具有抗球蟲活性的植物部分及提取物的制作方法
【專利說(shuō)明】具有抗球蟲活性的植物部分及提取物
[0001] 本申請(qǐng)要求于2012年6月27日提交的第61/664795號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)及于2013 年1月23日提交的第177/DEL/2013號(hào)印度申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，所述兩個(gè)申請(qǐng)均通過(guò)援引加入 本文。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本發(fā)明一般涉及對(duì)球蟲病的控制，更具體地，涉及用于控制家禽及其他動(dòng)物的球 蟲病的植物部分、植物提取物及化合物的施用。
[0004] 球蟲病是養(yǎng)禽業(yè)中的主要疾病，并且根據(jù)最近的調(diào)查，估計(jì)每年全球影響大于 三十億美元（worldpoultry. net/BroiIers/Health/2009/9/In-ovo-vaccination-against -coccidiosis-WP006949W/-2013年6月18日訪問(wèn)）。球蟲病由原生動(dòng)物寄生蟲、即艾美球蟲 (Eimeria)導(dǎo)致，其屬于頂復(fù)門（phylum Apicomplexa)和艾美蟲科（family Eimeriidae) (Clare，R. A 和 Danforth，Η· D(1989) · Major histocompatibility complex control of immunity elicited by genetically engineered Eimeria teneIla(Apicomplexa) antigen in chickens. Infection and immunity，57(3) :701 - 705) D 該寄生蟲入侵腸細(xì) 胞并且在腸中引起壞死，這導(dǎo)致吸收障礙、腹瀉、發(fā)病、增重降低、飼料轉(zhuǎn)化不良，并且在嚴(yán) 重的情況中，引起死亡（Williams，R.B(2005). Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens:Rational, integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathology，34 (3)，159-180) D 已知七種不同的艾美球蟲物種，即 堆型艾美球蟲（E.acervulina)、布氏艾美球蟲（E.brunetti)、巨型艾美球蟲（E. maxima)、 和緩艾美球蟲（E. mitis)、毒害艾美球蟲（E. necatrix)、早熟艾美球蟲（E. praecox)和 禽艾美球蟲（E.tenella))，在家禽中引起球蟲?。╓illiams，2005)，并且所述物種是高 度宿主和位點(diǎn)特異性的。禽艾美球蟲是在家禽中引起球蟲病的主要物種之一，并且其感 染位點(diǎn)是盲腸（Khazandi，M and Tiveyj D (2010). Developing an in vitro method for Eimeria tenella attachment to its preferred and non-preferred intestinal sites. Experimental Parasitology，125(2)，137-140) D球蟲病目前通過(guò)藥物來(lái)控制，但艾美球蟲 的耐藥株的不斷出現(xiàn)需要開發(fā)可替代的控制策略。因?yàn)橐阎参镉捎诖嬖诜宇惢衔锒?具有抗寄生蟲和抗球蟲活性（Tipu，M. A.，Akhtar，M. S.，Anjum，Μ. I 和 Raja，M. L(2006) · New dimension of medicinal plants as animal feed. Pakistan vet. J.，26(3):144-148)，所 以它們能夠成為抗家禽球蟲病的生物活性分子的潛在來(lái)源。
[0005] 其他人已嘗試將植物部分或植物提取物用于治療球蟲病。例如，McCann等人 試驗(yàn)了甜栗木（Sweet Chestnut Wood)單寧對(duì)接種活球蟲疫苗的肉雞的行為的作用 (Μ· E. E. McCann，E. Newell，C. Preston和K. Forbes. The Use of Mannan-Oligosaccharides and/or Tannin in Broiler Diets. Inti. J. of Poultry Sci. 5(9) :873-879, 2006) D 他們 報(bào)道了獨(dú)立地或組合地補(bǔ)充甘露聚糖-低聚糖或單寧未降低球蟲病的影響。
[0006] Wang等人教導(dǎo)了對(duì)球蟲病使用葡萄籽原花色素提取物（Wang等人，Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract in Broiler Chickens:Effect on Chicken Coccidiosis and Antioxidant Status. Poultry Science. 87:2273-2280, 2008)。他們將 活性歸于原花色素（縮合單寧而非可水解單寧）的抗炎和抗氧化性質(zhì)。
[0007] Naidoo等人教導(dǎo)了使用基于其抗氧化活性而選擇的四種植物的體內(nèi)研宄（Naidoo 等人，The value of plant extracts with antioxidant activity in attenuating coccidiosis in broiler chickens. Veterinary Parasitology. 153:214-219 ;2008)〇 他 們觀察到所述植物之一（紫嬌花（Tulbaghia violacea))降低雞排泄物中的艾美球蟲卵囊 數(shù)，并且他們推測(cè)該作用可歸因于抗氧化劑化合物S(甲硫基甲基）半胱氨酸亞砜。
[0008] McDougald等人描述了使用圓葉葡萄果渣來(lái)提高對(duì)肉雞的球蟲病的抵抗 (McDougald等人，Enhancement of Resistance to Coccidiosis and Necrotic Enteritis in Broiler Chickens by Dietary Muscadine Pomace. Avian Diseases. 52:646-651 ; 2008)。圓葉葡萄果渣是葡萄酒生產(chǎn)中所用的葡萄的副產(chǎn)物。他們未提及果渣中任何具體 化合物的功效。所提議的抗球蟲活性與Wang等人和Naidoo等人所提議的活性明顯不同。
[0009] 發(fā)明概沐
[0010] 本發(fā)明包括在控制動(dòng)物、特別是家禽的球蟲病方面有效的植物部分和植物提取 物的鑒定和使用。具體地，已發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子樹（Quercus infectoria)五倍子、鹽膚木（Rhus chinensis)五倍子、訶子（Terminalia chebula)果實(shí)的植物部分和天然提取物控制家禽 的球蟲病，更具體地控制由艾美球蟲屬引起的球蟲病。更具體地，植物部分或提取物包含有 效量的選自五倍子酸、沒(méi)食子鞣質(zhì)和可水解單寧的化合物。
[0011] 沒(méi)食子樹五倍子、鹽膚木五倍子和訶子果實(shí)的植物部分和天然提取物導(dǎo)致?lián)p傷分 數(shù)、糞便的每克卵囊數(shù)和死亡率的降低。還發(fā)現(xiàn)所述植物部分/提取物對(duì)艾美球蟲的子孢 子具有直接抑制作用，如在體外MTT測(cè)定中所觀察到的。還發(fā)現(xiàn)選自五倍子酸、沒(méi)食子鞣質(zhì) 和可水解單寧的化合物降低損傷分?jǐn)?shù)、糞便的每克卵囊數(shù)和死亡率。還發(fā)現(xiàn)所述化合物對(duì) 艾美球蟲的子孢子具有直接抑制作用，如在體外MTT測(cè)定中所觀察到的。
[0012] 本發(fā)明還包括通過(guò)給藥組合物來(lái)控制家禽及其他動(dòng)物的球蟲病的方法，所述組合 物包含植物部分或植物提取物，所述植物部分或植物提取物含有有效量的沒(méi)食子樹五倍 子、鹽膚木五倍子、訶子果實(shí)和/或諸如五倍子酸、沒(méi)食子鞣質(zhì)和可水解單寧的化合物。
[0013] 附圖簡(jiǎn)沐
[0014] 圖1是用沒(méi)食子樹治療的禽類的盲腸損傷的圖像。
[0015] 圖2是在感染后第7天用沒(méi)食子樹治療的禽類的排泄物的每克卵囊數(shù)（OPG)的圖 表；具有不同上標(biāo)的柱是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的（P〈〇. 05)。
[0016] 圖3是用沒(méi)食子樹治療的禽類的盲腸的HE染色切片的微縮照相圖像。
[0017] 圖4是在感染后第5天用沒(méi)食子樹水提取物治療的禽類的堆型艾美球蟲、巨型艾 美球蟲和禽艾美球蟲的損傷分?jǐn)?shù)的圖表；具有不同上標(biāo)的柱是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的（P〈〇. 05)。
[0018] 圖5是在感染后第7天用沒(méi)食子樹水提取物治療的禽類的排泄物的每克卵囊數(shù) (OPG)的圖表；具有不同上標(biāo)的柱是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的（p〈0. 05)。
[0019] 圖6是為評(píng)價(jià)不同劑量水平的沒(méi)食子樹以及作為陽(yáng)性對(duì)照的球蟲抑制劑（鹽霉 素）而進(jìn)行的MTT測(cè)定；具有不同上標(biāo)的柱是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的（p〈0. 05)。
[0020] 圖7是在用子孢子和不同濃度的沒(méi)食子樹入侵MDBK宿主細(xì)胞之后的PCR結(jié)果的 圖表。
[0021] 圖8是在一次治療之內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)的艾美球蟲DNA的倍數(shù)變化對(duì)T4的圖表。
[0022] 圖9是在用不同濃度的沒(méi)食子樹預(yù)治療的MDBK宿主細(xì)胞用子孢子入侵之后的PCR 結(jié)果的圖表。
[0023] 圖10是在一次治療之內(nèi)