促進(jìn)傷口愈合的方法
【專利說明】促進(jìn)傷口愈合的方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年7月27日提交的SG專利申請201205614-9號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益， 將其內(nèi)容以其整體引入于此以作參考用于所有目的。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明通常涉及生物化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及可用于傷口治療的mi-RNA、 抗-miRNA和多肽。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 糖尿病為一組特征在于由受試者產(chǎn)生和/或使用胰島素的能力受損引起的血液 中高葡萄糖水平的疾病。當(dāng)糖尿病沒有得到良好控制時，糖尿病可穩(wěn)步惡化并引起并發(fā)癥 如失明、神經(jīng)損傷、腎衰竭、心臟病和截肢。許多這些并發(fā)癥是由脈管系統(tǒng)損傷和不能愈合 傷口造成的。由糖尿病患者不能愈合傷口引起的慢性傷口是主要的全球性健康負(fù)擔(dān)，且為 最常見的下肢截肢的原因。在極端情況下，無效的傷口愈合可導(dǎo)致死亡。
[0006] 傷口愈合需要復(fù)雜的生物學(xué)事件的協(xié)調(diào)整合，這些生物學(xué)事件包括細(xì)胞迀移、增 殖和伴隨基質(zhì)沉積的細(xì)胞外重塑，普遍受到TGF-β和其它生長因子刺激。在糖尿病中，這 些復(fù)雜且交互的防護(hù)過程被破壞。因此，需要提供能夠恢復(fù)或改善正常傷口愈合的方法或 組合物。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一個方面，提供有一種促進(jìn)傷口愈合或傷口閉合的方法。本文所述的方法包括 施用miR-198抑制劑和/或卵泡抑素樣-I (follistatin-like-1，F(xiàn)STL1)多肽。
[0009] 在另一方面，提供有一種治療慢性皮膚傷口的方法。治療慢性皮膚傷口的方法可 包括施用miR-198抑制劑和/或卵泡抑素樣-I (FSTLl)多肽。
[0010] 在另一方面，提供有一種不愈合傷口（慢性皮膚傷口）的鑒定方法。所述慢性皮 膚傷口的鑒定方法可包括分析miR-198的表達(dá)水平，其中miR-198的表達(dá)或表達(dá)增加表明 所述傷口為慢性皮膚傷口。如本文所述的不愈合傷口的鑒定方法可任選包括分析FSTLl基 因的表達(dá)和/或FSTLl多肽水平，其中FSTLl基因的表達(dá)減少或無表達(dá)和/或FSTLl多肽 的水平降低或缺失表明所述傷口為慢性皮膚傷口。
[0011] 在另一方面，提供有miR-198作為用于鑒定不愈合傷口（慢性皮膚傷口）的生物 標(biāo)記物的用途。
[0012] 在另一方面，提供有miR-198在制備用于治療不愈合傷口的藥物中的用途。還提 供FSTLl多肽在制備用于治療不愈合傷口的藥物中的用途。
[0013] 在另一方面，提供有一種包含如本文所述的組合物或化合物的藥物組合物。所述 藥物組合物可包含miR-198抑制劑和TGF-β 1 ;或miR-198抑制劑和FSTLl多肽；或FSTL 多肽和TGF-β 1 ;或miR-198抑制劑和TGF-β 1以及FSTLl多肽。
[0014] 附圖簡述
[0015] 參見詳細(xì)說明，并結(jié)合非限制性實例和附圖考慮時，將更好地理解本發(fā)明，在附圖 中：
[0016] 圖1示出在上下文特定生理狀態(tài)下外顯子miRNA或所連接的ORF的表達(dá)。a)染 色體3(NCBI參考序列：NM_007085)中FSTLl基因的示意圖，示出外顯子-內(nèi)含子邊界，編 碼!1^1?-198前體的3'-^1?序列（下劃線的核苷酸表示成熟1^1?-198)。13)示出1^1?-198 表達(dá)的柱狀圖，如通過qRT-PCR在器官培養(yǎng)外植體中在損傷后的指定時間點所測定的。如 早在損傷后3小時觀察到的miR-198的顯著下調(diào)**[P〈0. 001]。c)在損傷后的（左）0和 (右）24小時時，由對正常皮膚上的成熟miR-198具有特異性的LNA探針原位雜交獲得的 圖像。注意，受傷后24小時時，miR-198表達(dá)顯著下調(diào)。d)在損傷前后在指定的時間點，對 外植體樣品中FSTLlmRNA的典型半定量-RT-PCR分析。e)在受傷后的（左）0和（右）24 小時時FSTLl蛋白的免疫組織化學(xué)定位。FSTLl蛋白表達(dá)在受傷后24小時時觀察到（η = 5)。比例尺=100 μΜ。圖1闡明了在損傷后0和24小時時，人皮膚離體器官培養(yǎng)系統(tǒng)的差 異miRNA表達(dá)譜。圖1闡明了 miR-198為在損傷時下調(diào)的一致且顯著差異表達(dá)的miRNA。
[0017] 圖2a)的直方圖表示轉(zhuǎn)染有對照或miR-198的N/TERT-1細(xì)胞中的成熟miR-198定 量（η = 3)。13)示出在刮傷后在不同時間點轉(zhuǎn)染有非祀標(biāo)miRNA對照（上圖）或miR-198(下 圖）的角化細(xì)胞迀移的代表圖。虛線標(biāo)記了角化細(xì)胞的細(xì)胞膜片（cellsheet)的迀移邊緣 (η = 6)。c)的直方圖表示在刮傷試驗中的相對傷口閉合。經(jīng)過24小時，在對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 觀察到完全傷口閉合，而miR-198的過表達(dá)導(dǎo)致35 ± 10 %的傷口閉合（η = 6)。林P〈0. 001。 誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。d)示出轉(zhuǎn)染有對照或miR-198的角化細(xì)胞的增殖，通過相對細(xì)胞匯 合度來評價。miR-198的過表達(dá)與增殖的任何顯著差異并不相關(guān)（η = 3)。e)示出轉(zhuǎn)染有 對照或miR-198模擬物的N/TERT-1細(xì)胞中FSTLlmRNA的相對水平。N. S :不顯著（η = 3)。 miR-198過表達(dá)不導(dǎo)致FSTLlmRNA水平的顯著變化。f)示出細(xì)胞共轉(zhuǎn)染有FSTL13'-UTR熒 光素酶報告基因構(gòu)建體以及miR-198或非靶向亂序?qū)φ?。?biāo)準(zhǔn)化的相對熒光素酶活性顯示 為柱形圖。熒光素酶活性表示為相對于對照的平均值，N. S :不顯著（η = 3)。g)示出從轉(zhuǎn) 染有對照或miR-198的角化細(xì)胞的微陣列數(shù)據(jù)中選擇的基因的基因表達(dá)值，表示為熱圖。 表達(dá)值顯示為在線性標(biāo)度下相對于基因的單個平均值的明暗度。h)示出表示從微陣列中 鑒定的且通過qRT-PCR驗證的所選基因的相對轉(zhuǎn)錄本豐度（對照對miR-198過表達(dá)）的直 方圖（η = 3)。微陣列數(shù)據(jù)示出與qRT-PCR結(jié)果的顯著相關(guān)。*P〈0. 05, #P〈0. 001。學(xué)生 t檢驗用于計算P值，誤差棒表示平均值土 s. e. m.。因此，圖2示出miR-198抑制角化細(xì)胞 迀移不依賴于FSTLl。
[0018] 圖3示出人皮膚器官培養(yǎng)物損傷模型中靶基因表達(dá)的結(jié)果。a)示出在損傷后0和 24小時使用來自皮膚（器官培養(yǎng)物）的RNA由微陣列產(chǎn)生的選擇基因（假定靶標(biāo)）的熱 圖。表達(dá)值顯示為在作為熱圖的線性標(biāo)度下相對于基因的單個平均值的明暗度。b)示出通 過熒光素酶報告基因試驗的miR-198的直接靶標(biāo)的驗證。293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染有如圖所示的 3' -UTR熒光素酶報告基因構(gòu)建體以及miR-198或非靶向亂序?qū)φ铡?biāo)準(zhǔn)化的相對熒光素 酶活性示為柱形圖。熒光素酶活性表示為相對于對照的平均值。（η = 3)。**P〈0. 001。學(xué)生 t檢驗用于計算P值，誤差棒表示平均值土s.e.m.。c)示出損傷后0小時和24小時，在來 自器官培養(yǎng)物的切片和來自慢性糖尿病傷口的切片上miR-198靶標(biāo)PLAU、LAMC2和DIAPHl 的免疫組織化學(xué)分析。在受傷后24小時時（中間圖）清楚觀察到靶基因的蛋白表達(dá)的大 幅增長。然而，在慢性糖尿病性潰瘍傷口（右圖）中，靶基因的表達(dá)仍相對較低（η = 8)。 d)示出在損傷后24小時的正常傷口或在慢性傷口切片上通過免疫組織化學(xué)檢測FSTLl蛋 白表達(dá)（左圖）和對miR-198的原位雜交（右圖）（η = 8)。比例尺-100 μΜ。FSTLl僅在 正常傷口中檢測到，而未在慢性糖尿病傷口中檢測到。慢性糖尿病傷口持久表達(dá)高水平的 miR-198,而miR-198在正常損傷中下調(diào)。因此，圖3闡明了調(diào)控開關(guān)在慢性傷口中受損。
[0019] 圖4示出為了理解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控開關(guān)而進(jìn)行的一系列試驗，確定轉(zhuǎn)錄本起到 pri-miRNA或mRNA的作用的命運。a)示出在TGF-M存在或缺失下使用抗KSRP抗體或 IgG對照對來自角化細(xì)胞裂解物RNA免疫沉淀。表示轉(zhuǎn)錄本富集倍數(shù)的定量RT-PCR揭示了 KSRP與pri-miR-198轉(zhuǎn)錄本的特異性結(jié)合，但不與最豐富的mRNA種類KRT14特異性結(jié)合（η =3)。b)顯示了 RNA-凝膠阻滯試驗，其示出KSRP與在pre-miR-198轉(zhuǎn)錄本的環(huán)中的富含 G-的基序特異性結(jié)合，且取消了與該位點的突變⑶C基序（Mut-I)的結(jié)合。pre-miR-198轉(zhuǎn) 錄本的莖中GG基序突變?yōu)镃C僅產(chǎn)生適度的結(jié)合損失（Mut-2)。僅用KSRP觀察到RNA-蛋 白質(zhì)復(fù)合物，而用BSA對照則未觀察到（最后泳道）（η = 3)。c)示出在重組KSRP (rKSRP) 的存在下pre-miR-198的有效加工。體外合成的pre-miR-198轉(zhuǎn)錄本用293T細(xì)胞質(zhì)提取 物在rKSRP的濃度有無增加下孵育。裂解的成熟miR-198通過與在pre-miR-198用RNase III處理時釋放的產(chǎn)物的共迀移來檢測。d)示出表示成熟miR-198的密度定量的直方圖