行雙酶切37 °C過夜， NTPase-II片段酶切產(chǎn)物純化回收，得到NTPase-II目的片段；DREP-EGFP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得11240bp的DREP大片段和720bp的EGFP片段，回收其大片段， 得DREP載體；
[0029] ⑷NTPase-II目的片段與載體的連接與轉(zhuǎn)化：
[0030] 將回收得到的NTPase-II目的片段與DREP載體用T4DNA連接酶進行連接，16°C連 接過夜，得連接產(chǎn)物，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中；
[0031] (5)重組質(zhì)粒的鑒定：
[0032] 挑取若干個大腸桿菌DH5α單菌落做菌液PCR鑒定，陽性菌株進行測序，結(jié)果完全 正確，即得DREP-NTPase-II重組菌；
[0033] (6)重組質(zhì)粒的大量提?。?br>[0034] 將DREP-NTPase-II重組菌大量搖菌，提取質(zhì)粒，獲得自殺性DNA疫苗，-20°C保存 備用。
[0035] 而且，所述步驟⑵中用高保真酶為KAPAHiFiHotStartReadyMix， KAPABIOSYSTEMS，KK2601 ;或者，所述步驟⑵中剩余的PCR產(chǎn)物用E.Z.N.A.?CyclePure Kit，OMEGABi〇-tek，D6492-02,試劑盒純化回收。
[0036] 而且，所述步驟⑶中NTPase-II片段酶切產(chǎn)物用E.Z.N.AJ?CyclePureKit， OMEGABio-tek，D6492-02,試劑盒純化回收，或者，所述步驟⑶中用E.Z.N.A.?Gel ExtractionKit，OMEGABi〇-tek，D2500-02,膠回收其大片段。
[0037] 而且，所述步驟⑷中T4DNA連接酶為NEB，#M0202S;或者，將10μ1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌DH5α中。
[0038] 而且，所述步驟(6)中用PlasmidMaxiKit，QIAGEN，12163,試劑盒提取質(zhì)粒。
[0039] -種如上所述的弓形蟲自殺性DNA疫苗在弓形蟲病防治中的應用。
[0040] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：
[0041] 1、本發(fā)明疫苗可有效地增強體液免疫和細胞免疫，有效地延長免疫小鼠接受RH(I 型株）急性感染弓形蟲后的生存時間，有效地減少免疫小鼠接受Pru(II型株）慢性感染后 腦組織中包囊的數(shù)量，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的疫苗安全高效，并可隨細胞凋亡而被機體 清除，從而避免DNA質(zhì)粒可能整合到宿主細胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，且更長 效穩(wěn)定，操作便捷。
[0042] 2、本發(fā)明疫苗構(gòu)建時方法簡單，性狀穩(wěn)定，易于大規(guī)模生產(chǎn)、保存和運輸；在使用 時，所需免疫劑量小，低劑量即可誘導強烈的免疫反應；其與現(xiàn)有的弱毒苗、滅活苗和普通 的DNA疫苗相比，該自殺性DNA疫苗更加安全、高效，因此該疫苗可以作為預防弓形蟲感染 的候選疫苗。
[0043] 3、本發(fā)明疫苗的構(gòu)建方法是將弓形蟲RH株速殖子弓形蟲核苷三磷酸水解酶 NTPase-II基因插入到甲病毒復制子載體DREP上的XmaI和SpeI位點，獲得重組質(zhì)粒 DREP-NTPase-II，即為本發(fā)明疫苗，該疫苗在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)具有自我復制能力，可在胞內(nèi)大 量表達外源抗原基因。
[0044] 4、本發(fā)明疫苗，對BALB/c小鼠進行肌肉注射免疫，通過測定細胞和體液免疫反應 指標來評價疫苗的免疫原性，通過弓形蟲速殖子的急性感染和弓形蟲包囊的慢性感染攻擊 來評價疫苗的免疫保護性，結(jié)果顯示，該疫苗就能誘導強烈的體液免疫和細胞免疫反應，有 效地延長免疫小鼠接受弓形蟲急性感染后的生存時間，尤其突出的是，大大降低了免疫小 鼠接受弓形蟲慢性感染后腦組織中的包囊形成率。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明編碼弓形蟲核苷三磷酸水解酶NTPase-II自殺性DNA疫苗 DREP-NTPase-II的兩種構(gòu)建路線示意圖；其中，圖1-1為以弓形蟲RH株DNA作為模板擴增， 圖1-2為以pBAD-HisB-NTPase-II質(zhì)粒（譚峰，等.弓形蟲三磷酸核苷水解酶的克隆、表 達及初步應用.中國人獸共患病學報，2008, 24(4) :312-315.)作為模板擴增；
[0046] 圖2為本發(fā)明中NTPasell擴增及重組質(zhì)粒鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中， A:NTPase-II基因擴增圖；B:載體DREP雙酶切（XmaI，SpeI)圖；C:DREP-NTPase-II重組 子菌液PCR鑒定圖；
[0047] 圖3為本發(fā)明中DREP-NTPase-II轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞293T后檢測NTPase-II表達 的間接免疫熒光圖，圖中標尺為1〇〇μπι;
[0048] 圖4為本發(fā)明疫苗免疫BALB/c小鼠后ELISA法檢測小鼠血清中IgG及其亞類 IgGl、IgG2a的抗體水平，其中A:IgG，B:IgGl和IgG2a;
[0049]圖5為本發(fā)明疫苗免疫BALB/c小鼠后ELISA法檢測小鼠淋巴細胞分泌的IFN-γ、 IL-2、IL-4和IL-10細胞因子水平圖。
[0050]圖6為本發(fā)明中免疫小鼠接受RH(I型株）急性感染后的生存曲線圖。
【具體實施方式】
[0051] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0052] 本發(fā)明中所使用的原料，如無特殊說明，均為常規(guī)的市售產(chǎn)品；本發(fā)明中所使用的 方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0053] 本發(fā)明疫苗評價該疫苗的免疫原性的方式為：將"自殺性"DNA疫苗經(jīng)肌肉注射免 疫BALB/c小鼠，并立即電擊促進疫苗進入宿主細胞，共免疫2次，間隔3周。末次免疫后2 周，于免疫小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，通過測定血清中的IgG及其亞類IgGl和IgG2a 抗體水平，來評價該疫苗的體液免疫應答；末次免疫后，取小鼠的脾臟，制備脾細胞懸液，通 過測定抗原刺激的淋巴細胞分泌的細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10,來評價該疫苗的細 胞免疫應答。
[0054] 本發(fā)明疫苗評價該疫苗的免疫保護性的方式為：末次免疫2周后，對免疫小鼠腹 腔注射2000個RH(I型株）速殖子，每天觀察并記錄其生存時間，來評價該疫苗對免疫小鼠 接受弓形蟲急性感染的免疫保護性；末次免疫2周后，對免疫小鼠經(jīng)口灌胃20個PrU(II型 株）包囊，5周后計算感染小鼠腦組織中的包囊數(shù)，來評價該疫苗對免疫小鼠接受弓形蟲慢 性感染的免疫保護性。
[0055] -種弓形蟲自殺性DNA疫苗，所述疫苗由弓形蟲NTPase-II基因和甲病毒復制子 載體DREP組成，所述NTPase-II是弓形蟲的核苷三磷酸水解酶，與弓形蟲的生存和繁殖有 關(guān)，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0056] -種如上所述的弓形蟲自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法，步驟如下：
[0057] 以弓形蟲RH株DNA為模板，利用一對特異性引物，PCR擴增獲得長為1815bp的 NTPase-II的編碼框序列，該序列不含信號肽，最后將純化后的NTPase-II片段插入到甲病 毒復制子載體DREP上的XmaI和SpeI位點，形成重組質(zhì)粒DREP-NTPase-II，提取質(zhì)粒并 純化之后，獲得弓形蟲自殺性DNA疫苗，構(gòu)建路線見圖1。
[0058] 具體構(gòu)建步驟如下：
[0059] 1)設(shè)計特異性引物：
[0060] 根據(jù)弓形蟲RH株NTPase-II基因序列（去除信號肽），設(shè)計一對特異性引物NTPase-II上游引物和NTPase-II下游引物，在引物5'端分別引入Xmal和Spel酶切位點：
[0061]NTPase-II上游引物：5' -TCCCCCCGGGACAGACTCATCGTCACTCCGG-3'(XmaI)
[0062]NTPase-II下游引物：5' -GGACTAGTTCACAGATTGTGAGAATATCCCG-3'(SpeI)
[0063]2)NTPase-II基因擴增：
[0064] 以弓形蟲RH株DNA為模板，用高保真酶ΚΑΡΑHiFiHotStartReady Mix(KAPABIOSYSTEMS,KK2601)擴增NTPase-II基因，PCR反應體系和反應條件如下：
[0065]
[0066]PCR反應條件：預變性 95°C5min，變性 98°C20s，退火 60°C15s，延伸 72°Clmin， 共32個循環(huán)，終延伸72°C2min;
[0067]PCR反應條件：預變性 95°C5min，變性 98°C20s，退火 60°C15s，延伸 72°Clmin， 共32個循環(huán)，終延伸72°C2min