一種基于樹狀大分子的具有rgd靶向功能的ct成像納米造影劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于CT成像造影劑領(lǐng)域，特別涉及一種基于樹狀大分子的具有RGD靶向功能的CT成像納米造影劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]RGD多肽因其能和整合素α νβ 3特異結(jié)合，在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成及轉(zhuǎn)移方面起到重要作用。近幾十年來(lái)，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，各種納米顆粒應(yīng)運(yùn)而生，尤其是連接RGD的納米顆粒，因?yàn)槠浔旧淼哪[瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的雙重靶向性能及與腫瘤相關(guān)的整合素的高親和力，使其在靶向整合素的配體中有著廣泛的應(yīng)用。另外，金納米顆粒由于其無(wú)細(xì)胞毒性、具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性、催化活性、生物相容性以及特殊的光學(xué)特性，使其可以很好的應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)、光熱治療和體內(nèi)疾病診斷等領(lǐng)域。然而單一的納米顆粒有自身的缺點(diǎn)和局限性，因此尋找合適的方法合成多功能的復(fù)合納米顆粒成為了當(dāng)今納米顆粒領(lǐng)域研宄的重點(diǎn)。
[0003]Au DENPs復(fù)合納米顆粒作為多功能復(fù)合納米顆粒中的一種，已被驗(yàn)證了可以成功應(yīng)用于細(xì)胞分離、抗菌和體內(nèi)雙模態(tài)成像等方面。在之前的研宄中，公開了一種用于CT成像的增強(qiáng)生物相容性的用PEG修飾的Au DENPsO G5.NH2事先用mPEG_COOH和通過(guò)PEG連接的配體RGD修飾，G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8用作包裹Au納米顆粒。將剩余的樹狀大分子終端乙?；梢垣@得靶向整合蛋白α ν β 3的{(Au °) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8}DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)。PEGylatedAu DENPs-R⑶靶向探針通過(guò)分別通過(guò) UV-Vis光譜、ICP-AES和TEM測(cè)定。在體外和體內(nèi)分別通過(guò)乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-435)和異種移植腫瘤模型評(píng)估靶向CT成像性能。PEGylatedAu DENPs-RGD探針的體內(nèi)腫瘤攝入的組織學(xué)研宄和MDA-MB-435的移植瘤的α νβ 3整合素的表達(dá)確定了其為腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的雙重靶向納米顆粒。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，生物分布顯示該靶向納米探針可以在96h內(nèi)被清除，這是第一個(gè)報(bào)道PEGylated Au DENPs連接整合素作為腫瘤靶向CT成像的探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于樹狀大分子的具有RGD靶向功能的CT成像納米造影劑的制備方法，該方法不僅提高了納米顆粒的穩(wěn)定性和生物相容性，而且對(duì)整合素高表達(dá)癌細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的雙重靶向作用；制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。
[0005]本發(fā)明的一種基于樹狀大分子的具有RGD靶向功能的CT成像納米造影劑的制備方法，包括:
[0006](I)取RGD-PEG-COOH，加入二甲基亞砜DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反應(yīng)2?4h，再加入樹狀大分子G5.NH2磁力攪拌反應(yīng)2?4h，得到RGD-PEG修飾的樹狀大分子G5.NH2;然后取mPEG-COOH，加入DMSO溶解，然后加入EDC和NHS反應(yīng)2?4h ;再加入RGD-PEG修飾的樹狀大分子G5.NH2磁力攪拌反應(yīng)2?4d，透析除去副產(chǎn)物和雜質(zhì)，得到G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8;
[0007](2)在磁力震蕩下將HAuCl4溶液加入G5.NH 2_ (PEG-RGD) 7_mPEG8，得到樹狀大分子/金鹽混合物；20?40min后，將冰浴處理的NaBH4溶液加入樹狀大分子/金鹽混合物中，繼續(xù)攪拌I?3h，得到{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs ;在持續(xù)的磁力震蕩下，將三乙胺加入{(Au0) 30Q-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs的水溶液中，20?40min后加入無(wú)水醋酸并持續(xù)攪拌，混合物持續(xù)反應(yīng)20?28h，透析，得到{(Au°) 3(I(1-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。
[0008]所述步驟(I)中的RGD-PEG-COOH、G5.順2和 mPEG-COOH 的質(zhì)量比為 46.32mg:40.16mg:30.88mg。
[0009]所述步驟(I)中的EDC和NHS分別與RGD-PEG-COOH、mPEG-COOH的摩爾比均為5:5:1ο
[0010]所述步驟(I)中的RGD-PEG-C00H與DMSO的質(zhì)量體積比為40.16mg: 10mL。
[0011]所述步驟(2)中的G5.NH2-(PEG-RGD)7IiPEGi^ 的 G5.NH 2與 HAuCl 4的摩爾比為300:1ο
[0012]所述步驟⑵中的三乙胺和無(wú)水醋酸的加入量分別為6.16 X 1^mmol,
6.16 X 10 3mmol ο
[0013]所述步驟(I)和⑵中的透析具體為采用PBS緩沖液和蒸餾水透析三天，每天3次，每次4L。
[0014]有益效果
[0015](I)本發(fā)明采用簡(jiǎn)單的復(fù)合納米顆粒方法，然后進(jìn)行乙酰化修飾；該方法工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，成本較低；
[0016](2)本發(fā)明制備的{(Au°) 3QQ-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-PEG8} DENPs 復(fù)合納米顆粒能夠長(zhǎng)時(shí)間地穩(wěn)定分散于水溶液中，沒(méi)有出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。所用的修飾劑RGD成本低，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。表面連接的甲氧基聚乙二醇(mPEG)又進(jìn)一步提高了納米顆粒的穩(wěn)定性、親水性和生物相容性。合成的納米顆粒具有很好的CT成像效應(yīng)，在體內(nèi)CT成像診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1 為{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7_PEG8} DENPs 的制備過(guò)程。
[0018]圖2 為在室溫 25 0C 下 G5.NH2-(PEG-RGD)7-PEGjP {(Au °) 300-G5.NHAc-(PEG-RGD)7_PEG8}DENPs溶解在水中的紫外可見(jiàn)光譜。
[0019]圖3為高分辨率TEM圖像(a)和PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方圖(b)。
[0020]圖4 為 PEGylatedAu DENPs-RGD 的 CT 值(a)和 Omnipaque (Au 和碘)作為放射性元素的分子聚集濃度(b)。
[0021]圖5為不同濃度的PEGylated Au DENPs-R⑶治療MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞4h的穩(wěn)定性MTT測(cè)試。
[0022]圖 6 為靶向 PEGylatedAu DENPs-RGD，非靶向 PEGylated Au DENPs-RGD，西侖吉肽(一種整合素α ν β 3抑制劑)阻滯的靶向NPs治療MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞4h的細(xì)胞攝入Au的量。
[0023]圖7為不同濃度的Au非靶向PEGylated Au DENPs-RGD,西侖吉肽阻滯的靶向NPs和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD治療細(xì)胞團(tuán)塊的CT值。
[0024]圖8為將靶向Au DENPs (a)，西侖吉肽阻滯的靶向PEGylated Au DENPs-RGD (b)和靶向PEGylatedAu DENPs-RGD (c)靜脈注射入負(fù)荷MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)后0，2，6以及24h后的軸位CT圖像，白色箭頭指向腫瘤。
[0025]圖9為將靶向Au DENPs,西侖吉肽阻滯的靶向PEGylatedAu DENPs-RGD和靶向PEGylated Au DENPs-RGD靜脈注射入負(fù)荷MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞的小鼠體內(nèi)后0，2，6以及24h后的CT值。
[0026]圖10為銀染色光學(xué)顯微鏡MDA-MB-435異種移植小鼠模型的圖像:(a)靜脈注射革巴向 PEGylated Au DENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1 Μ) ； (b)靜脈注射非革巴向 PEGylatedAu DENPs-RGD(200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (c)靜脈注射靶向西侖吉肽阻滯的 PEGylated AuDENPs-RGD (200 μ L, [Au] = 0.1Μ) ； (d)陰性未做治療的對(duì)照組。原始放大倍數(shù)為200。
[0027]圖11為Au在小鼠主要器官中心、肝、脾、肺、腎和腫瘤的Au生物分布。記錄在不同時(shí)間點(diǎn)注射 PEGylated Au DENPs-RGD 探針(200 μ L, [Au] = 0.1Μ)后的數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)取46.32mg RGD-PEG-COOH于一反應(yīng)瓶中，加入二甲基亞砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反應(yīng)3h。再加入40.16mg樹狀大分子G5.順2于1mlDMSO磁力攪拌反應(yīng)3h。然后，取30.88mg mPEG-COOH于一反應(yīng)瓶中，加入1ml 二甲亞砜(DMSO)使其溶解，然后加入EDC/NHS(69.48mg)反應(yīng)3h。再加入40.16mg RGD-PEG修飾的樹狀大分子G5.順2于1ml DMSO磁力攪拌反應(yīng)3d，接著溶液會(huì)逐漸變成淺黃色。將反應(yīng)混合液用PBS緩沖液和蒸餾水透析三天(3次，4L/次)，除去副產(chǎn)物和雜質(zhì)，獲得產(chǎn)物G5.NH2- (PEG-RGD) 7-mPEG8冷凍干燥后備用。
[0031](2)在磁力震蕩下將HAuCl4溶液加入G5.NH2-(PEG-RGD) 7-mPEG8 (G5.順2與金鹽的摩爾比為300:1)。30min后，冰浴處理的5mol過(guò)剩的NaBH4溶液加入樹狀大分子/金鹽混合物中，繼續(xù)攪拌。幾秒后，反應(yīng)混合物變成深紅色，完成整個(gè)反應(yīng)需要2h的持續(xù)攪拌。最終標(biāo)記的產(chǎn)物是{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs。將剩余的樹狀大分子終端氨基{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs乙?；?。簡(jiǎn)而言之，在持續(xù)的磁力震蕩下，三乙胺(6.16 X 10_3mmol)加入{(Au0) 300-G5.NH2- (PEG-RGD) 7_mPEG8} DENPs 的水溶液中。3Omin 后，無(wú)水醋酸(6.16 X 1^mmol)加入三乙胺/DENP的混合物中，并持續(xù)攪拌，混合物持續(xù)反應(yīng)24h。最終將反應(yīng)混合液用PBS緩沖液和蒸餾水透析三天(3次，4L/次)，獲得產(chǎn)物{(Au0) 300-G5.NHAc- (PEG-RGD) 7-mPEG8} DENPs (PEGylatedAu DENPs-RGD)冷凍干燥后備用。
[0032](3)稀釋的懸浮物PEGylated Au DENPs-RGD (lmg/mL，5 μ L)沉積在碳涂層銅網(wǎng)格，然后在風(fēng)干之前進(jìn)行測(cè)量。在獲取數(shù)字圖像后，每個(gè)樣本的300個(gè)納米顆粒隨機(jī)選擇并用ImageJ軟件測(cè)量，并畫出PEGylatedAu DENPs-RGD的分布直方圖。在分析PEGylated AuDENPs-RGD樣本時(shí)，將其放入水中溶解。ICP-AES (Leeman Prodigy，USA)用來(lái)分析PEGylatedAu DENPs-RGD 中 Au 的量。使用 64排螺旋 CT (Discovery CT750HD，GE healthcare)在 80kV、10mA下進(jìn)行掃描。不同濃度的PEGylated Au DENPs-RGD的Au溶液0.2ml放入1.5ml的微量離心管中，計(jì)算出每個(gè)樣本的CT值(HU)。
[0033](4)細(xì)胞培養(yǎng):MDA-MB-435細(xì)胞在37°C，5% CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中的培養(yǎng)液為10%滅火的牛胎血清(FBS)，100U/mL青霉素以及100U/mL鏈霉素。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，合成步驟簡(jiǎn)單。制備的