。取5μ1PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得預(yù)期大小 1815bp的目的條帶（見圖 2A)。剩余 20μ1 的PCR產(chǎn)物用E.Z.M.A.藝CyclePureKit(OMEGA Bio-tek，D6492-02)試劑盒純化回收，具體步驟見試劑盒說明書。
[0068] 3)NTPase-II目的片段及載體的雙酶切和回收：
[0069]NTPase-II片段和DREP-EGFP載體（在本實施例中，所述DREP-EGFP載體為瑞典 DanielX.Johansson教授饋贈，EvaK.L.Nordstrom,etal.Enhancedimmunogenicity usinganalphavirusrepliconDNAvaccineagainsthumanimmunodeficiencyvirus type1.JournalofGeneralVirology, 2005, 86:349 - 354 中已經(jīng)公開）用Xmal和Spe I進行雙酶切37 °C過夜，NTPase-II片段酶切產(chǎn)物用Ε.Ζ,Ν.Α,?CyclePureKit(OMEGA Bio-tek，D6492-02)試劑盒純化回收。DREP-EGFP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分 離（如圖2B)，獲得11240bp的DREP大片段和720bp的EGFP片段，用E.Z.N.A.?Gel ExtractionKit(0MEGABi〇-tek，D2500-02)膠回收其大片段，具體步驟參照試劑盒說明 書。
[0070] 4)NTPase-II目的片段與載體的連接與轉(zhuǎn)化：
[0071] 將回收得到的NTPase-II目的片段與DREP載體用T4DNA連接酶（NEB, #M0202S) 進行連接，16°C連接過夜。將10μ1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。
[0072] 5)重組質(zhì)粒的鑒定：
[0073]挑取若干個單菌落做菌液PCR鑒定（見圖2C)，陽性菌株送invitrogen公司測序， 結(jié)果完全正確。測序結(jié)果參見序列表中SEQIDNo. 1中308~2119位所示的核苷酸序列 (下劃線標出），其編碼的蛋白序列參見序列表中SEQIDNo. 2 26~628位所示（下劃線 標出）。
[0074] 6)重組質(zhì)粒的大量提取：
[0075] DREP-NTPase-II重組菌大量搖菌，用Plasmid Maxi Kit (QIAGEN,12163)試劑盒大 提質(zhì)粒，作為"自殺性"DNA疫苗，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0076] 本發(fā)明弓形蟲自殺性DNA疫苗的相關(guān)檢測：
[0077] 1、DREP-NTPase-II疫苗外源抗原基因NTPase-II在哺乳動物細胞中的瞬時表達 鑒定
[0078] (l)DREP-NTPase-II質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細胞：
[0079] 1)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的密度將293T細胞接種到置有細胞培養(yǎng)基的24孔板中的 爬片上，使轉(zhuǎn)染時細胞達到60~70%滿（使用不含抗生素的培養(yǎng)基）；
[0080] 2)將 1yg質(zhì)粒（例如，DREP-NTPase-II或DREP-EGFP)和 1μ1 脂質(zhì)體 LipoieciimiineJi. 2000Reagent(Invitrogen，11668-027)分另lj加入至lj25μ1Opti-MEM優(yōu)化 培養(yǎng)基（Gibco, 31985-070)中，渦旋30s，室溫靜置5min;
[0081] 3)將上述含有質(zhì)粒的Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基與含脂質(zhì)體的Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基混 合，渦旋30s，室溫靜置20min;
[0082] 4)將步驟3)中的50μ1質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物逐滴均勻地加入到24孔板中，輕輕 搖勻；
[0083] 5)細胞放入37°C，5%C02培養(yǎng)48h后，檢測外源基因的表達。
[0084] (2)間接免疫熒光檢測NTPase-II在293T細胞中的表達：
[0085] 1)轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)48h后，用PBST洗1次，5min/次；
[0086] 2)4% (w/v，g/L)的多聚甲醛室溫固定15min，用PBST洗滌3次，5min/次；
[0087] 3) 0· 5% (體積百分數(shù)）TritonX-100 透化 10min，用PBST洗滌 3 次，5min/ 次；
[0088] 4) 10 % (體積百分數(shù)）FBS(胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基37°C封閉30min;
[0089] 5)加入1:2000 (體積比）稀釋的一抗NTPase-II小鼠單抗（本實驗室前期 制備。FengTan,etal.Monoclonalantibodiesagainstnucleosidetriphosphate hydrolase-IIcanreducethereplicationofToxoplasmagondii.Parasitology International, 2010, 59:141-146)，37°C孵育 1. 5h或 4°C過夜，用PBST洗 5 次，5min/ 次；
[0090]6)加入 1:1000 (體積比）稀釋的二抗AlexaFluor1''488goatanti-mouse IgG(H+L) (1:1000,Lifetechnologies)，37°C孵育 45min，棄二抗；
[0091] 7)加入 0· 5μg/mlDAPI染色lOmin,用PBST洗 5 次，5min/ 次；
[0092] 8) 50% (體積百分數(shù)）甘油封片，200倍熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。
[0093] 間接免疫熒光結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染DREP-NTPase-II的293T細胞發(fā)很強的FITC 綠色熒光，轉(zhuǎn)染DREP-EGFP的細胞由于表達EGFP也可見綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染的細胞未檢測 到特異性綠色熒光，說明DREP載體可以使攜帶的外源基因NTPase-II或EGFP在哺乳細胞 293T中獲得大量的表達。
[0094]2、BALB/c小鼠的免疫程序
[0095]BALB/c小鼠，雌性，6~8w，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。小鼠隨機分成3 組（PBS組，DREP-EGFP組，DREP-NTPase-II組），每組20只。采用肌肉注射免疫，實驗組 每只小鼠于兩側(cè)大腿股四頭肌注射100μ1 (5μg)DREP-NTPase-II質(zhì)粒，注射后立即電擊， 電擊參數(shù)為：75V/cm電擊20ms，脈沖6次，間隔200ms。對照組注射免疫100μ1PBS或 100μ1 (5μg)質(zhì)粒DREP-EGFP作為陰性對照。共免疫2次，間隔3周。
[0096] 3、DREP-NTPase-II疫苗在BALB/c小鼠中引起的體液免疫水平的檢測
[0097]末次免疫后2周，小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分離血清。用間接ELISA法檢測各組血 清中的特異性抗體水平，各設(shè)3個復(fù)孔，以NTPase-II原核表達蛋白為包被抗原（0. 5μ1/ 孔）于96孔酶標板中，免疫小鼠血清（1:100封閉液稀釋）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP、羊抗 鼠IgGl-HRP、羊抗鼠IgG2a-HRP(1:2000封閉液稀釋）為二抗，同時設(shè)立空白對照，于450nm波長入測定每孔的OD值。數(shù)據(jù)用SPSS分析，結(jié)果如表1和圖4所示，與對照組PBS組和 DREP-EGFP組相比，DREP-NTPase-II免疫組的抗體水平檢測到高水平的弓形蟲特異性抗 NTPase-II的IgG，IgGl，IgG2a抗體（Ρ〈0· 01)，但IgG2a/IgGl比值有所降低，提示該疫苗誘 導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Thl、Th2混合型免疫反應(yīng)，以Thl型為主。
[0098] 表1各免疫組小鼠特異性抗體檢測結(jié)果表
[0099]
[0100] *Ρ〈0· 01 (DREP-NTPase-II免疫組與PBS組比較）
[0101] ▲Ρ〈0· 01 (DREP-NTPase-II免疫組與DREP-EGFP組比較）
[0102] 4、DREP-NTPase-II疫苗在BALB/c小鼠中引起的細胞因子水平的檢測
[0103] 末次免疫后2周，各組無菌取5只小鼠脾臟，分別過200目篩網(wǎng)研磨脾細胞，用紅 細胞裂解液去除脾細胞中的紅細胞，用淋巴細胞分離液分離出脾細胞懸液中的淋巴細胞， 重懸于含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，制備成淋巴細胞懸液。將淋巴細胞分別鋪入 24孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞密度為5xl06個/孔，每個樣品設(shè)4個復(fù)孔。每個樣品各取2 孔，加入NTPase-II原核表達蛋白（終濃度10yg/ml)刺激，同時另外2孔加入ConA(終濃 度5μg/ml)作為陽性對照，并以下時間點分別取上清進行細胞因子檢測：24h后檢測IL-2 和IL-4,72h后檢測IL-10,96h后檢測IFN-γ。細胞因子檢測用試