口腔用組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對(duì)于引發(fā)口腔疾病的口腔生物膜的牙周病改善效果良好的口腔用組 合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周病是出現(xiàn)在牙周組織的疾病的總稱，狹義上指牙齦炎、牙周炎和咬合性外傷 之類的疾病。牙周病是主要由牙菌斑引起的口腔內(nèi)感染癥。人的口腔內(nèi)存在700種以上的細(xì) 菌，在健康的口腔內(nèi)，牙齒表面附著有鏈球菌（Streptococcus)屬和放線菌（Actinomyces) 屬等初期附著菌。其中的內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii)被認(rèn)為是出血性牙銀 炎致病菌，初期附著的內(nèi)氏放線菌形成生物膜而生成牙菌斑，從而使牙齦發(fā)生炎癥。有報(bào) 道稱，放線菌導(dǎo)致的牙齦的炎癥是通過(guò)菌體膜上的核蛋白介以牙齦上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 的TLR2產(chǎn)生IL-8和TNF-a而導(dǎo)致的。如果牙齦發(fā)生炎癥，則形成牙周袋，并伴隨出血和 銀溝滲出液的滲出，形成作為牙周病病原性細(xì)菌已知的牙銀卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)和伴放線放線桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋 體（Treponema denticola)等在牙周袋生存的環(huán)境。此外，內(nèi)氏放線菌不僅附著于牙齒表 面，而且與大量的口腔內(nèi)細(xì)菌共凝集，從而成為牙周病病原性細(xì)菌向牙菌斑附著的基礎(chǔ)。由 于這些原因，內(nèi)氏放線菌使初期牙菌斑轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃谘谰撸ㄑ乐懿∩锬ぃ?，因此近年?lái)作 為與牙周病發(fā)生相關(guān)的重要的細(xì)菌引發(fā)關(guān)注。
[0003] 以往的牙周病預(yù)防中，殺滅牙齦卟啉單胞菌等牙周病病原性細(xì)菌來(lái)抑制牙周病是 主流的想法，但牙周病病原性細(xì)菌與生物膜一起存在于牙周袋的深處，因此抗菌物質(zhì)不易 滲透，大多無(wú)法獲得預(yù)期的效果。
[0004] 為了改善這一點(diǎn)，專利文獻(xiàn)1中揭示了通過(guò)將（A)N-酰基肌氨酸或其鹽和（B)異 硫氰酸芐酯混合且使（AV(B)的質(zhì)量比為0.5~20,顯示口腔生物膜抗菌效果和牙齦炎改 善效果。然而，專利文獻(xiàn)1中，耐藥菌出現(xiàn)的危險(xiǎn)性依然很高。
[0005] 牙周病因發(fā)生牙銀炎而加重，因此可通過(guò)預(yù)防牙銀炎而更有效地預(yù)防牙周病。因 此，抑制內(nèi)氏放線菌的生物膜形成的原材料可期待有效的牙周病預(yù)防效果。
[0006] 本發(fā)明人等確認(rèn)了內(nèi)氏放線菌的生物膜形成因酸壓力而被促進(jìn)，日本蕪菁和小松 菜等5種十字花科植物和冰葉日中花的提取物具有使內(nèi)氏放線菌的酸誘導(dǎo)性生物膜形成 量下降50~90%的活性（專利文獻(xiàn)2)。
[0007] 本申請(qǐng)中，將確認(rèn)了生物膜形成抑制活性的植物提取物中活性最高且容易獲得的 日本憲菁（日本憲菁，Brassica rapa var.nipposinica)作為候選原材料，進(jìn)行了詳細(xì)的 活性評(píng)價(jià)并對(duì)其活性成分的性狀確定進(jìn)行了詳細(xì)研宄。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1:日本專利特開(kāi)2008-174542號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)2:日本專利特開(kāi)2013-056855號(hào)公報(bào)
[0012] 發(fā)明的概要
[0013] 發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0014] 牙周病病原性細(xì)菌與生物膜一起存在于牙周袋的深處，一直以來(lái)使用以某種牙周 病病原性細(xì)菌為靶細(xì)菌的抗菌劑的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻礙抗菌劑的滲透，難以 發(fā)揮所設(shè)想的牙周病抑制效果。此外，出現(xiàn)抗藥菌的危險(xiǎn)性高，抗菌劑的使用不理想。因此， 與采用抗菌劑的牙周病病原性細(xì)菌的控制相比，進(jìn)行初期牙周病病原性細(xì)菌的生物膜形成 的控制被認(rèn)為是更安全且有效的牙周病預(yù)防法。
[0015] 解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案
[0016] 本發(fā)明人等進(jìn)行了認(rèn)真研宄，發(fā)現(xiàn)日本蕪菁的提取物對(duì)由酸誘導(dǎo)的內(nèi)氏放線菌的 生物膜形成具有抑制效果。提取溫度越低，該抑制效果越高。對(duì)日本蕪菁的活性成分進(jìn)行 了分離，推測(cè)活性成分為分子量10kDa以上的成分，發(fā)現(xiàn)活性部分中所含的成分的80%以 上為蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。日本蕪菁提取物對(duì)內(nèi)氏放線菌的增殖不產(chǎn)生影響，因此被 認(rèn)為作用機(jī)理與抗菌作用不同。
[0017] 內(nèi)氏放線菌是從牙齦炎和根面齲部位被發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，被認(rèn)為是初期的 牙周病病原性細(xì)菌。由于與鏈球菌和牙周病病原性細(xì)菌共凝集，因此是向牙周病菌斑的菌 群迀移的關(guān)鍵細(xì)菌，認(rèn)為內(nèi)氏放線菌的控制可用于牙周病預(yù)防。本發(fā)明人等的研宄中，確認(rèn) 生物膜形成因牙周病病原性細(xì)菌產(chǎn)生的丁酸等酸而增加。
[0018] 發(fā)明的效果
[0019] 本發(fā)明的包含日本蕪菁提取物的口腔用組合物顯著地抑制初期牙周病病原性細(xì) 菌的生物膜形成，所以可用作比抗菌劑更安全且有效的牙周病預(yù)防法。
[0020] 附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明
[0021] 圖1為基于提取溫度的不同的生物膜形成抑制活性的比較。
[0022] 圖2為基于提取溫度的不同的生物膜形成抑制活性的比較。
[0023] 圖3為日本蕪菁冷水提取物的在羥磷灰石上的生物膜形成抑制活性。
[0024] 圖4A為口腔內(nèi)臨床分尚株的系統(tǒng)分析。
[0025] 圖4B為口腔內(nèi)臨床分尚株的系統(tǒng)分析。
[0026] 圖5為日本蕪菁冷水提取物對(duì)臨床分離株的生物膜形成抑制活性。
[0027] 圖6為流動(dòng)池中的日本蕪菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性。
[0028] 圖7為采用共聚焦激光顯微鏡的生物膜觀察圖。
[0029] 圖8為日本蕪菁冷水提取物、日本蕪菁冷水提取物的采用透析處理的透析內(nèi)液、 透析外液的生物膜形成抑制活性的比較。
[0030] 圖9為日本蕪菁冷水提取物透析內(nèi)液的陰離子交換層析的結(jié)果。
[0031] 圖10為日本蕪菁冷水提取物透析內(nèi)液的硫酸銨分離部分的生物膜形成抑制活 性。
[0032] 圖11為日本蕪菁冷水提取物透析內(nèi)液的硫酸銨分離物的陰離子交換層析的結(jié) 果。
[0033] 圖12為摻入日本蕪菁冷水提取物的口香糖的生物膜形成抑制活性。
[0034] 實(shí)施發(fā)明的方式
[0035] 本申請(qǐng)的發(fā)明涉及包含日本蕪菁提取物的口腔用組合物。
[0036]另外，本申請(qǐng)的發(fā)明涉及所述日本蕪菁提取物為冷水提取物的口腔用組合物。 [0037] 此外，本申請(qǐng)的發(fā)明涉及包含日本蕪菁提取物的牙周病生物膜形成抑制劑。
[0038]另外，本申請(qǐng)的發(fā)明涉及所述日本蕪菁提取物為冷水提取物的酸誘導(dǎo)生物膜形成 抑制劑。
[0039] 此外，本申請(qǐng)的發(fā)明涉及由上述口腔用組合物形成的漱口劑、牙膏劑、吸入劑、含 片劑和食品。
[0040] 以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。本申請(qǐng)的發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。 實(shí)施例
[0041](實(shí)施例1)
[0042] 日本蕪菁提取物的制備方法：
[0043] 購(gòu)入市售的日本蕪菁（茨城縣產(chǎn)），冷凍干燥，從而制備日本蕪菁干燥葉。將日 本蕪菁干燥葉細(xì)碎粉碎，以lg該粉碎的日本蕪菁干燥葉對(duì)應(yīng)50ml去離子蒸餾水的比例在 70°C、室溫和4°C下進(jìn)行2小時(shí)的提取。抽濾所得的提取液，以13000Xg ? 10分鐘離心，將 其上清冷凍干燥后的產(chǎn)物作為日本蕪菁提取物供于試驗(yàn)。
[0044] (實(shí)施例2)
[0045] 生物膜形成試驗(yàn)
[0046] (實(shí)施例 2_1)
[0047] 使用96孔微量滴定板的生物膜形成
[0048] 將內(nèi)氏放線菌ATCC19039或放線菌臨床分離株用5ml的腦心浸液（BHI)液體培養(yǎng) 基在37°C的厭氧條件下培養(yǎng)一晚至穩(wěn)定期，以llOOXg ? 10分鐘離心而集菌。以同樣的條 件用PBS離心清洗3次，將用PBS調(diào)至0. D. 66tol= 0. 3的產(chǎn)物作為供試菌懸浮液供于試驗(yàn) 體系。
[0049] 生物膜形成用96孔微量滴定板進(jìn)行。向各孔中添加100 y 1的0. 5%蔗糖添加2X 胰酪胨大豆肉湯（TSB)培養(yǎng)基、50 y 1試驗(yàn)樣品、20 y 1的125mM丁酸、20 y 1供試菌懸浮液、 10 y 1的PBS，以37°C、5% C02的條件下進(jìn)行16~20小時(shí)的培養(yǎng)。
[0050] (實(shí)施例 2-2)
[0051] 96孔微量滴定板上的生物膜形成量的定量
[0052] 將按照實(shí)施例2-1培養(yǎng)而得的培養(yǎng)上清傾析，用200 y 1的PBS清洗各孔后添加 100 y 1的0. 25%番紅溶液（日水制藥株式會(huì)社），靜置15分鐘而對(duì)生物膜染色。將番紅溶 液傾析后用去離子蒸餾水清洗2次，干燥后添加100 y 1的70%乙醇，振蕩30分鐘而溶出番 紅，用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm的吸光度，對(duì)生物膜量進(jìn)行定量。
[0053] 通過(guò)上述的實(shí)施例，對(duì)從日本蕪菁以70°C、室溫、4°C的各條件下提取而得的各日 本蕪菁提取物的單位重量的比活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果在4°C的條件下提取而得的冷水提取 物的比活性最高（圖1和圖2)。此外，日本蕪菁冷水提取物對(duì)內(nèi)氏放線菌的增殖未顯示影 響。
[0054] 因此，以日本蕪菁冷水提取物作為放線菌生物膜抑制原材料的候選材料，對(duì)在人 口腔內(nèi)是否有顯示活性的可能性進(jìn)行進(jìn)一步的研宄。