經(jīng)生物工程改造的同種異體瓣膜的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2014年5月27日提交的美國臨時申請?zhí)?2/003, 129的優(yōu)先權(quán)和權(quán) 益，該申請的公開內(nèi)容以其整體作為參考并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及用于帶瓣靜脈中瓣膜的再細胞化的方法。通過本文公開的方法生產(chǎn)的 瓣膜對植入、移植或接枝至血管疾病患者是有利的。
【背景技術(shù)】
[0004] 靜脈瓣是在靜脈中的膜狀褶疊，其防止通過它的血液的反向流動。當(dāng)人站立時，血 液必須抵抗重力，從腿部靜脈向上流動以到達心臟。身體具有位于皮下脂肪層的淺靜脈，以 及位于肌肉中且沿著骨的深靜脈。短靜脈稱為連接靜脈，連接淺和深靜脈。深靜脈在向心 推動血液中發(fā)揮重要的作用。深靜脈中的單向瓣膜防止血液反向流動，且深靜脈周圍肌肉 壓縮它們，幫助迫使血液向心，正如擠壓牙膏管擠出牙膏。強大的小腿肌群是重要的，其強 有力地一步步地壓縮腿部深靜脈。深靜脈從腿部向心臟運載90%或更多的血液。
[0005] 單向瓣膜由邊緣匯合的兩瓣（flaps)(尖（cusps)或葉（leaflets))組成。這些 瓣膜幫助靜脈將血液返回至心臟。隨著血液向心運動，它推動尖像一對單向轉(zhuǎn)門（在左邊 顯示）開啟，如果重力暫時地反向推動血液，或者血液開始在靜脈中倒退，立即推動該尖閉 合，防止反向流動（在右邊顯示）。
[0006] 淺靜脈具有與深靜脈相同類型的瓣膜，但是他們沒有被肌肉包圍。因此，淺靜脈中 的血液不是通過肌肉的擠壓作用迫使向心，并且與深靜脈中的血液相比，它流動的更緩慢。 在淺靜脈中流動的大部分血液是通過深和淺靜脈間很多的連接靜脈轉(zhuǎn)移至深靜脈。連接靜 脈中的瓣膜允許血液從淺靜脈進入深靜脈但不可反向。
[0007] 慢性靜脈功能不全（CVI)是當(dāng)腿部靜脈中的靜脈壁和/或瓣膜不能有效工作時 發(fā)生的病癥，致使血液從腿部返回至心臟困難。CVI引起血液在這些靜脈中"淤積（pool)" 或聚集，這一淤積被稱為瘀證（stasis)。靜脈使血液從全身的器官返回至心臟。為到達心 臟，血液需要從腿部的靜脈向上流動。小腿肌群和腳部的肌群需要一步步地的收縮以擠壓 靜脈，并推動血液向上。靜脈包含單向瓣膜以保持血液向上流動且不倒退。當(dāng)這些瓣膜損 壞，允許血液反向滲漏時慢性靜脈功能不全發(fā)生。瓣膜損壞由于年齡、久坐或站立或者年齡 和降低的流動性的組合而發(fā)生。當(dāng)靜脈和瓣膜脆弱至難以使血液向上流到心臟時，靜脈中 血壓長時間持續(xù)升高，導(dǎo)致CVI。據(jù)估計美國中百分之四十的人口患有CVI。
[0008] 采用壓力襪結(jié)合體表手術(shù)的CVI傳統(tǒng)的治療方法似乎能提高靜脈的血液動力；但 是24周后，潰瘍愈合率僅達65%，并且12% /年的復(fù)發(fā)率。CVI和腿部潰瘍的重建深靜脈 手術(shù)治療是有創(chuàng)的，且因此使用有限。
[0009] 由于來源于心臟的栗送作用的動態(tài)壓力，血液通過動脈和靜脈流動。在封閉的循 環(huán)系統(tǒng)中，靜脈回流必須等同于心輸出量。大部分的動態(tài)壓力在動脈血液循環(huán)中耗散。剩 余的能量被釋放到靜脈系統(tǒng)。在正常情況下，在毛細血管靜脈端的壓力是12至18mm汞柱， 且穩(wěn)定地對動脈壓下降4至7mm汞柱。當(dāng)仰臥時，重力壓力被中和，血液隨著該動態(tài)壓力梯 度流動。在仰臥位中呼吸運動也強烈影響靜脈回流，但當(dāng)依賴于肢體時影響不大。
[0010] 靜液壓力源自右心房以下血液柱的重量。血密度和重力加速度決定了靜液壓力。 靜液和重力壓力以在心房下以厘米計的垂直距離的常量乘運算（0. 77mm汞柱/cm)表示。壓 力在直立時（坐或站立）但靜止的個體中最高。然而，測量的壓力還反應(yīng)外部因素，如肌肉 收縮。其他外部因素還通過可塌陷的（collapsible)靜脈管道改變流動。在吸氣時，橫隔 的收縮提高腹內(nèi)和下肢的靜脈壓力。腹水和肥胖產(chǎn)生相似的壓力提高，即使是仰臥時。
[0011] 在依賴上肢（dependentupperextremity)中的壓力反應(yīng)心房和第一肋骨間的垂 直距離。在直立的受試者中，上肢靜脈在垂直方向上位于心房上部，其將塌陷（如頭部或頸 部的顱外靜脈）。因此，在心房上靜脈的結(jié)構(gòu)中的壓力，不會降低至零以下。在上肢中不常 見水腫和返流，即使當(dāng)靜脈瓣先天缺失。單獨的中心靜脈血栓，一般僅產(chǎn)生暫時性的、近端 的水腫。
[0012] 在有能力的靜脈瓣的幫助下，通過下肢肌肉栗的血液擠壓，完成從依賴下肢的靜 脈至心臟的血液的靜脈回流。瓣膜發(fā)揮功能以使血液的靜液柱分割成段，且防止靜脈倒流。 盡管在膝下段更多數(shù)量的瓣膜暗示其更為重要的功能，但是可通過矯正股或胭靜脈功能不 全顯著改變靜液壓力。穿透靜脈瓣防止深至淺流動，與小腿栗的壓力/流動的關(guān)系一致的 概念。腳部的穿透靜脈是一個例外，其雙向流動被認為是正常的。
[0013] 慢性靜脈功能不全（CVI)和腿部潰瘍的患者每年巨大的直接花費構(gòu)成嚴重的醫(yī) 學(xué)和社會問題。下肢靜脈性潰瘍的患病率在0. 1至1. 0%。采用壓力襪結(jié)合體表手術(shù)的CVI 傳統(tǒng)的治療方法似乎能提高靜脈血液動力；但是24周后，潰瘍愈合率僅達65%，并且12% /年的復(fù)發(fā)率。
[0014] 此外，手術(shù)技術(shù)要求高，且因此在重建深靜脈的手術(shù)中使用有限。
[0015] 因此，治療患有慢性靜脈功能不全和腿部潰瘍的方法尚需改進。本公開提供了治 療這些疾病的替代策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本公開的特征在于，其中，用于脫細胞化（decellularizing)和再細胞化(rece11u1arizing)帶瓣靜脈中瓣膜的材料的方法。
[0017] 本公開提供了在體內(nèi)生理條件刺激下，經(jīng)組織工程改造的人帶瓣靜脈段的瓣膜功 能的成功保留。本公開進一步提供了以簡單的血液樣本，經(jīng)脫細胞化的人靜脈段和靜脈瓣 膜的成功再內(nèi)皮化，其中生成單層內(nèi)皮細胞。
[0018] 本公開提供了一種靜脈中瓣膜的再細胞化的方法，該方法包括引入血液至經(jīng)脫細 胞化的靜脈的管腔，血液包括內(nèi)皮細胞祖細胞和平滑肌細胞祖細胞，且在經(jīng)脫細胞化的靜 脈的管腔中培養(yǎng)細胞，從而再細胞化靜脈中的瓣膜。
[0019] 本公開提供了一種帶瓣靜脈中瓣膜的再細胞化的方法，其經(jīng)再細胞化的瓣膜是功 能性瓣膜。在實施方案中，該方包括從有經(jīng)再細胞化靜脈中瓣膜需要的受試者獲取靜脈段； 脫細胞化帶瓣靜脈；從受試者收集血液，其中血液包括內(nèi)皮細胞祖細胞和平滑肌細胞祖細 胞；用收集的血液灌注經(jīng)脫細胞化的帶瓣靜脈；以及在經(jīng)脫細胞化的帶瓣靜脈中培養(yǎng)細 胞，從而再細胞化該經(jīng)脫細胞化的靜脈中的瓣膜。
[0020] 在實施方案中，本公開包括一種再細胞化靜脈中瓣膜的方法，其中再細胞化恢復(fù) 經(jīng)再細胞化的瓣膜的能力（competence)和返流壓力的耐受性。
[0021] 本公開提供了在有需要的受試者（經(jīng)再細胞化的帶瓣膜靜脈的受體）中，治療慢 性靜脈功能不全（CVI)、深靜脈血栓（DVT)、和/或腿部潰瘍的方法，其通過引入經(jīng)再細胞化 的靜脈的帶瓣段至受試者，其中瓣膜是經(jīng)再細胞化的，再細胞化方法包括：脫細胞化同種異 體靜脈的帶瓣段；從受試者收集血液，其中血液包括內(nèi)皮細胞祖細胞和平滑肌細胞祖細胞； 用收集的血液灌注經(jīng)脫細胞化的帶瓣；在經(jīng)脫細胞化的帶瓣靜脈的管腔中培養(yǎng)細胞；從而 再細胞化該經(jīng)脫細胞化的靜脈瓣膜；以及接枝經(jīng)再細胞化的帶瓣靜脈至受試者，其治療受 試者中的CVI和/或腿部潰瘍。
[0022] 在實施方案中，血液是外周靜脈血或全血。在實施方案中，外周靜脈血或全血是通 過注射或灌注引入至經(jīng)脫細胞化的靜脈。該方法提供了通過內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基和平滑肌細胞 培養(yǎng)基的灌注培養(yǎng)細胞。內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基和平滑肌細胞培養(yǎng)基的灌注可以是交替的。在實 施方案中，經(jīng)再細胞化的瓣膜是CD31陽性的、vWF陽性的、平滑肌肌動蛋白陽性的、且具有 細胞核。在實施方案中，經(jīng)再細胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力在或者高于〇. 8N的力學(xué) 性能。在實施方案中，經(jīng)再細胞化的瓣膜具有等于或小于〇. 5秒的閉合時間。
[0023] 本公開提供了一種靜脈中瓣膜的再細胞化的方法，其通過引入內(nèi)皮細胞、平滑肌 細胞、內(nèi)皮細胞祖細胞和平滑肌細胞祖細胞的群中的一種或多種至經(jīng)脫細胞化的靜脈的管 腔中。細胞和/或祖細胞的群與經(jīng)脫細胞化的靜脈培養(yǎng)，從而再細胞化靜脈中的瓣膜。在 接枝到其受試者后，本公開的經(jīng)再細胞化的瓣膜恢復(fù)與正常健康瓣膜相似的正常的閉合時 間（即，能力）以及耐受返流壓力。本公開的特征在于提供了僅引入內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、 內(nèi)皮細胞祖細胞和平滑肌細胞祖細胞的群至經(jīng)脫細胞化的靜脈的管腔。
[0024] 本公開進一步提供了靜脈中瓣膜的再細胞化的方法，其中經(jīng)再細胞化的瓣膜是功 能性的。該再細胞化的方法包括的步驟包括：獲取人靜脈的帶瓣段；脫細胞化靜脈；從經(jīng)再 細胞化的瓣膜的受體收集血液；用收集的血液灌注經(jīng)脫細胞化的靜脈數(shù)小時（例如，約2小 時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時，或者約10-20小時）；用內(nèi)皮細胞 培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；以及用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細胞化經(jīng)脫細 胞化的靜脈瓣膜。在接枝到有需要的受試者后，本公開使用血液經(jīng)再細胞化的瓣膜恢復(fù)與 正常健康瓣膜相似的正常的閉合時間（即能力）以及耐受返流壓力。
[0025] 本公開提供了靜脈中瓣膜的再細胞化的方法，其中經(jīng)再細胞化的瓣膜是功能性 的。該再細胞化的方法包括步驟：脫細胞化從供體獲取的靜脈的帶瓣段；用收集于有治療 需要（即，有靜脈中瓣膜再細胞化需要）的受試者的血液灌注數(shù)小時（例如，約2小時、3小 時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時，或者約10-20小時）；任選地，用內(nèi)皮細胞 培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；以及用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細胞化經(jīng)脫細 胞化的靜脈瓣膜，其中，接枝到有需要的受試者時，再細胞化恢復(fù)經(jīng)再細胞化的瓣膜的能力 以及返流壓力的耐受性。
[0026] 在瓣膜再細胞化的方法中，存在或衍生自外周靜脈血或全血中的細胞群，用經(jīng)脫 細胞化的靜脈培養(yǎng)。本公開提供細胞群是同種異體的。本公開還提供細胞群是自體的。同 種異體和/或自體細胞群收集于或存在于外周靜脈血或全血。本公開提供從同種異體供體 收集的外周靜脈血或全血。外周靜脈血或全血是自體的。本公開提供用同種異體的外周靜 脈血或同種異體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細胞化的靜脈。本公開提供用同種異體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細 胞化的靜脈。本公開還提供用自體的外周靜脈血或自體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細胞化的靜脈。
[0027] 本公開提供了經(jīng)脫細胞化的靜脈。用脫細胞化步驟重復(fù)不止一次（定義為"周 期"）的方法脫細胞化靜脈。靜脈脫細胞化包括2至16個周期。例如，脫細胞化方法包括 14個周期。
[0028] 本公開的帶瓣靜脈在用包括2-16個脫細胞化周期的方法脫細胞化后，與未脫細 胞化的靜脈相比，細胞核的數(shù)量減少或無細胞核（在免疫組織化學(xué)檢測中細胞核染色減少 或陰性）。在2-16個脫細胞化周期后，靜脈的特征在于具有減少的或無人類白細胞抗原 (HLA)I類抗原（在免疫組織化學(xué)檢測中HLAI類抗原染色減少或陰性），和/或具有減少 的或無HLAII類抗原（在免疫組織化學(xué)檢測中HLAII類抗原染色減少或陰性）。與未脫 細胞化的靜脈相比，在2-16個脫細胞化周期后，靜脈的特征在于含有的膠原蛋白和硫酸化 糖胺聚糖（GAG)降低，并且彈性蛋白提高。與未脫細胞化的靜脈相比，脫細胞化降低了經(jīng)脫 細胞化的靜脈的DNA。
[0029] 本公開提供了在經(jīng)脫細胞化的帶瓣靜脈中瓣膜再細胞化，其中經(jīng)再細胞化的瓣膜 和靜脈有細胞核且為CD31陽性的。含經(jīng)再細胞化的瓣膜的靜脈也為平滑肌肌動蛋白陽性 的，且在靜脈外膜（tunicaadventitia)具有梭形的平滑肌細胞。經(jīng)再細胞化的瓣膜和靜 脈以及還是內(nèi)皮標(biāo)志物vWF陽性的。
[0030] 本公開提供了通過獲得功能性的瓣膜的方法，在經(jīng)脫細胞化的靜脈中再細胞化瓣 膜。該功能性瓣膜具有正常的閉合時間（即能力）和耐受正常水平的返流壓力。具有正常 功能的瓣膜的正常的閉合時間，在本文也被稱為能力，是小于或等于〇. 5秒。具有正常功能 的瓣膜耐受正常水平100mm汞柱的返流壓力，且在行走7至12步時，減少至平均約18mm汞 柱至約25mm汞柱。
[0031] 本公開提供了經(jīng)再細胞化的瓣膜，在接枝至有需要的受試者后，在毛細血管靜脈 端恢復(fù)12_至18_汞柱的壓力。在其受試者中經(jīng)再細胞化的瓣膜恢復(fù)正常的靜液和重力 壓力，其以在心房下以厘米計的垂直距離的常量乘運算（〇.77mm汞柱/cm)表示。接枝后， 在直立（坐或站立）但靜止時的受試者中，經(jīng)再細胞化的瓣膜恢復(fù)正常的最高水平的100mm 汞柱的壓力。本公開還提供了，在模擬行走和呼吸過程中發(fā)生的壓力下深靜脈系統(tǒng)中靜脈 流通的體外功能性實驗中，具有約100mm汞柱的靜脈返流壓力的功能性經(jīng)再細胞化的瓣 膜。
[0032] 本公開提供了瓣膜的再細胞化，在有能力的經(jīng)再細胞化靜脈瓣的幫助下，通過下 肢肌肉栗擠壓血液，完成從依賴下肢靜脈至心臟的血液的靜脈回流。本公開的經(jīng)再細胞化 的瓣膜發(fā)揮功能以使血液的靜液柱分割成段，且防止靜脈倒流。在膝下段，經(jīng)再細胞化的靜 脈恢復(fù)更多數(shù)量的瓣膜。瓣膜的再細胞化用于通過矯正股或胭靜脈功能不全，改善靜液壓 力改變引起的癥狀。穿透靜脈瓣膜防止深靜脈至淺靜脈流動，且恢復(fù)小腿栗的正常壓力/ 流動關(guān)系。
[0033] 在腳部穿透靜脈中，經(jīng)再細胞化的瓣膜恢復(fù)通過靜脈的血液的雙向流動。
[0034] 本公開進一步提供了在有需要的受試者中，治療或改善慢性靜脈功能不全（CVI) 和/或腿部潰瘍的癥狀的方法，其包括接枝經(jīng)再細胞化的靜脈的帶瓣段至受試者。該瓣膜 再細胞化方法包括一個或多個步驟。該方法包括一個或多個步驟：獲取人同種異體股靜 脈的帶瓣段；脫細胞化股靜脈中靜脈2-16個周期；從受試者收集血液；用抗凝劑灌注經(jīng)脫 細胞化的靜脈；用收集的血液灌注經(jīng)脫細胞化的靜脈數(shù)小時；排出血液并使用緩沖液沖洗 靜脈；以及首先用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；然后用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天 以上；從而再細胞化經(jīng)脫細胞化的瓣膜；其中經(jīng)再細胞化的瓣膜接枝至受試者治療或改善 CVI和/或腿部潰瘍。
[0035] 本公開提供了一種再細胞化的血管的帶瓣段，其用于在有需要的受試者中，治療 或改善慢性靜脈功能不全和/或腿部潰瘍的癥狀。再細胞化血管的段通過包括以下一個或 多個步驟的方法獲得：獲取人同種異體股靜脈的帶瓣段；脫細胞化股靜脈中靜脈2-16個周 期；從受試者收集血液；用抗凝劑灌注經(jīng)脫細胞化的靜脈；用收集的血液灌注經(jīng)脫細胞化 的靜脈數(shù)小時；排出血液并使用緩沖液沖洗靜脈；以及首先用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基灌注靜脈一 天以上；然后用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細胞化經(jīng)脫細胞化的瓣膜；其中 經(jīng)再細胞化的瓣膜接枝至受試者治療或改善CVI和/或腿部潰瘍；優(yōu)選地，其中，再細胞化 血管的段通過包括上述全部步驟的方法獲得。
[0036] 本公開提供了一種實施于瓣膜的方法，瓣膜是從身體/供體獲取或獲得的靜脈的 一段，且血液從待治療的受試者收集，其中供體和待治療的受試者不是同一個體。
[0037] 本公開的瓣膜脫細胞化的步驟包括，在合適的去垢劑/有機磷酸酯化合物中處理 帶瓣靜脈，其包括但不限于TRITON?.和磷酸三丁酯（Tri-n-butylphosphate)以及任選地 額外包含DNA酶。
[0038] 經(jīng)脫細胞化的瓣膜是通過以內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基灌注靜脈2-6天，接著通過以平滑肌 培養(yǎng)基灌注靜脈2-6天再細胞化的。在一個方面，經(jīng)脫細胞化的靜脈的培養(yǎng)是在體外的。
[0039] 經(jīng)再細胞化的瓣膜是⑶31陽性的。該經(jīng)再細胞化的瓣膜還可是平滑肌肌動蛋白 陽性的、vWF陽性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌細胞。經(jīng)再細胞化的瓣膜具有在第一 峰高于0· 8N的力學(xué)性能。
[0040] 本公開提供了使用經(jīng)再細胞化的帶瓣靜脈治療由深靜脈返流和/或靜脈高壓引 起的復(fù)發(fā)性下肢腫瘤的方法。本公開提供了經(jīng)再細胞化的帶瓣靜脈在治