g，0· 5mmol)和 1H-四氣唑（1401mg，20mmol)，混合物加熱 回流l〇h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī) 相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。因?yàn)榛プ儺悩?gòu)作用，在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑 基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化（流動(dòng)相為：石油醚/丙酮=100:1，v/V)， 收集黃色集中洗脫帶，再將洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化（流動(dòng)相為：石油醚/丙酮= 100:0. 5, v/v)，依次收集兩個(gè)淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物IV的黃色 粉末（85.7mg，42% )。
[0031] 4 NMR (500MHz，Chloroform-dl) δ 10.21 (s，1H)，6.53 (d，J = 95.4Hz，1H)，6.31 (S ,1H), 5. 73 (s, 1H), 4. 41 (t, J = 7. 8Hz, 4H), 4. 04 (s, 1H), 2. 09 (s, 1H), 1. 98 (s, 1H), 1. 85 (s, 1H), 1. 59 (s, 1H), 1. 33 (s, 3H), 1. 02 (s, 6H), 0. 93 (s, 6H).
[0032] 13C NMR(125MHz, DMS0-d6) δ 188. 01 (s)，183. 52 (s)，154. 09 (s)，147. 15 (s)，144. 6 0(s), 140. 11 (s), 136. 23 (s), 134. 42 (s), 130. 84 (s), 127. 86 (s), 118. 73 (s), 66. 79 (s), 46. 45 (s), 45. 42 (s), 37. 35 (s), 33. 27 (s), 25. 74 (s), 24. 62 (s), 24. 60 (s), 23. 32 (s), 22. 86 (s) ,22. 22 (s).
[0033] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C23H29N403:409 . 2 2 40 ;found:409. 2245。
[0034]
[0035] 實(shí)施例5組合物抗骨質(zhì)疏松作用的檢測(cè)
[0036] 1、材料與方法
[0037] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的55mg化合物III的粉末和研磨之后過 200目網(wǎng)的45mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組 合物，使用時(shí)用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0038] 將十周齡健康SD雌鼠（30只，江蘇省動(dòng)物中心）隨機(jī)分成5組，每組6只：假手術(shù) 組（Sham)、卵巢切除模型組（0VX)、組合物組、化合物III組和化合物IV組。飼養(yǎng)條件：溫 度為（23±2)°C，光照：黑暗為12 : 12。讓各組大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后開始骨質(zhì)疏松造模手 術(shù)：各組大鼠均經(jīng)腹腔注射20 %烏拉坦麻醉（6ml/kg體重），Sham組開腹后關(guān)腹，其余兩組 行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后第4周起，Sham組和0VX組每天進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，組合 物組、化合物III組和化合物IV組每天進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，同時(shí)分別灌胃給與組合 物、化合物ΠΙ和化合物IV 10mg/kg，連續(xù)3個(gè)月，每周稱一次體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用烏拉坦 麻醉，摘取眼球采血，2000r/min離心，吸取上清（即血清）。摘除大鼠子宮，迅速稱重。取 出大鼠雙側(cè)股骨和雙側(cè)脛骨，剔除軟組織。兩脛骨經(jīng)800°C高溫爐（由南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué) 院提供）中灰化8h，冷卻后稱灰重。用研缽碾碎成灰狀，取0. lg骨灰溶于lml，6mol/l鹽酸 中，測(cè)骨鈣和骨磷時(shí)取0. 2ml用超純水稀釋至lml，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)骨鈣和骨磷含 量。左股骨用骨密度儀測(cè)量骨密度（BMD)。血清生化指標(biāo)測(cè)定：取血清0.5ml，用全自動(dòng)生 化分析儀檢測(cè)血清堿性磷酸酶（ALP)、鈣（Ca)和磷（P)。
[0039] 2、結(jié)果
[0040] (1)組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠血清ALP，血清Ca和血清P的的影響
[0041] 表1可以看出去卵巢后，模型組大鼠血清堿性磷酸酶活性增加。去卵巢后，體內(nèi)雌 激素缺乏，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)化率增加，與絕經(jīng)后婦女的高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥一致。給予組合物3個(gè) 月后，堿性磷酸酶活性顯著下降，可見組合物可以抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率的增加，減少 骨質(zhì)的破壞。表中還顯示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清鈣明顯下降，而組合物可顯著提 升血清鈣濃度。血清鈣是骨形成的重要標(biāo)記物，說明組合物可以有效逆轉(zhuǎn)由于卵巢切除導(dǎo) 致的血清鈣的降低，有利于骨的形成。而化合物III和化合物IV沒有組合物的作用。
[0042] 表1組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠血清ALP，血清Ca和血清P的影響
[0044] *P〈0.05vs 0VX 組
[0045] (2)組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠左股骨BMD的的影響
[0046] 表2可以看出去卵巢后模型組大鼠左股骨骨密度較假手術(shù)組顯著下降，給予組合 物3個(gè)月后，骨密度顯著增加。而化合物III和化合物IV沒有此作用。
[0047] 表2組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠左股骨BMD的的影響
[0050] *P〈0.05vs 0VX 組
[0051] (3)組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠雙偵服骨參數(shù)的影響
[0052] 表3可以看出與假手術(shù)組相比，模型組大鼠雙脛骨灰重顯著降低，而組合物組較 模型組顯著升高。組合物也能顯著升高骨鈣和骨磷含量。而化合物III和化合物IV沒有 此作用。
[0053] 表3組合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠雙偵服骨參數(shù)的影響

[0055] *P〈0.05vs 0VX 組
[0056] 結(jié)論：組合物能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)和骨質(zhì)破壞，同時(shí)可以提高血 鈣濃度，有利于骨的沉積。對(duì)于由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有防治作用，并且無雌激 素樣副作用。組合物可以用于骨質(zhì)疏松的防治?；衔铴唉┖突衔颕V不能夠抑制去卵 巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)和骨質(zhì)破壞，不可以提高血鈣濃度，不利于骨的沉積，對(duì)于由于雌激 素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松不具有防治作用，不可以用于骨質(zhì)疏松的防治。
[0057] 實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0058] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0059] 實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0060] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100 粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為55%和45%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為：將化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為55 %和45 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述骨質(zhì)疏松 為雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松。5. 如權(quán)利要求4所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述雌激素缺 乏是由卵巢功能缺失引起的。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述組合物抑 制雌激素缺乏引起的骨轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)和骨質(zhì)破壞。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述組合物提 高血清ALP、血清Ca和血清P的濃度。8. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述組合物提 高股骨骨密度。9. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述組合物提 高雙脛骨骨鈣和雙脛骨骨磷。
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗骨質(zhì)疏松藥物上的用途。本發(fā)明公開了一種組合物及其制備方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有抗骨質(zhì)疏松的作用，具有開發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物的價(jià)值。
【IPC分類】A61P19/10, C07D295/088, A61K31/41, A61K31/495, C07D257/04
【公開號(hào)】CN105287572
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510742452
【發(fā)明人】王卓婷
【申請(qǐng)人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月4日