專(zhuān)利名稱(chēng)：用連續(xù)禽類(lèi)細(xì)胞系制備禽麻痹病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及連續(xù)禽類(lèi)細(xì)胞系的用途，其支持禽麻痹病病毒(MDV)以高滴度的生長(zhǎng)及該病毒的生產(chǎn)性感染。本發(fā)明涉及可用作培養(yǎng)基底以有效繁殖大量禽麻痹病病毒特別是用于疫苗制備的細(xì)胞系。本發(fā)明涉及重組禽麻痹病病毒載體和包裝所述載體的細(xì)胞系，以及可用作疫苗的重組禽麻痹病病毒。禽麻痹病病毒載體及疫苗可用于保護(hù)禽類(lèi)免受禽麻痹病病毒的感染，以及抵抗由于感染所引起的疾病。
禽麻痹病(MD)是一種幼禽的急性致癌性疾病，其引發(fā)淋巴瘤、內(nèi)臟瘤、神經(jīng)損害和免疫抑制。此疾病為全球性的，分布廣泛。病因是一種皰疹病毒，禽麻痹病病毒。在適于烤制的家禽中禽麻痹病已成為引起死亡的主要原因，危險(xiǎn)很大(Dalnek，B.W.和Witter，R.L.，家禽疾病，第9版，Iowa State Press，Ames，Iowa，342-385(1991))。
禽麻痹病病毒有三種血清型。血清型1包括全部致病株及其減毒型衍生物。血清型2由天然無(wú)致病力的幼禽病毒組成，而血清型3也稱(chēng)為火雞皰疹病毒(HVT)，包括可在幼禽中復(fù)制的無(wú)致病力的火雞病毒。這三種血清型有部分交叉保護(hù)作用，但可利用多克隆或單克隆抗體試驗(yàn)、多肽模式及DNA分析等方法(Silva，R.F和Lee，L.F.，病毒學(xué)，36卷，307-320(1984)；Payne，L.N.，病毒學(xué)百科全書(shū)(Webster，12.G及Granoff，A.編)，832-838(1994))和其它已知方法加以區(qū)分。
MDV血清型1及HVT的DNA基因組分別為大約180和160千堿基的線(xiàn)性雙鏈分子。與其它皰疹病毒相似，MDV基因組由被反向重復(fù)序列包圍的長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)和短獨(dú)特區(qū)(US)構(gòu)成。三種MDV血清型的基因組均為全長(zhǎng)閉合環(huán)狀DNA的形式，但是這三種MDV血清型之間在嚴(yán)格雜交條件下幾乎無(wú)同源性，盡管它們的基因組共線(xiàn)性(見(jiàn)，Payne，L.N.，病毒學(xué)百科全書(shū)(Webster，R.G和Granoff，A.編)，832-838(1994))。
與其它皰疹病毒相比禽麻痹病病毒似乎不易發(fā)生重組，病毒的細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)使從親本病毒中分離重組子的噬斑純化不易。盡管如此，已從下列血清型中產(chǎn)生了重組MD病毒血清型1(Sonoda，K.等人，疫苗(Vaccine)14卷，277-284(1996)；Parcells，M.S.等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，69卷，7888-7898(1995)；Parcell，M.S.等人，病毒基因(Virus Gene)(9)，5-13(1994)；Parcell，M.S.等人，病毒學(xué)，688239-8253(1994)；Sakaguchi，M.，疫苗，12953-957(1994)；Reddy，S.K.等人，疫苗，14469-477(1996)、血清型2(Marshall，D.R.等人，病毒學(xué)，(195)，638-648(1993)；Silva，R.F.第14屆國(guó)際皰疹病毒工作會(huì)議(摘要)(1989))和血清型3(Reddy，S.K.等人，疫苗，14469-477(1996)；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/29248(1995)；Silva，R.F.，第14屆國(guó)際皰疹病毒工作會(huì)議(摘要)(1989)；Darteil，R.，等人，病毒學(xué)211481-490(1995)；1995年授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5,187,087；Zelnik，V.等人，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Viroll.)，762903-2907(1995)；歐洲專(zhuān)利431,668B1，公開(kāi)于1995年；Morgen，R.W.等人，禽類(lèi)疾病，36858-870(1992)；Bandyopadhyay，P.K.等人，第13屆國(guó)際皰疹病毒工作會(huì)議323(摘要)(1988))。在所有上述文獻(xiàn)中，病毒均有復(fù)制能力，且在原代禽類(lèi)細(xì)胞中制備。
市售禽麻痹病病毒疫苗除了某些單價(jià)HVT制劑外，主要由活的禽麻痹病病毒感染的原代幼雞胚胎成纖維細(xì)胞(EF)構(gòu)成。與利用完整活體禽麻痹病病毒感染的原代幼雞細(xì)胞以生長(zhǎng)用于疫苗中的禽麻痹病病毒這種情況相關(guān)的顯著問(wèn)題在于，CEF細(xì)胞必須貯存在液氮溫度，且為保證有效須通過(guò)注射施用。以前需要完整活細(xì)胞疫苗是因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)物及感染的禽類(lèi)大多數(shù)的組織中三種禽麻痹病病毒血清型細(xì)胞結(jié)合性很強(qiáng)?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸實(shí)現(xiàn)禽類(lèi)內(nèi)感染的傳播，僅有極少或沒(méi)有不帶細(xì)胞的病毒放出。傳染性病毒體僅在羽濾泡上皮(FFE)中產(chǎn)生，負(fù)責(zé)禽與禽的傳播(Calnek，B.W.等人，禽類(lèi)疾病，14219-233(1970)；Witter，R.L.，等人，國(guó)家癌癥研究所雜志(J.Natl.Cancer Inst.491121-1130(1972)；Edison，C.S等人，國(guó)家癌癥研究所雜志，47113-120(1971))。
市售無(wú)細(xì)胞禽麻痹病病毒疫苗可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)制備。然而，無(wú)細(xì)胞禽麻痹病病毒疫苗的制備目前局限于僅利用血清型3的禽麻痹病病毒制備的疫苗。這是因?yàn)?，僅有血清型3的禽麻痹病病毒以對(duì)于禽麻痹病病毒疫苗制備足夠的量制造游離病毒體。已建議病毒糖蛋白D(gD)基因表達(dá)的缺乏可參與無(wú)細(xì)胞病毒體的有限度釋放(PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO95/29248，公開(kāi)于1995年；Tan，X和Velicer，L.F.第18屆國(guó)際皰疹病毒工作會(huì)議A，145(摘要)，(1993))。
除了CEF9，其它原代禽類(lèi)細(xì)胞也適用于生長(zhǎng)禽麻痹病病毒，包括幼雞胚胎腎(CEK)細(xì)胞和鴨胚胎成纖維細(xì)胞(DEF)。一種命名為QT 35的化學(xué)轉(zhuǎn)化的鵪鶉細(xì)胞系已被描述用作培養(yǎng)基底用于無(wú)致病性的禽麻痹病病毒血清型2和血清型3的培養(yǎng)，但不包括血清型1(Nikura，M.，Nanta，T等人，獸醫(yī)學(xué)雜志(J.Vet.Med.Sci)，53439-446(1991))。一種化學(xué)轉(zhuǎn)化的CEF細(xì)胞系(稱(chēng)為CHCC-OU2(Ogura，H和Fujiwara，T.，Acta Med.Okayama，41141-143(1987))已被描述可支持禽麻痹病病毒1的生長(zhǎng)(Abujoub，A.和Coussens，P.M.，病毒，214541-549(1985))。
其它已知用于禽麻痹病病毒制備的方法包括致腫瘤或致癌細(xì)胞系的使用。禽麻痹病轉(zhuǎn)化的類(lèi)淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(Nazerian，K.，禽類(lèi)病理學(xué)(Avian Pathol.)16527-544(1987))衍生自用致癌性禽麻痹病病毒1感染的幼雞淋巴瘤。在這些細(xì)胞中病毒基因組以潛伏型或半潛伏型保持，因而對(duì)共培養(yǎng)的CEF細(xì)胞或DEF細(xì)胞之感染的傳播，如果發(fā)生的話(huà)也是以很低的頻率。此外，這些類(lèi)淋巴母細(xì)胞系可耐受用其它禽麻痹病病毒的再度感染。而且，禽麻痹病病毒轉(zhuǎn)化的類(lèi)淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系未顯示出在制備非重組型(傳統(tǒng))禽麻痹病病毒疫苗或制備重組禽麻痹病病毒或制備基因工程改造的禽麻痹病病毒或載體中的用途。
類(lèi)似地，衍生自致癌性禽類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒(禽白血病病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒)的類(lèi)淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(Nazerian，K.，禽類(lèi)病理學(xué)，16527-544，1987)也未用于制備商業(yè)化禽麻痹病病毒疫苗或用于產(chǎn)生重組禽麻痹病病毒，因?yàn)榇嬖谀孓D(zhuǎn)錄病毒的釋放、類(lèi)淋巴母細(xì)胞較差的生長(zhǎng)特征以及低水平的禽麻痹病病毒生產(chǎn)性感染。因此，仍需要適合的培養(yǎng)基底用于以免疫接種為目的之高滴度生長(zhǎng)禽麻痹病病毒。
圖1描述了MDV-1(652)/QM7感染的轉(zhuǎn)化灶之免疫熒光和致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。在含3％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12中QM7細(xì)胞用652/DEF感染7天。感染的細(xì)胞然后用80％丙酮固定，用MDV-1特異性單克隆抗體(抗-gB和抗pp38)染色。QM7與DEF共培養(yǎng)的陰性對(duì)照染色呈全部陰性。上部圖為652/QM7轉(zhuǎn)化灶的免疫熒光結(jié)果；下部圖為652/QM7的感染轉(zhuǎn)化灶的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。
圖2是含有禽麻痹病病毒gH基因插入片段的pCR 3.1載體的圖譜。用PCR方法從Md5株中克隆MDV-1之2.6kb的gH基因。然后將其克隆入pCR3.1載體的多克隆位點(diǎn)(Invitrogen.Inc.，目錄號(hào)K3000-01)。
圖3描述了MDV-1 gH和gD蛋白質(zhì)的免疫熒光檢測(cè)。分別用pCR3 gH-HA和pCR3 gD-HA(gH和gD基因帶有一種HA標(biāo)記)轉(zhuǎn)染QM7。48小時(shí)后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用80％丙酮固定，用針對(duì)HA的單克隆抗體染色(Babco Mab，目錄號(hào)MMS-101R)。圖A，QM7細(xì)胞中的gH-HA；圖B，QM7細(xì)胞中的gD-HA。
圖4描述了MDV-1 gH和gD蛋白質(zhì)的免疫沉淀分析。分別用pCR3gH-HA和pCR3gD-HA(gH和gD基因帶有一種HA標(biāo)記)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染QM7細(xì)胞。選擇G418抗性細(xì)胞并克隆。然后將這些細(xì)胞用35S-Met(TransLabel，INC)代謝性標(biāo)記5小時(shí)，于裂解緩沖液(BoeringerMannheim免疫沉淀試劑盒)中裂解。與針對(duì)HA的單克隆抗體(BabcoMab，目錄號(hào)MMS-101R)溫育后使用蛋白質(zhì)G Sepharose。泳道1-3用pCR3gH-HA轉(zhuǎn)染的G418抗性細(xì)胞；泳道4-6用pCR3gD-HA轉(zhuǎn)染的G418抗性細(xì)胞；泳道7和8表達(dá)gH-HA細(xì)胞的單細(xì)胞克隆；泳道9和10表達(dá)gD-HA細(xì)胞的單細(xì)胞克隆。
圖5是pGreenLantern2質(zhì)粒圖譜(Life Technoligies)。
圖6是pGL2/5’-3’-gfp質(zhì)粒圖。這個(gè)質(zhì)粒中，將2kb長(zhǎng)度的MDV-1(Md5)5’gH側(cè)翼區(qū)插入經(jīng)改造的pGreenLantern 2質(zhì)粒的NsiI位點(diǎn)，將2kb長(zhǎng)度的MDV-1(Md5)3’gH側(cè)翼區(qū)插入到pGreenLantern 2的Nae I位點(diǎn)。
圖7描述了gfp+重組MDV-1病毒的鑒定。質(zhì)粒pGH2/5’-3’轉(zhuǎn)染入652/QM7感染的細(xì)胞。當(dāng)明顯可見(jiàn)病毒感染的致細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，將細(xì)胞傳代兩次。然后將細(xì)胞懸浮液通過(guò)FACS分選器檢測(cè)其綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)表達(dá)。將所選gfp+細(xì)胞接種至12孔板上。上部圖，在紫外線(xiàn)下gfp+感染的轉(zhuǎn)化灶可見(jiàn)；下部圖，在正常光下帶有病毒致細(xì)胞病毒效應(yīng)的相同轉(zhuǎn)化灶。
本發(fā)明涉及可有效支持禽麻痹病病毒(MDV)以高滴度生長(zhǎng)及生產(chǎn)性感染的禽類(lèi)細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及經(jīng)基因工程改造以支持天然存在的和重組禽麻痹病病毒以高滴度生長(zhǎng)及生產(chǎn)性感染的禽類(lèi)細(xì)胞系。本發(fā)明涉及以適于免疫接種目的的量制備禽麻痹病病毒的方法。
本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即連續(xù)禽細(xì)胞系可支持禽麻痹病病毒以高滴度的生長(zhǎng)及生產(chǎn)性感染。特別地，已發(fā)現(xiàn)了以高滴度支持病毒生長(zhǎng)的禽細(xì)胞系為鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“MDV”指一種MDV病毒顆粒，其相應(yīng)于天然存在的MDV病毒顆粒，如野生型MDV或天然存在的突變MDV，或重組MDV病毒顆粒。天然存在的MDV病毒顆粒由野生型MDV基因組或天然存在的MDV基因組編碼。重組MDV病毒顆粒由重組MDV基因組編碼。重組MDV基因組包含MDV基因組核苷酸序列或其片段。這種片段須有足夠長(zhǎng)度以編碼至少一種MDV基因產(chǎn)物或該基因產(chǎn)物的片段，以使該基因產(chǎn)物的片段保持基因的活性。例如，重組MDV基因組包含MDV的核苷酸序列，其中對(duì)于該病毒復(fù)制或病毒生活周期其它階段必需的基因產(chǎn)物的基因被刪除。此外，重組MDV基因組可進(jìn)一步包含編碼異源基因或異源片段的核苷酸序列。這種片段包含編碼抗原表位如禽白血病毒(ALV)的核苷酸序列、調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子序列，或是一段仍保留足夠長(zhǎng)片段的基因片段，以使由這種片段編碼的多肽仍保留基因產(chǎn)物的活性。
本發(fā)明包含了這樣的連續(xù)禽細(xì)胞系，其含有編碼天然存在的MDV或重組MDV的DNA，如MDV核苷酸序列或編碼在異源調(diào)節(jié)元件控制下的MDV核苷酸序列的DNA，或是編碼含有至少一種異源基因或其片段的MDV核苷酸序列的DNA。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明也包含了已經(jīng)基因工程化以表達(dá)天然存在的MDV或重組MDV的鵪鶉細(xì)胞系。
本發(fā)明也包含用編碼一種MDV的核苷酸序列的DNA轉(zhuǎn)染的連續(xù)禽細(xì)胞系，其中該MDV核苷酸序列已被刪除了一種基因或其片段，該基因的產(chǎn)物對(duì)于病毒復(fù)制或病毒生活周期的其它階段必需。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括連續(xù)禽細(xì)胞系，其含有且表達(dá)編碼MDV基因或其片段的DNA，該基因?qū)τ诓《緩?fù)制或病毒生活周期的其它階段必需。這種核苷酸序列可在細(xì)胞自身調(diào)節(jié)元件或異源調(diào)節(jié)元件控制下組成型表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。本發(fā)明還包括經(jīng)基因工程化以穩(wěn)定表達(dá)MDV核苷酸序列或其片段的連續(xù)禽細(xì)胞系，表達(dá)受組成型激活的調(diào)節(jié)元件或誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件的控制。
本發(fā)明也包括用天然存在的MDV或重組MDV感染的連續(xù)禽細(xì)胞系，或是用MDV感染的細(xì)胞裂解物或其組分感染的連續(xù)禽細(xì)胞系。
MDV可選自血清型1、血清型2或血清型3，可單獨(dú)選用或選用它們的任一組合。
另一方面，本發(fā)明涉及MDV用于制備可在禽中誘導(dǎo)針對(duì)疾病的保護(hù)反應(yīng)的疫苗方面的用途。
優(yōu)選地，所用連續(xù)禽細(xì)胞系為鵪鶉細(xì)胞系，如于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏號(hào)為ATCC-CRL 12599的QM7細(xì)胞系，其可用MDV 652株感染；又如于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏號(hào)為ATCC-CRL 12600的652-QM7細(xì)胞系。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明不包括使用命名為QT35的化學(xué)轉(zhuǎn)化的鵪鶉細(xì)胞系培養(yǎng)MDV血清型2或血清型3。
本發(fā)明也包括用于增殖MDV的方法，其包括通過(guò)用MDV或用MDV感染的細(xì)胞或其細(xì)胞裂解物感染細(xì)胞系，將天然存在的MDV或重組MDV導(dǎo)入連續(xù)禽細(xì)胞系，以及培養(yǎng)感染的細(xì)胞系，且從中收獲細(xì)胞組分。本發(fā)明還包括由在禽中可誘導(dǎo)針對(duì)疾病的保護(hù)反應(yīng)的所述細(xì)胞或其組分制備疫苗。
本發(fā)明也包括一種增殖MDV的方法，其包括用編碼天然存在的MDV或重組MDV的核酸序列之DNA感染連續(xù)禽細(xì)胞系，培養(yǎng)細(xì)胞系，從中回收組分。依本發(fā)明的這一方面，DNA可編碼天然存在的MDV核苷酸序列；包含有MDV基因組或其片段的核苷酸序列的重組MDV核苷酸序列。所述片段須足夠長(zhǎng)以編碼至少一種基因產(chǎn)物或該基因產(chǎn)物的片段，以便基因產(chǎn)物的片段保持基因活性。此外，重組MDV可有效連接于異源調(diào)節(jié)元件，或可含有至少一種異源基因或片段。
本發(fā)明也包括一種用編碼重組MDV的DNA轉(zhuǎn)染的連續(xù)禽細(xì)胞系，其中重組MDV已被刪除了一個(gè)基因或其片段，該基因產(chǎn)物對(duì)于病毒復(fù)制或病毒生活周期的其它階段必需。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有并表達(dá)編碼MDV基因或其片段的DNA之連續(xù)禽細(xì)胞系，其中所述MDV基因?qū)τ诓《緩?fù)制或病毒生活周期的其它階段必需。這種核苷酸序列可在細(xì)胞自身調(diào)節(jié)元件或異源調(diào)節(jié)元件控制下組成型表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。這種細(xì)胞系可用于制備重組MDV，方法是通過(guò)感染并培養(yǎng)這種帶有編碼禽麻痹病病毒核酸序列之DNA的基因工程化禽細(xì)胞系。例如，缺失的基因可以是對(duì)于復(fù)制必需的基因。更特別地，缺失的基因可以是禽麻痹病病毒的gH基因或其片段。依本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，感染并培養(yǎng)禽細(xì)胞系，其帶有獲自由MDV感染的或者經(jīng)基因工程化以表達(dá)MDV的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物或組分，從而可產(chǎn)生第二代MDV。
依本發(fā)明，禽細(xì)胞系可被基因工程化以瞬時(shí)表達(dá)編碼天然存在的或重組MDV的DNA，或可被基因工程化以穩(wěn)定表達(dá)編碼天然存在的或重組MDV的DNA。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，禽細(xì)胞系為鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系。
MDV可選自血清型1、血清型2和血清型3，可單獨(dú)選用或選用它們的任一組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及上述方法，其中MDV是一種病毒，其用于制備在禽中可誘導(dǎo)針對(duì)疾病的保護(hù)反應(yīng)的疫苗。
優(yōu)選地，所用連續(xù)禽細(xì)胞系是用MDV的652株感染的鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系，如1998年11月24日保藏于ATCC，保藏號(hào)ATCC-CRL12599的細(xì)胞系。其它合適的株的例子包括MDV-1的584A株和Md5株。MDV-1652株可獲自用652株感染的鵪鶉成肌細(xì)胞，其已于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏號(hào)ATCC-CRL 12600。
本發(fā)明涉及制備用作疫苗的安全減毒型MDV-1重組體，為了使其不含有細(xì)胞而改變MDV-1病毒的極端細(xì)胞結(jié)合特性；還涉及產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系以制備病毒。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基因工程化重組禽麻痹病病毒和病毒載體以用作疫苗。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組禽麻痹病病毒載體和病毒，其經(jīng)基因工程化以編碼突變的禽麻痹病病毒基因或編碼來(lái)自多種禽麻痹病病毒血清型的基因的組合。
所得表達(dá)產(chǎn)物和/或嵌合病毒體可有利地用于疫苗制劑。本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物和嵌合病毒體可經(jīng)基因工程化以產(chǎn)生抵抗包括病毒性抗原的侵襲禽類(lèi)的廣譜病原體的疫苗。特別地，本發(fā)明的嵌合病毒體可經(jīng)基因工程化產(chǎn)生抗ALV(禽白血病病毒)疫苗，其中將來(lái)自ALV的免疫原性多肽基因工程化入MDV基因組，以構(gòu)建可引起針對(duì)MDV和ALV的免疫應(yīng)答的疫苗。此外，可被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合載體以用于疫苗的異源基因序列包括但不限于，衍生自其它MDV血清型的序列、新城疫病毒(NDV)、傳染性Bursal疾病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、幼雞貧血病毒(CAV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(RV)和禽流感病毒(AIV)(見(jiàn)Field等人(編)，1991，病毒學(xué)基礎(chǔ)，第二版，Raven Press，紐約，此處全文引入作為參考)。
疫苗可包括選自血清型1、血清型2和血清型3的MDV，其中可單獨(dú)選用也可選用它們的任一組合。優(yōu)選地，利用由禽麻痹病病毒感染的或轉(zhuǎn)染的禽細(xì)胞系制備疫苗。
本發(fā)明的再一方面是利用上述方法制備的重組MDV。例如，重組MDV可包含天然存在的MDV的核酸序列，其中一種或多種基因如對(duì)于病毒復(fù)制必需的基因被刪除。這種必需基因的例子之一是MDV基因組的糖蛋白H(gH)基因或其片段。所得缺陷型病毒(復(fù)制缺陷型)有單次循環(huán)的傳染性，只要可得到經(jīng)基因工程改造含有關(guān)于病毒復(fù)制必需基因且籍此可表達(dá)所缺失基因產(chǎn)物的互補(bǔ)性細(xì)胞系，用來(lái)增殖缺陷型病毒。缺陷型病毒的制備及其作為疫苗的用途描述于PCT申請(qǐng)GB91/01632(公開(kāi)文本W(wǎng)O 92/05263)，在此引入全文作為參考。
本發(fā)明的又一方面是含有基因工程化禽細(xì)胞系的一種細(xì)胞系，其能表達(dá)復(fù)制必需的一種天然存在的MDV基因，例如gH，且能夠使缺陷型MDV病毒復(fù)制本發(fā)明的又一方面是利用上述方法產(chǎn)生的MDV載體。MDV載體包含重組MDV和一種或多種異源基因或其片段。任選地，MDV載體帶有包含SEQ ID NO2中所述核酸序列的3’側(cè)翼區(qū)。還任選，MDV載體帶有包含如SEQ ID NO1中所述核酸序列的5’側(cè)翼區(qū)。此外，MDV載體可以同時(shí)帶有包含SEQ ID NO2中所述核酸序列之3’側(cè)翼區(qū)以及包含如SEQ ID NO1中所述核酸序列之5’側(cè)翼區(qū)。
本發(fā)明的又一方面涉及一種保護(hù)動(dòng)物抵抗疾病的方法，其通過(guò)向動(dòng)物施用含有由上述方法制備的MDV的疫苗。優(yōu)選地，動(dòng)物為禽類(lèi)。
本發(fā)明提供了關(guān)于連續(xù)禽細(xì)胞系用以制備天然存在的和重組禽麻痹病病毒(MDV)的用途的方法，制備基因工程化MDV和MDV載體以及用MDV感染或轉(zhuǎn)染的連續(xù)禽細(xì)胞系的方法，以及用這些方法制備的能保護(hù)動(dòng)物抵抗MDV引起的疾病的疫苗和/或其它致病因子引起疾病的疫苗。此外，提供了向動(dòng)物施用MDV疫苗和MDV載體產(chǎn)生的疫苗，以保護(hù)動(dòng)物防止MDV感染。
將本發(fā)明的MDV疫苗制備分成下列步驟僅僅出于描述的目的，而不以任何方式限制a)重組MDV模板的構(gòu)建；b)基因工程化禽細(xì)胞系以支持天然存在的和重組MDV的生產(chǎn)性感染；和c)援救待配制成疫苗的MDV、細(xì)胞培養(yǎng)物、裂解物或裂解物組分。本發(fā)明也包括含有重組MDV編碼核苷酸序列的疫苗制劑。為論述清楚，用MDV652株血清型1在實(shí)施例中描述本發(fā)明，然而，可利用任何MDV的血清型。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“MDV”指一種MDV病毒顆粒，其相應(yīng)于天然存在的MDV病毒顆粒，如野生型MDV或天然存在的突變MDV，或重組MDV病毒顆粒。天然存在的MDV病毒顆粒由野生型MDV基因組或天然存在的MDV基因組編碼。重組MDV病毒顆粒由重組MDV基因組編碼。重組MDV基因組包含MDV基因組核苷酸序列或其片段。這種片段須有足夠長(zhǎng)度以編碼至少一種MDV基因產(chǎn)物或該基因產(chǎn)物的片段，以使該基因產(chǎn)物的片段保持基因的活性。例如，重組MDV基因組包含MDV的核苷酸序列，其中對(duì)于該病毒復(fù)制或其它病毒生活周期其它階段必需的基因產(chǎn)物的基因被刪除。此外，重組MDV基因組可進(jìn)一步包含編碼異源基因或異源片段的核苷酸序列。這種片段包含編碼抗原表位的核苷酸序列、調(diào)節(jié)序列，或是一段仍保留足夠長(zhǎng)片段的基因片段，以使由這種片段編碼的多肽仍保留基因產(chǎn)物的活性。MDV也包括重組產(chǎn)生的禽麻痹病病毒(重組禽麻痹病病毒)或其片段本發(fā)明包括重組禽麻痹病病毒，其帶有對(duì)于病毒復(fù)制或病毒生活周期中其它階段必需的基因或基因區(qū)中的缺失或突變，包括感染的起始和病毒顆粒的包裝。依本發(fā)明的這一方面，MDV基因組的缺失和/或突變足以消除或降低必需基因產(chǎn)物的表達(dá)，和/或消降或降低必需基因產(chǎn)物的活性。可作為靶目標(biāo)的MDV基因的例子包括但不限于gH、gB、gD和殼體基因。依本發(fā)明的這一方面，在嘗試產(chǎn)生減毒型表型的重組MDV時(shí)，MDV基因組的必需區(qū)是關(guān)注的目標(biāo)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中包括了含有在MDV基因組之必需或非必需區(qū)有缺失和/或突變的重組禽麻痹病病毒。MDV基因組中的這種區(qū)域可用任意異源核苷酸序列替換，從而產(chǎn)生嵌合MDV載體。實(shí)際上，可將任何異源基因序列構(gòu)建入MDV載體用于疫苗中。依本發(fā)明的這一方面，異源基因序列可包括一種用于提高或激活宿主細(xì)胞免疫和/或體液免疫應(yīng)答的基因產(chǎn)物，或者包括編碼一種誘導(dǎo)針對(duì)任一種不同類(lèi)型病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)的基因產(chǎn)物，或者包括結(jié)合中和抗體的抗原。例如，可被構(gòu)建入本發(fā)明的嵌合載體用于疫苗的異源基因序列包括但不限于，衍生自MDV其它血清型的序列、新城疫病毒(NDV)、傳染性Bursal病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、幼雞貧血病毒(CAV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILV)、禽類(lèi)白血病病毒(ALV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(RV)和禽類(lèi)流感病毒(AV)(見(jiàn)Fields等人編，1991，病毒學(xué)基礎(chǔ)，第二版，Raven Press，紐約，此處全文引用作為參考)。
可通過(guò)用異源基因全部或部分替換病毒編碼區(qū)實(shí)現(xiàn)異源基因插入MDV基因組。全部替換最好可通過(guò)使用PCR介導(dǎo)的突變方法來(lái)完成。簡(jiǎn)言之，PCR引物A可含有(從5’端至3’端)一個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)，如IIS類(lèi)限制性酶切位點(diǎn)(即移換酶(Shifter enzyme)；其識(shí)別特定的序列，但切割該序列的上游或下游的DNA)；一串與MDV基因區(qū)互補(bǔ)的核苷酸；以及一串與異源基因產(chǎn)物羧基端編碼片段互補(bǔ)的核苷酸。PCR引物B可含有(從5’端至3’端)一個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)；一串與MDV基因互補(bǔ)的核苷酸；以及一種與異源基因的5’端編碼片端相應(yīng)的核苷酸。利用這些PCR引物與克隆的異源基因拷貝進(jìn)行PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物可用單一限制性酶切位點(diǎn)切割和克隆。用IIS類(lèi)酶消化并用純化的噬菌體聚合酶轉(zhuǎn)錄后，產(chǎn)生了含有恰好在MDV基因未翻譯端帶有異源基因插入片段的分子。
應(yīng)理解，重組MDV包括例如禽麻痹病病毒核酸序列的替換、插入、反轉(zhuǎn)、添加和刪除或其任意組合，如禽麻痹病病毒的缺失突變體中MDV基因組的非必需區(qū)或必需區(qū)被刪除或突變，以使這些區(qū)未表達(dá)，如基因敲除或錯(cuò)義突變。這樣的變異體可自然發(fā)生或可用傳統(tǒng)重組技術(shù)進(jìn)行遺傳工程改造，以產(chǎn)生這樣的變異。
重組禽麻痹病病毒或其片段的制備和操作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)，可根據(jù)除了其它地方之外所描述的重組技術(shù)進(jìn)行，如在Maniatis等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等人，1989，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，Greene publishing Associates和Wiley Interscience，A cademic Press Inc.，San Diago；以及Erilch編，1992，PCT技術(shù)，Oxford University Press，NY，上述均全文引入作為參考。
利用重組技術(shù)制備多種重組禽麻痹病病毒和禽麻痹病病毒載體的方法均已知。例如，美國(guó)專(zhuān)利5,231,023(授權(quán)于1993年7月27日)描述了通過(guò)將異源基因插入MDV的基因組DNA之非必需區(qū)制備的禽麻痹病病毒病毒載體。
本發(fā)明也包括DNA表達(dá)載體和遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，其中DNA表達(dá)載體含有與可指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效結(jié)合的任一前述編碼序列，而遺傳工程改造的宿主細(xì)胞中含有與在宿主細(xì)胞中可指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效結(jié)合的任一前述編碼序列。如此處所用，調(diào)節(jié)元件包括但不限于，誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)表達(dá)的元件。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用在鵪鶉細(xì)胞系中有活性的或由MDV誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，這些元件由本申請(qǐng)人加以描述，包括單純皰疹病毒1(HSV-1)的gD啟動(dòng)子元件、ILTV的gG啟動(dòng)子元件、ILTV的gC啟動(dòng)子元件、PRV的gX啟動(dòng)子元件、SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子。
可通過(guò)重組DNA技術(shù)利用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)制備MDV基因組或其片段。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)載中含有MDV編碼序列、合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。見(jiàn)例如Sambrook等人1969(出處同前)和Ausubel等人，1989(出處同前)中所述的技術(shù)?；蛘?，可通過(guò)如合成儀化學(xué)合成能編碼MDV基因產(chǎn)物序列的RNA。見(jiàn)如描述于“寡核苷酸合成”，1984，Gait，M.J.編，IRL Press，Oxford中所述的技術(shù)，此處全文引用作為參考。
依本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“MDV載體”包括一種表達(dá)載體，其含有對(duì)于表達(dá)一種或多種有功能多肽如抗原所必需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的MDV載體的例子包括那些在包裝細(xì)胞系中表達(dá)的MDV基因組或其片段的那些載體，其中表達(dá)是在MDV調(diào)節(jié)元件控制下，或是在設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)MDV基因組表達(dá)的異源調(diào)節(jié)元件控制下。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用在鵪鶉細(xì)胞系中有活性或由MDV誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，其由本申請(qǐng)人證實(shí)，包括單純皰疹病毒1(HSV-1)gD基因啟動(dòng)子元件、ILTV的gG啟動(dòng)子元件、ILTV的gC啟動(dòng)子元件、PRV的gX啟動(dòng)子元件、SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子。
本發(fā)明也包括可產(chǎn)生帶有減毒型表型的病毒顆粒的重組MDV載體，其一個(gè)例子為必需基因已被突變和/或刪除從而導(dǎo)致復(fù)制缺陷型MDV的重組MDV。MDV基因組或其片段可包括野生型核苷酸序列、遺傳改變的MDV的核苷酸序列或其片段，其包括必需基因區(qū)的缺失或異源序列的插入。本發(fā)明此方面的一優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣一種重組MDV基因組，其中的gH基因被全部刪除，或被刪除了足夠大的一個(gè)片段，以防止gH基因產(chǎn)物的表達(dá)；或是其中的gH基因被突變?nèi)珏e(cuò)義突變，以防止gH基因產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明此方面另一優(yōu)選的實(shí)施方案中包括這樣一種重組MDV基因組，其衣殼基因被全部刪除，或被刪除了足夠大的一個(gè)片段，以防止衣殼基因產(chǎn)物表達(dá)，或者其中的衣殼基因被突變，如錯(cuò)義突變，以防止衣殼基因產(chǎn)物表達(dá)。
應(yīng)理解MDV也包括這樣的重組MDV，其含有位于MDV基因組核酸序列內(nèi)插入?yún)^(qū)的整合的一個(gè)或多個(gè)外源基因。在本發(fā)明此方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MDV基因組經(jīng)基因工程化以表達(dá)一種或多種MDV三種血清型的抗原肽，以產(chǎn)生施用于禽類(lèi)的多價(jià)疫苗，賦予它們更全面的抵抗MDV感染的保護(hù)作用。例如，MDV血清型1的MDV基因組還可經(jīng)基因工程化以編碼MDV血清型2和3的gB基因產(chǎn)物之抗原決定簇。在另一實(shí)施方案中，異源基因和基因片段可編碼其它引起禽類(lèi)疾病的因子之抗原。用于制備帶有異源基因和片段的重組禽麻痹病病毒的方法在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)，可依描述于Maniatis等人和其它上述文獻(xiàn)中的重組技術(shù)進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，MDV載體可被基因工程化以含有重組MDV的核苷酸序列，以及一種或多種編碼MDV抗原或其它引起禽類(lèi)疾病因子如(ALV)抗原的異源基因的核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，異源基因和基因片段可編碼其它引起禽類(lèi)疾病因子的抗原。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的MDV載體可經(jīng)基因工程化，以編碼已知可提高禽類(lèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)的異源蛋白質(zhì)，從而增強(qiáng)所施用疫苗的整體保護(hù)效果。
可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)的重組技術(shù)將MDV和異源基因經(jīng)基因工程進(jìn)入本發(fā)明的MDV載體，其可在本發(fā)明的連續(xù)禽細(xì)胞系中表達(dá)，一旦配制成適當(dāng)?shù)男问角沂┯糜谇蓊?lèi)，其可引發(fā)應(yīng)答重組禽麻痹病病毒和/或異源基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)。應(yīng)將足夠的且有功能的啟動(dòng)子與異源基因相連，以使MDV載體能表達(dá)異源基因。啟動(dòng)子可以是真核的、原核的或病毒啟動(dòng)子，其能在用重組MDV載體感染的細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子的制備和使用已知，且可依描述于Maniatis等人和其它上述文獻(xiàn)中的重組技術(shù)進(jìn)行。
本發(fā)明包括制備MDV和MDV載體的方法，方法為感染、轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)連續(xù)禽細(xì)胞系，如貓腎細(xì)胞和鵪鶉細(xì)胞系，其能產(chǎn)生MDV或用于MDV載體制備。在這種細(xì)胞系中制備的MDV可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離技術(shù)分離?！案腥尽被颉稗D(zhuǎn)染”是指病毒的DNA或其片段轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。用于基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍內(nèi)，如Watson等人1992，重組DNA，第2版，W.H.Freeman AndCompany N.Y，中所述。
本發(fā)明涉及連續(xù)禽細(xì)胞系，特別是鵪鶉肌成肌細(xì)胞，其有效地支持禽麻痹病病毒以高滴度生長(zhǎng)及生產(chǎn)性感染。本發(fā)明也包括經(jīng)基因工程化以表達(dá)病毒復(fù)制所需MDV基因產(chǎn)物的連續(xù)鵪鶉肌成肌細(xì)胞。依本發(fā)明的此方面，這種細(xì)胞系稱(chēng)為“互補(bǔ)性細(xì)胞系”，因?yàn)樗鼈兓パa(bǔ)在重組MDV載體中被刪除或突變的必需病毒基因和基因區(qū)。
本發(fā)明的互補(bǔ)性細(xì)胞系可經(jīng)基因工程化以表達(dá)任何被從重組MDV載體中刪除的基因或基因區(qū)。依本發(fā)明的此方面，可基因工程化細(xì)胞系以表達(dá)MDV基因產(chǎn)物，包括但不限于gH、gB、gD或衣殼蛋白。這些細(xì)胞系可經(jīng)基因工程化以在組成型激活或誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件的控制下瞬時(shí)或穩(wěn)定地表達(dá)MDV基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用在鵪鶉細(xì)胞系中有活性的或由MDV誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，其由本申請(qǐng)人證實(shí)包括HSV-1的gD啟動(dòng)子元件、ILTV的gG和gC啟動(dòng)子元件、PRV的gX啟動(dòng)子元件、SV40啟動(dòng)子元件、CMV啟動(dòng)子元件和RSV啟動(dòng)子元件。
在特別期望的途徑中，經(jīng)基因工程化以表達(dá)所有MDV病毒基因的細(xì)胞可產(chǎn)生帶有期望的基因型的傳染性嵌合病毒，因而不再需要篩選系統(tǒng)。理論上，可以用異源基因替換MDV基因的任一個(gè)。然而，這種方法的必需部分是保證缺陷型病毒的繁殖能力(由于正常病毒基因產(chǎn)物丟失或刪除的缺陷)。有許多可能的途徑可克服這個(gè)問(wèn)題。在一種途徑中，帶有突變蛋白質(zhì)的病毒可生長(zhǎng)在細(xì)胞系中，該細(xì)胞系被限制于組成型表達(dá)相同蛋白質(zhì)的野生型類(lèi)型。以此方式，細(xì)胞系互補(bǔ)病毒中的突變?？梢杂妙?lèi)似的技術(shù)構(gòu)建組成型表達(dá)任何MDV基因的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。這些構(gòu)建用于表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的細(xì)胞系可用于互補(bǔ)重組病毒中的缺陷，從而增殖病毒。另外，某種天然宿主范圍系統(tǒng)可用于增殖重組病毒，即禽細(xì)胞系。第三種增殖重組病毒的途徑可包括與野生型病毒共培養(yǎng)。這可以簡(jiǎn)單地選用重組病毒及用其與其它野生型MDV病毒(優(yōu)選為疫苗接種株)共感染細(xì)胞完成。野生型病毒應(yīng)當(dāng)與缺陷病毒基因產(chǎn)物互補(bǔ)，且允許野生型和重組病毒生長(zhǎng)。
對(duì)于長(zhǎng)期、高產(chǎn)量制備重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以基因工程化穩(wěn)定表達(dá)MDV基因產(chǎn)物的禽細(xì)胞系。不是利用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以利用由適當(dāng)表達(dá)控制元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和一種選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入異源DNA后，可使工程化細(xì)胞在加富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后移入選擇性培養(yǎng)基中。在重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記賦予可用于選擇的抗性，且使細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合入其染色體，使細(xì)胞生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化灶，再被克隆并擴(kuò)散到細(xì)胞系中。這種方法可有利地用于工程化改造細(xì)胞系，如此處所述表達(dá)gD和gH的細(xì)胞系。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼重組MDV和調(diào)節(jié)元件的DNA序列可被遞送至宿主細(xì)胞，并通過(guò)同源重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞，編碼重組MDV和調(diào)節(jié)元件的DNA序列可被遞送到宿主細(xì)胞，并通過(guò)同源重組導(dǎo)入宿主基因組，這是一種本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，如Chappel，美國(guó)專(zhuān)利4,215,051；Skoultchi，WO 91/06667中所述，此處全文引入作為參考。
可用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胞苷激酶(Wigler等人，1977，細(xì)胞，11223)、次黃嘌呤-腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalski和Szybalski，1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，482026)、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，細(xì)胞22817)基因可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中。同樣，抗代謝物抗性也可作為下列基因的選擇基礎(chǔ)dhfr，其賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler，等人，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，773567；O’Hare等人，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，781527)；gpt，其賦予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))；neo，其賦予氨基糖苷G418抗性(Colberre-Garapin等人，1981，分子生物學(xué)雜志，1501)以及hygro，其賦予潮霉毒抗性(Santerre等人，1984，基因30147)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，如此處所述一種綠色熒光基因可用于檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)。
本發(fā)明也包括用MDV或MDV載體感染的連續(xù)禽細(xì)胞系。用于以MDV轉(zhuǎn)染或感染的禽細(xì)胞系其特征為不含有禽類(lèi)病毒的連續(xù)細(xì)胞系。優(yōu)選地，禽細(xì)胞系是鵪鶉細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可用周知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)和維持，如Celis，Julio編，1994，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Academic Press，N.Y中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇并優(yōu)化用于這些細(xì)胞的多種培養(yǎng)條件，包括關(guān)于特定養(yǎng)分、氧氣、張力、二氧化碳和減少的血清水平等的培養(yǎng)基配制。
本發(fā)明優(yōu)選的禽細(xì)胞系是鵪鶉細(xì)胞系，更優(yōu)選的，是鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系。依本發(fā)明可利用任何鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系，例如，于1998年11月24日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，命名為ATCC CRL 12599的鵪鶉細(xì)胞系。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施方案中，不包括命名為QT35以培養(yǎng)MDV血清型2或3的鵪鶉細(xì)胞系。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，命名為QM7的鵪鶉細(xì)胞系用于培養(yǎng)本發(fā)明的MDV載體和病毒。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，命名為QM7鵪鶉細(xì)胞系用MDV 652株感染，其于1998年11月24日保藏于ATCC，保藏號(hào)ATCC-CRL 12600。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的已知細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)克隆用于本發(fā)明的鵪鶉細(xì)胞系。培養(yǎng)細(xì)胞，并用市售培養(yǎng)基在已知適于增殖細(xì)胞的條件下從一個(gè)細(xì)胞開(kāi)始繁殖。
例如，可將冰凍待用的本發(fā)明的細(xì)胞系在約37℃溫度下溫暖，然后加入合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，諸如含3％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12(Life Technologies，Inc.)。細(xì)胞可在37℃含有約5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中溫育直至生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)。為了細(xì)胞傳代，移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，向細(xì)胞加入0.05％胰蛋白酶和0.53mM EDTA。分散細(xì)胞，收集細(xì)胞懸浮液于離心管中，離心得細(xì)胞沉淀。除去胰蛋白酶溶液，將細(xì)胞沉淀重懸于新的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。再將細(xì)胞于另外的生長(zhǎng)器皿中進(jìn)一步增殖至期望的密度。
依本發(fā)明，連續(xù)細(xì)胞系包括可于體外至少15代的無(wú)限增殖化細(xì)胞。
對(duì)于非重組、重組或基因工程化MDV或MDV載體可通過(guò)與MDV感染的細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行感染或轉(zhuǎn)染。用于共培養(yǎng)的細(xì)胞可以是MDV感染的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞或DEF細(xì)胞、類(lèi)淋巴母細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、CHCC-OU2細(xì)胞、鵪鶉細(xì)胞和描述于實(shí)施例中的鵪鶉細(xì)胞克隆。另外，可以用MDV感染禽細(xì)胞系，方法是用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法將純化的MDV之DNA或來(lái)自MDV感染的細(xì)胞之DNA導(dǎo)入禽細(xì)胞系。如磷酸鈣沉淀法、DEAE葡聚糖法、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(Polybrene)法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。優(yōu)選地，DEF或CEF之MDV感染的細(xì)胞用于感染本發(fā)明的連續(xù)禽細(xì)胞系。MDV感染的CEF、DEF、類(lèi)淋巴母細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、CHCC-OU2細(xì)胞和鵪鶉細(xì)胞的培養(yǎng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。
例如，將細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)至約50％至約80％鋪滿(mǎn)，加入用MDV感染的細(xì)胞至半鋪滿(mǎn)的細(xì)胞，從而用MDV轉(zhuǎn)染禽細(xì)胞系。細(xì)胞可在約37℃下培養(yǎng)約一周，每2至3天更換培養(yǎng)基。通過(guò)如上述胰蛋白酶消化分開(kāi)細(xì)胞。通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的形成以及利用MDV特異性抗體之間接熒光抗體(IFA)監(jiān)測(cè)感染的細(xì)胞。可用已知的單克隆雜交瘤技術(shù)制備MDV特異性抗體(Goding，James W.，單克隆抗體原理與實(shí)踐，第二版，Acdemic Press(1986)；Harlow等人，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室，(1988))?？蓪DV-感染的細(xì)胞之冰凍貯存原種保存待用。
本發(fā)明也涉及用于含有MDV的疫苗制備的方法，包括感染諸如鵪鶉細(xì)胞系的連續(xù)細(xì)胞系，且培養(yǎng)感染的細(xì)胞系以產(chǎn)生可用作針對(duì)MDV的疫苗的抗原。然后將MDV感染的細(xì)胞用作抵抗MDV的疫苗，或從細(xì)胞分離的無(wú)細(xì)胞MDV可用作疫苗。
本發(fā)明還涉及用于制備含有MDV的疫苗的方法，其通過(guò)用MDV載體轉(zhuǎn)染或感染連續(xù)禽細(xì)胞系，諸如鵪鶉細(xì)胞系，該細(xì)胞系能表達(dá)除MDV之外額外的異源基因，該載體中包含MDV及一種或多種異源蛋白質(zhì)或多肽的基因，它可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽疾病的因子。
此外，本發(fā)明涉及用于制備疫苗的方法，其通過(guò)用MDV載體轉(zhuǎn)染連續(xù)禽細(xì)胞系，其中MDV載體包含有復(fù)制缺陷型MDV和一種或多種異源蛋白質(zhì)或多肽的基因，該細(xì)胞系能表達(dá)除MDV之外額外的異源基因，它可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽類(lèi)疾病的因子。
此外，本發(fā)明涉及用于制備疫苗的方法，其通過(guò)用MDV載體轉(zhuǎn)染連續(xù)禽細(xì)胞系，其中MDV載體包含有復(fù)制缺陷型MDV和一種或多種異源蛋白質(zhì)或多肽的基因，該細(xì)胞系能表達(dá)除MDV之外的異源基因，其可用于抵抗除了MDV之外的其它引起禽類(lèi)疾病的因子。其它引起禽類(lèi)疾病的因子可用于疫苗制備且由本發(fā)明的方法制備，這樣的因子的例子包括新城疫病毒(NDV)、傳染性Bursal病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、幼雞貧血病毒(CAV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILV)、禽白血病病毒(ALV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(RV)和禽流感病毒(AIV)(見(jiàn)Field等人編，1991，病毒學(xué)基礎(chǔ)，第二版，Raven Press，紐約，此處全文引入作為參考)。用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的MDV包含有一種或多種可用作單價(jià)或多價(jià)疫苗的異源蛋白質(zhì)或多肽。這樣的疫苗可由疫苗制備領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的方法制備。
依本發(fā)明，疫苗制品包含細(xì)胞系或其組分，例如細(xì)胞裂解物，應(yīng)檢查細(xì)胞系以確保細(xì)胞系中無(wú)其它病毒和病原體。特別地，待配制入疫苗以施用于動(dòng)物如禽類(lèi)的細(xì)胞系應(yīng)當(dāng)被檢查是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒，這種檢查可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，如逆轉(zhuǎn)錄酶檢驗(yàn)(Boehringer Mannheim)。此外，可用市售檢驗(yàn)方法檢查細(xì)胞系是是否存在禽類(lèi)病原體。
本發(fā)明還包括向動(dòng)物施用MDV疫苗及MDV載體制備的疫苗的方法，以保護(hù)MDV的感染。表達(dá)MDV的MDV和/或一種或多種異源蛋白質(zhì)或多肽包括可提高禽類(lèi)免疫應(yīng)答的那些，或是可用于免疫動(dòng)物(如對(duì)某些疾病引發(fā)因子敏感的幼雞和火雞)的禽類(lèi)疾病引發(fā)因子的蛋白質(zhì)或多肽。用MDV或由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的其它抗原免疫接種，可導(dǎo)致保護(hù)性免疫反應(yīng)，從而使接種的動(dòng)物免受那些疾病引發(fā)因子造成的繼后感染。
可配制活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗。優(yōu)選活疫苗，因?yàn)樵谒拗髦械姆敝吃斐闪伺c天然感染相比類(lèi)似種類(lèi)和數(shù)量級(jí)的但延長(zhǎng)的刺激，因而賦予有效的長(zhǎng)期的免疫。這種活重組病毒疫苗制劑的制備可用傳統(tǒng)方法實(shí)現(xiàn)，包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的增殖或在雞胚尿囊中的增殖，隨后進(jìn)行純化。
在這方面，用于疫苗接種的目的之基因工程化的MDV(載體)可期望在這樣的株中存在減毒特性。將適當(dāng)?shù)耐蛔?如刪除)導(dǎo)入用于轉(zhuǎn)染的模板，可提供帶有減毒特性的新型病毒。例如，與溫度敏感性或冷適應(yīng)性相關(guān)的特定錯(cuò)義突變可被加入到刪失突變中，這樣的突變比與冷或溫度敏感性突變相關(guān)的點(diǎn)突變應(yīng)當(dāng)更穩(wěn)定，且回復(fù)頻率應(yīng)當(dāng)極低。
另外，可構(gòu)造帶有“自殺”特性的嵌合病毒。這種病毒在宿主中僅可經(jīng)歷一次或幾次復(fù)制。當(dāng)用作疫苗時(shí)，重組病毒可經(jīng)歷有限的復(fù)制循環(huán)，且誘導(dǎo)足夠水平的免疫應(yīng)答，但在動(dòng)物宿主中不會(huì)進(jìn)一步引起疾病。缺乏一種或多種MDV基因或具有突變的MDV基因的重組病毒不能經(jīng)歷連續(xù)的復(fù)制循環(huán)?？稍谟谰帽磉_(dá)這種基因的細(xì)胞系中制備缺陷型病毒。缺乏必需基因的病毒可在這些細(xì)胞系中復(fù)制，但當(dāng)施用于動(dòng)物宿主時(shí)不能完成一個(gè)復(fù)制循環(huán)。除了產(chǎn)生非傳染性病毒顆粒，這種制品可在這樣的流產(chǎn)性循環(huán)中轉(zhuǎn)錄和翻譯足夠量的基因以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，可施用大量的毒株，以使這些制品用作滅活(殺死)的病毒疫苗。對(duì)于滅活疫苗，優(yōu)選異源基因產(chǎn)物被作為病毒組分表達(dá)，以便基因產(chǎn)物與病毒體結(jié)合。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，亞單位疫苗包括MDV的抗原決定簇或可作為疫苗配制的異源病毒抗原決定簇。這種制品的優(yōu)點(diǎn)在于它們含有天然蛋白質(zhì)，且不用經(jīng)歷用福爾馬林或其它用于制備殺死的病毒疫苗的因子處理的滅活。
在本發(fā)明的此方面的又一實(shí)施方案中，可用傳統(tǒng)技術(shù)“殺死”嵌合病毒制備滅活的疫苗制劑。就其傳染性遭破壞而言，滅活疫苗是“死”的。理想地，可破壞病毒的傳染性而不影響其免疫原性。為了制備滅活疫苗，可在細(xì)胞培養(yǎng)物或雞胚尿囊中生長(zhǎng)嵌合病毒，用區(qū)帶超速離心純化，用甲醛或β-丙酸內(nèi)酯滅活，收集合并。所獲疫苗一般由肌肉內(nèi)接種。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼帶有減毒表型的重組MDV之核苷酸序列或編碼含有MDV和/或異源抗原決定簇的重組子之核苷酸序列可被配制為疫苗。依這一實(shí)施方案，疫苗組合物可包含編碼帶有減毒表型的重組MDV之DNA，和/或含有MDV和/或與控制基因表達(dá)之調(diào)節(jié)序列有效連接的異源抗原決定簇。依本發(fā)明的此方面，將目標(biāo)DNA工程化入表達(dá)載體，受促進(jìn)DNA表達(dá)的調(diào)節(jié)元件即啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的控制。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子元件可為細(xì)胞特異性的，且僅在預(yù)先決定的細(xì)胞中允許DNA的實(shí)質(zhì)性轉(zhuǎn)錄?？梢月懵禗NA的形式(美國(guó)專(zhuān)利5,679,647，此處全文引入作為參考)或配制成組合物中的形式將DNA直接導(dǎo)入宿主中，其中DNA是與其它可促進(jìn)DNA吸收的試劑(包括病毒載體)一起配成組合物、或有助于免疫的試劑，如布比卡因(bupivicaine)和其它局部麻醉劑(美國(guó)專(zhuān)利5,593,972，此處全文引用作為參考)、皂苷(美國(guó)專(zhuān)利5,739,118，此處全文引入作為參考)和陽(yáng)離子聚胺(公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)WO 96/10038，此處全文引用作為參考)。
滅活病毒可與適當(dāng)?shù)淖魟┡渲埔栽鰪?qiáng)免疫應(yīng)答。這種佐劑可包括但不限于，礦物膠，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子；肽；油乳液和潛在有用佐劑如BCG和Carynebacterium parvum。
本發(fā)明的細(xì)胞系及其組分可以中性或鹽的形式配制入疫苗。藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽之游離氨基形成)，以及與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、磷酸或與有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來(lái)酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無(wú)機(jī)堿，如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化高鐵，以及有機(jī)堿，如異丙醇胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、脯氨酸等。
待施用疫苗的對(duì)象優(yōu)選禽類(lèi)，最優(yōu)選為家禽，如幼雞或火雞，非禽類(lèi)動(dòng)物包括但不限于牛、馬。
本發(fā)明的疫苗制劑包括免疫有效量的本發(fā)明的細(xì)胞系及其組分，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。疫苗制品包含免疫有效量的一種或多種抗原以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)可接受的載體為本領(lǐng)域周知，包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、無(wú)菌等滲水緩沖液和其組合。一種這樣的可接受的載體的例子是含有一種或多種穩(wěn)定劑的生理學(xué)平衡的培養(yǎng)基，如穩(wěn)定化的水解蛋白質(zhì)、乳糖等。載體更優(yōu)選無(wú)菌。制劑應(yīng)適應(yīng)施用的形式。
如需要，組合物可還含有少量保濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可為液體溶液、懸濁液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉劑?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
通常，以單獨(dú)或混合在單元?jiǎng)┝恐械男问教峁┏煞?，如干的冷凍干燥粉，或在密封容器中的無(wú)水縮合物的形式，如表明活性成分的量的安瓿或sachette中。當(dāng)組合物通過(guò)注射施用時(shí)，可提供無(wú)菌稀釋劑的安瓿以在施用前混合各成分。
可使用多種方法導(dǎo)入上述疫苗制劑，包括但不限于口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)途徑。也優(yōu)選地通過(guò)所設(shè)計(jì)疫苗針對(duì)的病原體感染的天然途徑導(dǎo)入嵌合病毒?？赏ㄟ^(guò)在用疫苗免疫后監(jiān)測(cè)測(cè)試動(dòng)物中的免疫反應(yīng)，如體液(抗體)反應(yīng)的產(chǎn)生和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，作為免疫反應(yīng)的指示。本發(fā)明的疫苗之有效劑量(免疫接種量)可從來(lái)自動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)外推得出。下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述而不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1QM7細(xì)胞可有效支持MDV感染本研究中QM7細(xì)胞為日本鵪鶉肌成肌細(xì)胞(ATCC CRL 12599)，衍生自已鑒定為可以高滴度支持MDV-1生長(zhǎng)的QT6纖維肉瘤細(xì)胞系。
MDV的652和584分離株加上MDV的分離株有很強(qiáng)的致毒性(Witler，R.L.，禽類(lèi)疾病，41149-163(1977))。用以DEF接種物感染的MDV(652/DEF的細(xì)胞培養(yǎng)物第十一次傳代物)感染QM7細(xì)胞。通過(guò)計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化灶的形成數(shù)量以及通過(guò)在IFA檢測(cè)中(圖1)檢測(cè)MDV病毒蛋白質(zhì)(gB和pp38)的表達(dá)的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)監(jiān)測(cè)MDV-1(652株)的生產(chǎn)性感染。檢測(cè)到大量且高染色強(qiáng)度的感染轉(zhuǎn)化灶。通過(guò)分別將652/QM7感染的細(xì)胞接種入(50-60％鋪滿(mǎn)的)未感染QM7細(xì)胞維持感染。652/QM7感染的轉(zhuǎn)化灶很大，無(wú)需抗體染色肉眼即可見(jiàn)。也檢測(cè)了QT6纖維肉瘤細(xì)胞系支持生產(chǎn)性MDV感染的能力。然而未證實(shí)QT6細(xì)胞系為MDV生長(zhǎng)的十分有效的宿主。
結(jié)果表明，QM7細(xì)胞可有效地支持MDV-1的感染，然而，為了進(jìn)一步表征和優(yōu)化QM7細(xì)胞的MDV-1感染，測(cè)試了6種不同生長(zhǎng)條件(兩種血清濃度，三種分裂(split)比率)。結(jié)果總結(jié)于下表。
表1652/QM7細(xì)胞第3代于DMEM/F-12培養(yǎng)基中的滴度
表2
這些結(jié)果表明，652/QM7感染的最適生長(zhǎng)條件為在DMEM/F-12(帶有3％胎牛血清)中培養(yǎng)感染的細(xì)胞，分裂比率1∶10。當(dāng)分裂比率超過(guò)1∶20后滴度明顯下降。從第7代至第10代滴度保持恒定。對(duì)QM7和652/QM7細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)用市售非放射性逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)檢測(cè)試劑盒(BoehringerMannheim)檢測(cè)細(xì)胞系的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。從DEF、652/DEF、QM7、652/QM7和NYU細(xì)胞(用作陽(yáng)性對(duì)照)制備細(xì)胞裂解物、澄清上清液和超速離心沉淀。所有樣品均作三份重復(fù)，且結(jié)果代表兩次RT檢測(cè)。用HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。細(xì)胞系/逆轉(zhuǎn)錄酶 裂解物 上清液 沉淀活性(ng/孔)NYU 0.819 0.003 1.945DEF -0.144 -0.155-0.455652/DEF -1.455 -4.456-0.455QM7 -0.142 -0.155-0.155652/QM7 -0.456 -0.458-0.456因其已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，選擇NYU細(xì)胞作為內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照。如這些結(jié)果所示，獲自NYU細(xì)胞的超速離心沉淀和細(xì)胞裂解物有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的強(qiáng)陽(yáng)性。在對(duì)至少20皮克敏感的本檢測(cè)中，QM7、652/QM7、DEF和652/DEF細(xì)胞明顯為陰性。這些結(jié)果表明，所有4種細(xì)胞系均不含任何逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。禽類(lèi)外源病毒檢測(cè)采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部9CFR檢測(cè)中“利用雞胚接種檢測(cè)病毒體的檢測(cè)”方法，檢測(cè)QM7細(xì)胞中是否存在任何禽類(lèi)病原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)任何禽類(lèi)病原體。簡(jiǎn)言之，將QM7細(xì)胞懸浮液感染雞胚。如果存在任何上源病毒，將會(huì)導(dǎo)致雞胚的損壞。MDV-1(652)DNA感染導(dǎo)致QM7細(xì)胞的生產(chǎn)性裂解感染從652/QM7感染的細(xì)胞中分離裸露DNA，以磷酸鈣轉(zhuǎn)染法(ClonTech試劑盒)轉(zhuǎn)染未感染的QM7細(xì)胞。培養(yǎng)7天后(每2-3天更換培養(yǎng)基)，在轉(zhuǎn)染平板上可見(jiàn)許多感染的轉(zhuǎn)化灶。這些轉(zhuǎn)化灶不能與用652/QM7感染的細(xì)胞共培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化灶區(qū)分開(kāi)來(lái)。這一結(jié)果確切表明，MDV-1可在QM7細(xì)胞中生產(chǎn)性復(fù)制和生長(zhǎng)，排除了652/QM7轉(zhuǎn)化灶源自污染性接種體的可能性。實(shí)施例2QM7細(xì)胞中的不同啟動(dòng)子活性進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)以證實(shí)在QM7細(xì)胞中鑒別何種啟動(dòng)子有活性，從而進(jìn)一步在MDV感染過(guò)程中何種啟動(dòng)子被活化或誘導(dǎo)。螢光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體(基于pGL3，Promega)含有不同的啟動(dòng)子(pSV40+增強(qiáng)子，pSV40，pCMV，pRSV)，將其分別轉(zhuǎn)染QM7和DEF細(xì)胞。72小時(shí)后，收集細(xì)胞裂解物，且用不同稀釋度檢測(cè)螢光素酶活性。
表3不同啟動(dòng)子在QM7和DEF細(xì)胞中的螢光素酶活性
這些結(jié)果提示在QM7細(xì)胞中這些不同啟動(dòng)子(pCMV、pRSV、pSV40和pSV40+增強(qiáng)子)很活躍。此外，在這些禽類(lèi)細(xì)胞中pRSV是特別強(qiáng)的啟動(dòng)子。
將多種MDV-1病毒誘導(dǎo)的啟動(dòng)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入652/QM7，從而在誘導(dǎo)條件下檢測(cè)啟動(dòng)子的強(qiáng)度。測(cè)量由螢光素酶報(bào)道基因產(chǎn)生的螢光素酶活性。除了用作對(duì)照的pCMV啟動(dòng)子之外，檢測(cè)了五種不同病毒啟動(dòng)子MDV-1(MD5株)的gH基因啟動(dòng)子元件；ILTV的gG和gC基因的啟動(dòng)子元件；PRV的gX基因啟動(dòng)子元件和HSV-1的gD啟動(dòng)子。
表4不同啟動(dòng)子在MDV感染的QM7細(xì)胞中的活性<
這些結(jié)果提示，來(lái)自HSV-1的啟動(dòng)子pgD被高度誘導(dǎo)，作為病毒誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)在QM7細(xì)胞的MDV感染中有活性，pCMV啟動(dòng)子在病毒感染的QM7細(xì)胞中也有活性。實(shí)施例3體內(nèi)致病性研究在體內(nèi)致病性研究中檢測(cè)652/QM7感染的細(xì)胞在幼雞中引發(fā)禽麻痹病的能力。
每組30只1日齡小雞共五組，分別腹膜內(nèi)接種(1)未感染的QM7細(xì)胞混合物；(2)652感染的QM7細(xì)胞的第3代細(xì)胞培養(yǎng)物；(3)652感染的QM7細(xì)胞的第3代細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)652感染的QM7細(xì)胞的第7代細(xì)胞培養(yǎng)物；和(5)652感染的QM7細(xì)胞的第7代細(xì)胞培養(yǎng)物。對(duì)每只小雞用250或750TCID50的MDV接種。在感染6-8天后于用80％丙酮固定的次代DEF細(xì)胞單層上利用TCID50法測(cè)定病毒滴度，用上述IFA檢查。
在補(bǔ)加了抗生素和適量胎牛血清(對(duì)于感染的細(xì)胞為3％；對(duì)于未感染的細(xì)胞為10％)的DMEM/F-12(Life Technoligies)中于潤(rùn)濕培養(yǎng)箱中在37℃和5％CO2條件下生長(zhǎng)感染的和未感染的細(xì)胞。
如果研究過(guò)程中禽死亡則進(jìn)行尸體解剖，檢查MDV感染的跡象。自存活禽中收獲腎、脾、肝、心和腦用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。
所有用652感染的細(xì)胞注射過(guò)的幼雞均形成了極強(qiáng)致病性MDV的典型癥狀，大多數(shù)這些雞死于禽麻痹病。在實(shí)驗(yàn)期間(8周齡)未感染細(xì)胞組未出現(xiàn)任何禽麻痹病的癥狀。結(jié)果示于表5。
表5 652/QM7細(xì)胞的體內(nèi)致病性
各組織(腎、脾、肝、心和腦)的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示，在來(lái)自感染組的存活禽中損傷與禽麻痹病一致。來(lái)自細(xì)胞對(duì)照或陰性對(duì)照組的禽中未見(jiàn)這樣的損傷。
這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，在QM7細(xì)胞中生長(zhǎng)的MDV-1(652)致病性很強(qiáng)，證實(shí)QM7細(xì)胞是MDV-1病毒以高滴度擴(kuò)增感染的良好宿主。實(shí)施例4pCR3.1gH構(gòu)建體的制備由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從禽麻痹病病毒株MD5中分離了3個(gè)2.6kb的糖蛋白H(gH)基因，并用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆入pCR2TA克隆(TA克隆載體，獲自Invitrogen Inc.美國(guó)，目錄號(hào)k2000-1)，采用了市售PCR試劑系統(tǒng)(GIBCO-Life Technoligies，目錄號(hào)10198-018)，所用上游PCR引物5’-GGGGG TACCA AGUG CATTGGATGG CTACA TA-3’，及下游PCR引物5’-GGGGC TAGCT TAAAGATCGT CGTAC AGGCT CAA-3’?？捎靡阎夹g(shù)測(cè)定gH基因序列。gH基因的序列述于Scott等人，普通病毒學(xué)雜志，741185-1190(1993)。
利用多克隆位點(diǎn)中(見(jiàn)圖2)的KpnI和XhoI位點(diǎn)將MDV的gH基因亞克隆至pCR3.1載體(獲自Invitrogen Inc.美國(guó)，目錄號(hào)k3000-01)。載體pCR3.1是真核表達(dá)載體，含有用于在哺乳動(dòng)物中有效表達(dá)的巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子，以及允許對(duì)含有該載體的細(xì)胞正選擇的新霉素抗性基因。載體pCR3.1通過(guò)如下方面表征CMV啟動(dòng)子堿基1-596；推定的轉(zhuǎn)錄起始?jí)A基520-625；17啟動(dòng)子/引發(fā)位點(diǎn)堿基638-657；多克隆位點(diǎn)堿基670-785；pCR3.1反向引發(fā)位點(diǎn)堿基797415；BGH多聚腺苷酸化位點(diǎn)堿基796-1010；ColE1起點(diǎn)堿基1100-1773；SV40啟動(dòng)子和起點(diǎn)堿基3178-3515；pGreenLantern-2質(zhì)粒，獲自GIBCO-Life Technoligies，美國(guó)(見(jiàn)圖5)。MDV-1 gH的5’側(cè)翼區(qū)獲自GeneBank，美國(guó)，其含有位于894至1925的TK基因。pGreenLantern-2質(zhì)粒含有編碼水母綠色熒光蛋白(gfp)的基因，其在產(chǎn)生gH缺失的重組病毒過(guò)程中用作標(biāo)記蛋白質(zhì)。用T4聚合酶處理pGreenLantern-2的NsiI位點(diǎn)(位于綠色熒光蛋白質(zhì)基因的CMV啟動(dòng)子上游)，以產(chǎn)生用以與含有PmeI末端的5’gH側(cè)翼區(qū)連接的平端。
獲自Tampa Bay研究所，F(xiàn)L，美國(guó)Meihan Nonoyama博士的質(zhì)粒含有MDV-1的BamHI片段F，其包括gH的3’側(cè)翼區(qū)(Fukuchi等人，病毒學(xué)雜志，102-109(1984))。約2.4kb區(qū)的DNA序列(此處稱(chēng)為3側(cè)翼區(qū))示于SEQ ID NO2。通過(guò)PCR克隆獲得MDV-1的gH之3’側(cè)翼區(qū)(上游引物5’AAGAT TTTTC CCAAG TCC3’；下游引物5’TCGTC GAATA ATGTG ATC3’)，且克隆入上述帶有插入于NsiI位點(diǎn)之MDV-1的5’側(cè)翼區(qū)的pGreenLantern-2質(zhì)粒。3’側(cè)翼區(qū)插入到NaeI位點(diǎn)，位于全部綠色熒光蛋白基因下游(圖6)。gH和gD蛋白質(zhì)在QM7細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)依下述制備穩(wěn)定表達(dá)MDV的gH或MDV的gD之QM7細(xì)胞。將質(zhì)粒構(gòu)建體pCR3 gH-HA和pCR 3gD-HA(HA標(biāo)記已被加到gH和gD基因的C-端用于方便的檢測(cè))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入QM7細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光檢驗(yàn)(IFA)利用抗HA單克隆抗體證實(shí)各個(gè)糖蛋白的表達(dá)(圖3)。
此外，將質(zhì)粒構(gòu)建體pCR3 gH-HA、pCR 3gD-HA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染入QM7細(xì)胞，獲得大量g418抗性細(xì)胞。通過(guò)用96孔板稀釋得到單細(xì)胞克隆。使用HA單克隆抗體在免疫熒光檢驗(yàn)中可見(jiàn)表達(dá)gH-HA和gD-HA蛋白質(zhì)。此外，用35S(Trans Label，CN)代謝性標(biāo)記細(xì)胞，用HA抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物。僅在獲自用pCR3 gH-HA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之裂解物中存在約90kD的條帶(圖4)。僅在獲自用pCR3gD-HA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解物中可見(jiàn)約50kd的寬條帶(圖4)。來(lái)自pCR 3載體在QMT細(xì)胞中表達(dá)的gH和gD蛋白質(zhì)的大小與其預(yù)期大小十分相符。因此結(jié)果表明，QM7細(xì)胞可經(jīng)改造以表達(dá)病毒復(fù)制所需的MDV蛋白質(zhì)。數(shù)個(gè)單細(xì)胞克隆有非常豐富的gH-HA蛋白質(zhì)表達(dá)。這些細(xì)胞系是用于互補(bǔ)gH功能的良好侯選者。此外，通過(guò)用pCR3 gH-HA和pCR3gD-HA共轉(zhuǎn)染入QM7細(xì)胞可建立共表達(dá)gH和gD蛋白質(zhì)的QM7細(xì)胞。實(shí)施例5帶有g(shù)H缺失的重組MDVgHgfp+MDV-1重組子的初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建體pGL2/5’-3’gfp含有作為選擇性標(biāo)記的gfp(綠色熒光蛋白質(zhì))(圖6)。其還含有用于同源重組的gH基因5’和3’側(cè)翼區(qū)域，以將gfp置換gH基因。將pGL2/5’-3’gfp轉(zhuǎn)染入已用652/QM7感染了的產(chǎn)生gH-HA的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后四天，將培養(yǎng)物傳代兩次，每次添加新鮮的產(chǎn)生gH-HA的細(xì)胞。利用FACS分選全部感染的培養(yǎng)物，尋找表達(dá)gfp的細(xì)胞。在兩孔孔板中培養(yǎng)找到的fgp+細(xì)胞。培養(yǎng)6天后，可見(jiàn)一些表型轉(zhuǎn)化灶。此外，在紫外光下這些轉(zhuǎn)化灶為綠色，提示它們?yōu)間fp+gH-MDV-1的侯選者。
由于MDV-1的細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)，將gfp+gH重組子從其野生野對(duì)應(yīng)物中純化是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性工作。然而，兩次培養(yǎng)物傳代后，許多轉(zhuǎn)化灶不再呈綠色，表明野生型病毒被分隔出。利用gfp為選擇性標(biāo)記再用FACS分選一次這些培養(yǎng)物，結(jié)果分選出表明為gfp+gH-MDV-1克隆的綠色轉(zhuǎn)化灶。純化gfp+gH-重組子，且進(jìn)一步用PCR和Southern印跡分析。
在將綠色熒光蛋白質(zhì)基因從gH基因缺失病毒中除去的第二個(gè)重組步驟中，任選地插入來(lái)自其它非MDV病毒的異源基因。如例如雞干擾素基因、新城疫病毒或傳染性bursal病病毒等，其可替代綠色熒光蛋白質(zhì)基因。與親本綠色轉(zhuǎn)化灶相反，存在白色病毒噬斑，其含有g(shù)H基因被刪除且綠色熒光蛋白質(zhì)基因被除去的新型重組MDV-1病毒。
已引用了一系列文獻(xiàn)，此處將其全文引入作為參考。
本發(fā)明的范圍不受所述特定實(shí)施方案的限制，其意在闡明本發(fā)明的個(gè)別方面，且功能等同的方法和成分落在本發(fā)明的范圍中。實(shí)際上除了那些此處所示和所述的之外，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考前面描述和附圖后對(duì)本發(fā)明的諸多修飾是顯而易見(jiàn)的。這樣的修飾也落入后附權(quán)利要求的范圍中。
序列表<110>輝瑞產(chǎn)品公司<120>利用連續(xù)禽細(xì)胞系制備禽麻痹病毒的方法<130>PC10483A<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2023<212>DNA<213>禽麻痹病毒<400>1acggtctctg aacaagacgg gcgataatat tagccatgtt tcgcatagcc gtacctcccg 60ttctctcctg attatttgaa aatgataaag tagccgtttt attacaagct atatgattcc 120tcaaatccgt tacgttagca gacgcctttc cactgcgtcg ttgtatatgt atcgtgtttg 180tattatgacg ttttaaaatt ttatgagtgt cagttatccg tgctttatag tcagacgcgg 240tcgccaatat agagcatagt ctatgaaaat cagtcactat gtgccttttc tttaggcaca 300tcacatgtag aacagacagt tttcgtcttg ctacaaatac taacattgga caaataacga 360tacaatctga tccttgaggc gcaatttgcc caatcagaga tttggaatcc aataactgct 420ttatgccggt gagtctttgt tcatgtttac tgcgtgtctt caggttacga gaaaatttgc 480aagtttttag ttctagaatg acgcatactc catcacagcc tacttcccac aaatcacgag 540gcaacttaaa catgcaaata caatccggtc tacgtcgttc taggtttact tcgaagacca 600atcgaaaatc cgtcaactgt ttaaatacat ctaataccat gaccttccca aaaattttgg 660caaagcttct ccccggccaa tcatacacct gagatcctag acacatcgct tctgcataaa 720gccgtttgta aaagcgatcg tgacatcgaa 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1.一種制備MDV的方法，包括培養(yǎng)用編碼MDV的核苷酸感染或轉(zhuǎn)染的連續(xù)鵪鶉細(xì)胞系，前提是所述鵪鶉細(xì)胞系不是含有MDV血清型2或3的QT35。
2.權(quán)利要求1的方法，其中鵪鶉細(xì)胞系是連續(xù)鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼一種天然存在的MDV。
4.權(quán)利要求1的方法，其中核苷酸序列編碼一種重組MDV。
5.權(quán)利要求4的方法，其中MDV是一種重組分子，包含MDV的核酸序列以及至少一種插入到所述MDV的核酸序列中的異源基因或其片段。
6.權(quán)利要求4的方法，其中MDV是一種重組分子，包含其中一種或多種基因、調(diào)節(jié)遺傳元件或其片段被刪除的MDV的核酸序列。
7.權(quán)利要求6的方法，其中被刪除的基因是復(fù)制必需的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中被刪除的基因是gH或其片段。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中MDV選自單獨(dú)地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一組合。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中MDV是一種病毒，用于制備在禽類(lèi)中可誘導(dǎo)抵抗疾病的保護(hù)反應(yīng)的疫苗。
11.權(quán)利要求1或2的方法，其中MDV是MDV-1的652株。
12.權(quán)利要求11的方法，其中細(xì)胞系是ATCC CRL-12600。
13.一種連續(xù)鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系，含有編碼MDV的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13的連續(xù)細(xì)胞系，其中MDV是天然存在的MDV。
15.權(quán)利要求13的連續(xù)細(xì)胞系，其中MDV是重組MDV。
16.一種獲自連續(xù)鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物，含有編碼MDV的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求15的細(xì)胞系，其中重組MDV包含MDV的核酸序列或其片段，且含有至少一種插入到所述MDV的核酸序列中的異源基因或其片段。
18.權(quán)利要求15的細(xì)胞系，其中重組MDV包含其中一種或多種基因、調(diào)節(jié)遺傳元件或其片段被刪除的MDV的核酸序列。
19.權(quán)利要求18的細(xì)胞系，其中被刪除的基因是復(fù)制必需的。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞系，其中被刪除的基因是gH或其片段。
21.權(quán)利要求13的細(xì)胞系，其中MDV選自單獨(dú)地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一組合。
22.權(quán)利要求13的細(xì)胞系，其中MDV一種病毒，用于制備在禽類(lèi)中可誘導(dǎo)抵抗疾病的保護(hù)反應(yīng)的疫苗，其中的疾病是下列病毒感染的結(jié)果MDV、新城疫病毒、傳染性Bursel病病毒、幼雞貧血病毒、傳染性喉氣管炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒或禽流感病毒。
23.一種制備MDV疫苗的方法，包括培養(yǎng)用編碼MDV感染或轉(zhuǎn)染的連續(xù)鵪鶉成肌細(xì)胞細(xì)胞系，且從中收獲細(xì)胞培養(yǎng)物成分。
24.一種制備含有編碼MDV基因組的核苷酸序列的連續(xù)鵪鶉細(xì)胞系的方法，包括培養(yǎng)連續(xù)鵪鶉細(xì)胞系，該細(xì)胞系中含有編碼天然存在的MDV或重組MDV的核苷酸序列。
25.權(quán)利要求24的方法，其中鵪鶉細(xì)胞系是鵪鶉肌成肌細(xì)胞細(xì)胞系。
26.一種疫苗，其包含用權(quán)利要求1的方法制備的MDV以及適當(dāng)?shù)乃幬镙d體。
27.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV是天然存在的MDV。
28.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV是重組MDV。
29.權(quán)利要求28的疫苗，其中MDV是一種重組分子，包含MDV的核酸序列以及至少一種插入到所述MDV的核酸序列中的異源基因或其片段。
30.權(quán)利要求28的疫苗，其中MDV是一種重組分子，包含其中一種或多種基因、調(diào)節(jié)遺傳元件或其片段被刪除的MDV的核酸序列。
31.權(quán)利要求30的疫苗，其中被刪除的基因是gH或其片段。
32.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV選自單獨(dú)地血清型1、血清型2和血清型3或是其任一組合。
33.權(quán)利要求23的疫苗，其中MDV是MDV-1的652株。
34.權(quán)利要求29的疫苗，其中細(xì)胞系是ATCC CRL12600。
35.一種保護(hù)動(dòng)物抵抗疾病的方法，其通過(guò)向所述動(dòng)物施用權(quán)利要求26的疫苗，其中的疫苗經(jīng)改造以誘導(dǎo)針對(duì)如下病毒的保護(hù)性反應(yīng)，所述病毒選自MDV、新城疫病毒、傳染性Bursel病病毒、傳染性支氣管炎病毒、幼雞貧血病毒、傳染性喉氣管炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒或禽流感病毒。
36.權(quán)利要求35的方法，其中的動(dòng)物是禽類(lèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及可有效支持禽麻痹病病毒以高滴度生長(zhǎng)和生產(chǎn)性感染的禽細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及已被改造以支持重組禽麻痹病病毒以高滴度生長(zhǎng)和生產(chǎn)性感染的禽細(xì)胞系。本發(fā)明涉及用于以適合免疫接種目的的量制備禽麻痹病病毒的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1256310SQ9912289
公開(kāi)日2000年6月14日 申請(qǐng)日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月9日
發(fā)明者S·龍, M·G·夏弗德 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司