一種豬單側(cè)輸尿管梗阻再通模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種動物模型的建立方法，尤其是指一種豬單側(cè)輸尿管梗阻再通模 型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎間質(zhì)纖維化是所有腎臟病發(fā)展至至終末期的最后共同通路。腎間質(zhì)纖維化的發(fā) 生機(jī)制是一個復(fù)雜的病理生理過程，很多細(xì)胞介質(zhì)和生長因子都參與了這一過程，但目前 對其發(fā)生機(jī)制尚缺乏全面的認(rèn)識，由此所致的終末期腎病需要血液透析治療，對患者、家 庭及社會均是沉重負(fù)擔(dān)。因此闡明腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制，尋找其干預(yù)靶點(diǎn)具有重大意義。
[0003] 目前關(guān)于腎間質(zhì)纖維化的模型研宄很多，包括六分之五腎切除模型、馬兜鈴酸 模型、硝酸雙氧鈾模型及腺嘌呤模型、環(huán)孢素A模型、阿霉素模型及單側(cè)輸尿管梗阻模型 (unilateralureteralobstruction，UUO)等。相對于其它腎間質(zhì)纖維化模型，UUO模型為 簡便、易行的有效模型。它有效模擬了臨床梗阻性腎病時的腎損傷，引起腎臟血流動力學(xué)及 代謝的改變，伴有腎小管損傷及細(xì)胞死亡、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤等。大量研宄表明，在嚙齒類 動物中，UUO模型引起進(jìn)展性的腎間質(zhì)纖維化。UUO模型操作簡便易行，并可根據(jù)時間、損傷 程度模擬不同的腎傷，科研工作中被廣泛應(yīng)用。當(dāng)梗阻性腎病的梗阻因素解除后，腎臟在形 態(tài)和功能上將出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，但目前關(guān)于UUO梗阻解除即再通后的腎臟會有怎樣的 病變或修復(fù)過程鮮有研宄。梗阻性腎病可導(dǎo)致腎臟間質(zhì)纖維化，我們假設(shè)，在梗阻解除即輸 尿管再通后腎間質(zhì)纖維化是否可以逆轉(zhuǎn)以及逆轉(zhuǎn)的時間點(diǎn)，單側(cè)輸尿管梗阻再通模型是否 能作為更有效可行的工具來研宄腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防及干預(yù)腎臟間質(zhì)纖維化？ 目前，關(guān)于腎間質(zhì)纖維化的動物模型大多局限在嚙齒類動物上，為了突破嚙齒類動物在此 研宄方面的局限性，同時更大程度的模擬人的生理結(jié)構(gòu)及病理改變，需立與人類內(nèi)環(huán)境的 相關(guān)程度高的動物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種豬單側(cè)輸尿管梗阻再通模型的建立方法，目的是為研宄腎間質(zhì)纖 維化提供很好的實(shí)驗平臺。
[0005] 動物模型在研宄人類疾病中發(fā)揮著重要作用。選擇動物模型最重要的準(zhǔn)則即動物 模型與。與其他動物相比，豬在形態(tài)、體積、生理結(jié)構(gòu)和功能上與人類有極大的相似性，因此 豬被用于包括心血管、呼吸系統(tǒng)及泌尿系等許多方面的研宄。另外，豬在染色體結(jié)構(gòu)和序列 上與人類存在很大程度的同源性，我們構(gòu)建了大動物豬的單側(cè)輸尿管梗阻再通模型。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：包括下列步驟：
[0007] ( -）選擇實(shí)驗動物，所選實(shí)驗豬為廣西巴馬香豬，月齡3個月，體重8-10公斤，飼 養(yǎng)符合標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)條件，18_25°C，12小時光/暗周期，每只豬每天喂養(yǎng)豬飼料2次，每次 250g；
[0008] (二）造模手術(shù)，實(shí)驗動物術(shù)前禁食水12小時，用地西泮、氯胺酮和速眠新II聯(lián)合 麻醉法，麻醉具體操作過程：先給予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，50~70秒后動物搖晃倒地， 肌肉松弛，再給予地西泮lmg/kg肌肉注射，速眠新0. 15ml/kg肌肉注射，110~130秒麻醉 生效，將豬置于37°C恒溫手術(shù)臺，所有手術(shù)步驟遵循無菌操作，常規(guī)備皮、鋪無菌洞巾，戴無 菌帽子、口罩及手套，皮膚消毒后取腹部正中切口，9~11cm，逐層分離皮膚直達(dá)臟層腹膜， 打開腹腔，翻開腸攀，將腸攀用37°C生理鹽水浸濕的紗布包繞，暴露右側(cè)輸尿管，在距離右 腎下級15cm處，用長2cm，寬Icm的聚乙烯片包繞，并在聚乙烯片上沿兩端用10號手術(shù)線結(jié) 扎，使右側(cè)輸尿管完全梗阻，還納腸攀，37°C，0. 9%生理鹽水反復(fù)沖洗腸攀并用吸引器吸出 鹽水，腹腔注入青霉素16萬單位/kg，逐層縫合關(guān)閉腹腔；
[0009] (三）再通手術(shù)：5天后按照上述操作步驟進(jìn)行麻醉，待麻醉生效后將豬至于恒溫 37°C手術(shù)臺上，所有步驟遵循無菌操作，常規(guī)備皮、鋪無菌洞巾，將原切口打開，逐層分離皮 膚直達(dá)臟層腹膜，打開腹腔，翻開腸攀，將腸攀用37°C生理鹽水浸濕的紗布包繞，找到右側(cè) 輸尿管，充分暴露結(jié)扎處輸尿管，此時可見結(jié)扎處輸尿管較正常狹窄，將結(jié)扎輸尿管的手術(shù) 線及聚乙烯管一并去除，用手輕輕按摩結(jié)扎處輸尿管，可見狹窄、迂曲、發(fā)白的輸尿管逐漸 恢復(fù)正常粗細(xì)，且血運(yùn)豐富，梗阻的輸尿管完全再通，留取雙側(cè)腎活檢組織約200毫克，并 留取雙側(cè)分腎靜脈血清標(biāo)本，還納腸攀，37°C，0. 9%生理鹽水反復(fù)沖洗腸攀并用吸引器吸 出鹽水，腹腔注入青霉素16萬單位/kg，逐層縫合關(guān)閉腹腔；
[0010] (四）繼續(xù)將梗阻再通后的實(shí)驗豬于動物室內(nèi)行標(biāo)準(zhǔn)觀察、飼養(yǎng)，再通7天、14天 及21天時分別再次行手術(shù)，打開腹腔留取腎組織及血清標(biāo)本，動態(tài)觀察腎臟功能及組織病 理學(xué)改變。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 1、近年來大量研宄結(jié)果表明，小型豬和人同源關(guān)系較近，在解剖學(xué)、生理學(xué)、生物 化學(xué)和疾病發(fā)生機(jī)理等方面極其相似。在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等 領(lǐng)域的研宄中常被用作為實(shí)驗動物。然而，小型豬應(yīng)用于醫(yī)學(xué)動物模型需要進(jìn)行外科手術(shù)， 沒有良好的麻醉，動物耐受不住手術(shù)強(qiáng)烈的疼痛刺激，這對完成手術(shù)過程和研宄過程造成 了障礙。以往資料表明，大多數(shù)實(shí)驗豬的麻醉，在單獨(dú)應(yīng)用一種麻醉藥物的情況下麻醉效果 均欠佳，且實(shí)驗術(shù)中需要應(yīng)用氣管插管保持呼吸道通通暢，這使豬的模型復(fù)雜化且增加了 實(shí)驗難度。針對小型豬的單側(cè)輸尿管梗阻再通模型，每次手術(shù)造模從開始到完成的時間約 為2個小時左右，手術(shù)時間較長，因此麻醉效果好是造模順利實(shí)施的前提保障。我們采用地 西泮、氯胺酮及速眠新II聯(lián)合麻醉法對實(shí)驗豬進(jìn)行術(shù)前麻醉，麻醉起效快，麻醉效果好，且 維持時間長，便于手術(shù)實(shí)施，且安全性高，無需術(shù)中氣管插管及呼吸機(jī)輔助呼吸，且術(shù)后動 物促醒快，無不良反應(yīng)。為手術(shù)順利進(jìn)行提供了保障，使大動物實(shí)驗簡便易行。另外，麻醉 后動物也較易蘇醒，與兩種藥物麻醉蘇醒時間并無顯著差異。
[0013] 2、以往的單側(cè)輸尿管再通模型曾有學(xué)者用彈性塑膠管等植入輸尿管內(nèi)造成輸尿 管梗阻模型，但此模型為將異物植入輸尿管，須手法輕柔，即便操作者技術(shù)嫻熟亦難免形成 手術(shù)粘連，導(dǎo)致操作處損傷、感染。其他如血管夾法亦容易對輸尿管造成牽拉損傷。此操作 過程中我們選用了聚乙烯片包繞法并用手術(shù)線在其上結(jié)扎，聚乙烯片價格低，容易獲得，同 時此方法避免了對輸尿管的反復(fù)牽拉及血管夾對輸尿管的損傷，二次手術(shù)再通時操作簡便 且保證了再通效果。
[0014] 3、反復(fù)進(jìn)行手術(shù)操作難免引起炎癥、腸道粘連等并發(fā)癥，我們在操作過程中用 37°C，0. 9%生理鹽水反復(fù)沖洗腸攀，并于手術(shù)結(jié)束時用青霉素注入腹腔，有效的避免了炎 癥、腸道粘連的并發(fā)癥，保證不同時間點(diǎn)的反復(fù)手術(shù)操作順利進(jìn)行。
[0015] 4、在同一只模型豬上進(jìn)行輸尿管梗阻再通操作，在梗阻以及再通的不同時間點(diǎn)都 可以留取血樣及腎組織，也就是說，每只模型豬可以經(jīng)歷4-5次手術(shù)，動態(tài)觀察了梗阻再通 不同時間點(diǎn)的腎臟病理及生理變化，這在其它模型上尚未得以實(shí)施。通過對豬的單側(cè)輸尿 管梗阻再通不同時間點(diǎn)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)隨著梗阻時間延長，病變側(cè)腎臟出現(xiàn)了不同程度 的腎小管上皮細(xì)胞扁平、刷狀緣脫落，管腔擴(kuò)大，隨著梗阻時間的延長甚至出現(xiàn)了腎間質(zhì)水 月中、間質(zhì)纖維化的改變以及腎小球的病變。再通時，不同的時間點(diǎn)，病變側(cè)及對側(cè)腎臟的組 織結(jié)構(gòu)和生理功能呈現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)。這為我們研宄腎臟纖維化的發(fā)病機(jī)制及腎臟病 纖維化的逆轉(zhuǎn)時機(jī)及治療提供了良好的工具和實(shí)驗平臺。
[0016] 5、本模型在對梗阻再通側(cè)進(jìn)行研宄的同時，還可針對對側(cè)腎臟進(jìn)行研宄，在不同 時間點(diǎn)留取雙側(cè)腎活檢組織標(biāo)本及雙側(cè)分腎靜脈血清標(biāo)本，在很大程度上模擬了人的病變 過程，在體內(nèi)實(shí)驗研宄中更有實(shí)用價值。因此，我們的造模過程為動態(tài)過程，可觀察不同時 間點(diǎn)的腎臟病變，且此動態(tài)變化可以在一只模型上觀察得到，更大程度的模擬了人的病變。 為研宄腎間質(zhì)纖維化提供了很好的實(shí)驗平臺，同時此模型也為藥物實(shí)驗提供了很好的工 具。
【附圖說明】
[0017] 圖1是腎臟及輸尿管示意圖；
[0018] 圖2是聚乙烯片卷曲成為聚乙烯管，包繞在腎輸尿管上的示意圖；
[0019] 圖3梗阻再通前后腎臟及輸尿管的大體圖片，圖中A:正常腎臟；B:梗阻腎臟；C: 正常腎臟剖面圖；D:梗阻腎臟剖面圖；E:梗阻輸尿管；F:再通后輸尿管；
[0020] 圖4是梗阻2周及3周的病變側(cè)腎臟組織的PAS及Masson染色圖；可以看到梗阻 2周及3周時腎臟病變明顯，甚至出現(xiàn)纖維化改變，說明梗阻模型成功；
[0021] 圖5是梗阻5天及再通7天、14天、21天豬的前腔靜脈血清肌酐改變圖；CON:正 常靜脈血肌酐水平；U5:梗阻5天；R7-R21 :再通7天、14天及21天；
[0022] 圖6是梗阻5天再通7天、14天、21天的腎臟病理染色圖；圖中A、E、I為梗阻5天 腎臟的PAS及MASSON染色圖；B、F、J為梗阻5天、再通7天后的PAS及MASSON染色圖；C、 G、K為再通14天的PAS及MASSON染色；D、H、L為再通21天的PAS及MASSON染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 速眠新II，由解放軍軍需研宄所研制研發(fā)，吉林省華牧動物保健品有限公司生 產(chǎn)；
[0024] 地西泮，上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；
[0025] 氯胺酮，福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
[0026] 實(shí)驗動物在吉林大學(xué)動物實(shí)驗中心飼養(yǎng)。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 包括下列步驟：
[0029](一）選擇實(shí)驗動物，所選實(shí)驗豬為廣西巴馬香豬，月齡3個月，體重8-10公斤，飼 養(yǎng)符合標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)條件，18-25°C，12小時光/暗周期，每只豬每天喂養(yǎng)豬飼料2次，每次 250g；
[0030](二）造模手術(shù)，實(shí)驗動物術(shù)前禁食水12小時，用地西泮、氯胺酮和速眠新II聯(lián)合 麻醉法，麻醉具體操作過程：先給予氯胺酮20mg/kg肌肉注射，50秒后動物搖晃倒地，肌肉 松弛，再給予地西泮lmg/kg肌肉注射，速眠新0. 15ml/kg肌肉注射，110秒麻醉生效，將豬置 于37°C恒溫手術(shù)臺，所有手術(shù)步驟遵循無菌操作，常規(guī)備皮、鋪無菌洞巾，戴無菌帽子、口罩 及手套，皮膚消毒后取腹部正中切口，9cm，逐層分離皮膚直達(dá)臟層腹膜，打開腹腔，翻開腸 攀，將腸攀用37°C生理鹽水浸濕的紗