Shroom3在慢性腎臟疾病和慢性異體移植腎病中的用圖
【專利說明】SHR00M3在慢性腎臟疾病和慢性異體移植腎病中的用途
[0001] 由于接受來自國立衛(wèi)生研究院的1U01AI070107-01號基金資助，美國政府對本發(fā) 明享有某些權利。
技術領域
[0002] 本申請涉及鑒別罹患腎臟疾病的患者和在腎異體移植物（allograft)接受者 中預測腎纖維化的發(fā)展和進展的方法。本發(fā)明包括用于鑒別罹患腎臟疾病的患者和用 于在腎異體移植物接受者中預測腎臟疾病和小管 -間質(zhì)纖維化（tubulo-interstitial fibrosis)的發(fā)展和進展的試劑盒。
【背景技術】
[0003] 慢性腎臟疾?。–hronic Kidney disease，CKD)影響10%的美國成年人，并且世 界范圍的發(fā)病率和患病率上升{Coresh J, 2007}。末期腎?。‥nd-stage renal disease， ESRD)需要腎置換治療（RRT)并且當前影響超過500, 000名美國成年人。除了導致末期腎 ?。‥SRD)的風險以外，CKD還增加心血管疾病和所有原因死亡的風險{Weiner D，2004}。小 管-間質(zhì)纖維化（TIF)是各種病因的CKD最終共同的病理過程，導致ESRD的發(fā)展。TIF也 是慢性異體移植腎?。╟hronic allograft nephropathy, CAN)的首要組成，并且與腎異體 移植物中的估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate, eGFR)的進行性 下降相關{Chapman J, 2005} {Nankivell BJ, 2003}。CAN 代表死亡截尾（death-censored) 長期移植物丟失的最常見原因，并通過慢性異體移植物異常指標評分（chronic allograft dysfunction index score，CADI 評分）而組織學地測定{Isoniemi Η, 1992} {Yilmaz S，2007}。迄今為止，沒有防止CKD或CAN進展的有效的抗纖維化療法。目前，一些有CKD 或CAN的患者將最終進展至ESRD并需要RRT。例如，腎異體移植物接受者代表了腎移植候 補名單上13. 5%的患者和2005年進行的所有移植的15% {Magee JC，2007}。腎異體移植 物接受者有30%的可能性在10年時需要RRT或再次移植{USRDS 2012}。RRT和ESRD護理 對于美國聯(lián)邦醫(yī)療保險是不成比例和迅速增長的財政負擔{Iglehart，2011}。因此，確定新 的敏感的生物標志物來預測腎纖維化發(fā)展是很關鍵的。此外，這些標志物可代表治療性介 入的靶標，以在早期防止TIF發(fā)展，從而防止向ESRD進展。
[0004] 基于異體移植物活檢的研究（因故的（for-cause)和程序性的（protocol))提供 了對早期異體移植物改變?nèi)绾闻c長期異體移植物結果相關聯(lián)的認識{Gago M，2012} {Rush D, 1994} {Seron D, 1997} {Cosio F, 2005} {Park W, 2010}。更近期地，已顯示出清楚的活檢 和血液基因表達譜（轉(zhuǎn)錄組）特征，來區(qū)分有急性排斥的患者、有慢性排斥的患者、處于免 疫抑制的患者和手術耐受的接受者{Akalin E，2010} {Akalin E，2001} {Flechner S，2004} {Donauer J, 2003} {Sarwal M, 2003}{Reeve J, 2009} {Scherer A,2003} {Sagoo P,2010} {Newell K, 2010}。這些基因面板（gene panel)能在單獨的組織學分類標準基礎上改 進{Sarwal M, 2003} {Reeve J, 2009}。全基因組關聯(lián)（Genome-wide association)研究 也強烈地將Shroom3基因（rsl7319721)的單核苷酸多態(tài)性（SNP)與基于人群的歐洲祖 系群組中由eGFR表征的偶發(fā)性和流行性CKD相聯(lián)系{Kottgen A, 2009} {Boger C，2011}。 Shr〇〇m3基因編碼含PDZ結構域的蛋白質(zhì)，其可直接結合絲狀肌動蛋白，并調(diào)節(jié)其在細胞 中的亞細胞分布。在小鼠中，Shroom3完全缺失或缺陷導致開放性神經(jīng)管缺陷和新生兒 死亡{Hildebrand J, 1999}。在MDCK腎細胞系中，Shroom3定位于頂端和銜接點復合物 (junctional complex)，并且對正常上皮細胞表型的維持至關重要{Hildebrand J, 2005}。 也已知Shroom3的C-端結構域與Rho-激酶（ROCKs)相互作用，從而促使肌球蛋白磷酸化 和肌動蛋白收縮{Nishimura T，2008}。然而，尚不了解Shroom3是否在CKD或CAN的腎纖 維化中發(fā)揮作用。
[0005] 技術中需要的是一些標志物，其表達可用來鑒別罹患腎臟疾病的患者，并預測腎 纖維化的發(fā)展。此外，需要此類標志物來鑒別面臨發(fā)展CAN的風險的腎異體移植物接受者， 并代表治療性介入的靶標，以在早期防止TIF發(fā)展，從而防止向ESRD進展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] Shr〇〇m3是新的候選基因，其在腎異體移植物中的表達先于腎功能降低和TIF，并 預測腎功能降低和TIF。更高的異體移植物Shr 〇〇m3水平預測CAN的組織學進展。也發(fā) 現(xiàn)這些關系在白種人供體腎的接受者（recipients of white-donor kidneys, WDKR)中 相關性最好。該發(fā)現(xiàn)首次確認，之前記述的慢性腎臟疾?。–KD)相關的Shroom3基因座 (rsl7319721) {Kottgen A, 2009} {Boger C, 2011}通過增加 Shroom3 表達而介導其效果。此 外，發(fā)現(xiàn)Shr〇〇m3在經(jīng)典TGF-β (beta)信號傳導和膠原蛋白-I的產(chǎn)生中具有有益的作用。
[0007] 在一方面，本發(fā)明提供一種在接受了來自供體的腎移植的患者中鑒別發(fā)展慢性異 體移植腎病（CAN)的風險的方法，其包括：鑒別腎供體的種族；確定在移植后預定的時間從 患者獲取的腎活檢標本中的SHR00M 3表達水平；將活檢標本中的SHR00M 3表達水平與對 照中的SHR00M表達水平相比較；確定異體移植物中的SHR00M 3表達水平是否顯著高于對 照，并且如果標本中的SHR00M 3表達水平顯著高于對照，則將患者診斷為面臨CAN的風險。
[0008] 在進一步的方面，本發(fā)明提供一種在接受了來自供體的腎的患者中鑒別發(fā)展慢性 異體移植腎病（CAN)的風險的方法，其包括以下步驟：鑒別腎供體的種族；從患者獲取腎異 體移植物活檢樣品；確定所述活檢中的SHR00M3表達水平；將所述活檢中的SHR00M3表達 水平與對照中的SHR00M3表達水平相比較，并且如果樣品中的SHR00M3水平顯著高于對照 且腎供體為高加索人，則告知患者面臨發(fā)展CAN的風險。
[0009] 還在進一步的方面，本發(fā)明提供一種在接受了來自供體的腎的高加索人患者中鑒 別發(fā)展腎病的風險的方法，其包括以下步驟：確定所述供體是否表達rs 17319721 SNP風 險等位基因，并進行基因分析以確定所述供體對于所述風險等位基因是否為純合的，其中 如果所述供體對于所述風險等位基因是純合的，那么所述患者面臨發(fā)展腎病的風險。
[0010] 還在進一步的方面，本發(fā)明提供一種在高加索人腎供體中鑒別發(fā)展纖維化的風險 的方法，其包括以下步驟：確定所述供體是否表達:TS 17319721 SNP風險等位基因，并進行 基因分析以確定所述供體對于所述風險等位基因是否為純合的；其中如果所述供體對于所 述風險等位基因是純合的，那么所述供體面臨纖維化的風險。
[0011] 還在進一步的方面，本發(fā)明提供一種鑒別高加索人患者發(fā)展選自由慢性異體移植 腎?。–AN)和慢性腎臟疾?。–KD)組成的組的進行性腎臟疾病的風險的方法，其包括：確定 在預定的時間從患者獲取的腎活檢標本中的SHROOM 3表達水平，將活檢標本中的SHROOM 3表達水平與對照中的SHROOM 3表達水平相比較，確定標本中的SHROOM 3表達水平是否顯 著高于對照，并且如果標本中的SHROOM 3表達水平顯著高于對照，則將患者診斷為面臨所 述疾病的風險。
[0012] 還在進一步的方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別罹患腎病和面臨發(fā)展CAN或CKD 風險的患者的試劑盒，其包括置于單獨容器中的：在SHR00M3表達的RT-PCR測定和rs 17319721 SNP風險等位基因的RT-PCR測定中使用的引物，陽性對照，緩沖液和使用說明。
[0013] 根據(jù)說明書、權利要求和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將對本領域技術人員變 得明顯。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :描述本文報道的研究中參與者數(shù)量，并示出對160名參與者從3個月異體移 植物活檢提取RNA用于微陣列的圖表。在這160名患者中，在移植后12個月時，147人報告 有 eGFR-肌酐（creatinine)，101 人報告有 CADI-12,和 85 人報告有 CADI-3。
[0015] 圖2A-2D :描述下列內(nèi)容的圖表：（2A) 3個月時的異體移植物的對數(shù)Shroom3表達 (微陣列）與12個月時的eGFR肌酐的相關性（r = -0· 20 ;p = 0· 007) ; (2B) 3個月時異體移 植物的對數(shù)Shroom3表達（微陣列）與CADI-12個月的相關性（皮爾遜相關系數(shù)（Pearson) R-0. 22 ;p = 0. 027) ; (2C)與沒有顯著纖維化進展的供體（CADI增量（Delta CADI)〈2 ;n = 68)相比，所有具有進行性纖維化的供體中Shroom3的表達更高（CADI增量=2或大于2 ; η = 17);和（2D)在死亡供體腎中，3個月Shroom3表達與12個月CADI之間的相關性最強 (r = 0. 34 ;p = 0. 0088)[線表示平均值；須=SD]。
[0016] 圖3A-3D :描述下列內(nèi)容的圖表：(3A)3個月時的Shroom3表達的倍數(shù)變化 (RT-PCR)與CADI-12個月的相關性（皮爾遜相關系數(shù)r = 0· 4169 ;p = 0· 0103) ; (3B) 3個 月時的Shroom3表達的倍數(shù)變化（RT-PCR)與12個月時eGFR肌酐的相關性（r = 0. 3230 ; p = (3C) 3個月時的異體移植物的對數(shù)Shroom3表達（微陣列）與3個月時Shroom3表達 的倍數(shù)變化之間的相關性（皮爾遜相關系數(shù)r = 0. 5613 ;p = 0. 0008);和（3D) 3個月時對 數(shù)Shroom3表達與同時的CADI評分之間的關系的回歸線-未能鑒別出關系。
[0017] 圖4A-4C :描述下列內(nèi)容的圖表：(4A)在白種人供體腎的接受者中，3個月時的異 體移植物的對數(shù)Shroom3表達與CADI-12個月的相關性（r = 0. 2538 ;p = 0. 02) ; (4B) 在白種人供體腎的接受者中，異體移植物的對數(shù)Shr〇〇m3表達與eGFR-肌酐的相關性（r =-0. 25 ;p = 0. 008);和（4C)與沒有顯著的纖維化進展的WDKR(CADI增量〈2 ;n = 56)相 比，有纖維化進展的WDKR(CADI增量彡2 ;n = 14)中的對數(shù)Shroom3表達更高[*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0018] 圖5A-5C :描述下列內(nèi)容的圖表：(5Α)在活體供體接受者（living donor recipients, LDR)中，3個月時的異體移植物的對數(shù)Shroom3表達（微陣列）與12個月CADI 之間沒有相關性；和（5B)在非WDKR中；（5C)在非-WDKR中，3個月Shroom3與eGFR-12個 月沒有相關性。
[0019] 圖6A-6B :示出下列內(nèi)容的圖表：（6A)Shroom3 SNP(rsl7319721)在（供體和 接受者當中的）白種人和非白種人之間分布不同。白種人的效應等位基因發(fā)生率更高 (p〈0. 0001)。（6B):供體腎中的風險等位基因的純合性與異體移植物Shr〇〇m3表達的顯著 增加有關（P = 〇. 033)，（須：第5至第95百分位；線位于中位數(shù)處；p = 0. 0183) [*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0020] 圖7A-7C :示出下列內(nèi)容的圖表：(7Α、7Β分別示出）供體中有效應等位基因（A)存 在時，Shroom3表達在WDKR和非WDKR中都增加。和（7C)接受者的SNP類型并不顯著影響 Shroom3表達（須：最小值-最大值；線位于中位數(shù)處；p = 0· 0309) [*ρ〈0· 05 ;#ρ〈(λ 001 ; ***ρ〈0· 0001]。
[0021] 圖8Α-8Β :示出下列內(nèi)容的圖表：(8Α)根據(jù)ESRD病因?qū)W，在354名白種人接受者中 的Shr〇〇m3 SNP等位基因流行率（示為％ )。與無關供體相比，患有來自糖尿病的ESRD的 接受者，有顯著更高的風險等位基因流行率（49% )。（8B):研究的3247名患者中Shr〇〇m3 SNP等位基因流行率。風險等位基因流行率在有CKD的糖尿病患者中最高（51%) [*p〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0022] 圖9 :下文實施例5中使用的螢光素酶報告質(zhì)粒的構建體圖。
[0023] 圖10Α-10Β :圖IOA是示出具有表現(xiàn)比G-等位基因更高的活性的A-等位基因增 強子元件的螢光素酶報告質(zhì)粒，和僅有啟動子的質(zhì)粒的圖；圖IOB是說明從293-Τ細胞中提 取的核蛋白表現(xiàn)出向含G-等位基因的核苷酸序列增強的結合的免疫印跡。
[0024] 圖11Α-11Β :圖IlA是示出下列內(nèi)容的圖：通過RT-PCR測得，在PRCEC中，TGF-β 處理以劑量依賴（上至5ng/ml)和時間依賴的方式增加 Shroom3(誤差棒（error bar):表 示在PRCEC中，TGF- β處理以時間依賴的方式增加 Shroom3 (上至5ng/ml))(誤差棒：平均 值土標準誤）[*ρ〈0· 05 ;#p〈0. 001 ;*#ρ〈0· 0001]。圖IlB是說明TGF-β以時間依賴的 方式增加 Shroom3的免疫印跡。
[0025] 圖12A-12B :圖12A是示出實施例6的結果的圖表，其顯示TGF-β以β-聯(lián)蛋白/ TCF712依賴的方式增加 Shr〇〇m3表達。槲皮素 （β -聯(lián)蛋白抑制劑）和BC-21 (TCF7L2抑制 劑）抑制TGF-β誘導的Shroom3表達增加（RT-PCR)。12Β是示出Shroom3蛋白以β -聯(lián) 蛋白/TGF-β依賴的方式增加的免疫印跡。
[0026] 圖13Α-13Β :圖13Α和圖13Β是示出分別由RT-PCR和免疫印跡所確認的在 PC-SHR00M3轉(zhuǎn)染的PRCEC中Shroom3過表達的圖表（平均值土標準誤）[*ρ〈0. 05 ; **ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001]。
[0027] 圖14A-14C:圖14Α是示出實施例7的結果的圖，并通過RT-PCR顯示在TGF-β 誘導的促纖維化（prof ibrotic)基質(zhì)標志表達上的效果。Shroom3過表達單獨增加膠 原蛋白-1和纖連蛋白產(chǎn)生，而敲減阻抑這些基質(zhì)標志（平均值土標準誤）[*P〈0. 05 ; **p〈0. 001 ;#*p〈0. 0001];圖14B是示出Shroom3過表達促進15分鐘時PRCEC中響應 TGF-β的Smad-3磷酸化的免疫印跡（右）；圖14C為照片，示出與TGFf3 1處理的沒有 SHR00M3過表達的細胞相比，TGF-β 1處理的SHR00M3-過表達的PRCEC也發(fā)展出更明顯的 絲狀肌動蛋白束（圖14C-上部和下部）。
[0028] 圖15A-15B :示出實施例7的結果的圖，其建立Shroom3在有PC-SHR00M3轉(zhuǎn)染的 PRCEC中過表達，分別由RT-PCR(圖15A)和免疫印跡（圖15B)確認（平均值土標準誤） [*ρ〈0· 05 ;**p〈0. 001 ;***ρ〈0· 0001]
[0029] 圖16A-16D : (16Α)示出對R0SA-RTTA(上圖）和COLTGM(下圖）的代表性基因型 分型結果。（16B)示出來自非Dox飼養(yǎng)對比Dox飼養(yǎng)的小鼠 （η = 2)的UUO腎的小鼠腎皮 質(zhì)裂解物中的磷酸化-SMAD3 (P-SMAD3)、總SMAD3 (SMAD3)、Shroom3和β -肌動蛋白的免疫 印跡。（16C)左至右-示出來自對比腎和非Dox飼養(yǎng)動物的腎，和Dox飼養(yǎng)動物的UUO腎的 代表性低倍（IOx)圖像的照片。上排-高碘酸希夫染色（Pe