一種抗血小板聚集的川麥冬皂苷組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種川麥冬皂苷組合物及其制備方法，以及該組 合物在抗血栓、抗血小板聚集、延長凝血時間上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 血栓性疾?。╰hrombotic disease)是由各種原因?qū)е碌难涸谘軆?nèi)或心臟中， 從流動狀態(tài)變?yōu)槟虪顟B(tài)，從而造成血管不同程度的栓塞（embolism)而形成的一系列綜 合征。故血栓性疾病又稱為血栓栓塞性疾病。大量的研究資料表明，血栓栓塞性疾病已成為 危害人群健康的重要因素。血栓栓塞可遍及大小動脈、靜脈、甚或毛細血管，由此導(dǎo)致的心 肌梗死、腦梗死、肺梗死等，死亡率與致殘率極高，為各種病因之首。血栓形成的基本條件： 1、血管壁損傷（主要為血管內(nèi)皮損傷）2、血流變化（血流瘀滯與渦旋）3、血液成分的改變 (凝血因子改變與血小板數(shù)量增多或功能亢進），而血管內(nèi)皮受損是最重要和最常見的。
[0003]目前所用的抗血栓藥物主要分為三類：一是抗血小板藥物，二是抗凝藥物，三是溶 栓藥物。
[0004] 血小板是一種多功能細胞，是由骨髓中成熟的巨核細胞的細胞質(zhì)脫落而成，平均 分布在血液中，具有粘附、聚集、釋放和分泌顆粒內(nèi)容物（如5-羥色胺，ADP)的功能。在血 栓形成的過程中，血小板的粘附起著重要的始動作用，隨之又激發(fā)了內(nèi)源性與外源性的凝 血過程。血流緩慢、渦流形成、血液凝固性增高及心血管內(nèi)膜受損等諸多因素出現(xiàn)時，或以 某種因素為主時，靠邊的血小板則黏附在裸露的膠原纖維上，并釋放ADP和血栓素A2,促使 更多的血小板黏附，但當(dāng)凝血過程啟動后，血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，后者使血 小板牢固地凝集于受損內(nèi)膜表面。上述過程反復(fù)進行，血小板黏集堆不斷增大、增多，構(gòu)成 多個血小板小丘，阻塞血流，從而引起血栓。因此血小板聚集性是預(yù)示血栓形成趨勢的重要 參數(shù)，血小板活化聚集可導(dǎo)致或促進這些疾病的發(fā)生和發(fā)展，所以，對于抗血小板藥物的研 究具有很重要的意義。
[0005] 臨床上，阿司匹林、氯吡格雷和GP Ilb/IIIa拮抗劑是當(dāng)前抗血小板藥物的主體， 前兩者可口服，后者只能靜脈注射，且僅適用于疾病急性期。但前兩者也常引起不良反應(yīng)， 如阿司匹林常引起紫斑、齦血、消化道出血或術(shù)后出血等。氯吡格雷常引起中性粒細胞減 少，血栓性血小板減少性紫癜及消化道癥狀等。
[0006] 抗凝藥物，目前常用的有肝素類、水蛭素及其基因重組制劑與維生素K拮抗劑等。 前兩者均為靜脈注射給藥，后者為口服抗凝藥物。肝素類藥物的主要不良反應(yīng)為出血，也可 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、過敏等。重組水蛭素的不良反應(yīng)遠遠低于其他抗凝劑，但由于其作用的不可 逆性而使醫(yī)者慎用。常用的維生素K詰抗劑有華法令（warfarin)和新抗凝（acencoumarol， 商品名sintrom)兩種。華法令可導(dǎo)致不同程度的出血，且其在臨床使用過程中影響因素較 多。
[0007] 溶栓藥物，主要有尿激酶、鏈激酶等，可使血栓完全溶解，但多需注射應(yīng)用，具有一 定抗原性，大劑量使用可導(dǎo)致全身出血、出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)等。
[0008] 針對此等現(xiàn)象，研究與開發(fā)安全、有效的抗血栓藥物顯得尤為重要。麥冬為百合科 植物麥冬的干燥塊根，其味甘、微苦，微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除 煩之功效，臨床用于治療支氣管炎、肺炎等炎癥性疾病以及心律失常及心肌缺血等心血管 疾病。麥冬含有留體皂苷、高異黃酮、多糖、氨基酸等活性類成分，現(xiàn)代藥理實驗證明麥冬 中所含的單體成分具有明確的藥理活性，如麥冬皂苷D具有抗氧化活性，短葶山麥冬皂苷C 具有明確的抗腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用和麥冬皂苷B可以抑制肺癌細胞的生長等。但單體類成 分制備過程較繁瑣，得率很低，且成本較高。所以我們選用含有各個單體的提取物作為出發(fā) 點，優(yōu)化其分離及制備提純方法，目的是可以得到具有治療效果明確的麥冬提取物，使其可 以直接用于醫(yī)療領(lǐng)域，并被制作成各種制劑，使其原料得到充分的利用。
[0009] 201310710650. 0公開了一種具有抗血小板聚集活性的提取物的制備方法，該方法 包括：以麥冬藥材為原料，用有機溶劑提取，提取液離心，大孔樹脂分離，以乙醇溶液進行洗 脫，收集洗脫液，干燥即得提取物。
[0010] 201310710650. 0實施例1公開了一種具有抗血小板聚集活性的提取物的制備 方法，該方法包括：取麥冬藥材，加麥冬原料重量大約15倍量水回流提取。提取液過濾， 靜置放涼后，離心，棄去不溶物，上清液、過DlOl型大孔樹脂柱分離，先以水洗脫至洗脫液 molish反應(yīng)呈陰性，再以30%的乙醇溶液洗脫，最后用85%的乙醇溶液洗脫，洗脫液回收 溶劑，干燥即得麥冬不同洗脫部位。實驗數(shù)據(jù)顯示，麥冬的抗血小板聚集作用的主要活性部 位為85%乙醇洗脫部位，與陽性藥持平。
[0011] 麥冬各洗脫部位對ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率的影響
[0012]
[0013] 結(jié)論：實驗數(shù)據(jù)顯示，麥冬的抗血小板聚集作用的主要活性部位為85%乙醇洗脫 部位，與陽性藥持平。所以根據(jù)實驗優(yōu)選出麥冬活性部位，即麥冬提取物，并對其提取制備 工藝進行進一步的優(yōu)化。
[0014] 由此可知麥冬具有良好的抗血栓活性，而麥冬的副作用或者不良反應(yīng)從未見有報 道，提示麥冬可以作為安全、有效的抗血栓藥物進行研究，具有重大意義。但是究竟哪個產(chǎn) 地的麥冬及哪個成分群是其主要的活性部位呢？
[0015] 針對這個疑問，本發(fā)明采用整體動物模型與體外抗凝血、抗血小板聚集以及細胞 實驗，篩選麥冬抗血栓活性部位；并對活性部位的制備工藝進行優(yōu)化，建立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量 控制標(biāo)準(zhǔn)。
[0016] 技術(shù)方案
[0017] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位及其制藥用途包括如下：
[0018] 本發(fā)明涉及一種抗血栓的川麥冬皂苷組合物。
[0019] 本發(fā)明涉及一種抗凝血的川麥冬皂苷組合物。
[0020] 本發(fā)明涉及一種縮短凝血時間活性的川麥冬皂苷組合物。
[0021 ] 本發(fā)明涉及一種抗血小板聚集的川麥冬皂苷組合物。
[0022] 本發(fā)明涉及一種保護缺氧復(fù)氧損傷細胞的川麥冬皂苷組合物。
[0023] 本發(fā)明涉及一種抗肺血栓的川麥冬皂苷組合物。
[0024] 本發(fā)明涉及的麥冬的種類包括：川麥冬、短葶山麥冬、湖北麥冬；
[0025] 本發(fā)明涉及的麥冬的藥材部位包括：麥冬的塊根、麥冬的須根；
[0026] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：麥冬皂苷組合物；麥冬皂苷組合物的正 丁醇的提取物；麥冬皂苷組合物的水解物；
[0027] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：川麥冬皂苷組合物；
[0028] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：川麥冬須根皂苷組合物；
[0029] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：短葶山麥冬皂苷組合物；短葶山麥冬皂 苷組合物的正丁醇的提取物；短葶山麥冬皂苷組合物的水解物；
[0030] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：短葶山麥冬須根皂苷組合物；短葶山麥 冬須根皂苷組合物的正丁醇的提取物；短葶山麥冬須根皂苷組合物的水解物；
[0031] 本發(fā)明涉及的麥冬的有效部位包括如下：湖北麥冬皂苷組合物；
[0032] 本發(fā)明涉及的麥冬皂苷組合物的制備方法包括如下：取麥冬的藥材部位，加水浸 泡6-18h，打碎，再加水煎煮0. 5-6h，兩次。提取液過濾，靜置放涼后，離心，棄去不溶物，上 清液、過D-101樹脂柱吸附，重復(fù)上樣一次，靜置6-18h，先以水洗脫至洗脫液molish反應(yīng) 呈陰性，再以30%的乙醇溶液洗脫，最后用85%的乙醇溶液洗脫，洗脫液分別回收溶劑，將 30 %乙醇部位和85 %乙醇部位混合，凍干，得麥冬皂苷組合物。
[0033] 本發(fā)明涉及的麥冬皂苷組合物的正丁醇萃取部位的制備方法包括如下：麥冬皂苷 組合物，采用水飽和正丁醇多次萃取，分別收集正丁醇層和水層，回收正丁醇，正丁醇層、水 層分別冷凍干燥。記錄凍干粉的重量，并計算得率，得到麥冬皂苷組合物的正丁醇萃取部 位。
[0034] 本發(fā)明涉及的麥冬皂苷組合物的水解物的制備方法包括如下：麥冬皂苷組合物， 加入酸水溶液置于沸水浴中水解，取出，放至室溫后，調(diào)PH至中性，抽濾，將殘渣烘至恒重。 經(jīng)石油醚索氏提取，提取液回收溶劑，殘渣用水混懸，冷凍干燥即得麥冬皂苷組合物的水解 物。
[0035] 分析鑒定方法
[0036] 本發(fā)明涉及一種麥冬皂苷的薄層色譜定性鑒別，
[0037] 取相同量1、2、3、4、5號樣品，Iml甲醇溶解，Supelclean?LC-C lsSPE固相萃取小柱 吸附，分別用水、40 %、75 %、85 %甲醇溶液各8ml洗脫，收集75 %洗脫部位，揮干溶劑，用少 量甲醇溶解，備用。
[0038] 為了比較5種樣品皂苷類成分之間的差異，選用三個展開系統(tǒng)進行比較。
[0039] 展開系統(tǒng)如下：
[0040](1)氯仿-甲醇iK(17 : 6 : 2)
[0041] (2)丙酮-乙酸乙酯-水-乙酸（5:5:I:0.2)
[0042] (3)水飽和正丁醇系統(tǒng)。
[0043] 本發(fā)明涉及一種HPLC-ELSD法對麥冬皂苷C進行定量分析
[0044] 為了進一步比較不同產(chǎn)地麥冬總皂苷成分之間的差異，選用HPLC-ELSD進行成分 定性測定。
[0045]色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4. 6X250mm，5 ym);
[0046] 色譜條件：甲醇-水梯度洗脫。洗脫條件見下
[0047] 總皂苷HPLC-ELSD色譜條件
[0048]
[0049] 本發(fā)明涉及一種比色法對麥冬皂苷進行含量測定
[0050] 本發(fā)明的技術(shù)方案的優(yōu)選過程如下：
[0051] 本發(fā)明涉及的試驗動物包括如下：ICR小鼠，體重18~22g，雌雄兼用，由揚州大學(xué) 比較醫(yī)學(xué)中心提供:Wistar大鼠，體重180-220g，雄性，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許 可證號：SUXR(蘇）2012~0004;大耳白兔，雄性，體重2. 5~3kg，由青龍山動物中心提供。
[0052] 本發(fā)明涉及的試驗細胞包括如下：人內(nèi)皮細胞株EA. hy926細胞，購自中科院上海 細胞庫。
[0053] 本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選是圍繞活性而展開的：
[0054] 本發(fā)明寡糖部位的制備方法：
[0055] 稱取川麥冬100g，分別加入5倍量水浸泡12h，打碎，再加入5倍量水25°C溫浸提 取2次，每次lh，過濾，合并濾液，回收溶劑至小體積后冷凍干燥即得川麥冬須根寡糖。
[0056] 稱取短葶山麥冬100g，分別加入5倍量水浸泡12h，打碎，再加入5倍量水25°C溫 浸提取2次，每次lh，過濾，合并濾液，回收溶劑至小體積后冷凍干燥即得短葶山麥冬寡糖。
[0057] 本發(fā)明糖苷的制備
[0058] 稱取短葶山麥冬須根100g，分別加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分別加入 10倍量、5倍量水60°C溫浸提取2次，每次lh，過濾，合并濾液，回收溶劑至小體積后冷凍干 燥即得短葶山麥冬須根糖苷。
[0059] 稱取川麥冬100g，分別加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分別加入10倍量、 5倍量水60°C溫浸提取2次，每次lh，過濾，合并濾液，回收溶