專利名稱：口服免疫增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物(最好是不包括人類的哺乳動(dòng)物)、魚類和甲殼動(dòng)物免疫力的口服免疫增強(qiáng)劑。
眾所周知，從低級(jí)動(dòng)物到高級(jí)動(dòng)物的各種動(dòng)物中，構(gòu)成微生物細(xì)胞壁主要成分的肽聚糖具有免疫強(qiáng)化特性。在海產(chǎn)品的水培領(lǐng)域已有許多專利申請(qǐng)?zhí)峤弧＠?，日本Patent Publication for OppositionPurpse(此后稱為“J.P.KOKOKU”)Hei 6-25067號(hào)公開預(yù)防剛斷乳小豬腹瀉感染的方法，其特征在于對(duì)三周齡小豬重復(fù)給予肽聚糖(胞壁酰二肽聚合物)。
然而，應(yīng)指出當(dāng)實(shí)際口服給予魚類等胞壁酰二肽聚合物時(shí)，其免疫活性的表現(xiàn)不明顯。其中，N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(胞壁酰二肽，MDP分子量492)屬于胞壁酰二肽家族且已知具有免疫強(qiáng)化活性，但價(jià)格昂貴，其在飼養(yǎng)家畜業(yè)中的使用尚無(wú)法預(yù)測(cè)，盡管它在口服給予后具有激活巨噬細(xì)胞的令人樂(lè)觀的效果。
本發(fā)明的目的是提供口服后能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物免疫力的免疫增強(qiáng)劑。
通過(guò)下列描述和實(shí)施例將使本發(fā)明的該目的和其它目的更為明顯。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是建立在這樣一種發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，即生物學(xué)活性根據(jù)構(gòu)成肽聚糖(即胞壁酰二肽家族)的分子的分子量不同而變化，或者換言之，用酶如溶菌酶或蛋白酶處理微生物的細(xì)胞壁所獲得的不大于10000的分子量的肽聚糖口服給予時(shí)表現(xiàn)出極佳的免疫增強(qiáng)作用。
即本發(fā)明提供含有基本不含胞壁酰二肽且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)作為活性成分的口服免疫增強(qiáng)劑。
用于本發(fā)明中的基本不含胞壁酰二肽且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)可以通過(guò)用酶如溶菌酶或蛋白酶處理芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、埃希氏桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬或雙歧桿菌屬微生物的細(xì)胞壁以除去分子量大于10000的部分而獲得。
在本發(fā)明中，可以采用日本專利2526733號(hào)中第3欄34行至第四欄37行所述的微生物培養(yǎng)方法和細(xì)胞壁的分解方法，該公開結(jié)合在此作為參考。
在上述微生物中，優(yōu)選使用芽孢桿菌屬、短桿菌屬和棒狀桿菌屬。
微生物細(xì)胞壁中含有的肽聚糖具有糖肽聚合物的一般結(jié)構(gòu)，它是由兩種糖即N-乙?；咸前?GlcNAc)和N-乙?；谒?MurNAc)通過(guò)β-1,4-糖苷鍵接合的重復(fù)單位，及連接于重復(fù)單位上的含有四個(gè)氨基酸的肽鏈組成的。當(dāng)使用(白蛋白)溶菌酶作為處理的酶時(shí)，它裂解MurNAc和GlcNAc的鍵，但不能斷開MurNAc和GlcNAc之間的鍵，因此，通過(guò)這種處理獲得的糖的最小單位為二糖。通常已知M-乙?；邗；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(胞壁酰二肽，MDP；分子量492)是具有免疫強(qiáng)化活性的肽聚糖的最小有效結(jié)構(gòu)，但它不會(huì)形成。因此，優(yōu)選用溶菌酶進(jìn)行酶處理。
用所述酶處理的微生物細(xì)胞壁中的分子量不大于10000的部分可以通過(guò)已知的蛋白分子量分離等方法純化，或者可以使用經(jīng)所述酶處理后而不用純化的含有該部分的產(chǎn)品。
盡管本發(fā)明的口服免疫增強(qiáng)劑優(yōu)選只含有分子量不大于10000的肽聚糖(PG)且基本上不含胞壁酰二肽，它可以含有分子量大于10000的肽聚糖。不過(guò)，當(dāng)其中含有大量的分子量大于10000的肽聚糖時(shí)，即使增加其劑量也不能獲得足夠的免疫強(qiáng)化作用。因此，含有分子量不大于10000的肽聚糖的量?jī)?yōu)選至少為肽聚糖總量的10％(重量)(此后稱為“％”)，更優(yōu)選為至少40％。如以下給出的實(shí)施例所示，令人吃驚的是，即使僅給予小鼠1mg含有約15％分子量不大于10000的肽聚糖的肽聚糖也能獲得極佳的免疫增強(qiáng)作用，而即使給予20mg含有約1％分子量不大于10000的肽聚糖的肽聚糖也不能獲得免疫增強(qiáng)作用。
用于本發(fā)明的所述肽聚糖的分子量不大于10000，優(yōu)選500-10000，更優(yōu)選500-4000。分子量可以通過(guò)凝膠過(guò)濾方法、光散射方法等確定。
在本發(fā)明中，已知具有免疫增強(qiáng)作用的分子量不大于10000、且基本上不含MDP的肽聚糖口服劑量?jī)?yōu)選至少為0.5mg/kg體重，更優(yōu)選至少為1mg/kg體重。給予肽聚糖的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物(優(yōu)選不包括人類)、魚類和甲殼動(dòng)物。
本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑可以直接口服給予所述動(dòng)物或加入到待給予動(dòng)物的食物中。
給藥的時(shí)間并不特意限定。當(dāng)將免疫增強(qiáng)劑給予魚和甲殼動(dòng)物時(shí)，在魚苗期即開始給藥可以獲得其預(yù)防效果。
當(dāng)把本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑加到食物中時(shí)，可將其摻入通常用于家畜飼養(yǎng)業(yè)或魚類水培業(yè)的食物原料中，其量適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)動(dòng)物或魚類決定。
根據(jù)本發(fā)明，提供了通過(guò)口服能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物免疫力的免疫增強(qiáng)劑，而不需昂貴的MDP。
以下實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1(1-1)培養(yǎng)微生物細(xì)胞的方法和獲得該細(xì)胞的方法將以下所示組成的液體培養(yǎng)基在高壓釜中滅菌(121℃，15分鐘)，然后接種乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13896。于30℃振搖培養(yǎng)物24小時(shí)后，于7000rmp離心該培養(yǎng)液10分鐘以除去培養(yǎng)基。將收集的微生物細(xì)胞懸浮于0.9％的氯化鈉水溶液中，于7000rmp離心獲得的懸浮液10分鐘并洗滌以獲得干凈的細(xì)胞。
1.0g/cc葡萄糖
1.0g/cc酵母提取物1.0g/cc蛋白胨0.5g/cc硫酸胺0.3g/cc磷酸氫鉀0.1g/cc磷酸二氫鉀0.05g/cc硫酸鎂，及平衡液蒸餾水pH:7(用氫氧化鉀調(diào)節(jié))。
(1-2)細(xì)胞壁成分的酶處理將通過(guò)上述方法(1-1)獲得的微生物細(xì)胞懸浮于蒸餾水中，用超聲波(超聲分解儀UR-200P,TOMY SEIKO CO.LTD.的產(chǎn)品，頻率20kHz,200W,30分鐘)處理獲得的懸浮液。將3000g懸浮液離心30分鐘以除去殘留的未分解細(xì)胞。然后將上清液于18000rpm離心30分鐘。將獲得的況淀懸浮于4％SDS水溶液中，于100℃熱處理所獲得的懸浮液40分鐘。冷卻至室溫后，于25℃以18000rpm再次離心30分鐘。
再次離心，將獲得的沉淀冷凍干燥并用0.01％白蛋白溶菌酶(Sigma Co的產(chǎn)品)和0.01％無(wú)色肽酶(achromopeptidase)(也為SigmaCo的產(chǎn)品)處理72小時(shí)?；厥针x心獲得的上清液以得到主要含有肽聚糖的細(xì)胞壁的可溶部分。
(2-1)分離分子量不大于10000的部分使在(1-2)中獲得的細(xì)胞壁可溶部分溶解于適宜量的蒸餾水中，使得到的溶液通過(guò)能使分子量不大于10000的物質(zhì)通過(guò)的聚砜超濾膜以進(jìn)行分離。
(2-2)通過(guò)口服給予小鼠以評(píng)價(jià)THF-α誘導(dǎo)的效果將分子量大于10000和在(1-2)中得到的分子量小于10000的細(xì)胞壁的可溶部分分別口服給予ICR小鼠(平均體重20g)。3小時(shí)后，靜脈注射市售的免疫增強(qiáng)劑(OK-432；Chugai Pharmaceutical Co.Ltd.的產(chǎn)品)，2小時(shí)后，測(cè)定血清中的THF-α活性。蒸餾水用作對(duì)照樣品，而胞壁酰二肽(Sigma；MDP)用作測(cè)定免疫強(qiáng)化作用的標(biāo)準(zhǔn)品。
通過(guò)測(cè)定二氨基胡椒酸(為肽聚糖特有的氨基酸)使分子量大于10000和分子量小于10000部分的肽聚糖的量相等以作為指標(biāo)，通過(guò)表1所示方法評(píng)價(jià)在每種情況下對(duì)血液中THF產(chǎn)生的作用。該結(jié)果如表2所示。
表1(樣品和劑量)待評(píng)價(jià)樣品劑量蒸餾水 1.0mg/鼠分子量大于10000的部分1.0mg/鼠分子量大于10000的部分2.0mg/鼠分子量小于10000的部分0.5mg/鼠分子量小于10000的部分1.0mg/鼠MDP 0.1mg/鼠表2(結(jié)果)對(duì)THF產(chǎn)生的作用蒸餾水(1.0mg/鼠) -分子量大于10000的部分(1.0mg/鼠)-分子量大于10000的部分(2.0mg/鼠)-分子量小于10000的部分(0.5mg/鼠)+分子量小于10000的部分(1.0mg/鼠)++MDP(0.1mg/鼠) ++通過(guò)相對(duì)評(píng)價(jià)測(cè)定對(duì)血液中TNF產(chǎn)生的作用，其中口服給予0.1mg/鼠的MDP所獲得的效果表示為“++”。
從表2所給的結(jié)果明顯看出，分子量小于10000的部分在TNF產(chǎn)生中具有與MPD相等的作用，即在口服后顯示出極佳的免疫強(qiáng)化作用。然而，分子量大于10000的部分對(duì)TNF產(chǎn)生沒有作用。
在這個(gè)實(shí)施例中，使用白蛋白溶菌酶進(jìn)行酶的處理。由于所述溶菌酶裂解MurNAc和GlcNAc的鍵，但不能斷開MurNAc和GlcNAc之間的鍵，通過(guò)這種處理獲得的糖的最小單位是二糖，通常已知MDP是具有免疫強(qiáng)化作用的肽聚糖的最小有效結(jié)構(gòu)，但它沒有形成。因此，很明顯，本試驗(yàn)獲得的免疫增強(qiáng)作用并非由于MDP。
實(shí)施例2對(duì)用酶處理的微生物細(xì)胞并含有具有免疫增強(qiáng)活性的低分子量的部分最佳劑量的研究按照實(shí)施例1方法(1-1)相同的方法制備枯草桿菌(ATCC 13952)和乳發(fā)酵短桿菌(ATCC 13869)的微生物細(xì)胞。
將如此獲得的微生物細(xì)胞懸浮于蒸餾水中，用超聲波(超聲分解儀UR-200P,TOMY SEIKO CO.,LTD.的產(chǎn)品，頻率20kHz,200W,30分鐘)處理獲得的懸浮液?；厥针x心懸浮液得到的沉淀并除去殘留的未分解細(xì)胞。然后將該上清液于18000rpm離心30分鐘。將獲得的沉淀懸浮于4％SDS水溶液中，于100℃熱處理所獲得的懸浮液40分鐘。冷卻至室溫后，于25℃以18000rpm再次離心30分鐘。再次離心，將獲得的沉淀冷凍干燥并用0.01％溶菌酶和0.01％無(wú)色肽酶處理。對(duì)于乳發(fā)酵短桿菌的反應(yīng)期為8小時(shí)和72小時(shí)，而對(duì)于枯草桿菌為48小時(shí)。酶處理完畢后，回收離心獲得的上清液以得到細(xì)胞壁的可溶部分。
為確定顯示免疫活性的最適劑量，按每種樣品0.5,1.5,10和20mg/鼠給予ICR小鼠(平均體重20.0g)，將THF-α誘導(dǎo)的作用與實(shí)施例1方法(2-2)結(jié)果對(duì)應(yīng)比較。
通過(guò)測(cè)定二氨基胡椒酸(diaminopimetic acid)(為肽聚糖特有的氨基酸)確定在各種條件下獲得的細(xì)胞壁可溶部分含有的肽聚糖的量以作為指標(biāo)。通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行分離和鑒定以發(fā)現(xiàn)肽聚糖中分子量不大于10000的部分的相對(duì)量。該結(jié)果如表3所示。
表3(結(jié)果)樣品 處理時(shí)間(Hr)PG量(％)PG中分子量不大于10000的部分的量短桿菌屬8 20.3 1.1％短桿菌屬72 20.5 15.1％芽孢桿菌屬 48 25.5 40.7％表3(結(jié)果)(續(xù))PO(priming)(在血中)劑量(mg/鼠)1510 20短桿菌屬--- -(0.002) (0.01) (0.02) (0.04)短桿菌屬+++ ++ ++(0.03) (0.15) (0.31) (0.62)芽孢桿菌屬 +++ ++ ++(0.10) (0.52) (1.04) (2.08)在表3中，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示分子量不大于10000部分的劑量/鼠。
用相對(duì)于口服0.1mg/鼠MDP所獲得的效果(++)評(píng)價(jià)血液中THF產(chǎn)生的作用。
如表3所示，隨著酶處理的時(shí)間由8小時(shí)變化為72小時(shí)，得自乳發(fā)酵短桿菌的樣品中的分子量不大于10000且具有免疫強(qiáng)化特性部分的相對(duì)量也由1.1％增加到15.1％。當(dāng)用所述酶處理枯草桿菌48小時(shí)時(shí)，所述肽聚糖中分子量不大于10000部分的相對(duì)量為40.7％。
實(shí)施例3對(duì)口服給予蝦(black tiger)酶處理的微生物細(xì)胞壁低分子量部分的免疫強(qiáng)化活性的研究按照實(shí)施例1方法(1-1)相同的方法培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌(ATCC13869)。然后用所述酶處理該微生物細(xì)胞壁成分。按照實(shí)施例2中的同樣方法用所述酶處理已用酶處理過(guò)的微生物細(xì)胞8小時(shí)或72小時(shí)以分別獲得該細(xì)胞壁的可溶部分。
將經(jīng)過(guò)8小時(shí)處理獲得的并認(rèn)為是富含分子量大于10000部分樣品以及經(jīng)過(guò)72小時(shí)處理獲得的并認(rèn)為是富含分子量不大于10000部分樣品以0％、0.005％、0.01％和0.1％加入到具有下列組成的基本飼料中以獲得試驗(yàn)飼料。
基本飼料材料 相對(duì)量(％)魚粉(Fish grounds) 28蝦粉10魷魚粉(Squid meal) 2魷魚肝粉3小麥麩質(zhì)6小麥粉 20豆餅10米糠10.77魚油2卵磷脂 2沸石1.5膽固醇 0.5維生素 0.88礦物質(zhì) 4.02纖維素 0.02
在每個(gè)提供充氣裝置和回流裝置的200L水池中飼養(yǎng)20只重0.70-0.75g的蝦。在飼養(yǎng)過(guò)程中，將海水保持在6.0-7.0ppm DO,28-30ppt鹽度和0.001ppm氨濃度。將示于上表中的混合飼料一天四次喂蝦，持續(xù)8周。8周后，采血并測(cè)定血細(xì)胞部分(主要為巨噬細(xì)胞)的吞噬細(xì)胞，將各試驗(yàn)組的結(jié)果互相比較。
將這樣獲得的血用1ml塑料針筒取出，以使其與抗凝劑
以1∶1體積比混合。充分?jǐn)嚢韬?，使該混合物?℃以1000rpm離心10分鐘。再加入LHM以獲得血細(xì)胞部分，攪拌得到的混合物，然后于4℃以1000rpm離心10分鐘?？偣仓貜?fù)該過(guò)程3次。使在血液部分含有的細(xì)胞數(shù)控制在1×106細(xì)胞/ml濃度的LHM培養(yǎng)基與含有控制在1×106珠/ml乳珠的等量LHM培養(yǎng)基混合。將該混合物置于玻片上并于濕潤(rùn)箱中培養(yǎng)45小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，使玻片上的細(xì)胞用含有0.125％戊二醛的LHM溶液固定并進(jìn)行吉姆薩染色。染色后立即用相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞總數(shù)和已吞噬所述珠粒的細(xì)胞計(jì)數(shù)。吞噬能力根據(jù)已吞噬珠粒的細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比率互相比較。通過(guò)測(cè)定二氨基胡椒酸(為肽聚糖特有的氨基酸)確定在各種條件下獲得的細(xì)胞壁可溶部分含有的肽聚糖的量以作為指標(biāo)。通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行分離和鑒定以發(fā)現(xiàn)肽聚糖中具有分子量不大于10000的部分的相對(duì)量。
該結(jié)果如表4所示。
表4(吞噬作用的比較)加入率(％)0 0.0050.010.1處理8小時(shí)后16.930.9 39.428.0(0) (0.11) (0.22) (2.2)處理72小時(shí)后 16.553.5 68.370.7(0) (1.55) (3.1) (31.0)
括號(hào)中數(shù)字每噸飼料PG中分子量不大于10000的部分的量(g)。
兩種樣品(處理8小時(shí)和處理72小時(shí)的樣品)的肽聚糖含量彼此基本相等。酶處理的時(shí)間不同(8小時(shí)和72小時(shí))，處理8小時(shí)后在所述肽聚糖中的具有分子量不大于10000部分的含量為1.1％，而處理72小時(shí)后的含量為15.1％(見表3)。
用上述樣品獲得的結(jié)果如下如表4所示，在處理72小時(shí)的樣品中，血細(xì)胞的吞噬作用隨加入率增加而增加，對(duì)加入率相等的所述樣品的比較明顯看出其吞噬能力高于處理8小時(shí)的樣品。另一方面，在處理8小時(shí)的樣品中，當(dāng)加入率不大于0.01％時(shí)，其吞噬能力取決于體積，此后加入率由0.01％增至0.1％時(shí)，所述吞噬能力不再增加。最高吞噬能力于加入率為0.01％時(shí)獲得。
從上述口服給予所獲得的吞噬能力的比較結(jié)果了解到處理72小時(shí)、且含有大量分子量不大于10000部分的樣品活性高于處理8小時(shí)、且含有大量分子量大于10000部分的樣品的活性。還表明處理72小時(shí)的樣品的作用隨劑量變化而變化，而處理8小時(shí)的樣品的作用在劑量增至0.01％或以上時(shí)沒有提高，甚至還有降低。
權(quán)利要求
1．口服免疫增強(qiáng)劑，它包含作為活性成分的基本不含胞壁酰二肽、且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)。
2．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，它含有至少10％(重量)的所述肽聚糖。
3．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，它含有至少40％(重量)的所述肽聚糖。
4．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，它基本由所述肽聚糖組成。
5．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，其中分子量為500-10000。
6．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，其中分子量為500-4000。
7．權(quán)利要求1的免疫增強(qiáng)劑，其中所述肽聚糖為得自選自芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬的微生物獲得的肽聚糖。
8．口服免疫增強(qiáng)劑，它包含作為活性成分的基本不含胞壁?；摹⑶曳肿恿繛?00-10000的至少40％(重量)的肽聚糖(PG)。
9．權(quán)利要求8的免疫增強(qiáng)劑，它基本由所述肽聚糖組成。
10．通過(guò)口服給予哺乳動(dòng)物有效量的免疫增強(qiáng)劑以增強(qiáng)哺乳動(dòng)物免疫力的方法，該免疫增強(qiáng)劑包含基本不含胞壁酰二肽、且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫增強(qiáng)劑含有至少40％(重量)的所述肽聚糖。
12．權(quán)利要求10的方法，其中分子量為500-10000。
13．權(quán)利要求10的方法，其中分子量為500-4000。
14．權(quán)利要求10的方法，其中所述肽聚糖為得自選自芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬的微生物獲得的肽聚糖。
15．權(quán)利要求10的方法，其中至少給予哺乳動(dòng)物0.5mg/kg體重的所述肽聚糖。
16．基本不含胞壁酰二肽、且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)在制備含有所述肽聚糖的免疫增強(qiáng)劑中的用途。
17．權(quán)利要求16的用途，其中所述免疫增強(qiáng)劑含有至少40％(重量)的所述肽聚糖。
18．權(quán)利要求16的用途，其中分子量為500-10000。
19．權(quán)利要求16的用途，其中分子量為500-4000。
20．權(quán)利要求16的用途，其中所述肽聚糖為得自選自芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬的微生物獲得的肽聚糖。
全文摘要
含有作為活性成分的基本不含胞壁酰二肽、且分子量不大于10000的肽聚糖(PG)的口服免疫增強(qiáng)劑，它通過(guò)口服給予后有可能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的免疫力。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1238216SQ9910399
公開日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1999年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月10日
發(fā)明者山崎正利, 作田莊平, 取出恭彥 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社