu)選的，所述乙醇水溶液，加入量是干粉體積的5-50倍，乙醇水溶液濃度為20-IOOwt% ;超聲或加熱回流提取10-90分鐘。
[0012] 2)紅三葉不同活性部位的制備
[0013] a.紅三葉石油醚部位萃取物（以下簡稱石油醚部位）的制備:將紅三葉提取物用水 溶解，再加入石油醚，劇烈振蕩，靜置分層，上清液為石油醚層，下層水溶液用石油醚重復(fù)萃 取2-5次，合并石油醚層，減壓濃縮，制得紅三葉石油醚部位；
[0014] b.紅三葉乙酸乙酯部位萃取物（以下簡稱乙酸乙酯部位)的制備:石油醚萃取后的 水溶液中加入乙酸乙酯，劇烈振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯層，下層水溶液用乙酸乙 酯重復(fù)萃取2-5次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，制得紅三葉乙酸乙酯部位；
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟2)的步驟a中，紅三葉提取物用其2-50倍體積的蒸餾水溶解。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟2)的步驟a中，加入紅三葉提取物溶液2-10倍體積的石油醚。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟2)的步驟b中，石油醚萃取后的水溶液中加入該溶液2-10倍體積 的乙酸乙酯。
【具體實施方式】
[0018] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0019] 實施例1紅三葉不同活性部位的制備
[0020] 1、紅三葉提取物的制備：采集新鮮的紅三葉植物的地上部位，陰干，粉碎。加入20 倍體積乙醇，超聲提取30分鐘，重復(fù)提取3次。將提取溶劑減壓濃縮，在通風(fēng)避光處風(fēng)干，得 紅三葉提取物。
[0021] 2、紅三葉不同活性部位的制備：取制得的紅三葉提取物20g，用5倍體積的蒸餾水 IOOmL溶解，在水溶液中加入3倍于水溶液體積的石油醚300mL，劇烈振蕩，靜置分層，上清液 為石油醚層;重復(fù)萃取3次，合并石油醚層，減壓濃縮，制得紅三葉石油醚部位。將石油醚萃 取后剩余水溶液中加入3倍體積的乙酸乙酯300mL，劇烈振蕩，靜置分層，上清液為乙酸乙酯 層，重復(fù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，制得紅三葉乙酸乙酯部位。將萃取后剩余水 溶液，減壓濃縮，制得紅三葉水相部位。
[0022]實施例2紅三葉不同萃取部位對α-葡萄糖苷酶抑制活性 [0023] 2.1實驗方法
[0024] α-葡萄糖苷酶抑制活性是α-葡萄糖苷酶(0.1單位/mL)和底物(p_NPG，l. OmM)溶解 在磷酸緩沖液(〇. 1Μ，ρΗ 6.7)中。所有的試驗樣品用DMSO溶解。樣品和α-葡萄糖苷酶在37°C 一起培養(yǎng)IOmin，加入底物反應(yīng)30min。加入Na2C〇3終止反應(yīng)，測定在405nm下的紫外吸收值 0D。所有的樣品取5個不同濃度，分別重復(fù)3次，并計算IC 5q值。以市售降糖藥物阿卡波糖為對 照。
[0025] 2.2數(shù)據(jù)處理
[0026]抑制率通過以下公式計算：
[0027]抑制率 ％ = (0β(?-0Dfta)/0ft(?X 100
[0028] 2.3活性測試結(jié)果
[0029] 表1不同部位抑制α-葡萄糖苷酶1(：50值
[0031]實施例3降糖活性化合物的跟蹤分離
[0032]活性結(jié)果表明，紅三