制備鯊烯的改良方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本發(fā)明專利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/IB2011/001397,國(guó)際申請(qǐng)日為2011年5月 12日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?201180023553. 3"，發(fā)明名稱為"制備鯊烯的改良方 法"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/395, 448(2010年5月12日提交）的優(yōu)先權(quán)，其全部 內(nèi)容通過(guò)引用納入本文以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明處于制造具有適于藥學(xué)應(yīng)用純度的鯊烯的領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0004] 鯊魚(yú)肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物（C3(]HM;[(CH 3)2C[= CHCH2CH2C(CH3)]2= CHCH 2-]2;2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳己 烯；CAS RN 7683-64-9)。已知鯊烯用于人類疫苗中的水包油乳液，例如用于佐劑化流感病 毒疫苗的MF59乳液。鯊烯還用于其他藥物制品（如油膏、栓劑）和化妝品。
[0005] 目前鯊烯的來(lái)源主要是魚(yú)油，尤其是鯊魚(yú)肝油。使用提取自鯊魚(yú)肝油的鯊烯可產(chǎn) 生相關(guān)問(wèn)題，尤其是不能維持嚴(yán)格的制造標(biāo)準(zhǔn)時(shí)（如諾華公司（Novartis)生產(chǎn)MF59期間 所用的那些）。例如，鯊魚(yú)可被對(duì)人也有感染性的病原體感染，或產(chǎn)生對(duì)人有害的物質(zhì)，且可 能存在TSE或TSE樣鯊魚(yú)制劑[如參考文獻(xiàn)1-3]。此外，鯊魚(yú)可含有人類毒素如真鯊毒素 (carchatoxin)。另外，鯊魚(yú)可含有人類對(duì)之過(guò)敏的蛋白。人類過(guò)敏的常見(jiàn)魚(yú)蛋白是在鯊魚(yú) 中發(fā)現(xiàn)的小清蛋白。因此鯊烯的廉價(jià)低級(jí)別來(lái)源不適于人類藥學(xué)應(yīng)用。在鯊烯是部分免疫 佐劑的情況中，其對(duì)人受體傷害的風(fēng)險(xiǎn)增加，這是由于根據(jù)定義，所述佐劑可誘導(dǎo)針對(duì)雜質(zhì) 的強(qiáng)烈不利免疫應(yīng)答。
[0006] 找到制備適于藥學(xué)應(yīng)用的鯊烯的其他和改良過(guò)程是有用的，即所述鯊烯是滿足調(diào) 節(jié)標(biāo)準(zhǔn)且不含可傷害人類的污染物、病原體、病毒、人毒素或蛋白的產(chǎn)品。本發(fā)明過(guò)程特定 用于純化源自鯊魚(yú)肝油的鯊烯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供從動(dòng)物源含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包括步驟：(a) 在溫度！\進(jìn)行純化蒸餾；(b)在溫度T 2進(jìn)行變性蒸餾；其中步驟（a)和（b)可以任一順序 進(jìn)行；!\和T 2足以使鯊烯沸騰；T 2>1\;且T 2彡20(TC。所述動(dòng)物來(lái)源通常是魚(yú)類來(lái)源，如鯊 魚(yú)肝油（或其提取物），即本發(fā)明提供從鯊魚(yú)肝油或從鯊魚(yú)肝油提取物中制備鯊烯的方法。
[0008] 本發(fā)明還提供從含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包括步驟（a)在溫度 !\進(jìn)行純化蒸餾；(b)在溫度T 2進(jìn)行變性蒸餾；其中步驟（a)和（b)可以任一順序進(jìn)行；T1和T2足以使鯊烯沸騰；T 'HOtC ;且T2>200°C。有用的所述含鯊烯組合物可為鯊魚(yú)肝油或 其提取物。
[0009] 本發(fā)明還提供重蒸餾含至少99 %鯊烯的組合物的方法，所述重蒸餾是在T2的溫度 下進(jìn)行的變性蒸餾；其中τ2> 200。該重蒸餾可將組合物中的含水量降低到如〈0. 01%。
[0010] 本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)適于藥學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)品。具體地，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn) 純化的鯊烯，其不含可傷害人類的污染物、病原體、病毒、人類毒素或蛋白，尤其是蛋白小清 蛋白。
[0011] 本發(fā)明還提供制造水包油乳液的方法，包括用上述方法準(zhǔn)備的鯊烯制備乳液。
[0012] 本發(fā)明還提供制備疫苗組合物的方法，包括如上所述制備乳液，并將所述乳液與 抗原混合。
[0013] 本發(fā)明還提供制備疫苗藥盒的方法，包括如上所述制備乳液并將乳液與抗原組分 一起包裝到藥盒中作為藥盒組分。
[0014] 本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的鯊烯。
[0015] 本發(fā)明還提供含本發(fā)明所述方法制備的鯊烯的水包油乳液。
[0016] 本發(fā)明還提供含本發(fā)明所述方法制備的鯊烯的疫苗。
[0017] 本發(fā)明還提供本發(fā)明方法所述制備的鯊烯在疫苗中的應(yīng)用。
[0018] 純化蒸餾
[0019] 含鯊烯組合物可源自任何來(lái)源，如黑液皂化物撇渣；妥爾油皂；粗制妥爾油；妥爾 油樹(shù)脂；甘蔗油；油和脂肪的提取、脫膠和精煉的殘余物；脂肪酸和酯類的蒸餾殘余物；植 物油的脫臭餾出物；橄欖油；大豆油；米糠油；鯊魚(yú)肝油；牛脂；.咖啡油；魚(yú)油；鱈魚(yú)肝油； 麥胚芽油；玉米胚芽油；棕櫚油；酸渣樹(shù)油（andiroba oil);和番茄殘余物的油。具體地，含 鯊烯的化合物可源自鯊魚(yú)肝油。
[0020] 所述純化蒸餾從含鯊烯組合物中移除雜質(zhì)，產(chǎn)生純化組合物。含鯊烯組合物通常 是液體。純化蒸餾前，含鯊烯組合物可含有雜質(zhì)如角鯊胺、烷基甘油、脂肪酸（如Ω-3-脂 肪酸）、維生素 A和D、姥鮫烷（pristine)、甘油三酸酯、甘油醚和脂肪醇。
[0021] 所述純化蒸餾在溫度T1進(jìn)行，其中T 以使鯊烯沸騰，即T i可大于或等于鯊烯的 沸點(diǎn)。760mm Hg(即1個(gè)大氣壓）時(shí)鯊烯的沸點(diǎn)為429-430°C。
[0022] 液體的沸點(diǎn)表示該化合物液相的蒸氣壓等于作用于該液體表面上的外部壓力的 溫度。因此，鯊烯的沸點(diǎn)，也即T1的下限取決于施加于含鯊烯組合物的表面的外部壓力。該 現(xiàn)象為本領(lǐng)域熟知，且技術(shù)人員能計(jì)算所用給定蒸餾壓力下觀察到的鯊烯沸點(diǎn)。或者，技術(shù) 人員能基于所需觀察到的鯊烯沸點(diǎn)來(lái)計(jì)算所需的蒸餾壓力。所述計(jì)算可用列線圖進(jìn)行。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在至少70°C的溫度進(jìn)行，如至少75 °C或至少 80°C。在另一實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在低于140°C的溫度進(jìn)行，如低于130°C、低于 120°C、低于110°C、低于100°C、低于95°C、低于90°C或低于85°C。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在接近真空下進(jìn)行。具體地，所述純化蒸餾可 在至少0. 5 μ m Hg的壓力下進(jìn)行，如至少0. 75 μ m Hg或至少1 μ m Hg。所述純化蒸餾可在 低于5 μπι Hg的壓力下進(jìn)行，如低于2. 5 μπι Hg或低于2 μπι Hg。
[0025] 本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括上述引用的最小和最大溫度以及最小和最大壓力的 組合。
[0026] 所述純化蒸餾可產(chǎn)生含至少95 %鯊烯的組合物，如至少96 %鯊烯、至少97 %鯊 烯、至少98 %鯊烯、至少99 %鯊烯、至少99. 5 %鯊烯、至少99. 8 %鯊烯、至少99. 9 %鯊烯或 甚至100%鯊烯。
[0027] 本文所引全部百分比是重量百分比且可用氣相色譜（GC)測(cè)量。GC技術(shù)可通過(guò) 將溶于己烷的鯊烯樣品注射到配有火焰離子檢測(cè)器（FID)的氣相色譜上來(lái)進(jìn)行。分析可 在30m X 0.32mm X 0.50mm毛細(xì)管柱上進(jìn)行，維持于200°C持續(xù)2分鐘，然后以每分鐘提高 12°C升到310°C，在此維持9分鐘。注射孔和FID分別維持于300°C和320°C。鯊烯峰值的 鑒定用GC/MS(用質(zhì)量選擇檢測(cè)器的氣相色譜）建立。純度報(bào)告為鯊烯峰面積占色譜中所 有峰面積之和的百分比。
[0028] 所述純化蒸餾可在所述變性蒸餾之前進(jìn)行，產(chǎn)生純化的組合物?；蛘撸黾兓?餾可在所述變性蒸餾之后進(jìn)行，產(chǎn)生變性的純化組合物。
[0029] 變性蒸餾
[0030] 鯊魚(yú)和因而源自鯊魚(yú)肝油的鯊烯可含有人類過(guò)敏的蛋白。人類可能過(guò)敏的常見(jiàn)魚(yú) 蛋白是在鯊魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的小清蛋白。此外，污染蛋白或材料可在例如純化蒸餾之后或作為鯊 烯的降解產(chǎn)物而被引入鯊烯組合物中?？赡艿奈廴镜鞍谆虿牧习ū?、乙醛、甲醛和水。 優(yōu)選地，變性蒸餾步驟使含鯊烯組合物變性和/或從中移除蛋白，尤其是小清蛋白和任何 污染蛋白，從而提供變性的組合物。本發(fā)明方法的另一優(yōu)點(diǎn)是變性蒸餾可保證含鯊烯組合 物中存在的任何潛在病毒失活和/或從純化的組合物中移除。因此所述變性組合物用于人 類應(yīng)用比非變性組合物安全。
[0031] 不希望被理論所限制，鯊烯的沸點(diǎn)取決于施加在含鯊烯組合物表面的外部壓力。 然而，含鯊烯組合物中存在的任何蛋白會(huì)變性的溫度通常獨(dú)立于施加在含鯊烯組合物表面 的外部壓力。因此，變性蒸餾可在特定溫度下進(jìn)行，而不考慮進(jìn)行蒸餾的壓力。具體地，所 述變性蒸餾可在T2的溫度下進(jìn)行，其中T2可大于或等于200°C，如大于或等于205°C、大于 或等于210°C、大于或等于215°C、大于或等于220°C、大于或等于230°C、大于或等于240°C、 大于或等于250°C、大于或等于260°C。
[0032] 所述變性蒸餾可在低于500 °C的溫度下進(jìn)行如低于480 °C、低于450 °C、低于 420°C、低于 400°C、低于 350°C或低于 300°C。
[0033] 變性蒸餾可在接近真空下進(jìn)行。具體地，所述變性蒸餾可在至少0. 5mm Hg的壓力 下進(jìn)行，如至少0.6mm Hg、至少0.7mm Hg或至少0.8mm Hg。所述變性蒸饋可在低于5mm Hg 的壓力下進(jìn)行，如低于4mm Hg、低于3mm Hg、低于2mm Hg、低于1.5mm Hg、低于Imm Hg或低 于 0· 9mm Hg〇
[0034] 本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括上述引用的最小和最大溫度以及最小和最大壓力的 組合。
[0035] 為了在該高溫下進(jìn)行變性蒸餾，優(yōu)選使用將含鯊烯組合物與熱表面接觸的設(shè)備。 熱表面可維持在如上所定義的溫度T2，所述熱表面周圍的壓力可為上述定義的壓力以用于 變性蒸餾。所述熱表面周圍的壓力可選擇成確保觀察到的鯊烯沸點(diǎn)是T2或更小。隨著含鯊 烯組合物與所述熱表面接觸，在所述熱表面周圍壓力下沸點(diǎn)低于T2的那些組合物成分（包 括鯊烯）會(huì)蒸發(fā)。未蒸發(fā)組分如蛋白保持在熱表面上，且可變性并從鯊烯中分離。
[0036] 變性蒸餾前，含鯊烯組合物可包括85% -99. 9%的鯊烯，如95% -99. 5%的鯊烯、 95% -99. 5%的鯊烯或97% -99. 5%的鯊烯。
[0037] 所述變性蒸餾可產(chǎn)生具有較高鯊烯百分比的鯊烯組合物。具體地，所述變性蒸餾 可產(chǎn)生至少含95%鯊烯的變性組合物，如至少99%鯊烯、至少99. 5%鯊烯、至少99. 9%鯊 稀或甚至100%藍(lán)稀。
[0038] 變性蒸餾可產(chǎn)生含少于0. 5%蛋白的變性組合物，如少于0. 1 %蛋白、少于0. 01% 蛋白或〇%蛋白。因此，本發(fā)明提供含少于0.5%蛋白的鯊烯，如少于0. 1 %蛋白、少于 0. 01%蛋白或0%蛋白。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述變性蒸餾可在所述純化蒸餾之后進(jìn)行，產(chǎn)生純化的