治療和預防創(chuàng)傷性腦損傷性神經元損害的組合物和方法
【專利說明】治療和預防創(chuàng)傷性腦損傷性神經元損害的組合物和方法
[0001] 政府利益
[0002] 本發(fā)明榮獲美國國立衛(wèi)生研宄院資助，資助號NS072631。政府對本發(fā)明具有一定 的權利。
【背景技術】
[0003] 創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)是導致死亡及兒童和年輕人殘疾的主要原因（Aitken 等，2009McCarthy等，2006)。TBI誘發(fā)腦內（包括海馬和皮質區(qū)域）的神經元死亡。TBI不 僅能通過直接組織缺損引起原發(fā)性損傷（Hall等，2004 ;Hall等，2005b;Singh等，2006)， 還通過該原發(fā)事件在存活的細胞中引發(fā)繼發(fā)性損傷（Faden等，1989 ;Fujimoto等，2004b; Hall等，2005b;Marion等，1997)。損傷廣泛存在于腦組織中，如大腦皮層和海馬區(qū)域，此 損傷在人類（Ariza等，2006;Bigler等，1997;Isoniemi等，2006;Tate和Bigler, 2000 ; Umile等，2002;Wilde等，2007)和實驗動物（Bonislawski等，2007;Hall等，2005b; Lowenstein等，1992 ;Saatman等，2006a)中均可見，且導致認知、感覺以及運動功能的缺 損（Greve和Zink, 2009 ;Hall等，2005b;Singh等，2006)。目前尚未出現(xiàn)FDA批準的針對 TBI后癥狀的有效治療。
[0004] 文獻已表明在實驗性TBI后會誘發(fā)細胞興奮性毒性，后者導致了損傷后細胞的快 速死亡（Palmer等，1993)。細胞興奮性毒性可引起細胞凋亡還是壞死取決于起始刺激的強 度和細胞群體的特性（Ankarcrona等，1995 ;Bonfoco等，1995 ;Martin等，1998)。在小鼠 TBI模型中，大多數(shù)的神經元死亡發(fā)生于TBI后24小時內，此后，細胞死亡持續(xù)在一個較低 水平至少另外兩周（Zhou等，2012)。大部分死亡的細胞并未顯示出凋亡的形態(tài)學特征，且 凋亡標記只在小部分死亡細胞亞群中為陽性。與之相對，大多數(shù)的細胞死亡為壞死性死亡， 此結果提示，中度TBI誘發(fā)的主要是快速壞死性細胞死亡。
[0005]腦源性神經營養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是生長因 子家族的成員之一。它在成年大腦內廣泛分布且活躍，包括海馬和皮層（Egan等，2003; Huang等，1999 ;Hyman等，1991)。BDNF對神經元起多種重要的作用，例如有助于成熟神經 元（Barde, 1994;Ghosh等，1994;Lindholm等，1996;Shulga等，2008)和未成熟神經元 (Gao和Chen, 2009;Kirschenbaum和Goldman, 1995;Liu等，2003)的生存。此外，無論對 成熟嚙齒類動物或人類皮層，BDNF都是海馬發(fā)育過程中最豐富的營養(yǎng)因子（Maisonpierre 等，1990Jimmusk等，1994 ;Webster等，2002)。若在海馬發(fā)育階段敲除bdnf基因， BDNF表達的減少會加重TBI后的神經元死亡（Gao和Chen, 2009)。此結果說明，BDNF參 與調控了神經元的生存，并有望用于保護神經元，使其在TBI后免于死亡。7, 8-二羥黃酮 (7, 8-dihydroxyflavone，DHF)是一個仿BDNF的小分子，已有研宄表明該小分子能保護野 生型神經元免于凋亡（Jang等，2010)。對于嚙齒類動物的壓力（Andero等，2012)、抑郁 (Liu等，2010)、高齡（Zeng等，2012a;Zeng等，2012b;Zeng等，2011)和阿爾茲海默病模 型（Devi和Ohno, 2012)，DHF處理有助于改善其神經功能。

【發(fā)明內容】

[0006]在此公開的信息為，DHF減少了TBI后的神經元死亡（壞死性死亡為主）。用DHF 處理TBI小鼠，促進了其BDNF受體--酪氨酸相關激酶B(Tyrosine-relatedkinaseB， TrkB)的磷酸化（Yan等，1997)，同時顯著減少了TBI后24小時內海馬的神經元死亡和皮 層的組織缺損。另一方面，抑制BDNF信號通路可削弱DHF的神經保護作用。
[0007]本發(fā)明包括了創(chuàng)傷性腦損傷的治療方法和組合物。具體而言，在此公開的方法抑 制和/或防止創(chuàng)傷性腦損傷后神經元死亡的方法。在一個實施方案中，治療TBI的方法包 括對TBI發(fā)生后的受試對象給予DHF或其衍生物。DHF或其衍生物也可在臨床環(huán)境下給藥， 其中受試對象在TBI后被帶至臨床機構。在一個實施方案中，DHF或其衍生物通過腹腔注 射的方式在受試對象的損傷側給藥。
[0008]在一個實施方案中，治療TBI的方法包括預防性給予DHF或其衍生物，由此DHF或 其衍生物在TBI的發(fā)生前給藥。TBI在一些運動和職業(yè)中很常見，比如在橄欖球、足球、拳 擊、冰球和武術等運動中，頭部損傷時常發(fā)生。在許多情況中，TBI是由于頭部的反復撞擊 引起。因此，一個實施方案包括在運動進行前或者途中將DHF或其衍生物給予運動員。
[0009]在一個實施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其藥學上可接受的鹽、酯類、 溶劑化物、互變異構體、光學異構體、包合物、水合物、多晶或前體藥物在制備用于在TBI可 能發(fā)生之前預防或抑制TBI后的神經元死亡的藥物或用于治療TBI后的受試對象的藥物中 的用途。
[0010]在一個實施方案中，本文提供了DHF或其衍生物、或其藥學上可接受的鹽、酯類、 溶劑化物、互變異構體、光學異構體、包合物、水合物、多晶或前體藥物，其用于在TBI可能 發(fā)生之前預防或抑制TBI后的神經元死亡或用于治療TBI后的受試對象。
[0011]在一個實施方案中，本文提供了用于在TBI可能發(fā)生之前預防或抑制TBI后的神 經元死亡或用于治療TBI后的受試對象的組合物，其包含有效量的DHF或其衍生物、或其藥 學上可接受的鹽、酯類、溶劑化物、互變異構體、光學異構體、包合物、水合物、多晶或前體藥 物。在一個方面，所述組合物為藥物組合物或者飲料，比如運動飲料。
【附圖說明】
[0012] 圖1顯示體外DHF保護神經元免于谷氨酸/甘氨酸介導的細胞興奮性毒性死亡。 (a)明場圖顯示DMSO處理的對照組細胞。（b)PI染色檢測DMSO處理的對照組細胞的細胞 死亡。（c)a圖和b圖的疊加。（d)明場圖顯示經谷氨酸和甘氨酸處理誘導細胞興奮性毒性 的細胞給予DMSO預處理作為對照組。（e)PI染色檢測經谷氨酸和甘氨酸處理和DMSO預處 理對照組的細胞死亡。（f)d圖和e圖的疊加。（g)明場圖顯示經谷氨酸和甘氨酸處理誘導 細胞興奮性毒性的細胞給予DHF預處理。（h)PI染色檢測經谷氨酸/甘氨酸處理以及DHF 預處理的細胞死亡。（i)g圖和h圖的疊加。（j)明場顯示未經谷氨酸和甘氨酸處理誘導細 胞興奮性毒性而給予DHF處理的細胞。（k)PI染色檢測未經谷氨酸和甘氨酸處理而用DHF 處理的細胞死亡。（l)j圖和k圖的疊加。（m)DMSO組、谷氨酸/甘氨酸處理組、谷氨酸/甘 氨酸/DHF組和DHF組的細胞死亡計數(shù)。（n)對不同濃度的DHF處理的組的細胞死亡計數(shù)， 以評估DHF的劑量對經谷氨酸/甘氨酸誘導細胞興奮性毒性的細胞保護作用的影響。
[0013] 圖2顯示DHF處理減輕了TBI后皮層的損傷。小鼠在TBI造模前接受在DMSO中 的DHF的預處理或接受無DHF的DMSO(作為對照）的預處理。（a)無DHF的DMSO預處理的 損傷中心腦片的焦油紫染色。（b)DHF預處理的損傷中心腦片的焦油紫染色。（c)損傷側與 對側皮層的缺損面積比例對照。
[0014] 圖3顯示DHF處理減少了TBI后海馬的細胞死亡。TBI造模后24小時，腦片經FJB 染色以檢測海馬內的細胞死亡。（a)假手術組的小鼠腦片，片中可見海馬齒狀回。腦片經 DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）復染呈藍色以顯示細胞核。（b)TBI造模而不給予DHF處 理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測該組小鼠海馬齒狀回中的FJB陽性細胞（綠色）。腦片經DAPI復 染呈藍色以顯示細胞核。（C)TBI造模前接受DHF預處理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測該組小鼠 海馬齒狀回中的FJB陽性細胞（綠色）。腦片經DAPI復染呈藍色以顯示細胞核。（d)TBI造 模前接受DMSO預處理的小鼠，F(xiàn)JB染色以檢測該組小鼠海馬齒狀回中的FJB陽性細胞（綠 色）。腦片經DAPI復染呈藍色以顯示細胞核。（e)對海馬中不同分區(qū)的FJB陽性細胞的計 數(shù)結果。
[0015] 圖4顯示DHF處理增加了TBI后海馬內新生未成熟神經元的數(shù)量。造模后24小 時，用DCX特異性抗體進行免疫染色，以展示小鼠海馬齒狀回中的新生未成熟神經元。（a) 假手術組小鼠的海馬齒狀回中的Dcx陽性新生未成熟神經元（紅色）。腦片經DAPI復染 呈藍色以顯示細胞核。（b)TBI損傷組小鼠的海馬齒狀回中的Dcx陽性新生未成熟神經元 (紅色）。腦片經DAPI復染呈藍色以顯示細胞核。