基于dc的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療 性疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi) 腫瘤的40-50%，以發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死率高，成為腫瘤治療的難題。傳統(tǒng)治療方法主 要是手術(shù)和放化療來提高患者的生存機(jī)率。但是位于重要功能區(qū)的膠質(zhì)瘤很難做到全切 除。放射治療幾乎是各型膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療，但療效評價不一，除髓母細(xì)胞瘤對放療高度敏 感，室管膜瘤中度敏感外，其他類型對放療均不敏感?；熕幬锵抻谘X屏障及藥物的毒副 作用，療效尚不肯定。近年來，免疫治療成為腦膠質(zhì)瘤繼手術(shù)、放化療后的有效治療手段。與 其他方式聯(lián)合應(yīng)用，具體有很強(qiáng)的互補(bǔ)作用，對患者受損的免疫系統(tǒng)能夠起到恢復(fù)與重建 的獨(dú)特療效，從而進(jìn)一步防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中存在的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的雙向調(diào)節(jié)治療性疫苗及其制備方法，但經(jīng) ELISP0T法（固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)）檢測該治療性疫苗發(fā)現(xiàn)激發(fā)T細(xì)胞分泌IFN-γ的能 力較弱，治療效果不夠顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中神經(jīng)膠質(zhì)瘤疫苗性狀不穩(wěn)定、免 疫原性較弱、特異性不強(qiáng)等缺陷，提供一種免疫原性及特異性強(qiáng)的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治 療性疫苗。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治 療性疫苗的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0006] 獲取未成熟DC ;
[0007] 加入神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽與未成熟DC共培養(yǎng)；
[0008] 再加入腫瘤壞死因子-α和白介素或脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)，至DC成熟且負(fù)載上神經(jīng)膠 質(zhì)瘤抗原多肽。
[0009] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述白介素為 白介素-1。
[0010] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死 因子-α的濃度為l-10ng/ml、白介素-1的濃度為5-15ng/ml、脂多糖的濃度為l-10ng/ml。 [0011] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死 因子- α的濃度為濃度為5ng/ml、白介素-1的濃度為8ng/ml。
[0012] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死 因子- α的濃度為濃度為10ng/ml、白介素-1的濃度為5ng/ml。
[0013] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死 因子-α的濃度為濃度為lng/ml、白介素-1的濃度為15ng/ml。
[0014] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，加入腫瘤壞死 因子-α和白介素或脂多糖后繼續(xù)培養(yǎng)未成熟DC和神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽7-13天。
[0015] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述神經(jīng)膠質(zhì) 瘤抗原多肽是由FAT10154 162、FAT10155 163和FAT10 49 57表位肽基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物。
[0016] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述 FAT10154 162、FAT10155 163、FAT1049 57表位肽的摩爾比為 1 :1 :1〇
[0017] 在本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗的制備方法中，所述神經(jīng)膠質(zhì) 瘤抗原多肽與未成熟DC在含有粒-巨噬細(xì)胞因子和白介素-4的培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0018] 本發(fā)明還提供一種基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗，由上述基于DC的神經(jīng)膠質(zhì) 瘤治療性疫苗制備方法所獲得。
[0019] 實(shí)施本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗及其制備方法，可以達(dá)到以 下有益效果：通過本發(fā)明獲得的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗不僅性狀較穩(wěn)定，而且免 疫原性及特異性較強(qiáng)，能夠很好的調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的機(jī)體免疫機(jī)制，改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤引起 的肝臟免疫耐受的現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0020] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0021] 圖1為通過蛋白質(zhì)印跡法檢測出的本發(fā)明提供的基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫 苗所表達(dá)的蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明提供的一種基于DC的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗，其制備方法包括以下步驟：
[0024] (1)獲取未成熟DC ;
[0025] (2)加入神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽與未成熟DC共培養(yǎng)；
[0026] (3)再加入腫瘤壞死因子-α和白介素或脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)7-13天，至DC成熟且 DC負(fù)載上神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽。
[0027] 步驟（1)中，未成熟DC可來源于人體血液，但由于未成熟DC在血液中僅占單核細(xì) 胞總數(shù)的〇. 5-1. 0%，數(shù)量很少；因此，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，采取誘導(dǎo)單核細(xì)胞的方式獲 取未成熟DC，具體步驟為：
[0028] (11)從血液中分離出單核細(xì)胞；
[0029] (12)再加入體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)72h，對步驟（11)中獲得的單核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增；
[0030] (13)用體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行半量換液，并將步驟（12)中擴(kuò)增后的單核細(xì)胞定向 誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞。
[0031] 在步驟（11)中，單核細(xì)胞可以為CD34+和/或CD14+單核細(xì)胞，其中，CD34 +單核細(xì) 胞可以從骨髓、臍帶血或脾臟等分離得到；CD14+細(xì)胞從人外周血分離得到的。由于從臍帶 血中純化出CD34+單核細(xì)胞費(fèi)用昂貴；骨髓采集不易，而且容易污染，患者比較痛苦，擴(kuò)增費(fèi) 用昂貴；而脾臟來源受限等使得CD34+單核細(xì)胞獲取較困難；因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選采用 從人外周新鮮血液中分離篩選出CD14+單核細(xì)胞，從新鮮血液中獲取，相比經(jīng)過冷庫儲存或 者培養(yǎng)傳代之后的CD14+單核細(xì)胞，從新鮮血液中提取的CD14 +單核細(xì)胞離體時間不長，其 細(xì)胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于獲取DC。
[0032] ⑶14+單核細(xì)胞從人外周血分離的過程為：
[0033] 取人外周血20ml,用Ficon淋巴細(xì)胞分離液并根據(jù)Ficon淋巴細(xì)胞分離液使用說 明書分離出CD14+單核細(xì)胞，PBS溶液洗滌后按2. 5-5x10 7/3ml/孔接種于六孔板中，并用 RPMI-1640培養(yǎng)基（RPMI實(shí)驗(yàn)室出產(chǎn)的批號為1640的培養(yǎng)基）于37°C，5% 0)2條件下放 置培養(yǎng)90分鐘，收集貼壁細(xì)胞即CD14+單核細(xì)胞。
[0034] 步驟（12)和步驟（13)中的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液優(yōu)選為適宜于DC生長的含10%胎牛 血清、粒-巨噬細(xì)胞和白介素-4的RPMI-1640培養(yǎng)基。需要特別注意的是，由于DC相比非 貼壁細(xì)胞其能具有貼壁性，但是其貼壁性能并不強(qiáng)，而是偏向于半貼壁的類型，因此在步驟 (13)的培養(yǎng)的過程中需采用半量換液，以避免將目的DC吹成懸浮而流失。
[0035] 當(dāng)然可以理解的是，本發(fā)明獲得未成熟DC的途徑也并不局限于此，通過現(xiàn)有技術(shù) 中的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)單核細(xì)胞獲得的未成熟DC同樣適用于本發(fā)明。
[0036] 在步驟（2)中，優(yōu)選地，采用含有粒-巨噬細(xì)胞因子和白介素-4的培養(yǎng)基上進(jìn)行 DC與神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽的共培養(yǎng)。由于DC有簇狀生長的習(xí)慣，濃度太高，集結(jié)成團(tuán)，位于 中心的DC不易成熟，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原的負(fù)載，從而影響疫苗的免疫效果，因此，DC濃度 不易過高，在該步驟中，待未成熟DC在培養(yǎng)基中的濃度小于或等于5 X 105個/ml或?qū)⒉襟E (1)獲得未成熟DC的濃度調(diào)整為小于或等于5 X 105個/ml時，加入神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽進(jìn) 行預(yù)負(fù)載。
[0037] 由于未成熟DC表達(dá)能介導(dǎo)DC攝取抗原的一些膜受體如Fc受體，因而相比成熟 DC擁有更強(qiáng)的抗原攝取、加工和處理能力，因此，步驟（2)中利用未成熟DC與神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗 原多肽共培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽的預(yù)負(fù)載，促進(jìn)提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原多肽負(fù)載 量，同時，未成熟DC經(jīng)抗原致敏