用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于制備可W合適地用于再生治療、細(xì)胞培養(yǎng)等的微粒脫細(xì)胞組織的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)從其他的生物組織移植移植物時(shí)，接受移植物的主體的組織的排斥成為問題。 為了解決此問題，預(yù)期開發(fā)假體。已經(jīng)嘗試各種大分子作為材料。然而，由于此材料和生物 組織之間的相容性低，移植物可W從接合部位掉出或可能發(fā)生傳染病。因此，為了改善與 生物組織的相容性，已經(jīng)開發(fā)技術(shù)W使用脫細(xì)胞生物組織，其是作為移植物的在從生物組 織去除細(xì)胞之后保留的支持組織。對(duì)于生物組織的脫細(xì)胞，已知的方法是使用表面活性劑 (例如參考專利參考文獻(xiàn)1和2)，使用酶（例如參考專利參考文獻(xiàn)3)，使用酸化劑（例如參 考專利參考文獻(xiàn)4)，用超高流體靜力壓處理（例如參考專利參考文獻(xiàn)5至7)等。
[0003] 粒狀或粉狀形式的脫細(xì)胞組織（微粒脫細(xì)胞組織）也是已知的。微粒脫細(xì)胞組織 已經(jīng)用于通過其向患病部位（affectedsites)注射而促進(jìn)患病部位的再生和治愈，或模塑 用作移植物（例如參考專利參考文獻(xiàn)8至10)。迄今已知的微粒脫細(xì)胞組織已經(jīng)通過使用 表面活性劑來制備。然而，通過用超高流體靜力壓處理制備的微粒脫細(xì)胞組織是未知的。
[0004] 專利參考義獻(xiàn)1:日本專利公開號(hào)60-501540 專利參考專獻(xiàn)2:日本專利公開號(hào)2003-518981 專利參考專獻(xiàn)3:日本專利公開號(hào)2002-507907 專利參考專獻(xiàn)4:日本專利公開號(hào)2003-525062 專利參考專獻(xiàn)5:日本專利公開號(hào)2004-094552 專利參考專獻(xiàn)6:W0 2008/1。530 專利參考專獻(xiàn)7:日本專利公開號(hào)2013-502275專利參考專獻(xiàn)8:日本專利公開號(hào)07-509638 專利參考專獻(xiàn)9:日本專利公開號(hào)2002-518319 專利參考專獻(xiàn)10:日本專利公開號(hào)2012-505013。
[0005] 發(fā)明公開內(nèi)容 (本發(fā)明待解決的技術(shù)問題） 迄今已知的微粒脫細(xì)胞組織不引起移植物排斥，且可用于患病部位的再生和治愈。然 而，存在其不顯示足夠有效的組織再生和當(dāng)用作用于細(xì)胞培養(yǎng)的材料時(shí)顯示細(xì)胞毒性的問 題。
[0006] (用于解決問題的方式） 本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)真研究W解決上述問題，且作為結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在介質(zhì)中應(yīng)用高 流體靜力壓而脫細(xì)胞的微粒動(dòng)物組織顯示細(xì)胞吸引的效果和誘導(dǎo)細(xì)胞分化的效果，但在細(xì) 胞培養(yǎng)的同時(shí)不顯示細(xì)胞毒性，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明設(shè)及用于制備微粒脫細(xì)胞 組織的方法，其包括將高流體靜力壓應(yīng)用于介質(zhì)中的動(dòng)物來源的組織的步驟。
[0007] 具體地，本發(fā)明包括W下發(fā)明。
[0008] [1]用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法，其包括將高流體靜力壓應(yīng)用于介質(zhì)中的動(dòng) 物來源的組織的步驟。
[0009] [2]根據(jù)[1]的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法，其中所述高流體靜力壓為2至 1, 500MPaO
[0010] 閒根據(jù)山或凹的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法，其中在粉碎動(dòng)物來源的組 織之后應(yīng)用所述高流體靜力壓。
[0011] W根據(jù)山或凹的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法，其中粉碎通過將高流體靜 力壓應(yīng)用于介質(zhì)中的所述動(dòng)物來源的組織而獲得的動(dòng)物來源的脫細(xì)胞組織。
[001引 閒根據(jù)山至M中任一項(xiàng)的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法，其中用不包含陰 離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑的洗涂液洗涂通過將高流體靜力壓應(yīng)用于介質(zhì) 中的所述動(dòng)物來源的組織而獲得的動(dòng)物來源的脫細(xì)胞組織。
[001引 [6]微粒脫細(xì)胞組織，其通過根據(jù)山至閒中任一項(xiàng)的用于制備微粒脫細(xì)胞組織 的方法制備。
[0014] [7]使用根據(jù)[6]的微粒脫細(xì)胞組織的用于移植或治療的材料。
[001引 閒使用根據(jù)[6]的微粒脫細(xì)胞組織的用于細(xì)胞培養(yǎng)的材料。
[001引發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明的方法，獲得微粒脫細(xì)胞組織，其不顯示細(xì)胞毒性，但顯示細(xì)胞吸引的效果 和誘導(dǎo)細(xì)胞分化的效果，且顯示組織再生的高效果。由于其微粒形式，通過本發(fā)明的方法獲 得的微粒脫細(xì)胞組織，不限于其可應(yīng)用的部位，而是可W應(yīng)用于各種部位。
[0017] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示不添加NGF的實(shí)施例2中的神經(jīng)突增生測(cè)試的結(jié)果。
[001引圖2顯示不添加NGF的實(shí)施例3中的神經(jīng)突增生測(cè)試的結(jié)果。
[0019] 圖3顯示不添加NGF的空白的神經(jīng)突增生測(cè)試的結(jié)果。
[0020] 圖4顯示添加NGF的空白的神經(jīng)突增生測(cè)試的結(jié)果。
[0021] 圖5顯示實(shí)施例1中的皮下填補(bǔ)法測(cè)試中在第28天的皮下囊袋（左圖）和染色 的大鼠組織的切片（右圖）。
[0022] 圖6顯示實(shí)施例1中的凍傷模型測(cè)試中的測(cè)試前外觀（左上圖）、測(cè)試后外觀（右 上圖）和染色的大鼠組織的切片（下圖）。
[0023] 圖7顯示凍傷模型測(cè)試中的空白的測(cè)試前外觀（左上圖）、測(cè)試后外觀（右上圖） 和染色的大鼠組織的切片（下圖）。
[0024] 實(shí)施本發(fā)明的最佳方式 下面詳細(xì)解釋本發(fā)明。
[00巧]牛物紀(jì)織 本發(fā)明的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法中使用的生物組織沒有特別限制，只要它們 包含來自脊椎動(dòng)物的細(xì)胞，但鑒于低排斥優(yōu)選地是來自哺乳動(dòng)物或禽類的那些，且鑒于可 用性更優(yōu)選地是來自哺乳動(dòng)物的家畜或禽類的家畜或人的那些。哺乳動(dòng)物的家畜包括牛、 馬、駱駝、美洲駝、驢、巧牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、狗、貍、關(guān)鼠、狐貍、貓、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠、 大鼠、小鼠、松鼠、綻熊等。禽類的家畜包括長(zhǎng)尾嬰鳥醋、嬰鳥醋、雞、鴨、火雞、碟、珍珠雞、錐、駝 鳥、鶴譜等。其中，鑒于穩(wěn)定的可用性，來自豬、兔和人的生物組織是優(yōu)選的。
[0026]由其獲得生物組織的身體部位可W是具有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的那些，包括肝、腎、輸 尿管、膀脫、尿道、舌、扁桃體、食管、胃、小腸、大腸、肛口、膜腺、屯、臟、血管、脾、肺、腦、骨、脊 髓、軟骨、睪丸、子宮、輸卵管、卵巢、胎盤、角膜、骨骼肌、肌腫、神經(jīng)、皮膚等。鑒于其高組織 再生，由其獲得生物組織的身體部位優(yōu)選地是軟骨、骨、肝、腎、屯、臟、肺、腦和脊髓。去除之 后，優(yōu)選處理生物組織，用于防止腐敗或功能降低，包括用化學(xué)品殺菌處理，通過冷藏冷凍 處理等，鑒于對(duì)組織的低傷害，優(yōu)選冷凍處理。
[0027] 粉巧巧驟 在本發(fā)明的用于制備微粒脫細(xì)胞組織的方法中，可W在從去除生物組織、將高流體靜 力壓應(yīng)用于生物組織、洗涂和去除破壞的細(xì)胞至獲得微粒脫細(xì)胞組織的任何階段將生物組 織（或脫細(xì)胞組織）粉碎成微粒。然而，它們可W優(yōu)選至少在洗涂和去除細(xì)胞之前粉碎，因 為微粒形式的破壞的細(xì)胞可W比其在形狀得到維持的生物組織中更容易地洗涂和去除。
[0028] 用于粉碎生物組織的方法包括，但不限于，當(dāng)生物組織在常溫時(shí)粉碎生物組織，冷 藏生物組織和在冷凍條件下將其粉碎，等。然而，在常溫下難W粉碎的生物組織諸如軟組織 (例如，腎）的情況下，它們優(yōu)選在冷凍條件下進(jìn)行粉碎。在冷凍條件下粉碎的情況下，由 于組織有時(shí)由于在約〇°C的冰晶生長(zhǎng)而受損，粉碎溫度優(yōu)選為-80°c至-5°c，更優(yōu)選-50°c 至-l〇°C，最優(yōu)選-40°C至-15°C。由于優(yōu)選在冷凍條件下保存生物組織，因此在冷凍條件下 保存的生物組織的粉碎將簡(jiǎn)化該步驟，且允許用高流體靜力壓處理微粒生物組織。
[0029] 生物組織也可W在干燥之后粉碎，其中粉碎之后的分類是更容易的。生物組織的 干燥方法包括用加熱干燥、減壓下干燥、凍干、用有機(jī)溶劑脫水等，優(yōu)選凍干和用有機(jī)溶劑 脫水，鑒于細(xì)胞和核酸的