專利名稱：可溶性mhc復合體及其使用方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及主要組織相容性復合體(MHC)分子的新復合體和表達方法及這些復合體的使用。例如，一方面，本發(fā)明涉及包括被修飾的II類β2鏈的MHC II類分子。另一方面，本發(fā)明涉及包括共價連接的免疫球蛋白恒定區(qū)的I類和II類MHC復合體。本發(fā)明還涉及多特異性MHC復合體，以及表達和純化MHC復合體的方法。本發(fā)明的MHC復合體可用于多種應(yīng)用中，包括篩選能在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)T-細胞活性的肽。
2.背景由抗原性肽引起抗原特異的T-細胞應(yīng)答。
肽通常作為識別和應(yīng)答外來抗原之免疫系統(tǒng)機制的一部分而結(jié)合于MHC的結(jié)合溝中。結(jié)合的抗原性肽與T-細胞受體相互作用并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。抗原性肽通過非共價方式結(jié)合于由多態(tài)性氨基酸殘基組成的特殊“結(jié)合口袋”中。
天然存在的MHC II類分子是由α和β鏈組成的雜二聚糖蛋白。這些分子的α1和β1結(jié)構(gòu)域一起折迭形成肽結(jié)合溝。抗原性肽通過肽上的錨定氨基酸和α1及β1結(jié)構(gòu)域之間的相互作用與MHC分子結(jié)合。對與流感病毒肽結(jié)合的人II類HLA-DR1復合體的晶體學分析表明，結(jié)合肽的N-和C-末端從結(jié)合溝中伸出，使得肽的C-末端靠近β鏈的N-末端。參閱如J.Brown等人，自然，36433(1993)；L.Stern等人，自然，368215(1994)。MHC I類和II類分子有不同的結(jié)構(gòu)域組成。參閱如A.Rudensky等人，自然，353622(1991)。有關(guān)MHC分子的討論也參閱美國專利5,284,935；5,260,422；5,194,425；5,130,297；WO 92/18150；WO 93/10220和WO 96/04314。
尤其是，J.Brown等人(出處同前)已報道MHC II類β2鏈在MHC II類復合體的正確折迭中起關(guān)鍵作用。
α和β鏈跨膜結(jié)構(gòu)域在MHC分子的裝配和/或胞內(nèi)運輸中起重要作用。例如，TM結(jié)構(gòu)域中的氨基酸改變會導致缺陷MHC分子。MHCα和β鏈跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已公開。參閱P.Cosson等人，科學，258659(1992)；W.Wade等人，免疫學，32433(1995)；H.Kozono等人，自然，369151(1994)及J.Brown等人(出處同前)。
與抗原性肽復合的MHC分子可通過幾種不同機制誘導選擇性免疫抑制。參閱如J.Guery等人，免疫學評述(Critical Reviews inImmunology)，13(3/4)195(1993)。
更特別的是，已報道如果抗原呈遞細胞還運送共刺激信號，則抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)表面的肽-MHC復合體將只誘導對MHC結(jié)合肽特異的T-細胞系的克隆擴充。一種推薦的方法利用了對T-細胞激活的這種要求，并報道了通過在缺乏共刺激信號的條件下與結(jié)合于MHC分子上的抗原性肽相互作用，可抑制T-細胞的發(fā)育。參閱M.Nicolle等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，931361-1369(1994)；和S.Sharma等人，美國國家科學院院報，8811465-11469(1991)。
另一推薦方法包括用含結(jié)合肽的MHC分子抑制T-細胞發(fā)育。結(jié)合肽可以是T-細胞受體(TCR)的拮抗劑或不完全激動劑。參閱B.Evavold等人，今日免疫學，14(12)602-609(1993)。
已嘗試對TCR結(jié)合的抗原性肽進行修飾，以檢查出負責特異T-細胞應(yīng)答的殘基。確定抗原性肽中這樣的“活化”氨基酸將有助于了解有可能充當TCR激動劑或拮抗劑起作用的那些氨基酸序列。參閱Evavold，B.等人，見上文。
推測在確定與MHC分子結(jié)合之多種抗原性肽的性質(zhì)的基礎(chǔ)上可開發(fā)新疫苗。參閱Chicz等人，今日免疫學，15(4)155-160(1994)。
前面的研究已顯示MHC II類雜二聚體分子能結(jié)合外源肽。然而，MHC II類鏈經(jīng)常解離。在分散狀態(tài)下，MHC II類鏈有可能不適于結(jié)合呈遞肽。參閱Stern，L.J.和D.C.Wiley，細胞68465(1992)；Scheirle，A.B.等人，免疫學雜志1491994(1992)；Kozano H.等人，自然369151(1994)。
為獲得完全可溶并有功能的MHC復合體已進行多種嘗試。例如，在某方法中，用包括暴露于蛋白水解酶、鹽和/或去污劑之類粗糙介質(zhì)中的生化技術(shù)從細胞中已分離了MHC復合體。這些介質(zhì)經(jīng)常必須通過透析或結(jié)合反應(yīng)除去。參閱如，J.M.Turner等人，生物化學雜志2527555(1977)；T.A.Springer等人，PNAS(美國)732481(1976)。
然而，對于大量分離完全可溶并有功能的MHC復合體，這些方法經(jīng)常不是最適宜的。
能調(diào)節(jié)T-細胞活性的很有用的MHC I類和II類復合體及制備復合體的方法已公開于PCT申請公開號WO 96/04314(1995年7月31日提出申請)中。所公開的MHC復合體通常結(jié)合特異性肽配基。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及完全可溶并有功能的新MHC I類和II類復合體，如空單鏈MHC II類復合體，有負載的單鏈MHC II類復合體，單鏈MHC II類肽融合復合體，多特異性單鏈MHC II類復合體(空的、有負載的，或包括融合肽的)及這些復合體的使用。
總的說來，我們已發(fā)現(xiàn)，通過將免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)融合至MHC復合體上，能促進MHC復合體的可溶性表達。我們還發(fā)現(xiàn)，通過修飾MHC II類復合體的II類β鏈，包括刪除整個II類β鏈，可促進MHC復合體的可溶性表達。
我們以前在PCT申請公開號WO 96/04314及PCT申請公開號WO97/28191(1996年1月31日提出申請)中公開了非常有用的單鏈(“sc-”)MHC I類和II類復合體，其中每一篇均全部在此引用作為參考。所公開的sc-MHC I類和II類復合體包括重組融合了呈遞肽的sc-MHC分子(sc-MHC肽融合分子)、空sc-MHC分子(未重組融合呈遞肽)及有負載的sc-MHC復合體(包括非共價結(jié)合的呈遞肽)。
我們已發(fā)現(xiàn)，通過融合免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(即Ig-CL)和/或修飾II類sc-MHC分子中的β2鏈，有可能促進前面公開的sc-MHC I類和II類分子的可溶性表達。Ig-CL融合包括將Ig-CL鏈或其合適片段加到sc-MHC I類或II類復合體上。II類β2鏈修飾包括刪除、取代或添加氨基酸到II類β2鏈上，包括刪除整個II類β2鏈。Ig-CL融合及II類β2鏈修飾增強了sc-MHC分子的可溶性表達，且不顯著影響sc-MHC分子的特異結(jié)合活性。
本發(fā)明進一步提供了新的多特異性MHC復合體。這些復合體通常包括一個或多個sc-MHC I類或II類分子、一個或多個配基結(jié)合分子、一個或多個連接分子及一個或多個可選擇的效應(yīng)分子。如此處所用，術(shù)語“配基結(jié)合分子”包括免疫球蛋白、免疫球蛋白衍生的單鏈分子及受體配基。選擇復合體的sc-MHC和配基結(jié)合分子部分以特異結(jié)合預期的靶結(jié)構(gòu)，并在一個MHC復合體內(nèi)提供潛在的多結(jié)合特異性。如果期望，通過下文詳述的Ig-CL融合和/或II類β2鏈修飾，可在多種細胞類型中促進完全有功能之多特異性MHC復合體的可溶性表達。
術(shù)語“本發(fā)明的MHC復合體”或相關(guān)術(shù)語用于此處以表示本文及PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191中公開的sc-MHC I類和II類分子，該sc-MHC分子包括本文所提供的被修飾II類β2鏈和/或融合的Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段。該術(shù)語還包括以具有或不具有被修飾II類β2鏈和/或融合Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段形式提供的多特異性MHC復合體。
本發(fā)明的MHC復合體在體外和體內(nèi)有許多用途。
例如，本發(fā)明的MHC復合體可用于檢測和分析諸如肽之類的多種配基。尤其是，MHC II類復合體也可供諸如檢測有致病性質(zhì)的T-細胞的診斷目的使用。MHC復合體另外可用于功能性細胞和分子試驗中，用于結(jié)構(gòu)分析中，包括X-射線晶體學、核磁共振成象、諸如計算機圖解顯示之類的計算技術(shù)。很顯然，預期MHC復合體的單鏈形式和增強的可溶性表達可簡化數(shù)據(jù)收集和分析的數(shù)個方面。MHC復合體也可用于篩選中以鑒定和分離TCR和/或MHC激動劑及拮抗劑，尤其是可抑制天然TCR和MHC復合體間相互作用的小分子。另外，有多種已知技術(shù)可用于篩選能夠阻斷本發(fā)明MHC復合體和TCR或MHC復合體特異性抗體間相互作用的小分子。
本發(fā)明的MHC復合體在體內(nèi)有重要的用途。例如，這些復合體可用于對抗諸如免疫相關(guān)失調(diào)或疾病中所涉及的那些致病性抗原呈遞細胞(APC)；或用于免疫哺乳動物，如人，以抵抗如存在于APC表面并執(zhí)行或協(xié)助其它分子執(zhí)行致病或其它有害功能的細胞外區(qū)域之類的MHC結(jié)構(gòu)。尤其是，可利用本發(fā)明的MHC II類復合體，按如下述之類的免疫方法制備抗體。由可用于治療策略的方法產(chǎn)生的抗體設(shè)計用來調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答，如通過抑制或減少識別預期抗原的特異APC的數(shù)目而調(diào)節(jié)。尤其是，可選擇特異結(jié)合MHC表位的單克隆抗體，以便能靶向、并優(yōu)選清除掉免疫失調(diào)或疾病或其他病理學中所涉及的限制性APC亞型或群體。如下文將更完整敘述的，APC或其結(jié)合抗體可以是未修飾的，或若期望，還可與藥物、毒素、放射性核素或其他試劑如酶之類共價連接。
另外，本發(fā)明的MHC復合體可用于篩選免疫細胞，如體外表達預期靶結(jié)構(gòu)的T-細胞。它已被用于多種環(huán)境中，以獲得和增殖表達如細胞受體糖蛋白、脂蛋白、脂類、糖脂及碳水化合物之類靶結(jié)構(gòu)的所選T-細胞。顯然，本發(fā)明的一個多特異性MHC復合體可用于選擇表達多種靶結(jié)構(gòu)的細胞。
用于本文中時，術(shù)語“呈遞肽”指例如用下文公開試驗所測定能調(diào)節(jié)T-細胞受體活性的肽，這種調(diào)節(jié)或者是誘導T-細胞增殖，抑制或鈍化T-細胞發(fā)育，這些試驗依次包括以下步驟培養(yǎng)T-細胞使其增殖、用本發(fā)明的MHC復合體(帶有融合的或非共價結(jié)合的肽)接觸T-細胞并隨后評估是否復合體抑制了T-細胞的進一步發(fā)育。
術(shù)語“空的”用于此處時，是指缺乏共價或非共價結(jié)合的呈遞肽的本發(fā)明MHC復合體。典型的空MHC復合體包括由一條多肽鏈組成的空II類MHC復合體，而非多個多肽的復合體?？誐HC復合體的另一例子是包括含融合多肽之一個或多個sc-MHC II類分子的空多特異性II類MHC復合體。空MHC復合體包括能特異結(jié)合肽的肽結(jié)合溝或裂縫。
術(shù)語“有負載的”用于此處時，指含有與MHC復合體的肽結(jié)合溝或裂縫非共價結(jié)合之呈遞肽的本發(fā)明空MHC復合體。非共價結(jié)合比較合適的是通過呈遞肽和空MHC復合體的肽結(jié)合溝或裂縫之間穩(wěn)定的氫鍵發(fā)生的結(jié)合。非共價結(jié)合可在體外或體內(nèi)進行。有負載之MHC復合體的例子是由多肽單鏈而非多肽復合體組成的有負載sc-MHC II類復合體。
本發(fā)明的MHC復合體具有顯著的優(yōu)勢。例如，如上文所提及，所提供的被修飾II類β2鏈和/或Ig-CL鏈可促進復合體的可溶性表達。因此，MHC復合體的生產(chǎn)和使用受到了積極的影響。此外，關(guān)于含預期呈遞肽(負載的，或共價連接的)的MHC復合體，早期的實踐要求從抗原呈遞細胞中純化出有負載的MHC分子。這些有負載的肽通常被緊密地結(jié)合，并且不能用目的肽有效地交換。相反，MHC復合體可包含能容易地從表達細胞中大量分離的單個抗原性肽。通過使用這些MHC復合體，將促進與T-細胞受體相互作用的分析。另外，因為肽中只有少數(shù)氨基酸(約4-6個)對于與特定MHC分子的結(jié)合比較重要，所以有很多種肽可被呈遞而與T-細胞相互作用。因此，可將不同肽的文庫與MHC分子連接以便進行T-細胞呈遞。
本發(fā)明的MHC復合體還有進一步的優(yōu)點。例如，多特異性MHC復合體能特異結(jié)合一個以上靶結(jié)構(gòu)，從而能夠用一種復合體檢測表達多個靶結(jié)構(gòu)的細胞。因為多特異性MHC復合體可包括多個結(jié)合位點，因此結(jié)合力可增強。此外，許多多特異性MHC復合體(如那些小于約50-70kDa)不大，這使得在許多應(yīng)用中，例如使細胞成象和運送藥物、毒素或放射性核素之類的所需小分子至細胞的應(yīng)用中，這種復合體可能比整個抗體更有用。
本發(fā)明的多特異性MHC復合體具有另外的用途和優(yōu)點。例如，依據(jù)本發(fā)明，在溫度、濃度、緩沖液條件等控制條件下，體外組合多特異性MHC復合體的單鏈部分是可能的。尤其是，可以組合多鏈多特異性MHC復合體的單鏈，以產(chǎn)生新的同或異二聚體的多特異性MHC復合體。若期望，用如下文所特別提供的一種或多種標準技術(shù)的聯(lián)合可純化所產(chǎn)生的復合體?；蛘?，多特異性MHC復合體的單鏈可原位組合。即在培養(yǎng)細胞內(nèi)組合，并自如下所述的那些細胞中純化。
本發(fā)明的MHC復合體還提供了進一步的優(yōu)點。例如，空的I類或II類MHC復合體可用于篩選中以鑒定天然TCR所識別的肽。MHC復合體的其它優(yōu)點包括在抑制免疫應(yīng)答的方法(如具自身免疫失調(diào)或變態(tài)反應(yīng)之類免疫失調(diào)個體的治療)和誘導所需免疫應(yīng)答[如在哺乳動物是或可能變成無免疫應(yīng)答的情況下，如在免疫系統(tǒng)因病毒侵染(如，在AIDS中)或化療(如，用于治療癌癥的放射療法中)而受到抑制的情況下]的方法以及諸如HLA定型和體內(nèi)診斷成象之類的診斷方法中的應(yīng)用。也包括直接施用編碼MHC肽融合復合體的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明的空MHC分子具有特殊的好處。例如，空的sc-MHC或多特異性II類分子可容易地與多種合適的呈遞肽結(jié)合以形成有負載的MHC分子。方便地裝載本發(fā)明空MHC分子的能力使得可篩選許多呈遞肽，以評估每種呈遞肽調(diào)節(jié)T-細胞受體活性的能力。
本發(fā)明的多特異性MHC復合體通常包括1個或多個sc-MHC I類或II類分子(相同或不同的)，可多達約2個至5個這樣的分子。按照本發(fā)明，sc-MHC分子可包括修飾的β2 II類鏈和/或融合的Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段，以促進復合體的可溶性表達。典型的多特異性MHC復合體包括含有一個sc-MHC II類分子，有時含修飾的β2 II類鏈的II類復合體。另外，含一個或多個已知類型之sc-MHC分子(IAd，DR1，DR2，DP，IE，QP，等)的嵌合型多特異性MHC復合體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的sc-MHC分子(I類和II類)的結(jié)構(gòu)已完整公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191中。
簡短地說，以前所公開的sc-MHC I類和II類分子按所期望的可以是空的、有負載的或可包括融合的或被負載的呈遞肽。例如，sc-MHCII類分子可具有與MHCα或β鏈共價連接的呈遞肽。一般說來，呈遞肽通過肽接頭與α或β鏈的N-末端連接。sc-MHC分子通常將被截短(尤其是不包括所有的跨膜部分)，或如果期望，在某些例子中它可以是“全長的”并包括跨膜部分或其部分，和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其部分。sc-MHC分子還可包括與跨膜結(jié)構(gòu)域相鄰、在本領(lǐng)域中有時被稱為“鉸合部”的部分。參閱Kabat，G.A.等人，見下文。
在期望獲得完全可溶性MHC復合體的情況下，sc-MHC II類分子通常不包括所有的跨膜部分，雖然假如單鏈分子是完全有功能并可溶的，它也可包括跨膜部分的合適片段(如1-5個氨基酸)。優(yōu)選的sc-MHC II類分子將包括下文提供的β2 II類修飾和/或Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段融合體。在期望提高溶解度和幫助純化MHC復合體的情況下，或加到切割位點上，可將如下文所公開之類的合適蛋白質(zhì)標簽加到MHC復合體上。
如PCT申請WO 96/04314和WO 97/28191中所公開的，含融合呈遞肽之sc-MHC分子通常還包括插入到MHC鏈和呈遞肽之間的柔性接頭序列。接頭序列理想地能夠使呈遞肽相對于MHC結(jié)合溝有效定位，從而呈遞肽能調(diào)節(jié)T-細胞受體活性，這種調(diào)節(jié)或者是誘導T-細胞增殖，或者是抑制或鈍化T-細胞發(fā)育。通過包括下文所公開試驗的多種體外和體內(nèi)試驗可測定T-細胞活性。典型的試驗是那些依次包括以下步驟的體外試驗培養(yǎng)T-細胞使其增殖，用MHC肽融合復合體接觸T-細胞并隨后評估MHC復合體是否抑制T-細胞的進一步發(fā)育。
如PCT申請WO 96/04314和WO 97/28191中所進一步公開的，對于包括肽融合的sc-MHC分子來說，MHCα和β鏈亞基作為單鏈融合蛋白連接在一起，且呈遞肽一般與融合蛋白的β鏈連接。這樣的連接單鏈復合體能提供許多好處。特別是，在還原復合體成為單個分子的過程中，分子的產(chǎn)量和穩(wěn)定性一般可被增強。對于不可能以活性形式有效產(chǎn)生的可溶性分子，這可能尤為重要。如下文將更完整描述的，通過下文公開的II類β2鏈修飾和/或Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段融合進一步增強了sc-MHC分子的產(chǎn)量。
如下文將更詳細公開的，本發(fā)明的MHC復合體包括可含多種I類(H-2或HLA)或II類(IA，IE，DR，DQ，或DP)MHC分子的sc-MHC分子。典型的MHC鏈包括與諸如變態(tài)反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答之類免疫應(yīng)答有關(guān)的那些MHC鏈。其他的例子已公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO97/28191中。
正如所提到的，我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，當II類β2鏈被修飾、特別是被刪除時，本發(fā)明的MHC II類復合體顯示增強的可溶性表達并能特異結(jié)合。II類β2鏈可以是例如已知DNA序列的IA、IE、DR、DQ或DP鏈。
在本發(fā)明作為例證的一個實施方案中，本發(fā)明的MHC復合體包括其中β2 II類鏈的至少一個氨基酸已缺失的sc-MHC II類分子。被缺失的氨基酸可以是連續(xù)或不連續(xù)的，最多達基本上全長β2 II類鏈。
在另一作為例證的實施方案中，MHC復合體包括II類β2鏈中有1個或多個氨基酸添加或取代。特別包括II類β2鏈中能使半胱氨酸殘基之間的交聯(lián)減到最小或消除的那些氨基酸取代。取代可以是連續(xù)或不連續(xù)的，最多可達基本上全長II類β2鏈。
如上所述，我們還發(fā)現(xiàn)Ig-CL鏈與sc-MHC復合體的融合能促進該復合體的可溶性表達。因而在作為例證的一個實施方案中，本發(fā)明的MHC復合體包括與Ig-CL鏈融合的sc-MHC分子。Ig-CL鏈可通過合適的肽接頭序列直接或間接地與單鏈MHCβ或α鏈融合。
Ig-CL鏈可獲自已知DNA序列的κ-或λ-型免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)。κ-型Ig-CL鏈在此經(jīng)常被稱為“Cκ鏈”，而λ-型Ig-CL鏈經(jīng)常被稱為“Cλ鏈”。
進一步提供的是包括與所需sc-MHC分子融合之合適Ig-CL片段的本發(fā)明MHC復合體。此片段可包括所需全長Cκ或Cλ鏈的一個或多個氨基酸缺失。所述一個或多個缺失氨基酸可以是連續(xù)或不連續(xù)的，基本上可多達全長Cκ或Cλ鏈。
本發(fā)明進一步提供了含有其中至少一個氨基酸已被取代之融合Ig-CL鏈的本發(fā)明MHC復合體。取代可以是連續(xù)或不連續(xù)的，最長可達基本上全長Cκ或Cλ鏈。如果期望，Ig-CL鏈也可包括1個或多個氨基酸的添加。
如上所提到，如果期望，與Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段融合的本發(fā)明MHC復合體還可包括修飾的II類β2鏈，以增強可溶性表達。
因此本發(fā)明提供了多種II類MHC復合體，其中可包括能促進MHC復合體的可溶性表達并保持該復合體特異結(jié)合活性的II類β2鏈修飾和/或Ig-CL鏈(或合適片段)的融合。
本發(fā)明還涉及多特異性MHC復合體。多特異性復合體通常包括一個或多個sc-MHC I類或II類分子、一個或多個配基結(jié)合分子和一個或多個可任選的效應(yīng)分子。復合體進一步包括一個或多個共價或非共價連接的連接分子。各組分的次序不重要，只要每一組分均發(fā)揮其預期功能即可。
更特別的是，在一實施方案中，多特異性MHC復合體包括由連接分子連接的多條鏈。例如，一條鏈可包括與第一連接分子及一任選效應(yīng)分子融合的sc-MHC II類分子。該第一連接分子可以共價或非共價地與第二連接分子連接，后者進一步與配基結(jié)合分子和任選效應(yīng)分子連接。第一和第二連接分子通過共價或非共價鍵(如氫鍵)連接起來。
在本發(fā)明的另一實施方案中，多特異性MHC復合體由單條鏈組成。例如，該鏈可包含與配基結(jié)合分子和任選的效應(yīng)分子共價連接的sc-MHC II類分子。因此，術(shù)語“多特異性”指由含有潛在多結(jié)合特異性之單個MHC復合體組成的單鏈和多鏈分子。
此處關(guān)于本發(fā)明多特異性MHC復合體所用的術(shù)語“連接分子”指能共價(如通過二硫鍵)或通過氫鍵非共價地與另一蛋白質(zhì)或多肽特異結(jié)合并形成特異結(jié)合對的蛋白質(zhì)或多肽。一般地，通過連接分子特異結(jié)合的分子在本文中有時被稱為第二連接分子，該第二連接分子與(第一)連接分子相同或不同。典型的連接分子包括免疫球蛋白恒定鏈(H或L)或其合適的片段，以及卷曲螺旋和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基元，如下文更完整敘述的那些。具體地說，Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段是連接分子的一種類型。
此處關(guān)于本發(fā)明多特異性MHC分子所用的術(shù)語“效應(yīng)分子”指含有能特異結(jié)合抗體(多克隆、單克隆或嵌合抗體)之表位的分子。一般地說，此抗體將是單克隆抗體。該術(shù)語還包括細胞毒素、受體配基、藥物、放射性核素、或諸如眾所周知的myc、6xHIS或EE標志之類的蛋白質(zhì)“標志”。典型的標志已公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191。正如從以下內(nèi)容中可更明顯看到的，某些情況中連接分子可以是如本文所提供的效應(yīng)分子(如Ig-CL鏈或片段)。
如果期望，有時可通過合適的肽接頭將多特異性復合體的一個亞基與另一亞基連接。術(shù)語“亞基”意指由如sc-MHC分子、配基結(jié)合分子或效應(yīng)分子組成的多特異性MHC復合體的單元部分。亞基通常以按預期用途所選擇的相繼次序互相連接。合適的肽接頭可用于按預期隔開亞基，以提供亞基間更強的柔性。典型的肽接頭序列和用于檢測肽接頭序列功能性的試驗公開如下。
本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明MHC復合體之序列的核酸區(qū)段(RNA、mRNA、cDNA或基因組DNA)。獲得編碼多種sc-MHC I類和II類復合體之DNA區(qū)段的方法已公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO97/28191中。
簡短地說，編碼目的sc-MHC I類或II類分子的核酸可獲自多種來源，包括可公開得到的MHC鏈序列的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增。按照本發(fā)明，核酸部分可包括能促進完全可溶并有功能的復合體表達的β2 II類鏈修飾和/或融合的Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段。在大多數(shù)情況下，核酸部分被插入到能在預期細胞，通常為真核或原核細胞內(nèi)表達MHC復合體的DNA載體(即DNA表達載體)中。為了增加細胞內(nèi)MHC復合體的表達，核酸部分可包括諸如啟動子、前導序列和/或任選的增強子序列之類有效連接的控制元件或與其相融合。或者，如果需要，可按已知方法將核酸部分最優(yōu)化，以用于無細胞翻譯體系中。
正如以下討論中將更明顯看到的，在某些情況下，核酸部分或攜有其的DNA載體將只編碼本發(fā)明MHC復合體的一部分。例如，所提供的一些多特異性MHC復合體是能從一個或多個DNA載體表達的多鏈分子。由DNA載體編碼的表達單鏈可與另一種表達單鏈在體外或原位(即在細胞內(nèi))結(jié)合以形成復合體。例如，通過將多核酸部分或攜有其的DNA載體引入合適細胞中并表達該復合體，可制備多特異性MHC復合體。然后通過翻譯、加工和裝配途徑而在細胞中裝配多特異性MHC復合體?；蛘?，可分別收獲復合體的單個鏈并在控制條件下，如通過透析反應(yīng)而體外聯(lián)合。
一般地，本發(fā)明的核酸部分被制成使天然MHC控制元件最少的形式。術(shù)語“控制元件”意指那些影響目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或加工的已知核酸序列。在多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)表達將由包括啟動子、任選增強子元件和前導序列在內(nèi)的與核酸部分有效連接的預定轉(zhuǎn)錄控制元件所驅(qū)動。在本發(fā)明的一個方面，Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段被連接至核酸部分上，且有時會包括來自Ig-CL鏈的內(nèi)含子和外顯子序列，例如在能進行RNA剪接的細胞類型中表達MHC復合體時即可如此。當期望在原核細胞中表達MHC復合體時，可去除內(nèi)含子。如下文所將詳述的，可將多種Ig-CL鏈或其合適片段與MHC復合體融合以促進可溶性表達。
本發(fā)明還提供了獲得大量完全可溶并有功能的MHC復合體的方法。一般說來，這些方法包括在合適細胞中表達MHC復合體，培養(yǎng)該細胞，并從中純化復合體(若需要)以獲得基本純的MHC復合體。正如早些時候所提到的，在一些多特異性復合體的例子中，理想的是在體外或原位組合MHC單鏈以促進所需復合體的生產(chǎn)。這些方法可用于從多種裝置中大量(即，至少毫克級)表達和純化所需的MHC復合體，包括滾瓶、旋轉(zhuǎn)瓶、組織培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐。明顯地，所提供的II類β2鏈修飾和/或Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段融合對本發(fā)明的分離和純化方法有積極的影響。
本發(fā)明的分離和純化MHC復合體的方法是非常有用的。例如，對于顯示有所需的結(jié)合活性或潛在的多結(jié)合活性(如，體外或體內(nèi)免疫反應(yīng)性T-細胞的抑制或與預期免疫細胞的特異結(jié)合)的MHC復合體，獲得表達和純化MHC復合體的方法是非常有用的。能生產(chǎn)至少毫克水平的預期MHC復合體的方法特別有用，如，可以將MHC復合體制成適于醫(yī)療、研究、家庭或商業(yè)用途的試劑盒中的一種組分。此外，有大量MHC復合體可供使用，對簡化結(jié)構(gòu)分析，以及期望時進一步純化和/或檢測均很有用。
本發(fā)明的純化方法通常包括層析方法，它們能被特制成用于自其天然相關(guān)細胞組分中純化預期MHC復合體的形式。一般地，這些方法包含MHC復合體亞基的特異結(jié)合。顯然可應(yīng)用多種策略純化本文公開的多特異性MHC復合體，包括設(shè)計為選擇一種或多種sc-MHC分子、配基結(jié)合分子、連接分子、效應(yīng)分子和融合Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段的層析方法。
本發(fā)明還涉及體外篩選以檢測天然MHC復合體所識別的肽，包括能誘導T-細胞發(fā)育的肽以及諸如MHC拮抗劑之類能拮抗天然MHC復合體的肽或部分激動劑。
本發(fā)明還提供了抑制哺乳動物，尤其是人體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括給哺乳動物施用有效量的本發(fā)明MHC復合體，如sc-MHC II類肽融合復合體、有負載的sc-MHC II類復合體、多特異性II類肽融合體、有負載的多特異性II類肽融合復合體，等等。本發(fā)明的方法包括治療遭受或易患自身免疫失調(diào)的哺乳動物，所述疾病例如是多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病或類風濕性關(guān)節(jié)炎，或者治療易產(chǎn)生不期望的免疫應(yīng)答的哺乳動物，如有慢性變態(tài)反應(yīng)的個體或接受了器官或皮膚移植手術(shù)之類移植外科手術(shù)的病人。
按照本發(fā)明，用一種或結(jié)合使用多種可選擇策略可抑制免疫應(yīng)答。特別地，在缺乏或近乎缺乏共刺激信號的情況下服用有效量的本發(fā)明一種或多種MHC復合體，可誘導T-細胞的無反應(yīng)性或凋亡。一般地，MHC復合體不包含全長MHC分子的完整跨膜結(jié)構(gòu)域或其部分。
還提供了用于抑制哺乳動物內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括施用編碼本發(fā)明MHC復合體的有效量DNA區(qū)段(或攜有其的載體)。如前文所提到，在希望使用編碼含多條鏈之本發(fā)明多特異性MHC復合體的DNA區(qū)段的情況下，施用有效量的編碼各鏈的兩種或多種DNA序列常常是有用的。一般地，所編碼蛋白質(zhì)在體內(nèi)或體外的共表達和裝配將形成多特異性MHC復合體。在某些情況下，與編碼諸如CD80或CD86之類合適的T-細胞刺激因子的基因一起施用編碼MHC復合體的一種或多種DNA序列可能也是合乎需要的。當用于本文中時，術(shù)語“T-細胞共刺激因子”指能提供共刺激信號，從而在一種或多種MHC融合復合體存在時能激活T-細胞增殖的肽。用本文公開的試驗可測定這樣的T-細胞增殖激活。
進一步提供了診斷方法，包括用本發(fā)明的MHC復合體，如已被修飾而含有放射性核素(如125I，32P或99Tc)或其它可檢測標志的MHC復合體進行的HLA定型和體內(nèi)診斷成象。
本發(fā)明還包括通過應(yīng)用本文所公開的MHC復合體檢測和純化T-細胞之類免疫細胞的方法。因此可將T-細胞之類能特異結(jié)合MHC復合體的細胞與按已知方法(如流速細胞儀，免疫淘選)不能結(jié)合的其它細胞基本上分開，其量足以制備基本純的T-細胞群體。這樣的T-細胞可用于許多臨床和研究中，如無免疫應(yīng)答病人的免疫系統(tǒng)重建，及檢測與不希望有的免疫反應(yīng)相關(guān)的呈遞肽的體外篩選。
附圖簡述

圖1是編碼單鏈IAd/OVA 323-229MHC融合分子(即sc-IAd/OVA)(SEQ ID NO24)之基因的圖解表示。IAdβ2鏈由IAd/OVA單鏈基因(SEQID NO24)的第452-734位核苷酸編碼。IAdβ2鏈跨越第150-243位氨基酸(SEQ ID NO25)。圖中示出了Kozak共有序列。箭頭指示信號肽酶切割位點。IAdβ1-β2和IAdα結(jié)構(gòu)域中的“//”代表為清晰起見而省略的氨基酸和核苷酸序列。OVA 323-339肽(SEQ ID NO26)(虛線)在sc-IAd/空白MHC分子中是不存在的。
圖2A和2B是說明sc-IAd/OVA分子的細胞表面表達(2A)和T-細胞誘導活性(2B)的圖表。
圖3A-3N是概括DNA載體SDE3、pMB959、pMB808、pIADK和pDRHK合成的圖。
圖4A和4B是含(4A)IAd和(4B)DR-2鏈的sc-MHC II類融合肽融合體的圖。所用縮寫詞如下SP，信號肽序列；PEP，融合的抗原性肽序列；L1，10氨基酸接頭；L2，氨基酸接頭；EE，抗體標志；IgG-CL，免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)；α TMCy，胞質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域。除序列“PEP”被刪除外，可以用相同的圖表示相應(yīng)的空分子。有負載的分子將具有與sc-MHC II類結(jié)合溝非共價結(jié)合的“PEP”序列。
圖5A和5B是顯示可溶性單鏈MHC II類/肽蛋白質(zhì)表達的聚丙烯酰胺凝膠電泳或免疫印跡。圖5A顯示用12％SDS-PAGE分析并用考馬斯藍染色的sc-IAd樣品(泳道1-3)。給出了分子量標準的遷移。sc-II類蛋白質(zhì)(泳道4-6)也被轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用特異于OVA323-339肽的小鼠抗血清進行探測。圖5B顯示用10％SDS-PAGE分析的scDR2Δβ2樣品的抗DR親和純化分布圖。親和純化的蛋白質(zhì)顯示于泳道3-5(還原條件)和泳道7-9(非還原條件)。
圖6A-C是說明單鏈II類/肽蛋白質(zhì)特異激活T-細胞應(yīng)答的圖。圖6A顯示對與IAd結(jié)合之OVA323-339特異的DO11.10 T-細胞雜交瘤被刺激而產(chǎn)生IL-2。圖6B顯示兩種不同的T-細胞雜交瘤GD12(特異于gD246-261和IAd)或DO11.10被刺激，從而以呈遞肽特異方式分泌IL-2。圖6C顯示固定化的帶OVA肽之sc-IAd/空蛋白質(zhì)或sc-IAd/OVA融合蛋白質(zhì)(但非空融合蛋白質(zhì))刺激IL-2從DO11.10細胞中的釋放。
圖7是顯示抗T-細胞受體抗體(抗-TcRmAb)或sc-IAd/OVA能誘導T-細胞凋亡的溴化乙錠染色凝膠照片。
圖8A和8B是表明sc-IAd/OVA的體內(nèi)表達抑制T-細胞克隆擴充的圖。
圖9A和9B是多特異性sc-II類/肽IgG-CL二聚體(9A)和sc-II類/肽IgG-CL單鏈抗體分子(9B)的圖示。
圖10A和10B顯示下文實施例中所用的寡核苷酸(10A)和多肽序列(10B)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供了完全可溶并有功能的新MHC復合體。MHC復合體包括含融合Ig-CL鏈或片段和/或修飾的II類β2鏈的sc-MHC I類和II類復合體。已發(fā)現(xiàn)通過將Ig-CL或合適Ig-CL片段融合到MHC復合體上，和/或通過修飾II類β2鏈，有可能顯著地增加MHC復合體的可溶性表達。如上所提到，若需要，本發(fā)明的多特異性MHC復合體可包括被修飾的II類β2鏈和/或Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段，以促進可溶性表達。
大體上，本發(fā)明的MHC復合體的制備包括常規(guī)重組步驟，包含如寡核苷酸引物介導的位點特異性誘變，聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR)，質(zhì)粒DNA的制備，用限制酶切割DNA，DNA的連接，mRNA的分離，將DNA引入合適細胞，培養(yǎng)該細胞，所表達MHC復合體的分離和純化。通常參閱Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(第二版(1989))；Ausubel等人，《分子生物學最新方法》，John Wiley & Sons，紐約(1989)。這些方法適于制備本文所公開的MHC復合體，包括空的或有負載的MHC分子，如空的或有負載的多特異性MHC復合體，部分空的或有負載的sc-MHC II類分子，和含融合呈遞肽的MHC復合體。
以下涉及含融合呈遞肽、肽接頭等等的sc-MHC肽融合復合體之制備的討論，已公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191中。應(yīng)當理解，該論述普遍適用于制備和使用本發(fā)明的MHC復合體，包括空的或有負載的復合體。從下文應(yīng)當理解，為了制備空的或有負載的MHC復合體，編碼融合呈遞肽的DNA序列不包括在編碼空或有負載分子的核酸構(gòu)建體中。
編碼所需MHC蛋白質(zhì)(即雜二聚體MHC分子)的DNA可獲自多種來源中的任何一種，包括例如下文實施例1所公開的細胞系。編碼MHC蛋白質(zhì)的DNA的其它來源是已知的，如人類淋巴母細胞。一旦分離，即可用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或本領(lǐng)域已知的其他方法擴增編碼MHC蛋白質(zhì)的基因。用于擴增MHC蛋白質(zhì)基因的合適PCR引物可將限制位點加到PCR產(chǎn)物上。PCR產(chǎn)物還優(yōu)選包括編碼接頭序列或這種序列連接所需限制酶切位點的序列。合適的引物、PCR條件和表達載體構(gòu)建技術(shù)公開于例如以下實施例及附圖中。
接頭序列優(yōu)選編碼能有效地將呈遞肽定位到MHC分子結(jié)合溝內(nèi)的肽的核苷酸序列。用于本文中時，短語“呈遞肽被有效定位于MHC分子的結(jié)合溝中”或“能調(diào)節(jié)T-細胞活性的MHC融合復合體”，或其他類似短語意指與MHC蛋白質(zhì)連接的呈遞肽所處的位置使得呈遞肽融合復合體能調(diào)節(jié)T-細胞受體的活性，按以下公開的試驗測得或者是誘導T-細胞增殖或者是抑制或鈍化T-細胞發(fā)育。一個典型試驗包括以下連續(xù)步驟培養(yǎng)T-細胞使其增殖，用本發(fā)明MHC復合體接觸T-細胞及隨后評估該復合體是否抑制T-細胞的進一步發(fā)育。
一般地，sc-MHC肽融合復合體包括通過共價連接肽接頭序列分隔的MHC單鏈。例如，sc-MHC II類分子通常包含通過合適的單鏈接頭序列而與MHC II類α1、α2鏈相連接的MHC II類β1、β2鏈。如上文所提及的，II類β2鏈通常如下文所示被修飾。因而單鏈接頭序列應(yīng)使連接的MHC復合體能折迭成活性形式，即MHC分子能調(diào)節(jié)T-細胞活性的形式。這樣的有效單鏈接頭序列能容易地根據(jù)經(jīng)驗測定。因而，例如，可克隆和表達編碼其中α和β鏈通過接頭序列連接的單鏈MHC復合體的DNA構(gòu)建體，并檢測單鏈MHC復合體以確定此復合體能否調(diào)節(jié)T-細胞受體的活性，如由下文所公開的試驗測得或者是誘導T-細胞增殖或者是抑制T-細胞發(fā)育。
為了使其具有柔性，單鏈接頭優(yōu)選主要包含帶小側(cè)鏈的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸。優(yōu)選接頭序列的約80％或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，特別是甘氨酸和絲氨酸殘基。一般地，接頭序列不包含會抑制柔性的脯氨酸殘基。對于那些包括帶共價連接肽之sc-MHC II類分子的MHC融合復合體，接頭序列被適當?shù)剡B接到MHC分子的β鏈上，盡管如果需要接頭肽序列也可連接到MHC分子的α鏈上。典型的肽接頭序列包含約7-20個氨基酸，優(yōu)選約8-16個氨基酸，更優(yōu)選約8-12個氨基酸。接頭序列通常是柔性的，以使呈遞肽不被約束于個別不合乎需要的構(gòu)象中。為了共價連接呈遞肽至MHCII類β鏈分子上，接頭的氨基酸序列應(yīng)能跨越從MHC II類β鏈N-末端殘基至呈遞肽C-末端殘基約30埃()的距離。參閱例如已公開的PCT申請的圖1A和1B。當這樣的β+肽鏈與α鏈一起表達時，連接的呈遞肽應(yīng)折迭成α1和β1結(jié)合溝，導致有功能的MHC分子，如公開的PCT申請中圖1C中所概述的。例如，一合適的接頭序列是與例如MHC II類蛋白質(zhì)β1結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸相連接的ASGGGGSGGG(SEQ IDNO35)(即，Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)?？墒褂貌煌慕宇^序列，包括已成功用于將抗體可變區(qū)連接在一起的許多柔性接頭設(shè)計中的任一種(即M.Whitlow等人，方法酶學方法指南(MethodsA Companion to Methods in Enzymology)，297-105(1991))。用常規(guī)計算機技術(shù)也可確定單鏈接頭序列的合適大小和序列。
其他合適接頭序列可根據(jù)經(jīng)驗鑒定。例如，可克隆和表達編碼包括接頭序列的MHC融合復合體的DNA構(gòu)建體，并檢測融合復合體以確定該復合體是否能調(diào)節(jié)T-細胞受體的活性，即按下文公開試驗測定或者是誘導T-細胞增殖或者是抑制或鈍化T-細胞發(fā)育。接頭序列的合適大小和序列也可用常規(guī)計算機模擬技術(shù)，基于MHC復合體的預計大小和形狀確定。
多數(shù)情況下，在含編碼接頭序列和MHC蛋白質(zhì)之融合核苷酸序列的DNA構(gòu)建體內(nèi)設(shè)計了限制性位點，以使編碼目的呈遞肽(如抗原性或者拮抗劑呈遞肽)的基本上任何核苷酸序列均能連接到此構(gòu)建體內(nèi)。例如，在下文實施例舉例說明的一個系統(tǒng)中，在前導序列末端與接頭起始處之間包含了合適的限制位點(如Afl II和Nhe I位點)，以方便各種呈遞肽插入于MHC分子的β鏈基因中。參閱，例如，已公開的PCT申請之圖3和以下實施例。典型前導序列的核苷酸和氨基酸序列描述于PCT申請公開WO 96/04314的圖18A和18B。也可參閱以下實施例及PCT申請公開WO 97/28191。
MHC融合復合體的呈遞肽組分應(yīng)能如上所述調(diào)節(jié)T-細胞活性。對于含II類MHC分子的MHC融合復合體，呈遞肽通常具有約4-35個氨基酸，更優(yōu)選約6-30個氨基酸，還更優(yōu)選約8-25個氨基酸。對于含I類MHC分子的MHC融合復合體，優(yōu)選呈遞肽具有約4-25個氨基酸，更優(yōu)選約6-20個氨基酸，還更優(yōu)選約6-15個氨基酸，更優(yōu)選約8-10個氨基酸。I類和II類MHC分子顯示優(yōu)先結(jié)合不同的肽序列。最近，已在II類結(jié)合肽中鑒定出了確定MHC等位基因特異性肽基元的錨定殘基(F.Sinigaglia等人，免疫學最新觀點(Curr.Opin.inImmun.)，652-56(1994))。例如，在人II類HLA-DR1分子中，在肽的氨基末端(第1位)附近經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有芳香族氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)，在第4位發(fā)現(xiàn)有疏水殘基(如甲硫氨酸或亮氨酸)，在第6位發(fā)現(xiàn)有小氨基酸(如丙氨酸或甘氨酸)。其它MHC分子具有不同的基元，例如，對于II類分子，參閱Sinigaglia.，出處同前；對于I類分子，參閱K.Parker等人，免疫學雜志，152163-175(1994)。為了促進最佳的MHC結(jié)合，優(yōu)選呈遞肽包含所需的MHC結(jié)合基元。因而，例如，在人II類HLA-DR1 MHC分子中，優(yōu)選呈遞肽的氨基末端(第1位)附近有芳香族氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)，呈遞肽的第4位有疏水殘基(如甲硫氨酸或亮氨酸)，呈遞肽的第6位有小氨基酸(如丙氨酸或甘氨酸)。對于本發(fā)明的免疫抑制方法(如治療自身免疫疾病或變態(tài)反應(yīng)，或抑制不希望有的T-細胞應(yīng)答的方法)，呈遞肽優(yōu)選與已知或推測在所針對的疾病中負責活化T-細胞的肽相同或有同源性(例如至少有多于80％或90％的共有序列)。因而，例如，MPB肽80-105被分離自多發(fā)性硬化癥病人的MPB特異性T-細胞的30％以上所識別[參閱E.Meinl等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，922633-2643(1993)]，并適合作為本文所公開的用于免疫抑制應(yīng)用的MHC融合復合體中的呈遞肽。參閱以下實施例3。此外，特殊呈遞肽的活性，即抗原性或拮抗劑或部分激動劑，可用本文所公開的方法，包括下文公開的體內(nèi)試驗，根據(jù)經(jīng)驗容易地測定。
如上及PCT申請WO 96/04314和WO 97/28191中所述，單鏈MHC融合復合體是合乎需要的，即寧要由單個多肽組成的融合復合體，而不要多鏈聚集體，如其中α和β鏈及肽通過非共價相互作用結(jié)合的天然雜三聚體II類/肽復合體。就單鏈MHC II類復合體來說，α和β鏈亞基作為單鏈融合蛋白質(zhì)與呈遞肽連接，其中呈遞肽優(yōu)選連接到鏈融合蛋白質(zhì)的β鏈上。典型的sc-MHC II類融合復合體描述于圖1、4A和4B中。優(yōu)選使用接頭序列連接α和β鏈。用于連接MHC分子各結(jié)構(gòu)域的這種接頭序列在本文中有時被稱為“單鏈接頭序列”，由此區(qū)別于上述插入于呈遞肽和MHC分子之間并將它們共價連接的接頭序列。這樣的接頭序列見下文圖1所示。
優(yōu)選單鏈MHC II類復合體在β2結(jié)構(gòu)域的羧基末端和α1結(jié)構(gòu)域的氨基末端之間連接，盡管MHC復合體的多個結(jié)構(gòu)域可通過其他位置連接。
本文所提供的復合體的MHC分子在氨基酸序列上與天然MHC分子，如人的MHC分子(I類或II類)、小鼠或其他嚙齒類動物或其他哺乳動物的MHC分子一致比較合適。優(yōu)選融合復合體的MHC分子的氨基酸序列至少約70％將與諸如上文所提及之類天然MHC分子的氨基酸序列相同，更優(yōu)選融合復合體的MHC分子的氨基酸序列至少約90％與天然MHC分子的氨基酸序列相同，還更優(yōu)選融合復合體的MHC分子的氨基酸序列約98％至全部與天然MHC分子的氨基酸序列相同。
除了呈遞肽不與分子共價連接之外，本發(fā)明的空MHC復合體，特別是空的單鏈MHC分子可按上述任何合適的方法制備。例如，如PCT申請WO 97/28191和下文實施例1-3中所公開的，將編碼OVA呈遞肽之寡核苷酸和接頭-β1-β2基因片段連接起來的步驟即可省略。在另一實施例中，通過使用標準重組DNA操作，可將呈遞肽從已具有共價連接的呈遞肽的本發(fā)明MHC分子中除去。例如，可用合適的限制酶(如Afl II和Nhe I)除去編碼sc-IAd/OVA呈遞肽的DNA。
如上所述，我們已發(fā)現(xiàn)，通過修飾II類β2鏈有可能促進多種sc-MHC復合體的可溶性表達。具體地說，我們發(fā)現(xiàn)β2 II類鏈對于MHC復合體的特異結(jié)合是非必需的。如前文所提到，按本發(fā)明修飾的II類β2鏈可以是DNA序列已知的IA、IE、DR、DQ或DP鏈中任何一種。II類β2鏈的DNA序列可獲自多種來源，如Kabat，E.A.等人，(1991)《有免疫學價值的蛋白質(zhì)的序列》(第5版)公共衛(wèi)生機構(gòu)，國立衛(wèi)生研究所，其內(nèi)容被引用作為參考。
尤其是，人II類β1和β2鏈結(jié)構(gòu)域一般分別對應(yīng)于第1-94位和第95-188位氨基酸，其中第1位對應(yīng)于成熟II類β鏈的N-末端氨基酸。這些位置可變化1-5個氨基酸，這依特定的II類分子而定。典型的II類β2鏈缺失包括β2結(jié)構(gòu)域起始的第95位氨基酸至β2結(jié)構(gòu)域末端第188位氨基酸的缺失。參閱以下實施例3?；蛘哒f，可從第95-188位之間缺失一個或多個連續(xù)或不連續(xù)氨基酸，甚至缺失長達整個II類β2鏈。
更特別的是，II類β2 IAd鏈是由跨越IAd/OVA323-229 MHC分子第452-734位核苷酸的DNA序列所編碼的(見圖1和SEQ ID NO24)。IAd/OVA β2鏈跨越第150-243位氨基酸(SEQ ID NO25)。對于涉及制備含II類IAd或DRβ2鏈的單鏈MHC分子的內(nèi)容，也可參閱以下實施例1和3。
如上所提及，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了帶β2 II類鏈缺失的MHC II類復合體。該β2 II類鏈缺失可跨越至少1個氨基酸，優(yōu)選至少5、10、25、50、60、70、80或90個氨基酸，更優(yōu)選II類β2鏈的基本上所有氨基酸。在另一實施方案中，MHC復合體可包括含一個或多個非連續(xù)氨基酸缺失至多達基本上整個II類β2鏈缺失的被修飾β2 II類鏈。
優(yōu)選的非連續(xù)缺失可跨越至少2個氨基酸，優(yōu)選II類β2鏈的至少5-10個或更多個氨基酸。
在本發(fā)明另一作為例證的實施方案中，MHC II類復合體可包括其中一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代的β2 II類鏈修飾。優(yōu)選的II類β2鏈取代可以是保守或非保守氨基酸取代，其中鏈內(nèi)至少1個氨基酸、優(yōu)選至少2、5、10、25、50、60、70、80、90或更多氨基酸被保守或非保守氨基酸取代。因此，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守氨基酸取代的一個例子，而用丙氨酸取代精氨本酸代表了非保守氨基酸取代。優(yōu)選地，保守或非保守氨基酸取代是親水或中性的氨基酸。尤其是，可用非半胱氨酸殘基取代β2 II類鏈中的一個或多個半胱氨酸殘基，以使交聯(lián)潛力實質(zhì)性地減小或消除。優(yōu)選至少1個或多個、最好所有半胱氨酸殘基均被非半胱氨酸殘基取代。參閱以下實施例3，它公開了其中一個半胱氨酸殘基被絲氨酸取代的II類β2鏈例子。
其他II β2鏈修飾也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，II類β2鏈可被修飾成在II類β2結(jié)構(gòu)域的第95位和最后第188位之間包括一個或多個氨基酸添加。更特別的是，β2鏈可被修飾成包括一個或多個優(yōu)選為中性或親水殘基的添加。優(yōu)選地，被修飾的II類β2鏈包括至少一個中性或親水性氨基酸，更優(yōu)選2、5、10、15或20個氨基酸，甚至多達約25-30個氨基酸。在此實施方案中，限制被添加的氨基酸殘基的數(shù)目至大約II類β2鏈的長度常常是合乎需要的。因而，在多數(shù)情況下，對于每一個加入此鏈中的氨基酸，除去等量或幾乎相等數(shù)量的II類β2鏈殘基將是比較理想的。在某些例子中，除去β2 II類鏈附近的額外序列，如接頭序列和/或β1鏈序列將能進一步提高溶解性，并對呈遞肽和MHC分子之間的特異結(jié)合無消極影響。這樣的構(gòu)建體可按本文所述方法容易地制備并檢測。
按照本發(fā)明的II類β2鏈修飾可用多種標準重組技術(shù)完成，包括使用限制酶或PCR引物以從編碼II類β2鏈的預擴增DNA序列中切出編碼一個或多個氨基酸的核酸。制備這種缺失體的優(yōu)選方法包括用誘變DNA寡核苷酸引物和PCR擴增預定的β2鏈位點而進行的寡核苷酸引物介導的定點誘變。
如上所述，本發(fā)明的MHC復合體可包括連接于，例如復合體C末端的共價連接的Ig-CL鏈。在一實施方案中，MHC復合體包括融合的哺乳動物Ig-CL鏈，優(yōu)選全長小鼠或人的Ig-CL鏈(Cκ或Cλ)。小鼠和人Ig-CL鏈的核酸和蛋白質(zhì)序列已公開。參閱例如，《基礎(chǔ)免疫學》(Fundamental Immunology)，(1993)第3版，W.Paul.編，Rsen.PressLtd.，紐約；和Kabat，E.A.，出處同前。
術(shù)語Ig-CL鏈還指因一個或多個氨基酸取代或添加而與公開的全長序列不同的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)。例如，用常規(guī)重組方法，可將氨基酸在鏈的一端或兩端加到公開的Ig-CL鏈序列上。此外，若需要，可通過重組方法取代鏈中一個或多個特定的氨基酸，優(yōu)選用中性或親水性氨基酸取代。如果需要，取代可以是保守或非保守取代。一般地，氨基酸添加將包括約1-30個中性或親水氨基酸，優(yōu)選約2、5、10、20或25個這樣的氨基酸。取代Ig-CL鏈中另一氨基酸的氨基酸一般為保守或非保守氨基酸置換。如下文對于Ig-CL鏈片段所指出的，含融合Ig-CL鏈的本發(fā)明MHC分子將是完全可溶并有功能的。
在某些例子中，將諸如小鼠或人Cκ鏈片段之類合適Ig-CL鏈片段融合至本文所公開的MHC復合體上將是合乎需要的。短語“合適Ig-CL鏈片段”意指全長Ig-CLλ或κ序列的一部分，當它與預期MHC復合體融合時，將形成如下文所定義的完全可溶并有功能的復合體。Ig-CL鏈片段(Cκ和Cλ型都可)可按標準重組方法制備，且可以是全長序列的連續(xù)或不連續(xù)缺失體。例如，可通過PCR擴增小鼠或人的目的Cκ或Cλ鏈片段，隨后將PCR產(chǎn)物連至編碼MHC復合體的DNA區(qū)段或載體中，制備合適Ig-CL片段?？砂葱枰僮鱌CR產(chǎn)物，以包含限制酶切割位點。制備Ig-CL鏈片段的特別優(yōu)選方法是用誘變DNA引物和PCR擴增預定β2鏈位點而進行的寡核苷酸介導的定點誘變。一般地，合適的小鼠或人Cκ鏈片段長度大約為80-130個氨基酸，優(yōu)選約90-120個氨基酸，更優(yōu)選約100-110個氨基酸。含適于PCR擴增之小鼠或人Cκ鏈DNA的細胞在本領(lǐng)域中是已知的。參閱下文實施例。
上述II類β2鏈修飾、Ig-CL鏈和Ig-CL鏈片段融合不會顯著影響本發(fā)明MHC復合體特異結(jié)合配基的能力。也就是說，通過修飾II類β2鏈和/或通過將Ig-CL鏈或Ig-CL鏈片段融合至MHC復合體上，MHC復合體與合適的對照、如含全長II類β2鏈并缺乏融合Ig-CL或片段的sc-MHC復合體相比，其特異結(jié)合未降低超過約30％，優(yōu)選不超過10％，更優(yōu)選不超過5％或更少。典型的結(jié)合試驗公開于下文實施例中，包括標準蛋白質(zhì)印跡和T-細胞刺激試驗。
如上所提及，本發(fā)明的MHC復合體是完全可溶并有功能的。術(shù)語“完全有功能的”或類似術(shù)語意指在有II類β2鏈修飾和/或融合Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段存在時，融合蛋白質(zhì)能特異結(jié)合配基。檢測這種特異結(jié)合的試驗公開于本文中。
術(shù)語“完全可溶”或類似術(shù)語意指融合蛋白質(zhì)在低離心力離心(如在標準離心機中低于約30,000轉(zhuǎn)/分鐘)時不容易從含水緩沖液，如細胞培養(yǎng)基中沉淀出來。此外，如果在低濃度或者無陰離子或非離子型去污劑存在時，融合蛋白質(zhì)保持在溫度高于約5-37℃、pH中性或近中性的水溶液中，則MHC復合體是可溶的。在這些條件下，可溶性蛋白質(zhì)將經(jīng)常具有低沉降值，如少于約10-50S單位。此處提及的水溶液一般具有緩沖化合物以維持pH值，一般在約pH5-9范圍內(nèi)，離子強度在約2mM-500mM之間。有時加入蛋白酶抑制劑或溫和的非離子型去污劑。此外，如果需要還可加入牛血清清蛋白(BSA)之類的載體蛋白質(zhì)至數(shù)mg/ml。典型的含水緩沖液包括標準磷酸緩沖鹽溶液、tris緩沖鹽溶液或其它眾所周知的緩沖液及細胞培養(yǎng)基配方。
本發(fā)明還涉及單鏈和多鏈多特異性MHC I類和II類復合體。多鏈多特異性復合體用以下通式表示
(通式I)其中，a)A是一個或多個sc-MHC I類或II類分子，b)B1、B2各自獨立地是一個或多個相同或不同的連接分子，c)C1、C2各自獨立地是一個或多個相同或不同的效應(yīng)分子，或-H；并且d)D是與上述A相同或不同的一個或多個sc-MHC I類或II類分子，或D是一個或多個配基結(jié)合分子。
進一步提供了用以下通式表示的單鏈多特異性MHC I類或II類復合體A-B1-C1，B1-A-C1，和A-C1-B1，其中A、B1、C1如上文所定義，條件是當多特異性I類或II類復合體用A-C1-B1表示時，C1不是-H。
關(guān)于以上提供的每個通式，單線代表共價鍵(如肽鍵)，而雙線代表一個或多個共價鍵，例如那些連接免疫球蛋白重鏈之類的二硫鍵；或雙線代表氫鍵。括號指示括號內(nèi)分子(即亞基)的排列次序可柔性變動。因而，亞基的次序是不重要的，只要每個亞基發(fā)揮各自預期功能即可。
如上所述，在顯示代表多特異性MHC復合體的每一通式中，亞基A、B1、B2、C1、C2和D各自獨立地代表一個或許多個分子。在亞基代表許多個分子的例子中，每個分子通常與相同類型的分子連接(如，sc-MHC II類分子與另一sc-MHC II類分子重組連接)。此外，這些連接分子的數(shù)目通常約2-10個，優(yōu)選約2-5個，更優(yōu)選2個這樣的分子，最優(yōu)選1個這樣的分子。sc-MHC II類分子可各自獨立地包括共價連接的呈遞肽，或者，sc-MHC II類分子可以是空的，并可按本文所述方法引入合適的呈遞肽。每個亞基或含亞基的多個分子可通過合適的肽接頭間隔開，以增強所期望的柔性。
按照本發(fā)明，修飾含II類β2鏈的那些多特異性MHC復合體的β2II類鏈常常是合乎需要的?？商娲鼗蝾~外地，Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段可被融合到多特異性MHC復合體上。例如，關(guān)于所提供的多特異性MHC復合體，上述通式中的B1或B2可各代表Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段，如小鼠或人的Cκ鏈片段。在此實施方案中，多鏈多特異性MHC分子可包括CH1之類的合適重鏈恒定結(jié)構(gòu)域或其合適片段，以使復合體能形成特異結(jié)合對。
本發(fā)明的多特異性MHC復合體可包括全部或部分來自免疫球蛋白的一個或多個連接分子。若復合體包括1個以上連接分子(如多鏈多特異性分子)，則連接分子可以是相同或不同的類型(IgG，IgA，IgM，IgD或IgE類)。因此，嵌合型多特異性MHC復合體也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。例如，如上所指出，連接分子可以是免疫球蛋白輕鏈(κ或λ類型)，或連接分子可以是重鏈恒定區(qū)或片段。因此典型的連接分子對包括CL(κ或λ類型)，CH1；CH2CH2；或CH3，CH3鏈；或它們的按本文所述試驗測定能形成特異結(jié)合對的合適片段。其他合適的連接分子例子包括能形成特異結(jié)合對的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋和卷曲螺旋蛋白質(zhì)基元。
免疫球蛋白連接分子可以來源于動物(例如，嚙齒類動物，如小鼠或大鼠)或人，或可為嵌合的或人源化的(參閱，如Morrison等人，PNAS81，6851(1984)；Jones等人，自然321，522(1986))。典型的連接分子包括那些能被諸如下文公開的抗獨特型抗體以及如公開于Linscott’s指南(40Glen Drive，Mill Valley California 94941)及美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)12301 Parklawn Drive，Rockville，Md20852中的市售抗獨特型抗體特異結(jié)合的分子。
本發(fā)明多特異性MHC復合體的一個例子是圖9A中所示的雙特異性復合體。在此實施方案中，雙特異性MHC復合體包括形成特異結(jié)合對的兩個sc-MHC II類肽復合體和兩個Ig-CL連接分子。兩個sc-MHC II類肽復合體可以是相同或不同的，盡管在某些情況中優(yōu)選它們是相同的以增加雙特異性MHC復合體的結(jié)合力。
圖9B中顯示了另一例子。在此實施方案中，雙特異性復合體包括sc-MHC II類肽復合體和sc-Fv抗體(常被稱為“單鏈抗體”)。該雙特異性復合體還包括形成特異結(jié)合對的Ig-CL和IgGCH1連接分子。sc-MHCII類肽復合體及sc-Fv抗體可結(jié)合相同或不同的分子，如T-細胞受體或T-細胞上的其它分子。
按照本發(fā)明的雙特異性復合體可包括一個或幾個配基結(jié)合分子。配基結(jié)合分子可以是如圖9B中所示的單鏈抗體，或可以是能特異結(jié)合抗原的其片段或免疫球蛋白可變區(qū)(如Fv)。這樣的抗原結(jié)合性免疫球蛋白片段或可變區(qū)是已知的。參閱例如公開于Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，化學系，Brookhaven國家實驗室，Upton，紐約(1973)和Kabat等人(見上文)中的蛋白質(zhì)序列。
適于包括在本發(fā)明多特異性復合體中的單鏈抗體可用數(shù)種眾所周知的方法制備。通常參閱Pastan，I和Fitzgerald D.，(1991)科學2541173；Webber，等人，分子免疫學(1995)，32249；和PCT申請公開WO 96/05228和WO 97/28191中關(guān)于制備和使用單鏈抗體的內(nèi)容。典型的單鏈抗體是能特異結(jié)合諸如糖蛋白和脂蛋白之類的細胞表面靶目標的那些單鏈抗體。具體糖蛋白的例子包括但不局限于CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD45、CTLA4和Fas。參閱Gillilan L.K.，等人(1996)組織抗原47∶1中有關(guān)可結(jié)合這些分子的單鏈抗體的制備和鑒定方面的內(nèi)容。
在另一實施方案中，上文式I中所示的配基結(jié)合分子D可以是受體配基，該配基可將復合體限制在細胞受體結(jié)合伙伴上。典型的受體配基包括FasL。
作為制備含融合單鏈抗體之多特異性MHC復合體的可選擇方法，在某些情況下將預期抗體(或其抗原結(jié)合片段)，如單克隆抗體偶聯(lián)至本發(fā)明的MHC復合體上是有用的。例如，當編碼所需抗體可變區(qū)的DNA序列未知時，這樣的方法可能比較有用。一般地，偶聯(lián)將包括標準蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)，如概述于Means，G.E.和Feeney，R.E.(1974)《蛋白質(zhì)的化學修飾》(Chemical Modification of Proteins)，Holden-Day中的那些反應(yīng)。也可參閱，S.S.Wong(1991)《蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)化學》(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)，CRC Press。典型的單克隆抗體包括能特異結(jié)合CD28、CTLA4或FAS的那些抗體。
如以前所提到，本發(fā)明還涉及包括非免疫球蛋白連接分子的多特異性MHC復合體。例如，第一和第二連接分子可以是包含如螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋或亮氨酸拉鏈基元之類蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合基元或由它們所組成的蛋白質(zhì)(或多肽)。這些結(jié)合基元的許多例子已被描述(參閱如Horberg，等人，(1993)科學2621401；Kamtekar等人(1993)科學2621680；Harris，等人，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)(1996)2361356)。這樣的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合基元通常形成特異結(jié)合對，并常發(fā)現(xiàn)于例如fos、jun等等轉(zhuǎn)錄因子中。下文實施例14公開了優(yōu)選的非免疫球蛋白連接分子。
另外，應(yīng)當理解，可用數(shù)種眾所周知的方法修飾本發(fā)明的多特異性MHC復合體，使其適于預期用途。例如，復合體可按已知方法被二硫化物穩(wěn)定化(參閱如PCT申請公開WO/29350)。
本發(fā)明的MHC分子分子量將根據(jù)不同的參數(shù)而變化，包括是否分子是可溶或全長的(包括膜結(jié)合型)和/或是否選擇Ig-CL鏈或合適片段融合至MHC分子上?？扇艿腗HC II類融合復合體通常具有大于約45kDa的分子量，無跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的成熟α和β鏈各自的分子量將大于約20kDa，更通常是約21-26kDa。一般地，無跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的成熟單鏈MHC II類分子將具有約48-50kDa的分子量。對于全長(膜結(jié)合型)分子，成熟α和β鏈通常將具有大于約25kDa的分子量，優(yōu)選分子量約26-30kDa。一般地，有單個(連接于α或β鏈上)跨膜或膜錨定結(jié)構(gòu)域的成熟單鏈MHC II類融合分子將具有大于約49kDa的分子量，優(yōu)選分子量約50-52kDa。所有上述分子量可用SDS-PAGE凝膠電泳估計。
對許多應(yīng)用來說，多價sc-MHC復合體比較合乎需要。MHC抗原性肽復合體的價數(shù)影響復合體對T-細胞受體的作用。例如，3DT52.5 T-細胞雜交瘤的活化需要已制成多價的MHC抗原性分子。單價可溶性MHC復合體不能刺激此T-細胞(J.McCluskey等人，免疫學雜志(J.Immunology)，1411451-1455(1988)。理想的多價MHC復合體包括那些連接于免疫球蛋白，如IgG、TgM或Fab′2上的復合體?；瘜W交聯(lián)的MHC融合復合體(例如交聯(lián)至樹枝狀聚合物上)也是合適的多價種類。例如，MHC復合體可通過包括編碼半胱氨酸或組氨酸之類具化學活性側(cè)鏈之氨基酸殘基的序列而被基因修飾。這種具化學活性側(cè)鏈的氨基酸可置于MHC融合復合體中的多個位置處，優(yōu)選在MHC融合復合體呈遞肽和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遠側(cè)。例如，遠離呈遞肽的MHC分子β鏈的C末端適當?shù)乜砂@樣的活性氨基酸。合適的側(cè)鏈可用來將兩個或多個MHC復合體化學連接至合適樹枝狀聚合物顆粒上，得到多價MHC復合體。樹枝狀聚合是合成的化學聚合物，可在它們的表面具有許多不同官能團中的任一種[D.Tomalia，Aldrichimica Acta，2691101(1993)]?？捎糜诒景l(fā)明的典型樹枝狀聚合物包括如E9 starburst多胺樹枝狀聚合物和E9 comburst多肽樹枝狀聚合物，它們可連接半胱氨酸殘基。
編碼本發(fā)明MHC復合體的DNA區(qū)段可通過多種重組技術(shù)插入合適的DNA載體中。對于那些包括融合呈遞肽的復合體，編碼呈遞肽的DNA可通過自天然來源分離DNA或用已知合成方法，如磷酸三酯方法獲得。參閱如《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，IRL Press(M.Gait編，1984)。合成的寡核苷酸也可用市售寡核苷酸自動合成儀制備?？蓪⒕幋aMHC復合體的核苷酸序列直接與編碼呈遞肽的DNA序列連接，或者更為一般地，可將如上所述編碼接頭序列的DNA序列插入編碼MHC分子的序列及編碼呈遞肽的序列之間并用合適的連接酶連接起來。
DNA區(qū)段中還可包括其他核苷酸序列。例如，控制編碼MHC復合體之序列表達的啟動子序列或指導MHC復合體至細胞表面或培養(yǎng)基中的前導序列可包括在構(gòu)建體中或存在于此構(gòu)建體將插入的表達載體中。典型的啟動子包括免疫球蛋白或病毒啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動子。參見以下實施例。構(gòu)建體中還可包括強翻譯起始序列，以增強翻譯起始效率。優(yōu)選的起始序列是Kozak共有序列(CCACCATG)(SEQID NO1)。
優(yōu)選包括于DNA構(gòu)建體中的前導序列含有效放置的限制位點，以使編碼目的呈遞肽的寡核苷酸可以如需要與MHC分子連接。合適的限制位點可摻入前導序列的3’-末端，在本文中有時被稱為接點序列，例如長度約2-10個密碼子，它被置于呈遞肽編碼區(qū)之前。盡管其他切割位點也可摻入呈遞肽編碼區(qū)之前，但其中一個典型的限制位點是Afl II位點。如上所述，這樣的限制位點與一般置于接頭編碼序列起始處的另一個限制位點結(jié)合使用能使編碼多種呈遞肽的序列快速和直接地插入MHC復合體的DNA構(gòu)建體中。典型的前導序列包含強翻譯起始位點和其mRNA的3′末端加帽位點。例如，前導序列可連接到I類MHC分子的α1結(jié)構(gòu)域上，或前導序列可連接到II類MHC分子的β1結(jié)構(gòu)域上。優(yōu)選的前導序列能提供MHC融合復合體的分泌表達。
特殊的sc-MHC II類構(gòu)建體例子包含連接在一起的、依次編碼下述的核苷酸序列β鏈前導序列/呈遞肽/接頭序列/β1-Δβ2鏈/單鏈接頭序列/α1-α2鏈；β鏈前導序列/呈遞肽/接頭序列/β1-Δβ2鏈/單鏈接頭序列/α1-α2鏈/Ig-CL鏈；和β鏈前導序列/呈遞肽/接頭序列/β1-β2鏈/單鏈接頭序列/α1-α2鏈/Ig-CL鏈；其中Δ符號表示如上所述的β2 II類鏈修飾，優(yōu)選多達和包括基本上整個β2鏈的β2 II類鏈缺失。sc-MHC II類構(gòu)建體的其它例子是剛提及的連接核苷酸序列，不同之處僅在于Ig-CL鏈被合適Ig-CL鏈片段取代。MHC DNA構(gòu)建體被適當?shù)匾爰毦U狀病毒-昆蟲細胞及哺乳動物表達系統(tǒng)，包括本文公開的那些特異表達系統(tǒng)。然后表達MHC復合體，若需要，還對其純化以獲得基本純的MHC復合體。
如上所提到，本發(fā)明的MHC復合體包括那些含有II類β2鏈修飾和/或Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段融合以促進完全可溶并有功能的分子表達的復合體。然而，如果需要，MHC復合體可作為細胞膜、如免疫細胞膜的部分提供。制備和使用膜結(jié)合形式的MHC復合體的方法已公開于PCT申請公開96/04314。
構(gòu)建表達本發(fā)明MHC復合體兩條鏈的單個表達載體可能比較合乎需要，即編碼MHC融合復合體α和β鏈的各序列均連接到一個表達載體中，即使不是單鏈分子也可以。這樣的表達載體可能比MHC復合體的每條鏈各用獨立載體的情況有更好的結(jié)果，在難于選擇已引入載體的細胞時尤為如此。構(gòu)建編碼MHC復合體(如多特異性MHC復合體)各鏈以及其他因子，尤其是B7或B7-2之類T-細胞共刺激因子的單個表達載體可能也合乎需要，即，編碼MHC復合體各鏈的序列和編碼共刺激因子的序列均連接到單個表達載體中，以使進行一次轉(zhuǎn)化步驟即可。另外，此方法還可避免對已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染兩次或多次的細胞可能比較困難的篩選工作。
作為編碼本發(fā)明多特異性MHC復合體的DNA載體的一個實例，該DNA載體可包括編碼合適的連接分子的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段被重組融合至編碼sc-MHC II類分子的另一DNA區(qū)段的5′或3′末端，包括例如重組融合的呈遞肽。如果需要，該DNA序列可任選地融合至編碼效應(yīng)分子的序列上。優(yōu)選的連接分子來自能特異結(jié)合另一免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白輕鏈或重鏈恒定區(qū)，用SDS-PAGE凝膠電泳測得分子量在約20-30kDa之間。
本發(fā)明的多特異性MHC復合體可用一種或多種策略聯(lián)合生產(chǎn)。例如，通過在合適細胞中共表達i)編碼A-B1-C1鏈的DNA表達載體，和ii)如上定義編碼D-B2-C2鏈的DNA分子，可制備雙特異性MHC復合體。在連接分子整個或部分來自免疫球蛋白的情況下，可使用制備和使用編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA表達載體的合適方法(參閱，如Near等人，分子免疫學(Mol.Immunol.)30，4，369(1993)；Near等人，分子免疫學27，901(1990))。或者，雙特異性MHC復合體可由含有編碼各單鏈之DNA區(qū)段的單個DNA載體編碼。
還如上所提到，本發(fā)明的MHC復合體還可以適于包括研究、臨床和商業(yè)使用在內(nèi)的多種應(yīng)用的試劑盒形式提供。例如，按照本發(fā)明，這樣的試劑盒可用于檢測感興趣的結(jié)構(gòu)，例如含預期細胞表面分子的細胞。特別令人感興趣的是諸如含預期TCR或其他細胞表面分子如其他受體、糖蛋白、脂蛋白的T-細胞之類的免疫細胞，或被標志或抗體(如單克隆抗體)標記了的細胞。一般地，該試劑盒將包括以所需結(jié)合特異性為特征的一種或多種本發(fā)明MHC復合體，或在本文所公開的多特異性MHC復合體情況下，是具有一種以上所需結(jié)合特異性的復合體。通常還提供合適的含水緩沖液，以便例如對被試者施用一種或多種MHC復合體或完成MHC復合體與生物樣品中預期靶結(jié)構(gòu)之間的特異結(jié)合反應(yīng)。若需要，試劑盒可包括一種或多種可檢測性標記的MHC復合體，這種復合體或者是未結(jié)合形式或者是固定于所期望的固相支持體上?；蛘?，試劑盒可包括用本文所述可檢測標志標記復合體的說明書。
如PCT申請WO 96/04314和WO 97/28191中所公開，有許多策略可用來表達本發(fā)明的MHC復合體。例如，可以用已知方法，如用合適的限制酶切開載體以插入構(gòu)建體，隨后連接，將上述MHC基因融合構(gòu)建體摻入合適載體中。然后將含基因構(gòu)建體的載體引入MHC復合體表達的合適宿主中。通常參閱，Sambrook等人，見上文。可基于涉及克隆流程的因素根據(jù)經(jīng)驗選擇合適載體。例如，載體應(yīng)與所用宿主相容，并具適當復制子。此外，載體須能接納編碼待表達之MHC復合體的DNA序列。
在制備可溶性MHC融合復合體的一個優(yōu)選方案中，編碼MHC分子(II類)呈遞肽和β1-β2鏈的DNA序列被排列在一起，使得呈遞肽的C-末端通過柔性接頭序列與β1結(jié)構(gòu)域的起始氨基酸、優(yōu)選β1結(jié)構(gòu)域的第1個氨基酸連接。這樣一種構(gòu)建體描述于下文圖4中。對于I類MHC分子，優(yōu)選編碼呈遞肽的DNA序列與MHC分子的α結(jié)構(gòu)域連接，最好是使得呈遞肽將與該α鏈的N-末端連接。如上所述，優(yōu)選在前導序列末端和接頭起始處之間加入限制位點，以使基本上任何編碼目的呈遞肽(即抗原性或拮抗劑)的寡核苷酸均能與β鏈基因連接。
如前文所述，β2 II類鏈可被修飾并/或?qū)g-CL鏈或片段融合至MHC復合體上，以促進可溶性表達。用已知方法可分離和純化所表達的MHC融合復合體。例如，在一種具體方法中，離心培養(yǎng)基，然后用親和或免疫親和層析純化上清液，例如蛋白A或蛋白G親和層析或免疫親和方案，包括使用可與表達的融合復合體如連接的MHC或其免疫球蛋白區(qū)結(jié)合的單克隆抗體。例如，可以用廣為人知并公開于例如Harlow，E.等人，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988)中的方法，在單克隆抗體L243-Sepharose柱上通過親和層析純化含有人HLA-DR1序列的MHC融合復合體。L243單克隆抗體對正確折迭的HLA-DR1分子的構(gòu)象表位是特異的(J.Gorga等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，26216087-16094)，因此優(yōu)選用于純化有生物活性的MHC融合復合體。MHC復合體還可包含有助于純化的序列。參閱，如下文中公開6xHis和EE標志的使用的實施例7和圖4A。
可按上文和PCT申請WO 96/04314和WO 97/28191以及下文實施例，包括實施例1-8所述制備單鏈MHC復合體。例如，可從合適的細胞系獲得編碼所需MHC蛋白質(zhì)的DNA，用PCR或其他方式擴增分離的基因。至于MHC II類分子，可將α1-α2基因片段克隆入載體，隨后克隆編碼帶插入其中的單鏈接頭序列的β1-β2結(jié)構(gòu)域的基因片段。然后在合適宿主中表達此單個載體，再收獲單鏈分子，需要的話還進行純化。參閱下文實施例，包括實施例1-8。還可參閱授予Ladner等人的美國專利5,260,203，其中論述了單鏈抗體的制備，該方法通?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的單鏈MHC融合復合體。
在一種典型的制備方法中，具體地通過用PCR從B細胞系或其它MHC分子來源中分離編碼區(qū)，獲得MHC II類分子α和β鏈的編碼區(qū)。編碼單鏈β-α融合MHC融合分子的序列可通過用如上所述連接β鏈基因至成熟α鏈(尤其是連接到α鏈基因的第一個密碼子)的單鏈接頭序列置換編碼β鏈基因跨膜結(jié)構(gòu)域的序列而構(gòu)建。為進行單鏈融合復合體的膜結(jié)合型表達，α鏈基因可適當?shù)匕目缒^(qū)，或者，為進行單鏈MHC融合復合體的可溶性表達，α鏈基因可在胞外區(qū)域末端被截短。優(yōu)選在β鏈前導序列和β鏈第一個密碼子之間包含有對呈遞肽比較合適的限制位點及接頭。如上文所述，II類β2鏈可缺失以促進可溶性表達，此時β1鏈將與單鏈接頭連接。可替代地或另外地，可通過融合合適Ig-CL鏈或合適Ig-CL片段至分子上，優(yōu)選在編碼β鏈的末端，進一步修飾所產(chǎn)生的構(gòu)建體。然后基本上任何呈遞肽的編碼區(qū)均可作為寡核苷酸引入產(chǎn)生的限制位點內(nèi)。再將此構(gòu)建體適當?shù)刂糜诓溉閯游锘蚣毦鷨幼?，包括本文公開的那些特異啟動子的控制之下。應(yīng)當理解，通過連接至編碼所需Ig-CL鏈或片段的合適載體上，可完成Ig-CL鏈或合適Ig-CL鏈片段的融合。參閱，如Near等人(出處同前)和論述合適載體的以下實施例。
如上所提及，本發(fā)明MHC復合體可包括多種效應(yīng)分子。合適的效應(yīng)分子包括那些賦予MHC復合體所需的生物學、化學或物理學性質(zhì)的分子。更特別地，效應(yīng)分子可以是例如植物或細菌來源的細胞毒素，如白喉毒素(DT)、志賀菌毒素、相思豆毒蛋白、霍亂毒素、蓖麻毒蛋白、皂草素、假單胞菌外毒素(PE)、美洲商陸抗病毒蛋白或gelonin。這些毒素的生物學活性片段在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括例如白喉毒素A鏈和蓖麻毒蛋白A鏈。另外，該毒素可以是在細胞表面有活性的因子，諸如磷脂酶(如磷脂酶C)。另一例子中，效應(yīng)分子可以是化療藥物，如長春酰胺、長春新堿、長春堿、氨甲喋呤、阿霉素、博來霉素或順式鉑氨，或另外地，效應(yīng)分子可以是放射性核素，如碘-131、釔-90、錸-188或鉍-212。參閱如，Moskaug等人，生物化學雜志264，15709(1989)；Pastan，I.等人，細胞47，641，1986；Pastan等人，作為新型治療劑的重組毒素(Recombinant Toxins as NovelTherapeutic Agents)，生化年鑒(Ann.Rev.Biochem.)61，331，(1992)；“嵌合毒素”O(jiān)lsnes和Phil，Pharmac.Ther.，25355(1982)；PCT申請公開WO 94/29350；PCT申請公開WO 94/04689；及美國專利5,620,939，各文獻均在此引用作為參考。
合適效應(yīng)物的更進一步例子是蛋白質(zhì)標志，它是在生理pH下帶電荷的多肽，如6xHIS。在這種情況下，如果需要，用于純化MHC復合體的合適合成基質(zhì)應(yīng)是例如可購買到的金屬瓊脂糖凝膠，諸如Ni-Sepharose或其他能在約pH6-9結(jié)合6xHIS的合適基質(zhì)。EE表位和myc表位是合適蛋白質(zhì)標志更進一步的例子，這些表位可被一種或多種市售單克隆抗體特異結(jié)合。一般地，多種能被抗體，優(yōu)選可購得的單克隆抗體特異結(jié)合的表位，能用作本發(fā)明MHC復合體的標志。
在本發(fā)明的一些實施方案中，將MHC復合體融合至帶化學裂解位點或蛋白酶切割位點，如凝血酶或蛇毒蛋白酶切割位點的蛋白質(zhì)標志可能是有用的，這樣可以使該標記(或與該標志融合的其它MHC亞基)以可控制方式除去。
從前文應(yīng)當理解，在某些情況下，諸如蛋白質(zhì)標志之類的效應(yīng)分子也可以是連接分子。效應(yīng)分子可通過諸如SPDP、碳二亞胺等等之類異雙功能蛋白質(zhì)交聯(lián)劑與MHC復合體偶聯(lián)。參閱Meany和Feeney，見上文；Wong，見上文。
對于某些應(yīng)用來說，非重組地修飾本發(fā)明MHC復合體將是有用的。例如，這可通過偶聯(lián)所需因子而達到，盡管如果需要，該因子常常可重組融合至復合體上。例如，除諸如藥物、酶、激素、能結(jié)合的螯合劑(如放射性核素)等上述因子之外，MHC復合體還可包括多種藥用因子，以及可用于疾病診斷或治療的其他蛋白質(zhì)和多肽。為了診斷的目的，MHC復合體可以被標記或未標記。例如，可適當應(yīng)用多種的標記，諸如放射性核素、熒光團、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、如半抗原之類的配基，等等。
如上所提及，在某些情況下，通過包含融合的肽接頭序列而靈活地放置本發(fā)明MHC復合體亞基可能是合乎需要的。數(shù)種合適的肽接頭及其相應(yīng)檢測方法已被描述，并很容易適合于與復合體一起使用。另外，在某些情況下，按眾所周知的技術(shù)將因子添加到與MHC復合體融合的肽接頭上可能是有用的。有用因子的例子包括光度計可檢測標記，如染料或熒光團；以及酶(如β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，這些酶能形成光度計可檢測標志)?？傮w參閱美國專利5,434,051關(guān)于合適的光度計可檢測標志的論述?；蛘?，可以用不涉及肽接頭的多種其他方式將因子與本文公開的多特異性MHC復合體偶聯(lián)，其中一些方法公開于下文中。
此外，如果需要，本發(fā)明的MHC復合體可通過如碳水化合物或脂肪酸添加等被翻譯后修飾。例如，MHC復合體可被糖基化修飾。蛋白質(zhì)上的糖基化位點在本領(lǐng)域中是已知的，一般是N-連接(天冬酰胺連接)或O-連接(絲氨酸或蘇氨酸連接)的。這樣的糖基化位點可通過MHC復合體蛋白質(zhì)序列的分析容易地鑒定出來。如SDS-PAGE凝膠電泳所顯示，MHC復合體可被合適的真核細胞糖基化。SDS-PAGE凝膠電泳和其它相關(guān)方法可與酶消化之類常規(guī)生化技術(shù)結(jié)合，以檢測與本發(fā)明MHC復合體結(jié)合的碳水化合物。優(yōu)選的消化酶例子包括如可購自NewEngland Biolabs(Beverly MA)并按制造商指示使用的內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶。因此，可很容易分析本發(fā)明MHC復合體中是否存在糖基，尤其是寡糖基。
在某些情況下，獲得基本純的糖基化形式的本發(fā)明MHC復合體可能是有用的。尤其是，在某些時候，當作為治療劑施用時，這樣的糖基化MHC復合體在體內(nèi)可能降解較少，從而增加了循環(huán)半壽期(參閱如，Goto，M.等人，生物技術(shù)(Bio/Technology)667(1988))。因此，本發(fā)明的方法很適于獲得大量基本純的糖基化MHC復合體。
如果需要，本發(fā)明的MHC復合體可用一種技術(shù)或結(jié)合多種技術(shù)純化。生產(chǎn)MHC復合體的典型方法包括在能表達該復合體的細胞中進行表達。例如，通過在昆蟲細胞，如基于桿狀病毒的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中表達MHC復合體，可獲得MHC復合體。參閱例如下文實施例5。合適的昆蟲細胞包括那些能被桿狀病毒感染的昆蟲細胞，如來自秋粘蟲(如SF9細胞)或粉紋夜蛾的細胞(參閱，如，Ausubel等人，分子生物學最新方法，John Wiley & Sons，紐約，1989；Summer和Smith，用于桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養(yǎng)操作的方法手冊(A Manual of Methodsfor Baculovirus Vector and Insect Cell Culture Procedures)Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555，Colledge Station，德克薩斯(1988)；D.R.O′Reilly等人，桿狀病毒表達載體實驗室手冊(Baculovirus Expression VectorsALaboratory Manual)，W.H.Freeman & Co.，紐約(1992))。合適的昆蟲細胞還優(yōu)選能在如轉(zhuǎn)瓶、滾瓶、多組織培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。
除了在昆蟲細胞中表達本發(fā)明MHC復合體之外，還可利用諸如哺乳動物細胞之類的其他真核細胞生產(chǎn)MHC復合體。參閱例如下文實施例6。總的說來，這些方法包括將編碼MHC復合體的合適哺乳動物表達載體引入哺乳動物細胞中，并在支持MHC復合體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)該細胞。合適的哺乳動物細胞是最好能在如轉(zhuǎn)瓶、滾瓶、多組織培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中表達大量外源蛋白質(zhì)的細胞。
術(shù)語“載體”(包括“表達載體”)用于此處意指能被引入宿主細胞導致目的核酸表達的任何感興趣的核酸序列。載體可包括例如線性核酸序列、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒和染色體外DNA。特別地，載體可以是重組DNA。同樣用于此處的術(shù)語“表達”或“基因表達”意指目的核酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生產(chǎn)，包括DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯。
用于表達本發(fā)明MHC復合體的其它合適細胞包括原核生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌；以及其他真核生物，諸如動物細胞和酵母株系，如釀酒酵母和粟酒裂殖酵母。經(jīng)常優(yōu)選哺乳動物細胞，如J558、NSO、COS、CV-1、SP2-O、CHO、HeLa、p3-X63Ag8或骨髓瘤細胞。參閱下文實施例4-6。
除了本文公開的特殊細胞外，可檢測其他細胞表達MHC復合體的能力?？偟恼f來，檢測幾乎任何植物、昆蟲、哺乳動物、細菌、真菌或酵母細胞表達、優(yōu)選大規(guī)模表達本文所公開MHC復合體的能力是有可能的。
例如，檢測細胞表達本發(fā)明MHC復合體情況的一種方法如下。通過將編碼目的MHC復合體的DNA序列(最好位于合適載體中)用如轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方式引入細胞，進行蛋白質(zhì)表達實驗。導入編碼目的MHC復合體的DNA序列后，在有利于MHC分子生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細胞。然后用例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡或SDS-PAGE凝膠電泳監(jiān)測蛋白質(zhì)表達以確定細胞是否在細胞內(nèi)或細胞培養(yǎng)基中表達顯示正確預定分子量的MHC分子。一般地，按ELISA或SDS-PAGE凝膠所測定，合適的細胞將能生產(chǎn)約1ng/1×106細胞/天至1000ng/1×106細胞/天或者更多。
在某些情況下，在合適真核細胞中瞬時表達本發(fā)明MHC復合體可能比較合乎需要。例如，如果真核細胞是昆蟲或哺乳動物細胞，則通過合適DNA表達載體方式瞬時表達MHC復合體可能是有用的。
可依據(jù)涉及相容性的因素根據(jù)經(jīng)驗選擇用于表達本文公開之MHC復合體的合適載體。例如，載體應(yīng)與所用宿主相容，并具有適合于該宿主的合適復制子。另外，該載體必須能容納編碼MHC復合體的DNA序列。具體地說，對于本發(fā)明的多特異性MHC復合體，載體按需要可編碼多特異性復合體的一部分，例如其中一半或其他預先選擇的部分。
更特別的是，在細菌中復制的合適載體通常包括如(i)在大腸桿菌中有功能、來自如pBR322，優(yōu)選來自眾所周知的pUC19載體的復制起點；(ii)可選擇的抗生素抗性基因，如氨芐青霉素和/或新霉素抗性基因；(iii)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，如大腸桿菌trp操縱子的終止區(qū)；(iv)轉(zhuǎn)錄啟動子，如phoA、tac、tac-lac、lacZ，lacuvs、T7或T3啟動子；(v)前導序列，如pelB或ompA前導序列；(vi)編碼目的MHC復合體的DNA區(qū)段和(vii)轉(zhuǎn)錄終止子，如來自大腸桿菌核糖體RNA位點的T1T2序列。如前面所提及，MHC復合體將包括諸如基本上整條鏈被缺失之類的被修飾II類β2鏈，且/或MHC復合體包括諸如小鼠或人Cκ片段之類的融合Ig-CL鏈。
已發(fā)現(xiàn)，用特定的誘導條件可促進細菌內(nèi)本發(fā)明MHC復合體的可溶性表達。術(shù)語“誘導條件”意指這樣的培養(yǎng)條件，其中消耗掉培養(yǎng)基中的一種必需營養(yǎng)物(如氨基酸或諸如磷酸鹽之類的無機鹽)，從而誘導與編碼MHC復合體之序列有效連接的特殊啟動子的表達。因而優(yōu)選進行細菌表達的編碼MHC復合體的載體或區(qū)段被制成在這些誘導條件下表達最大化的形式?？稍诖苏T導條件下培養(yǎng)的宿主細胞的具體例子包括下文實施例中提供的細菌。
例如，下文所述的phoA啟動子是在缺乏磷酸鹽的誘導條件下于細菌中表達MHC復合體的特別優(yōu)選元件的例子。見下文實施例4。構(gòu)建體中還可包含強翻譯起始序列以增強翻譯效率。一般地，當培養(yǎng)基中磷酸鹽被用完時，phoA啟動子的誘導被迅速啟動。
通過在較長的生長期間誘導宿主細胞，可在細菌中表達編碼MHC復合體的DNA載體。未與任何特殊理論結(jié)合，已發(fā)現(xiàn)誘導超過近2-8小時、優(yōu)選約4-6小時，似乎可增強MHC復合體的表達。例如，制備包括與編碼所需MHC復合體之序列有效連接的phoA啟動子(強)的DNA載體。見下文實施例3和4。然后用該DNA載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使宿主細胞培養(yǎng)基中的磷酸鹽經(jīng)過幾個小時、一般約2-10小時、更典型的是4-6小時消耗掉。已發(fā)現(xiàn)，當消耗掉了培養(yǎng)基磷酸鹽時，強phoA啟動子被誘導，顯著增加了可溶并完全有功能的MHC復合體的量。
可設(shè)計另外的DNA載體，以便在真核細胞中表達MHC復合體。優(yōu)選將DNA載體制成適于在細菌宿主中復制的形式，以便得到合適量的DNA載體。例如，DNA載體通常可包括(i)在大腸桿菌中有功能的復制起點；(ii)可選擇的抗生素抗性基因；(iii)強病毒啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子和任選的增強子元件；(iv)編碼所需MHC復合體的DNA區(qū)段；(v)生長激素多聚腺苷酸化序列，如牛生長激素(bgh)polyA序列；和(vi)編碼可選擇性真核標記的DNA，例如強病毒啟動子如猿猴病毒40(SV40)啟動子之類連接至與病毒多聚腺苷酸化序列(如SV40polyA序列)融合的抗生素抗性基因(如新霉素)上。合適DNA載體的例子公開于下文實施例6。如前文所提及，MHC復合體常常包括被修飾的II類β2鏈，優(yōu)選基本上整條鏈的缺失，和/或MHC復合體將包括融合的Ig-CL鏈或諸如小鼠或人Cκ片段之類的合適Ig-CL鏈片段。
可按常規(guī)技術(shù)修飾用于所需哺乳動物細胞的本發(fā)明DNA載體，使在一種或多種其他哺乳動物細胞中的可溶性表達最優(yōu)化。例如，編碼上述新霉素抗性基因的真核標記可被例如編碼胸苷激酶(TK)基因的DNA所置換，以促進在TK-(TK缺陷型)哺乳動物細胞中表達sc-MHC融合蛋白質(zhì)。可以用本領(lǐng)域眾所周知的其他方法(如變換啟動子、抗生素抗性基因，用免疫球蛋白、SV40、腺病毒或乳頭瘤病毒啟動子置換CMV啟動子，等等)修飾DNA載體，使MHS復合體在所需哺乳動物細胞中的表達最優(yōu)化?；蛘?，可將編碼sc-MHC蛋白質(zhì)的DNA序列插入眾所周知適于在酵母或昆蟲細胞中表達的載體內(nèi)。見如Ausubel等人，見上文。
適合于在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明MHC復合體的其它DNA表達載體包括來源于pEE13或pCDNA-3載體的DNA載體，如SCE1，其中MHC復合體被置于合適的巨細胞病毒啟動子的下游。見公開的各項PCT申請中的實施例及下文實施例6。其他已知的DNA表達載體也可按本發(fā)明用于表達MHC復合體(見如Ausubel等人，見上文和Sambrook等人，見上文)。
有多種標準方法可用于將編碼所需MHC復合體的DNA區(qū)段或者攜有該區(qū)段的DNA載體引入所需細胞中。例如，可以通過任何可接受的途徑，諸如磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化、病毒或噬菌體感染(用編碼MHC復合體的重組病毒)、電穿孔、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)移或biolistic轉(zhuǎn)移，按照常規(guī)技術(shù)(參閱如Cockett等人，生物技術(shù)(Bio/Technology)8662(1990)；Ausubel等人，見上文；和Sambrook等人，見上文)，將DNA區(qū)段或DNA載體引入合適細胞中。然后在支持MHC復合體表達的條件下培養(yǎng)細胞，如在微載體或中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)、懸浮系統(tǒng)、與滾瓶、旋轉(zhuǎn)瓶、生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐有關(guān)的培養(yǎng)系統(tǒng)；使所選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)保持在培養(yǎng)基、空氣和溫度最適條件下。若需要，可優(yōu)化培養(yǎng)條件，使其適于大規(guī)模生產(chǎn)所需的MHC復合體。見下文實施例4-6。
在某些情況下，在將導致載體發(fā)生染色體整合的條件下增殖含編碼MHC復合體之載體(包括可選擇標記)的真核細胞可能比較合乎需要。通過標記選擇而獲得的細胞系特別適用于組成型表達MHC復合體。
本發(fā)明的MHC復合體可包括多種I類或II類MHC分子。例如，參照圖1中所描述的可溶性sc-MHC II類肽融合分子，其中IAdβ1-β2和IAdα1-α2II類分子可被其它I類(H-2或HLA)或II類(IA、IE、DR、DQ或DP)分子獨立地取代?；蛘?，IAdβ1-β2和IAdα1-α2II類分子可以被I類或II類分子的呈遞肽結(jié)合部分獨立地取代。例如，圖4A和4B顯示了含IAd(圖4A)或DR2(圖4B)鏈的sc-MHC II類分子。通常I類或II類分子具有已知的DNA序列，從而可以用本文公開的重組DNA技術(shù)將該分子(或其呈遞肽結(jié)合部分)制成MHC復合體的一部分。
更特別的是，本發(fā)明的MHC I類或II類分子包括變態(tài)反應(yīng)或自身免疫相關(guān)的MHC分子，諸如與多發(fā)性硬化癥(MS)相關(guān)的HLA-DR2(DRB1*1501)；HLA-DR4，HLA-DQ8和HLA-DQ7，它們均與類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)；與胰島素依賴型糖尿病(IDDM)相關(guān)的HLA-Q8(DQB1*0302)；與腹腔疾病相關(guān)的HLA-DQw2；與SJL/J小鼠中實驗性自身免疫腦脊髓炎相關(guān)的IA結(jié)構(gòu)域；與NOD小鼠中的自發(fā)性糖尿病相關(guān)的IAg7；與DBA/1小鼠中膠原誘導的關(guān)節(jié)炎相關(guān)的IAq；或它們的肽結(jié)合部分。見下文實施例3。
通過用可檢測分子(如125I，131I，3H或生物素)標記呈遞肽，并在足以使呈遞肽裝載到相應(yīng)全長MHC分子上的條件下使標記的呈遞肽接觸I類或II類MHC片段，可容易地鑒定出I類和II類MHC分子的呈遞肽結(jié)合部分。一般地，當于相當或相關(guān)負載條件下，與相應(yīng)的全長MHC分子相比時，I類或II類MHC分子的呈遞肽結(jié)合部分將結(jié)合被標記呈遞肽的至少約50％(摩爾百分比)，更優(yōu)選60％、70％、80％、90％或更多。某些MHC分子的某些呈遞肽結(jié)合部分也已有報道。
總的說來，裝載呈遞肽至空MHC分子上的方法包括將純化的MHC復合體與約20-50倍摩爾過量的呈遞肽在升高的溫度(如約37℃)溫育約20-60小時。這些裝載反應(yīng)的最適pH可依MHC復合體中的具體MHC II類分子及所用呈遞肽而變化，然而，通常裝載呈遞肽的最適pH為約pH4.5-pH7?？扇菀椎赜眠@些方法將幾乎任何呈遞肽裝載至MHC II類復合體上。見下文實施例8。也參閱Stern，L.J.等人，1992，細胞68465；Sette，A.S.等1992，免疫學雜志148844。
而且，可以通過與合適的可檢測分子標記呈遞肽，使標記的呈遞肽接觸MHC復合體，隨后經(jīng)例如HPLC凝膠過濾膜過濾、免疫吸收或旋轉(zhuǎn)超濾監(jiān)測在預期pH或pH范圍內(nèi)的裝載情況，對呈遞肽和MHC復合體對的裝載pH進行最優(yōu)化?？梢杂脴藴史蛛x技術(shù)將在特定pH或pH范圍有負載的MHC復合體與未裝載的被標記肽分開。通常，將特殊呈遞肽裝載至II類MHC復合體中的最適pH或pH范圍是導致至少約50％(摩爾百分比)，更優(yōu)選60％、70％、80％、90％或更多的II類MHC復合體被該肽結(jié)合的pH或pH范圍。
有多種呈遞肽可被裝載或共價連接(如重組融合)至MHC復合體上。例如，可將OVA(323-339)和HSV-1gD(246-261)呈遞肽融合或裝載至可溶性的sc-IAdMHC II類分子上(參閱例如下文實施例1和3)。其它的合適呈遞肽包括變態(tài)反應(yīng)相關(guān)肽，例如來自昆蟲變應(yīng)原，如室內(nèi)粉塵螨變應(yīng)原DERp I；家畜變應(yīng)原，如貓變應(yīng)原Feld I植物變應(yīng)原，如豚草變應(yīng)原Amba I和AmbaV；和神經(jīng)元鞘蛋白的肽。例如，下文的實施例3提供了氨基酸84-102的免疫顯性MBP表位。令人感興趣的其它可能的呈遞肽包括蛋白脂質(zhì)蛋白(如氨基酸30-49的免疫顯性表位和氨基酸180-199的免疫顯性表位，它們均與MS有關(guān))；來自結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，如與RA相關(guān)的II型膠原的肽；來自酶和肽激素，如谷氨酸脫羧酶和與IDDM相關(guān)的胰島素的肽。
MHC復合體的典型呈遞肽將具有約4-35個氨基酸，優(yōu)選約6-30個氨基酸，更優(yōu)選約8-25個氨基酸。盡管這些肽的DNA序列可用本領(lǐng)域已知技術(shù)容易地測定，但優(yōu)選這樣的呈遞肽由已知序列的DNA編碼。其他合適的呈遞肽包括猜測與變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病或二者均相關(guān)的那些呈遞肽。按下文及PCT申請公開WO 96/04314和WO97/28191中公開的T-細胞試驗，可容易地檢測這樣的肽調(diào)節(jié)T-細胞活性的能力。
如前面所提到，可以多種方式純化本發(fā)明的MHC復合體。例如，基本純的MHC復合體通常優(yōu)選至少90-95％均質(zhì)，對于許多藥物、臨床和研究應(yīng)用來說，最優(yōu)選至少98-99％均質(zhì)。一旦部分純化，或達到制劑中所期望的均一性，則對于治療應(yīng)用來說，MHC復合體應(yīng)基本上無污染物。
還有多種其它純化方法適用于本文公開的sc-II類MHC分子和多特異性MHC分子。例如，可以將諸如EE或myc之類本領(lǐng)域已知的其它標志融合至目的sc-II類MHC分子或多特異性MHC分子上，以制成“被標記”復合體。這樣的“被標記”復合體可用數(shù)種已知的免疫親和方法純化，如應(yīng)用金屬瓊脂糖載體或含能特異結(jié)合該標志并間接與MHC分子結(jié)合之抗體或其抗原結(jié)合片段、優(yōu)選單克隆抗體片段的其它層析載體。還有其它一些已知的蛋白質(zhì)純化方法可用于純化此“標記”分子，如免疫沉淀。這類方法的例子描述于下文實施例7中。
在多數(shù)情況下，本發(fā)明的MHC復合體將能修飾T-細胞之類免疫細胞的活性。一般地，選擇合適的呈遞肽與所需的MHC復合體結(jié)合(通過裝載或重組方法)，以激活肽特異性T細胞應(yīng)答(如細胞因子分泌)。或者，可選擇呈遞肽，以通過例如本文公開方法誘導肽特異性T細胞的凋亡而抑制T-細胞活性。檢測本文公開的MHC復合體的生物活性的幾種試驗描述如下。見下文實施例2、9-13。
更尤其是，本發(fā)明MHC復合體可用于許多治療和相關(guān)應(yīng)用中，包括調(diào)節(jié)各種免疫系統(tǒng)應(yīng)答，如細胞凋亡、變態(tài)反應(yīng)、細胞因子釋放、免疫抑制和免疫細胞誘導。其中特別令人感興趣的是直接或間接影響T-細胞的那些免疫系統(tǒng)應(yīng)答。例如，可檢測帶融合(共價連接)或非共價裝載的呈遞肽的MHC復合體抑制免疫反應(yīng)性T-細胞的能力，方法按諸如實施例11所描述的操作，其中公開了檢測Ig類轉(zhuǎn)換抑制及體內(nèi)T-細胞擴充抑制的方法。這些方法很容易適用于檢測本發(fā)明的幾乎任何MHC復合體抑制體內(nèi)免疫反應(yīng)性T-細胞的能力。
對于某些治療應(yīng)用，可以施用編碼與呈遞肽連接之本發(fā)明所需MHC分子的DNA表達載體，以體內(nèi)表達融合復合體。這樣的方法避免了一般與重組蛋白質(zhì)制備相關(guān)的昂貴純化步驟，并避免了與常規(guī)方法相關(guān)的抗原吸收和加工的復雜性。見下文實施例12。
本發(fā)明還包括體外鑒定T-細胞受體識別分子肽、包括能誘導T-細胞發(fā)育的肽以及能拮抗T-細胞受體的肽，即T-細胞受體(TcR)拮抗劑或部分激動劑的方法。
抑制免疫應(yīng)答的另一種方法涉及施用本文公開的含呈遞肽的一種或多種多特異性MHC復合體有效量，所述呈遞肽是T-細胞拮抗劑或部分激動劑。
現(xiàn)已顯示，若APC還運送共刺激信號，則APC表面上的肽-MHC復合體將只誘導特異于MHC結(jié)合肽之反應(yīng)性T-細胞系的克隆擴充。在缺乏APC送遞的共刺激信號時，人們認為這些反應(yīng)性TH細胞被誘導至變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。分離自APC的可溶性雜三聚肽/MHC II類復合體已顯示可抑制TH細胞的免疫應(yīng)答(Sharma，S.D.等人，1991，美國國家科學院院報8811465-11469；Nicolle，M.W.，1994，臨床研究雜志931361-1369)。
本文公開的含有作為T-細胞受體拮抗劑或部分激動劑的呈遞肽的MHC復合體可作為無共刺激信號的可溶性復合體施用。
此外，本文公開的含有改變了與CD4受體之間結(jié)合情況的被修飾II類β2結(jié)構(gòu)域的MHC復合體也可用于誘導T-細胞至變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。
或者，本發(fā)明MHC復合體可以有效量的含有編碼“全長”MHC融合復合體(即含一個或多個全長MHC蛋白質(zhì)的復合體，該蛋白質(zhì)包括有跨膜部分和與MHC分子共價連接的具拮抗劑或部分激動劑活性的呈遞肽)之DNA載體的DNA序列形式施用。
如上述PCT申請WO 96/04314中所公開的，sc-MHC I類和II類分子可用于檢測和鑒定肽。例如，本發(fā)明包括可用于對T-細胞的未鑒定表位作圖的方法，步驟如下將編碼隨機肽文庫或選定肽的序列克隆入本發(fā)明表達載體系統(tǒng)的呈遞肽位置，如上文鑒定的含編碼sc-MHC復合體的DNA序列及任選地編碼接頭序列的DNA序列的那些表達載體系統(tǒng)?？梢院线m地利用合適cDNA或基因組DNA文庫的限制片段(見Sambrook，等人，見上文，Ausubel等人，見上文)作為插入表達載體的序列的來源，或者將諸如已知序列的合成寡核苷酸之類的選定寡核苷酸用做插入序列。用含基因融合體，即編碼MHC分子的序列與編碼附加肽的序列連接在一起的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主，諸如哺乳動物細胞和上述鑒定的其它細胞。在適當條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并篩選細胞表達按下文公開試驗測得與T-細胞克隆有反應(yīng)性的目的融合復合體的情況。然后挑出反應(yīng)性菌落并分離出載體。對DNA插入物的序列分析將表明哪一種克隆肽序列對應(yīng)于T-細胞克隆所識別的表位?？誷c-MHC分子可以相同方式使用，不同之處僅在于肽是被裝載于空分子上，而非用重組方法加入。本文公開的多特異性MHC復合體的相關(guān)用途在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，條件是對于某些多特異性MHC復合體，將應(yīng)用一種以上的合適載體，這些載體將編碼多特異性MHC復合體的適當部分。
用體外或體內(nèi)試驗可容易地測定sc-MHC分子(帶負載或融合的呈遞肽)調(diào)節(jié)T-細胞受體活性(包括T-細胞應(yīng)答失活)的能力。一般地，用于這些試驗的T-細胞可由T-細胞雜交瘤之類的轉(zhuǎn)化T-細胞系或分離自哺乳動物(如人或小鼠之類嚙齒類動物)的T-細胞提供。其它的合適T-細胞包括1)可公開獲得或可用已知方法制備的T-細胞雜交瘤，2)T輔助細胞，及3)T細胞毒性細胞，優(yōu)選細胞毒性CD4+細胞。T-細胞可用已知方法從哺乳動物中分離。見例如R.Shimon kevitz等人，實驗醫(yī)學雜志158303(1983)及下文的實施例。體外試驗的合適例子已公開于PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191中。具體地說，公開的各PCT申請公開了使用含空的或有負載的肽結(jié)合位點的sc-MHCII類分子以及含重組融合呈遞肽的分子的試驗和方法。從下文應(yīng)當理解，公開于已公開的各PCT申請中的試驗和使用方法可容易地適于本發(fā)明的MHC復合體。本發(fā)明多特異性MHC復合體的相關(guān)用途前已公開，它們也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
下面是測定含融合肽的本發(fā)明MHC復合體是否能調(diào)節(jié)T-細胞活性的典型試驗。應(yīng)當理解，該試驗適于多種MHC復合體，諸如本文公開的那些有負載MHC復合體。該試驗通常按下文的相繼步驟1-4進行。T-細胞適當?shù)乇磉_可被檢測并顯示T-細胞激活或激活后T-細胞活性調(diào)節(jié)的標記。因而，例如下文實施例2和9中所公開的，可應(yīng)用激活時表達白介素-2(IL-2)的小鼠T-細胞雜交瘤DO 11.10。檢測IL-2濃度以確定具體的呈遞肽是否能調(diào)節(jié)此T-細胞雜交瘤的活性。這樣的合適試驗通過以下順序步驟進行1.從諸如感興趣的T-細胞雜交瘤中得到或從哺乳動物中分離攜有特異于肽/MHC復合體的T-細胞受體的T-細胞。
2.在允許增殖的條件下培養(yǎng)T-細胞。
3.將增殖的T-細胞與所選的MHC融合復合體接觸。
4.使T-細胞與抗原呈遞細胞接觸以提供激活必需的信號，并分析標志，例如檢測IL-2的生產(chǎn)。IL-2產(chǎn)量增加，如24小時后IL-2產(chǎn)量增加100％或更多，更通常的是24小時后IL-2產(chǎn)量增加1000％或更多，表明MHC融合復合體可調(diào)節(jié)T-細胞的活性并能抑制免疫應(yīng)答。下文實施例9舉例說明了這樣的一個試驗。該試驗適用于分析不含跨膜部分的可溶性截短MHC復合體的活性。此外，該試驗適用于鑒定含有作為T-細胞受體拮抗劑或部分激動劑起作用的共價連接呈遞肽的MHC融合復合體。該試驗還可方便地與本發(fā)明的有負載MHC復合體一起使用。
在適于增殖的條件下溫育試驗中所用的T-細胞。例如，將DO11.10T細胞雜交瘤在約37℃和5％二氧化碳中適當溫育于完全培養(yǎng)基(補充有10％FBS、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和5×10-5M 2-巰基乙醇的RPMI1640)中。將系列稀釋的MHC融合復合體加入T-細胞培養(yǎng)基中。加至T-細胞中的MHC融合復合體的合適濃度一般在10-12-10-6M范圍內(nèi)。T-細胞活化信號由已裝載適當抗原性肽的抗原呈遞細胞提供。我們認為，最好使用產(chǎn)生稍低于最大T-細胞活化的抗原劑量和APC數(shù)來檢測MHC融合復合體對T-細胞應(yīng)答的抑制。與MHC融合復合體接觸后IL-2產(chǎn)量的降低表明融合復合體可調(diào)節(jié)T-細胞的活性并能抑制免疫應(yīng)答。
或者，不檢測諸如IL-2之類表達蛋白質(zhì)，而可以通過用本領(lǐng)域接受的放射標記技術(shù)檢測抗原依賴型T-細胞增殖的變化，適當?shù)販y定T-細胞活化的調(diào)節(jié)。例如，可以向試驗培養(yǎng)基中導入標記(如氚標記的)核苷酸。由該標記核苷酸摻入DNA的情況可測量T-細胞的增殖。此試驗不適于生長不需抗原呈遞的T-細胞，如T-細胞雜交瘤。它適于檢測MHC融合復合體對分離自哺乳動物之未轉(zhuǎn)化T-細胞的T-細胞活化調(diào)節(jié)。與MHC復合體接觸后T-細胞增殖水平降低表明融合復合體可調(diào)節(jié)T-細胞的活性并能抑制免疫應(yīng)答。對于測量MHC融合復合體對體內(nèi)T-細胞克隆擴充中抗原特異性改變的影響，優(yōu)選體外T-細胞增殖試驗。
這些體外試驗可用于選擇和鑒定由隨機文庫之DNA或其他寡核苷酸編碼的、能調(diào)節(jié)T-細胞受體活性(包括T-細胞發(fā)育的活化或抑制)的肽。具體地說，可以將編碼隨機肽文庫或所選肽的DNA序列克隆入表達載體系統(tǒng)的呈遞肽位置，所述載體例如是上文鑒定的含編碼MHC分子之DNA序列及任選的編碼接頭序列的DNA序列的載體系統(tǒng)。適當?shù)?，可以將基因組DNA文庫中適當eDNA的限制片段(見Sambrook等人，上文)用作插入表達載體中的序列的來源，或者，將諸如已知序列的合成寡核苷酸之類的所選寡核苷酸用作插入序列。用含基因融合體，例如編碼MHC復合體的序列與編碼呈遞肽的序列連接在一起的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，如哺乳動物細胞和上文所鑒定的其他細胞。在合適條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并通過與所選擇的T-細胞接觸而篩選細胞表達目的MHC復合體的情況。上述試驗，例如測量IL-2產(chǎn)量或T-細胞增殖的試驗，可用于測定是否與MHC復合體接觸可調(diào)節(jié)T-細胞活化。例如，APC刺激的T-細胞的IL-2產(chǎn)量增加可鑒定出那些能調(diào)節(jié)T-細胞活性的MHC融合復合體?；蛘?，可用體外試驗鑒定上文所述的多價MHC復合體，其中包含可增強T-細胞應(yīng)答的呈遞肽。
也可合適地使用體內(nèi)試驗測定MHC復合體調(diào)節(jié)T-細胞活性的能力，包括抑制或鈍化T-細胞發(fā)育的能力。例如，可分析MHC融合復合體抑制免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(即IgM變成IgG)的能力(參閱如P.Linsley等人，科學，257792-795(1992))。這樣的試驗特別描述于下文實施例13中。
還提供了使用含MHC融合分子之本發(fā)明MHC復合體的診斷方法，包括體內(nèi)診斷成像和HLA定型(參閱如A.K.Abbas，細胞和分子免疫學(Cellular and Molecular Immunology)，328頁(W.B.Saunders Co.1991))。例如，用于體內(nèi)成像時，可以給哺乳動物施用具放射性標記(如125I，32P，99TC)或其他可檢測標記的MHC融合分子，并對受試者用已知方法掃描MHC分子的結(jié)合情況。這樣的哺乳動物分析可有助于許多失調(diào)的診斷和治療，包括例如此處公開的不期望有的免疫應(yīng)答的診斷和治療。
含空肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明MHC復合體，例如本文公開的空sc-MHC II類分子，可用于篩選非共價結(jié)合于MHC分子的肽結(jié)合溝或裂縫中的呈遞肽。這樣的篩選可用于鑒定那些可結(jié)合特殊MHC分子，例如IAd、DR1、IE、DP和DQ之類II類MHC分子的呈遞肽。例如，可用可檢測標志(例如，125I、生物素或本文公開的其它蛋白質(zhì)標志)修飾sc-IAd/空分子，然后用于篩選隨機肽文庫。標記蛋白質(zhì)和篩選文庫的方法是眾所周知的(參閱例如Sambrook等人，見上文，和Ausubel等人，見上文，John Wiley & Sons，紐約，1989；此處引用作為參考)。多種隨機肽文庫中的任何一種均可被適當?shù)貞?yīng)用[參閱如J.Scott等人，科學，249386(1990)；J.Devlin等人，科學，249404(1990)；S.Cwirla等人，PNAS(USA)，876378(1990)；J.Hammer等人，實驗醫(yī)學雜志，1761007(1992)；D.O′Sullivan等人，免疫學雜志，1472663(1991)]。能結(jié)合sc-IAd/空分子的肽可用于制備相應(yīng)的有負載分子。然后可在此處所述的任何T-細胞試驗中檢測有負載分子，以察看被鑒定肽是否能調(diào)節(jié)T-細胞活性。
還可利用試驗評估本發(fā)明MHC復合體治療免疫失調(diào)的潛在用途。例如，實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是小鼠中的自身免疫疾病，是已被接受的多發(fā)性硬化癥模型。可以處理合適的小鼠品系，以產(chǎn)生EAE，然后施用MHC融合復合體，并評估動物以確定施用MHC融合復合體后EAE的發(fā)展是否被抑制或阻止。這樣的試驗具體描述于PCT申請公開WO 96/04314和WO 97/28191中。
本發(fā)明MHC復合體誘導免疫應(yīng)答的能力，包括對所針對疾病的免疫接種，可以用體內(nèi)試驗容易地測定。例如，可給諸如小鼠之類的哺乳動物施用包括融合重組肽的本發(fā)明MHC復合體或編碼MHC融合復合體的DNA，在最初用藥時及其周期性地多數(shù)(如在施用融合復合體或DNA后2、5和8周時)從哺乳動物獲取血樣。從血樣中收集血清并測定由免疫接種引起的抗體的存在情況。并可測定抗體濃度。下文實施例12和13具體描述了這樣的試驗。
在某些情況下，直接施用編碼本發(fā)明MHC復合體、尤其是包括融合呈遞肽的MHC復合體的DNA構(gòu)建體，以在受試細胞中表達復合體是有用的。例如，可以將攜帶含融合呈遞肽之MHC復合體的編碼區(qū)、并適當?shù)靥幱谥T如CMV啟動子之類恰當啟動子和任選增強子的控制下的DNA直接注射入被試者骨骼肌中。為了保證MHC融合分子的展示將引起被試者體內(nèi)的免疫應(yīng)答，優(yōu)選將編碼共刺激因子的DNA載體與編碼MHC呈遞肽融合體的DNA一起施用于被試者。優(yōu)選共施用的DNA載體包括例如含有處于CMV啟動子控制下的CD80或CD86編碼區(qū)的那些載體。所表達的CD80和CD86蛋白質(zhì)可提供共刺激信號，以協(xié)助啟動免疫應(yīng)答。
誘導諸如哺乳動物之類被試者中免疫應(yīng)答的這種方法具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法的優(yōu)越之處。外源蛋白質(zhì)抗原呈遞中的起始步驟是天然抗原與抗原呈遞細胞(APC)的結(jié)合。在結(jié)合至APC后，抗原通過吞噬作用、受體介導的胞吞或胞飲進入細胞。這樣的內(nèi)化抗原被定位到胞內(nèi)膜結(jié)合小泡(稱為內(nèi)體)中。內(nèi)體-溶酶體融合后，抗原被位于溶酶體中的細胞蛋白酶加工成小肽。該肽與這些溶酶體內(nèi)的MHC II類分子的α和β鏈相聯(lián)系。事先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的這些MHC II類分子被相繼轉(zhuǎn)運至高爾基復合體、然后至溶酶體區(qū)室中。肽-MHC復合體被展示在APC的表面，以進行T和B細胞的活化。因而，抗原內(nèi)蛋白水解加工位點的可接近性、溶酶體中所產(chǎn)生肽的穩(wěn)定性及肽對MHC分子的親和性是具體表位免疫原性的決定因素。這些因素不會因施用佐劑而改變。然而，直接表達MHC融合復合體(即MHC直接共價連接至呈遞肽上)應(yīng)避免了這樣的復雜情況，能誘導針對MHC融合分子上所攜帶表位的免疫應(yīng)答。
然而，不采取直接給受試者施用編碼MHC復合體的DNA，而可以給受試者施用已引入這種DNA的宿主相容性抗原呈遞細胞。也就是說，可以將編碼本發(fā)明一種或多種MHC復合體的DNA引入宿主相容性抗原呈遞細胞中，并將該轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的抗原呈遞細胞施用于目標宿主，因位點的定向性，將發(fā)生與適當T-細胞的最有效相互作用。通過施用于被試者，這種設(shè)計細胞可在體內(nèi)于細胞表面上表達該DNA編碼的MHC復合體?？山o被試者施用這種工程化細胞，以便如本文所公開誘導免疫應(yīng)答或抑制免疫應(yīng)答，這取決于細胞中其它共刺激信號的表達。也就是說，如果通過服用，細胞可在缺乏有效量共刺激信號或存在有效量耐受誘導信號的條件下提供MHC復合體，或者提供含有具拮抗劑或部分激動劑活性之呈遞肽的MHC復合體，則可將該細胞施用于宿主以抑制免疫應(yīng)答。例如，表達于細胞表面上、能與T細胞上的耐受誘導型受體(如CTLA-4或Fas)相互作用的因子，可提供有效量的耐受誘導信號?；蛘?，如果細胞在有有效量共刺激信號存在時可提供MHC復合體，例如細胞表面上表達諸如B7或B7-2之類的T-細胞共刺激因子，則可將該細胞施用于哺乳動物宿主以誘發(fā)哺乳動物中的免疫應(yīng)答，如本文所公開。優(yōu)選構(gòu)建如上述編碼MHC復合體的兩條鏈、以及T-細胞共刺激因子(如果應(yīng)用的話)的表達載體，并將該載體引入宿主相容性APC中，以制備可供施用的細胞。
本領(lǐng)域人員應(yīng)當認識到，術(shù)語“宿主相容性”抗原呈遞細胞意指與待引入該細胞的被試者或“宿主”屬于相同單元型的抗原呈遞細胞。優(yōu)選轉(zhuǎn)化的宿主相容性抗原呈遞細胞是能遷移至已引入該細胞的被試者的淋巴結(jié)，并能在此位置表達MHC復合體的那些細胞。
本發(fā)明的MHC復合體及編碼這種復合體的DNA構(gòu)建體具有許多治療用途。例如，可以施用MHC II類融合復合體以抑制哺乳動物的免疫應(yīng)答，例如治療患有或易患自身免疫失調(diào)(諸如多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病、類風溫性關(guān)節(jié)炎，等等)的哺乳動物，包括人。還適于治療那些遭受或可能遭受不期望有的免疫應(yīng)答的被試者，例如進行諸如心臟、腎、皮膚或其它器官移植之類的某類型外科移植手術(shù)的病人。在這樣的情況下，治療方案在外科手術(shù)之前開始比較合適。
依據(jù)本發(fā)明，有許多獨特的方法可用于抑制哺乳動物的免疫應(yīng)答。
具體地說，如上所述，在已公開的PCT申請中已顯示，若還送遞諸如來自抗原呈遞細胞的共刺激信號，則MHC分子將只誘導T-細胞系特異的克隆擴充。在缺乏共刺激信號，或至少缺乏送遞T-細胞增殖有效量的這種T-細胞共刺激信號時，該T-細胞將被誘導至變態(tài)反應(yīng)或細胞凋亡狀態(tài)，導致克隆缺失。
因此，在用于抑制免疫應(yīng)答的一種治療方法中，通過在基本缺乏任何共刺激信號的條件下施用有效量的一種或多種本發(fā)明MHC II類復合體，例如MHC融合復合體從而誘導對特異T-細胞的變態(tài)反應(yīng)并有效抑制不希望有的免疫應(yīng)答。例如，可以施用“截短的”可溶性MHC復合體，即不含跨膜部分的MHC復合體?？商禺愑诓幌Ｍ忻庖邞?yīng)答的T細胞選擇被施用的可溶性MHC融合復合體的呈遞肽，以誘導關(guān)于那些T-細胞的變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。用上文鑒定的體外方案可容易地鑒定和選擇這樣的呈遞肽。
本發(fā)明的MHC復合體可通過注射，如腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射適當?shù)匾氩溉閯游?。局部用藥，例如滴眼液，及通過鼻或肺吸入施用也應(yīng)是有可能的。MHC復合體，至少用于治療用途的那些復合體，可在哺乳動物細胞中生產(chǎn)并在使用前純化，以使其基本上或完全無任何細菌物或致熱原。具體治療應(yīng)用的最適劑量可用常規(guī)方式測定。
本發(fā)明的MHC復合體，包括含有融合呈遞肽的那些復合體，可以在含有融合復合體的治療或藥物組合物中被適當?shù)匾胧茉囌?特別是人或家畜，如牛之類的哺乳動物)?？梢园幢绢I(lǐng)域已知方法制備和使用本發(fā)明的這種藥物組合物。例如，可在單位劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿和小瓶中)中提供含治療有效量MHC復合體的制劑，并可保存于凍干條件下，只需在臨用前加入無菌液體載體(如對于注射來說是水)即可。對許多用途還優(yōu)選用脂質(zhì)體配方。腸胃外施用的其它組合物也比較合適，包括含水或不含水的無菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使藥劑與預期接受者的血液等滲的溶質(zhì)；含水和不含水的無菌懸液，其中可包括懸浮劑和增稠劑。
在用于抑制免疫應(yīng)答的另一種治療方法中，施用含有不能有效補充T-細胞上TCR-CD4受體的被修飾II類β2結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明MHC復合體。使T-細胞受體與肽-MHC復合體相互作用而阻斷與CD4的結(jié)合時，可導致部分激動劑T-細胞信號傳導和T-細胞變態(tài)反應(yīng)(Madrenas等人，實驗醫(yī)學雜志，185219-229(1997))。MHC融合復合體可如上述裝載了呈遞肽或共價連接了呈遞肽。MHC融合復合體可以是缺少全部或部分跨膜部分的截短形式，并可作為可溶性蛋白質(zhì)如上所述施用?；蛘?，MHC融合復合體可以是全長的，即包含跨膜蛋白質(zhì)。用這些復合體進行的治療包括給哺乳動物施用有效量的包含編碼本發(fā)明全長MHC融合復合體之DNA載體的DNA序列，所述全長MHC融合復合體含有被修飾的II類β2結(jié)構(gòu)域?；蛘?，治療將包括給哺乳動物施用有效量的在表面上表達本發(fā)明全長MHC融合復合體的細胞，所述全長MHC融合復合體含有被修飾的II類β2結(jié)構(gòu)域。
用于抑制免疫應(yīng)答的另一種治療方法包括施用本發(fā)明的多特異性MHC復合體，該多特異性MHC復合體含有MHC復合體和與T-細胞上的耐受誘導受體可相互作用的一種或多種附加結(jié)合活性。例如，附加的結(jié)合活性可由與T-細胞表面蛋白質(zhì)(如CTLA-4或Fas)有特異性相互作用的蛋白質(zhì)或肽，諸如單鏈抗體或FasL所決定。CLTA-4與Fas的作用導致T-細胞功能的下調(diào)或T-細胞的凋亡。MHC復合體可以如上所述用呈遞肽裝載或共價連接呈遞肽。多特異性MHC復合體可以是缺少跨膜部分的截短形式，并可作為如上所述的可溶性蛋白質(zhì)施用。
用于抑制免疫應(yīng)答的另一種治療方法涉及施用含有共價連接的呈遞肽的本發(fā)明MHC復合體，該呈遞肽是T-細胞受體拮抗劑或部分激動劑(參閱A.Sette等人，免疫學年鑒(Annu.Rev.Immunol.)，12413-431(1994))。MHC融合復合體可以是截短的形式并可作為如上所述的可溶性蛋白質(zhì)施用?；蛘撸揗HC融合復合體可以是全長的，即包含跨膜部分。用這些復合體進行的治療將包括給哺乳動物施用有效量的含有DNA載體的DNA序列，所述DNA載體編碼本發(fā)明的全長MHC融合復合體及作為TCR拮抗劑或部分激動劑的呈遞肽。參閱例如以上論述及關(guān)于這種MHC融合復合體的制備及其免疫抑制治療用途的下文實施例3、11-13。作為TCR拮抗劑或部分激動劑的呈遞肽可用上文鑒定的體外方法容易地鑒定和選擇。含有作為T-細胞受體拮抗劑或部分激動劑的MHC融合復合體特別優(yōu)選用于治療變態(tài)反應(yīng)和自身免疫疾病，諸如多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病和類風濕性關(guān)節(jié)炎。
此外，如上文及PCT申請WO 96/04314中所討論的，可以給受試者施用已導入了編碼本發(fā)明MHC復合體的DNA的宿主相容性抗原呈遞細胞，以抑制免疫應(yīng)答。通過施用，細胞在缺乏有效量T-細胞共刺激信號時可表達MHC復合體，即誘導T-細胞變態(tài)反應(yīng)，和/或被施用的細胞表達含有具拮抗劑或部分激動劑活性之連接呈遞肽的MHC融合復合體。
本發(fā)明的不同免疫抑制療法也可以與諸如抗炎癥藥之類的其他已知免疫抑制劑聯(lián)合使用，以達到對T-細胞介導失調(diào)的更有效治療。例如，可以將免疫抑制性MHC融合復合體與諸如皮質(zhì)類固醇和非類固醇藥物之類抗炎癥劑聯(lián)合使用，以治療自身免疫失調(diào)和變態(tài)反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了在諸如人之類哺乳動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括給人之類哺乳動物接種疫苗以抗感染性因子或癌癥之類的所針對疾病，尤其是黑素瘤癌癥，或瘧疾之類的其它失調(diào)。
這些方法包括給哺乳動物施用有效量的含DNA載體之DNA序列，該DNA載體編碼含跨膜部分的本發(fā)明MHC復合體，和/或施用含跨膜部分的這種MHC融合復合體和/或施用含編碼這種MHC復合體之DNA的宿主相容性抗原呈遞細胞。MHC復合體表達載體的制備如上文及以下實施例1-3中所述。施用質(zhì)粒DNA、接受給藥的被試者細胞攝取該DNA及蛋白質(zhì)的表達方法均已被報道(參閱J.Ulmer等人，科學，2591745-1749(1993))。
在一種作為例證的方法中，將編碼MHC復合體的DNA與編碼T-細胞共刺激因子的DNA、如編碼CD80或CD86的DNA，一起施用于哺乳動物。CD80基因及其表達描述于D.Harlant等人，美國國家科學院院報，913137-3141(1994)中。通過被試者細胞攝入該DNA，將表達T-細胞共刺激因子并能提供共刺激信號，從而協(xié)助免疫應(yīng)答的起始。參閱已公開的PCT申請及未決的美國申請關(guān)于涉及含CD80或CD86基因之表達載體構(gòu)建的內(nèi)容。
盡管如上所述給人之類哺乳動物施用編碼MHC復合體的DNA是引起被試者中免疫應(yīng)答的一種方法，MHC復合體還可通過其它途徑適當?shù)厥┯?。因此，如上所述，可以給被試者施用已引入編碼MHC復合體之DNA的宿主相容性抗原呈遞細胞，以誘發(fā)免疫應(yīng)答。通過施用，細胞在有有效量的T-細胞共刺激信號如CD80或CD86存在下表達MHC復合體，以引起免疫應(yīng)答，和/或被施用的細胞表達能引起免疫應(yīng)答的全長MHC復合體，例如由下文實施例詳述的操作測得T-細胞增殖增加所顯示。
或者，可以給受試者直接施用能引起免疫應(yīng)答的本發(fā)明合適MHC復合體，例如，含有能刺激或誘導T-細胞增殖之共價連接的抗原呈遞肽的MHC復合體。盡管按需要可以在一些應(yīng)用中使用空的或有負載的復合體，但通常MHC復合體將包括重組融合的呈遞肽。
用于引起免疫應(yīng)答的另一種治療方法涉及施用本發(fā)明的多特異性MHC復合體，該多特異性MHC復合體包含MHC復合體及一種或多種能與T-細胞上的共刺激受體相互作用的附加結(jié)合活性。例如，這種附加結(jié)合活性可由能與諸如CD28之類T-細胞表面蛋白特異相互作用的蛋白質(zhì)或肽，如單鏈抗體、CD80或CD86所確定。由CD28提供的共刺激信號決定了TCR參與的結(jié)果，因為它們能增強T-細胞的增殖及效應(yīng)細胞的功能，諸如細胞因子產(chǎn)生和細胞溶解。如上所述，MHC復合體可裝載了呈遞肽或共價連接了呈遞肽。如上所述，多特異性MHC復合體可以是缺少跨膜部分的截短形式，并作為可溶性蛋白質(zhì)施用。
本發(fā)明誘導免疫應(yīng)答的方法，包括給被試者接種疫苗以抵抗目標疾病，可與誘導免疫應(yīng)答的已知方法聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的sc-MHC II類復合體或編碼這種MHC復合體的DNA構(gòu)建體可與疫苗組合物配合或混合施用于被試者，以提高或延長這種疫苗組合物的所需效果。
此外，本發(fā)明的MHC復合體、編碼這種復合體的DNA載體和含這種DNA載體的宿主相容性抗原呈遞細胞均可通過多種其他途徑施用于被試者。例如為了誘發(fā)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將編碼抗原性MHC融合復合體的DNA載體單獨或與編碼共刺激因子的DNA一起皮內(nèi)施用于被試者。這樣的給藥會導致皮內(nèi)抗原呈遞細胞(如樹突細胞)的轉(zhuǎn)化和T-細胞的增殖。MHC融合復合體及編碼這種融合復合體的DNA載體還可通過其他途徑施用于被試者，如口服或經(jīng)皮方式。
除了治療人類疾病之外，本發(fā)明的MHC復合體，諸如包括融合呈遞肽的那些復合體，和編碼這種復合體的DNA構(gòu)建體將對獸醫(yī)應(yīng)用具有重要價值，例如，可用于治療牛、綿羊等之類家畜和狗、貓之類寵物的失調(diào)。
盡管本文公開的MHC復合體或編碼這種復合體的DNA構(gòu)建體可單獨施用于被試者，它們也可作為藥物組合物的一部分使用。藥物組合物通常包含一種或多種本發(fā)明MHC復合體或編碼這種復合體的DNA構(gòu)建體，還含有一種或多種可接受載體。載體必須是“可接受的”，即與配方中的其它成分相容并對其接受者無害。例如，對于腸胃外用藥，諸如注射藥方，可制備含水的無菌溶液或懸浮液，或其它藥學可接受溶液。這樣的藥物組合物可用本領(lǐng)域已知方法適當?shù)刂苽洹?br> 具體治療中所用的具體MHC復合體或編碼它的DNA構(gòu)建體的實際優(yōu)選用量將隨以下因素而變化所用的具體活性化合物，配制的具體組合物，運用模式，施用的具體位置，病人體重，總體健康狀態(tài)，性別等等，被治療的具體病癥，等等，及包括護理醫(yī)生或獸醫(yī)在內(nèi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的其它這種因素。具體給藥方案的最適給藥比率可由本領(lǐng)域技術(shù)人員用如前述原則及此處公開試驗所進行的常規(guī)劑量測定實驗容易地決定。
如前文所述，本發(fā)明的空MHC復合體，如空sc-MHC II類復合體，可與合適的呈遞肽混合以形成本發(fā)明有負載的sc-MHC復合體。應(yīng)當理解，這樣的有負載復合體在如上所述需要施用MHC肽融合復合體的某些情況中可以合適地應(yīng)用。在使用編碼MHC肽融合復合體之DNA構(gòu)建體的情況下，可應(yīng)用一種或多種編碼合適空單鏈MHC復合體的DNA構(gòu)建體，條件是提供合適呈遞肽非共價結(jié)合至空MHC分子的肽結(jié)合溝或裂縫中的合適條件。用于結(jié)合合適呈遞肽至空單鏈MHC分子上的條件的例子更完整地論述于下文。本發(fā)明的有負載MHC復合體，如有負載的MHC II類肽融合復合體，在如上所述人、家畜和寵物失調(diào)的治療中有一定用途。
應(yīng)當理解，本發(fā)明的MHC復合體可按PCT申請公開WO 96/04314中所述方法用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠株系。這樣的小鼠株系可作為例如其中T-細胞之類特異免疫細胞活性可被調(diào)節(jié)的模型系統(tǒng)。
術(shù)語“特異結(jié)合”或類似術(shù)語意指按照如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、RIA、凝膠遷移率變動分析、酶免疫試驗、競爭試驗、飽和試驗或本領(lǐng)域已知的其它合適蛋白質(zhì)結(jié)合試驗所測定，本文公開的分子能與另一分子結(jié)合，從而形成特異結(jié)合對，但它不識別和結(jié)合其他分子。關(guān)于檢測蛋白質(zhì)之間特異結(jié)合的合適常規(guī)方法，通常參閱Ausubel等人，見上文，Sambrook等人，見上文，和Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，CSH Publications，紐約(1988)。
還應(yīng)理解，“啟動子”意指在基因轉(zhuǎn)錄起始前轉(zhuǎn)錄酶復合體結(jié)合其上的DNA區(qū)段。為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，優(yōu)選的啟動子包括由Ohashi等人在“細胞”65，305-317(1991)中所描述的IAd啟動子和大鼠胰島素啟動子。
本文所提及的所有文件均全文在此引用作為參考。
以下非局限性實施例用以說明本發(fā)明。實施例1 帶有一個TM結(jié)構(gòu)域的單鏈II類MHC分子(sc-IAd/OVA)的構(gòu)建和細胞表面表達根據(jù)本文所述方法，用以下方法制備sc-IAd/OVA融合分子(見圖1和SEQ ID NO24和25)進行逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，從分離自A20-1.11細胞的總RNA中擴增IAdα和β鏈基因片段[K.Kim等人，免疫學雜志，122546(1979)]。為了便于克隆，通過PCR在基因片段兩端引入合適的限制酶位點。通過PCR，將編碼一個10氨基酸肽接頭的DNA序列引入β1-β2基因片段的5’末端，并將Kozak共有序列引入β信號序列的5’末端。編碼24氨基酸接頭及OVA抗原性肽的區(qū)域由退火寡核苷酸產(chǎn)生。在pBlueScript-II載體(Stratagene)中裝配PCR片段和雙鏈寡核苷酸，產(chǎn)生sc-IAd融合基因(見圖1和SEQ ID NO 24)。為了進行哺乳動物表達，通過亞克隆sc/IAd-OVA基因(包括α鏈TM和胞質(zhì)區(qū)域)到pEE13(Cell Tech)中CMV啟動子的下游，產(chǎn)生pSCT1載體。pEE13載體還攜帶有可選擇的谷氨酸合成酶基因。
用以下方法檢測sc-IAd/OVA融合分子的細胞表面表達情況選擇被攜有sc-IAd/OVA融合基因之表達載體轉(zhuǎn)染了的漿細胞瘤NS-O細胞，并用流式細胞儀檢查II類分子的表面表達情況。用攜帶sc-IAd/OVA融合基因的線性pSCT1 DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)染NS-O細胞。通過生長于無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中選擇細胞。14-21天后，轉(zhuǎn)染子(即T12細胞)變得比較明顯，對其分析II類MHC分子的表面表達情況。用FITC偶聯(lián)的抗IAdmAb(AMS-32.1；PharMingen)染色細胞，并用流式細胞儀檢查熒光。用同型配對的FITC偶聯(lián)抗IAkmAb(10-3.6；PharMingen)作為陰性對照。
圖2A顯示了有功能的單鏈融合分子的細胞表面表達。用IAd和抗IAkmAb，通過流式細胞儀分析穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。T12轉(zhuǎn)染子的結(jié)果與其它三個獨立轉(zhuǎn)染子中所見相似(m.f.i.＝平均熒光強度)。結(jié)果證明在轉(zhuǎn)染了sc-IAd/OVA表達載體的細胞表面上sc-IAd/OVA的表達增強。對于II類分子的細胞表面表達，不需要有完整的βTM結(jié)構(gòu)域；連接β和α鏈的柔性接頭可代替βTM結(jié)構(gòu)域的功能。最后，結(jié)果還證明共價連接呈遞肽至單鏈MHC II類分子上促進了MHC分子的穩(wěn)定裝配和表面表達。連接呈遞肽至β鏈上還能使得單鏈MHC融合分子進行穩(wěn)定裝配和細胞表面表達。實施例2 細胞表面sc-IAd/OVA融合復合體誘導體外T-細胞應(yīng)答為了檢查OVA肽是否正確折迭進入sc-IAd融合復合體，測定sc-IAd/OVA轉(zhuǎn)染細胞刺激T-細胞的能力。其中使用表達T-細胞受體(TcR)的小鼠T-細胞雜交瘤(DO 11.10)。TcR識別IAd前后序列中的OVA323-339肽。當這些細胞的TcR與APC(在此是sc-IAd/OVA轉(zhuǎn)染子)相互作用時，DO11.10細胞分泌白介素-2(IL-2)。在存在T12轉(zhuǎn)染子之NS-O細胞(1×105/孔)的條件下培養(yǎng)DO11.10細胞(2×105/孔)24小時，并用IL-2特異ELISA(PharMingen)測定釋放入培養(yǎng)基中的IL-2。用作為抗原呈遞陽性對照的20mM OVA 323-339脈沖處理帶有小鼠IAd的B細胞淋巴瘤A20-1.11(1×105/孔)[K.Kim等人，免疫學雜志，122549(1979)]。在只有T12細胞的培養(yǎng)基中未檢測到IL-2。如圖2B所示，NS-O細胞(未轉(zhuǎn)染)不能刺激DO11.10細胞，而轉(zhuǎn)染了sc-IAd/OVA融合基因的細胞很強地刺激DO11.10細胞釋放IL-2。這些結(jié)果與對另兩個sc-IAd/OVA轉(zhuǎn)染子觀察到的相似。IL-2分泌的程度與對用OVA肽脈沖的帶IAd的APC觀察到的相當。結(jié)果證明OVA肽正確折疊到sc-IAd融合復合體中，并且IAd前后序列中的折迭OVA肽能被DO11.10細胞表面上的TcR識別。實施例3單鏈II類分子基因和單鏈II類-IgG CL融合基因的構(gòu)建使用兩種不同的IAd限制性肽來自小雞卵清蛋白(Buus，S.等人，科學2351353(1987))的OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQID NO26))和來自HSV-1糖蛋白D(Grammer，S.F.，等人，免疫學雜志145249(1990))的gD 246-261(APYSTLLPPELSETP(SEQ ID NO27))。將編碼這些肽的寡核苷酸插入sc-IAd基因中信號肽序列和肽接頭之間(見例如圖1和3A、B)。構(gòu)建產(chǎn)生的融合基因編碼不帶肽(sc-IAd/空分子)、帶有OVA 323-339肽(sc-IAd/OVA)或gD 246-261肽(sc-IAd/gD)的sc-IAd融合蛋白質(zhì)。
此實施例所述載體制備的詳細方案如圖3A-3N中所示。構(gòu)建中用于sc-II類基因上的引物表如表1所示。進行逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)，從分離自A20-1.11細胞的總RNA擴增IAdα和β鏈基因片段。以下寡核苷酸對用于開始的PCR擴增IAdβ前導序列基因片段-OPR132(SEQ ID NO2)，OPR 133(SEQ ID NO3)；IAdβ1-β2基因片段-OPR102(SEQ ID NO4)，OPR104(SEQ ID NO5)；和IAdα1-α2-OPR100(SEQ ID NO6)，OPR101(SEQ ID NO7)。為了便于片段克隆，在隨后的PCR擴增中于基因片段兩端引入限制位點。通過PCR，將編碼10氨基酸肽接頭的序列引入β1-β2基因片段的5′端，將Kozak共有序列(SEQ ID NO1)引入β信號序列的5′端。由退火寡核苷酸得到編碼24氨基酸接頭和抗原肽的區(qū)域。在pBlueScript-II中裝配PCR片段及雙鏈寡核苷酸，得到sc-IAd融合基因，如圖3A和3B中所示。
為了進行可溶性表達，sc-II類融合基因編碼用于正確分泌和加工的信號肽、插入抗原性或自身反應(yīng)性肽的區(qū)域、肽接頭序列、II類β1-β2結(jié)構(gòu)域、單鏈肽接頭序列和II類α1-α2結(jié)構(gòu)域。為了便于純化和使sc-II類分子能夠結(jié)合連接蛋白質(zhì)和/或效應(yīng)分子，可以將附加的序列插入II類α1-α2結(jié)構(gòu)域之后。所述序列包括編碼6組氨酸殘基(6×His或6H)、抗體標志序列(EE標志)或IgG CL結(jié)構(gòu)域的那些序列。
例如，sc-IAd-IgG Cκ融合構(gòu)建體的制備進行如下用寡核苷酸引物IADF100(SEQ ID NO8)、IADB100(SEQ ID NO9)PCR擴增OVA-IAdβ1-β2-sc接頭-IAdα1-α2模板(見實施例1)。這些反應(yīng)在OVA序列5′端加上了EcoRV位點，在α2序列3′端加上了κ外顯子/內(nèi)含子序列和BstB I位點。將sc-IAd/OVA PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中并驗證序列。然后將融合基因亞克隆入帶CMV啟動子、小鼠IgG κ前導序列、克隆區(qū)、小鼠κ內(nèi)含子和小鼠κ恒定區(qū)外顯子序列的哺乳動物表達載體pSUN6(描述如下)。產(chǎn)生的載體被稱為pIADK。
1.將多發(fā)性硬化癥相關(guān)基因插入II類MHC分子將多發(fā)性硬化癥相關(guān)的HLA-DR2(1501)基因連接成類似于sc-IAd基因的單鏈形式(見圖4A和4B)。sc-DR2基因產(chǎn)物可與多發(fā)性硬化癥相關(guān)肽，如MBP(83-102)Y83Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(SEQ ID NO28)復合(共價或非共價)(Arimilli，S.等人(1995)，生物化學雜志270971)。如先前所述(見PCT申請公開WO96/04314)分離DRA1*0101 α1 α2基因片段(編碼氨基酸1-192)。用將HindIII和Xho I位點加至其5′端、將BamH I位點加至其3′端的引物(OPR158，DR1A-B)通過PCR再擴增此基因片段。將HLA-DR2α1-α2基因片段亞克隆(用HindIII和BamH I)入帶克隆區(qū)(HindIII、BamHI和EcoR I位點)的穿梭載體pJRS161.1，以驗證序列。將HLA-DR2α1-α2基因片段亞克隆(用Xho I和EcoR I)入細菌穿梭載體SBIA，此載體帶克隆區(qū)(Nco I、Nhe I和Spe I位點)、14氨基酸的接頭序列(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-S-S，SEQ ID NO29)和第二克隆區(qū)(XhoI、BamH I和EcoR I位點)。將編碼EE抗原標志(E-E-E-E-Y-M-P-M-E-P-G-終止子(SEQ ID NO30))的退火寡核苷酸(OPR203000(SEQ IDNO12)，OPR203001(SEQ ID NO13))亞克隆入第二克隆區(qū)的BamHI和EcoR I位點之間。產(chǎn)生的載體被稱為SBDE1。還將HLA-DR2α1-α2基因片段亞克隆入(用Xho I和EcoR I)細菌穿梭載體SIA，該載體帶克隆區(qū)(Nco I、Nhe I和Spe I位點)、24氨基酸的單鏈接頭序列(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-S-S(SEQ ID NO31))和第二克隆區(qū)(Xho I、BamH I和EcoR I位點)。將編碼EE抗原標志的退火寡核苷酸(OPR203000，OPR203001)亞克隆入第二克隆區(qū)的BamH I和EcoR I位點之間。產(chǎn)生的載體被稱為SDE3。參閱Kabat，E.A.，(出處同前)關(guān)于涉及HLA-DR2(1501)基因序列的內(nèi)容。
對于HLA-DRB1*1501基因，自人淋巴細胞系DO208915(ASHI保藏機構(gòu)登記號9008)分離總RNA。用寡核苷酸引物(DR2B-F(SEQ ID NO14)，DR2B-B2(SEQ ID NO15))進行DRB1*1501 β1-β2基因片段(氨基酸1-188)的eDNA合成和PCR擴增。這些引物將Nhe I位點和一個8氨基酸接頭序列加入到β1序列的5′-端，將Spe I和EcoR I位點加入到β2序列的3′端。將該DRB1*1501 PCR產(chǎn)物克隆入(Nhe I/EcoRI)帶Afl II、Nhe I和EcoR I限制位點的載體。將編碼MBP(84-102)(D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(SEQ ID NO32))的退火寡核苷酸(MBPF，MBPR)亞克隆入DRB1*1501載體的Afl II和Nhe I位點之間。將編碼24氨基酸的單鏈接頭序列(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-S-S SEQ ID NO31)的DNA片段插入DRB1*1501載體的Spe I和EcoR I位點之間。最后，將上述DRA1*0101α1α2基因片段(編碼氨基酸1-192)插入sc-接頭序列之后。所得載體攜有MBP-DRB1*1501β1-β2-sc接頭-DRA1*0101α1α2基因片段，將其用做進一步操作的模板。
1.MHC II類β2結(jié)構(gòu)域中的缺失提高了可溶性表達為了檢測增加的可溶性表達，制備在β2結(jié)構(gòu)域中帶缺失的單鏈DR2構(gòu)建體(見圖4B)。在一例子中，通過用適當?shù)墓押塑账嵋?對細菌表達是MB201806(SEQ ID NO16)和MB175959(SEQ ID NO17)，對于桿狀病毒表達是MB201807(SEQ ID NO18)和MB175959(SEQ IDNO17))對MBP-DRB1*1501β1-β2模板進行PCR擴增，刪除整個β2結(jié)構(gòu)域。這些反應(yīng)將MBP序列改變?yōu)閅-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(SEQ ID NO28)。將用于細菌表達的PCR產(chǎn)物克隆入細菌表達載體8BIA(來自pKC62，pKC62描述于1997年3月7日遞交的共同未決的美國申請08/813,781中，其內(nèi)容被引用作為參考)。該載體帶有phoA啟動子和pelB前導序列，可用于克隆基因片段的誘導型可溶性表達。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中，并驗證序列。進行細菌表達時，將MBP-DRB1*1501β1片段(Nco I-Spe I)亞克隆入SBDE1載體，得到SDRB2表達載體。進行桿狀病毒表達時，將pGEM-T中的MBP-DRB1*1501 β1片段克隆(Nsi I-Nco I)入被修飾成在多角體蛋白啟動子控制下編碼mellitin信號肽的pBlueBac4.5變體(Invitrogen)中。將SBDE1的14氨基酸接頭-DR2α1-α2-EE標志融合基因片段(Spe I-EcoR I)亞克隆入帶MBP-DRB1*1501 α1片段的pGEM-T載體。將單鏈DR2Δβ2/MBP片段克隆(Nsi I/EcoR I)入被修飾成在多角體蛋白啟動子控制下編碼mellitin信號肽的pBlueBac4.5變體(Invitrogen)。所得載體被稱為pMB959。
上述pKC62載體(pSUN19)已根據(jù)布達佩斯條約保藏于12301Parkman Drive，Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。此DNA載體保藏于1997年2月26日，保藏號為97896。pKC62載體包括phoA啟動子、被修飾的pelB序列、基因10核糖體結(jié)合位點和細菌噬菌體基因VIII啟動子。按標準方法，該DNA載體可容易地在大腸桿菌或其他合適宿主細胞中增殖。
為了進一步修飾β2結(jié)構(gòu)域，用適當?shù)墓押塑账嵋?MB201807(SEQ ID NO18)和MB201810(SEQ ID NO21)以及MB201809(SEQ IDNO20)和MB201808(SEQ ID NO19))PCR擴增pCI-neo/DR2模板，以將氨基酸117位的半胱氨酸密碼子突變成絲氨酸密碼子，隨后用MB201807(SEQID NO18)和MB201808(SEQ ID NO19)進行重疊PCR。這些反應(yīng)將MBP序列改變成如下序列Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(SEQ ID NO28)。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中，驗證序列。進行桿狀病毒表達時，將pGEM-T中的MBP-DRB1*1501β1-modβ2片段克隆(Nsi I-Nco I)入被修飾成在多角體蛋白啟動子控制下編碼mellitin信號肽的pBlueBac4.5變體(Invitrogen)中。將SDE3中24氨基酸的接頭-DR2α1-α2-EE標志融合基因片段(Spe I-EcoR I)亞克隆入帶MBP-DRB1*1501 β1-mod β2片段的pGEM-T載體中。將單鏈DR2Δβ2/MBP片段克隆(NSiI/EcoRI)入被修飾成在多角體蛋白啟動子控制下編碼mellitin信號肽的pBlueBac4.5變體(Invitrogen)中。所得載體被稱為pMB808。
為了制備sc-DR2-IgG Cκ融合構(gòu)建體，用寡核苷酸引物OPR215(SEQ ID NO22)、OPR216(SEQ ID NO23)PCR擴增MBP-DRB1*1501β1-β2-sc接頭-DRAI*0101α1α2模板。這些反應(yīng)將Age I位點加到MBP序列的5′端，改變MBP序列成Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(SEQ ID NO28)，并將κ外顯子/內(nèi)含子序列及ClaI位點加至α2序列的3′端。將sc-DR2/MPB PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中，證實序列。隨后將融合基因亞克隆入帶CMV啟動子、小鼠IgGκ前導肽序列、克隆區(qū)、小鼠κ內(nèi)含子和人κ恒定區(qū)外顯子序列的哺乳動物表達載體pKCM180(下文詳述)中。產(chǎn)生的載體稱為pDRHK。
如下制備哺乳動物Ig-Cκ表達載體pSUN6和pKCM180載體骨架是帶CMV啟動子以驅(qū)動克隆基因表達的質(zhì)粒pCDNA3(Invitrogen)。用Hind III/Xho I切開該質(zhì)粒，并插入“輕鏈多接頭”DNA片段以產(chǎn)生起始pCDNALCPL載體。該接頭包含限制位點Hind III、Kpn I、Cla I、Pml I、EcoRV、Age I、Xma I、BamH I和Xho I，以促進隨后的克隆步驟。將含輕鏈前導序列、抗CKMB κ輕鏈基因組片段和3′UTR的Sma I/Bcl I DNA片段克隆入pCDNA/LCPL的EcoRV/BamH I位點。該片段中的小鼠內(nèi)含子、外顯子和3′UTR來自pneo/20-10VL，[描述于Near，等人，(1990)分子免疫學(Mol.Immunol.)27901中]。隨后進行誘變，以消除和引入合適限制酶位點，得到pSUN6載體。該載體帶有CMV啟動子，其后是輕鏈前導序列和抗CKMMBκ輕鏈基因組序列，后者的可變區(qū)基因以EcoRV/BstB I片段存在，而小鼠κ恒定區(qū)基因序列以EcoN I/Xho I片段存在。
為了制備人Cκ表達載體，用帶人κ恒定區(qū)的恰當PCR擴增片段取代pSUN6的小鼠κ恒定區(qū)序列(EcoN I/Xho I)。產(chǎn)生的載體pKCM180帶有CMV啟動子，隨后是輕鏈前導序列、抗-CKMB κ輕鏈可變區(qū)外顯子、小鼠內(nèi)含子和人κ輕鏈外顯子序列。
上述pDRHK和pIAdk載體已按布達佩斯條件保藏于上列地址的ATCC。兩DNA載體保藏于1997年9月17日，保藏號分別為209274(pDRHK)和209275(pIAdk)。這些DNA載體按標準方法可容易地在多種合適哺乳動物宿主細胞中增殖。實施例4 細菌細胞中可溶性sc-MHC II類分子的表達通過標準分子克隆方法，用SDE3質(zhì)粒(如可溶性sc-DR2Δβ2/MBP，見實施例3)轉(zhuǎn)化MM294大腸桿菌菌株(Sambrook等人，見上文)。該載體攜帶有賦予氨芐青霉素抗性的基因。將轉(zhuǎn)化的MM294細胞在高磷酸鹽培養(yǎng)基(10mM KH2PO4，于已知成分培養(yǎng)基中-50μg/ml氨芐青霉素，0.4％葡萄糖，0.15％酪蛋白氨基酸，0.0002％硫胺素，4mMtricine，10mM FeSO4，9.7mM NH4Cl，0.29mM K2SO4，0.07mM CaCl2，0.53mM MgCl2，50mM NaCl，40mM MOPS，pH7.4)中30℃生長過夜。為了誘導sc-DR2基因產(chǎn)物的表達，將細胞轉(zhuǎn)移至低磷酸鹽培養(yǎng)基(0.1mMKH2PO4于已知成分培養(yǎng)基中)中，于30℃培養(yǎng)8小時。收獲細胞并重懸于PBS+1％Trition-X100。超聲處理破細胞壁，并在離心后收集可溶性物質(zhì)。用MAS-96p(Harlan Sera-Lab)作為捕獲單抗(0.1μg/孔)，HRP偶聯(lián)L243(0.1μl/ml)(ATCC HB-55)作為探針單抗，通過構(gòu)象特異性的DR特異性夾心ELISA檢測所表達的sc-DR2分子。通過與親和素過氧化物酶(0.25μg/孔)溫育、隨后與ABTS底物(Kirkegaard和Perry)溫育檢測抗體結(jié)合。純化的天然DR2用作陽性標準。這樣的試驗結(jié)果如表2所示。
這些結(jié)果顯示，缺少β2結(jié)構(gòu)域的sc-DR2分子以能夠被特異于正確折迭的天然HLA-DR構(gòu)象的抗體所識別的形式表達。這是一個意外的結(jié)果，因為II類分子的β2結(jié)構(gòu)域已知與α2結(jié)構(gòu)域有相互作用，并被認為在復合體的正確折迭中起重要作用(見Brown，J.H.等人，1993自然36433)。而且，除去該結(jié)構(gòu)域似乎提高了細菌細胞中sc II類分子的可溶性表達。這是沒有料想到的，因為帶完整β2結(jié)構(gòu)域的sc-DR2構(gòu)建體在大腸桿菌中以不溶的形式表達。
1.在細菌細胞中大規(guī)模生產(chǎn)MHC復合體用細菌表達系統(tǒng)可完成可溶性sc II類分子的大規(guī)模生產(chǎn)。例如，可以向含80L合成生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種攜有sc-DR2融合基因的轉(zhuǎn)化MM294。按標準細菌發(fā)酵技術(shù)維持細胞。一旦生長培養(yǎng)基中的磷酸鹽被消耗完，將誘導sc-DR2基因產(chǎn)物的表達?？梢栽谶m當?shù)臅r間通過連續(xù)流動離心或用Millipore Pellicon切向流微孔過濾裝置過濾收集細胞。可以用Gaulin壓碎器破碎細胞，隨后離心獲得含有sc-MHC II類分子的可溶性物質(zhì)。預期每批發(fā)酵將生產(chǎn)約0.01-0.1克量的可溶性MHC II類分子。實施例5在昆蟲細胞中表達可溶性sc-MHC II類分子用桿狀病毒表達系統(tǒng)(Invitrogen)，從SF9昆蟲細胞中獲得可溶性sc-IAd和sc-DR2分子。按制造商說明書(Invitrogen)，分別將編碼不帶肽(sc-IAd/空分子)、帶有OVA 323-339肽(sc-IAd/OVA)、或帶有g(shù)D 246-261肽(sc-IAd/gD)的可溶性sc-IAd的構(gòu)建體亞克隆入pBlueBac III中桿狀病毒多角體蛋白啟動子下游。如上所述制備sc-DR2構(gòu)建體pMB959和pMB808。然后將融合基因分別重組入桿狀病毒，再與線性化wt AcMN-PV(野生型)一起進行脂質(zhì)體介導的SF9昆蟲細胞共轉(zhuǎn)染。經(jīng)有限稀釋克隆后，制備純化的重組病毒原種。
更具體地說，通過在補充有10％胎牛血清的Hink’s TMN-FH昆蟲培養(yǎng)基中感染SF9細胞(1×106細胞/ml)，進行可溶性sc-IAd融合基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。感染復數(shù)(MOI)約為10。5天后，收集培養(yǎng)物上清液，然后在親和純化前用1M Tris調(diào)至pH8.0。用M5/114(Bhattacharya，A.，M.E.Dorf，T.A.Springer.1981.免疫學雜志1272488)作為捕獲單抗(0.1μg/孔)，用生物素偶聯(lián)的AMS-32.1(Wall，K.A.，M.L.Lorbver，M.R.Loken，S.McClatchey，和F.W.Fitch.(1993)免疫學雜志1311056)(0.1μg/ml)(PharMingen)作為探測單抗，通過靈敏的IAd特異性夾心ELISA檢測表達的sc-IAd分子。通過與親和素過氧化物酶(0.25μg/孔)溫育、隨后與ABTS底物(Kirkegaard和Perry)溫育，檢測抗體的結(jié)合。
在另一實施例中，檢測在β2結(jié)構(gòu)域中帶修飾的可溶性sc-DR融合基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。如上所述完成SF9細胞的感染。用MAS-96p(Harlan Sera-lab)作為捕獲單抗(0.1μg/孔)，HRP偶聯(lián)的L243(0.1μl/ml)(ATCC HB-55)作為探測單抗，通過構(gòu)象特異性的DR特異性夾心ELISA檢測表達的sc-DR2分子。通過與親和素過氧化物酶(0.25μg/孔)溫育、隨后與ABTS底物(Kirkegaard和Perry)溫育檢測抗體的結(jié)合。純化的天然DR2用作陽性標準。這些試驗的結(jié)果如表3所示。
>如上所述，這些結(jié)果是未料到的，因為II類分子的β2結(jié)構(gòu)域被認為在復合體的折迭中起重要作用(參閱Brown，J.H.等人，1993，自然36433)。缺少此結(jié)構(gòu)域或在此結(jié)構(gòu)域中有修飾的sc-DR2分子能被特異于正確折迭的天然HLA-DR構(gòu)象的抗體所識別。此外，該結(jié)構(gòu)域的去除或修飾似乎提高了昆蟲細胞中sc-II類分子的可溶性表達。這是沒有料想到的，因為帶完整β2結(jié)構(gòu)域的sc-DR2構(gòu)建體在該系統(tǒng)中表達水平很低。
1.昆蟲細胞中大規(guī)模生產(chǎn)MHC復合體可以進行可溶性sc-II類分子的大規(guī)模生產(chǎn)。例如，可以用約2×1010個SF9昆蟲細胞分別接種含20L生長培養(yǎng)基的3個旋轉(zhuǎn)瓶?？砂礃藴始毎囵B(yǎng)技術(shù)維持細胞并用50％氧氣50％氮氣連續(xù)充氣。然后用重組桿狀病毒原種之一接種每個旋轉(zhuǎn)瓶，并在合適時間用Millipore Pellicon切向流微孔過濾裝置通過過濾收集SF9培養(yǎng)基。實施例6哺乳動物細胞中可溶性sc-IAd分子的表達哺乳動物細胞系的轉(zhuǎn)染和選擇進行如下在冰冷PBS中洗1×107NSO細胞兩次，重懸于760μl冷PBS中，并與40μg(1μg/μl)SalI線性化質(zhì)粒SCE1 DNA(即對于sc-IAd/OVA分子的可溶性形式)混合。冰浴5分鐘后，用Gene Pulser(Biorad)電穿孔該細胞，以運送250伏特、960μFd的脈沖。將脈沖過的細胞冰置2-5分鐘，并加入到30ml非選擇性培養(yǎng)基(IMDM，10％FBS，2mM谷氨酰胺，5000單位/ml青霉素，5000μg/ml鏈霉素)中。將細胞鋪板到96孔平底組織培養(yǎng)板中，24小時后，向每孔中加入150μl選擇性培養(yǎng)基(IMDM，10％透析FBS，5000單位/ml青霉素，5000μg/ml鏈霉素，1×核苷，1×谷氨酸+天冬酰胺)。每周一次通過取出100μl/孔舊培養(yǎng)基并加入100μl/孔新鮮選擇培養(yǎng)基而給平板補充選擇培養(yǎng)基，使細胞逐漸消耗培養(yǎng)基中的所有殘留谷氨酰胺。SCE1質(zhì)粒上所帶的谷氨酰胺合成酶基因能使得轉(zhuǎn)染細胞在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中選擇性生長。被質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了的細胞的集落在14-21天后變得明顯。
對帶有SCE1載體(即sc-IAd/OVA分子的可溶形式)的轉(zhuǎn)染子進行增殖，通過上述IAd特異性ELISA試驗對MHC分子的表達和分泌進行篩選。SCEI載體的構(gòu)建已描述于PCT申請公開WO 96/04314中。來自兩個SCE1轉(zhuǎn)染細胞系之培養(yǎng)物上清液的這種試驗結(jié)果顯示于表4中。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染細胞可產(chǎn)生和分泌sc-IAd/OVA分子。表4
1.IgG Cκ片段的融合可促進可溶性表達為了檢測sc-II類分子的表達水平是否可提高，制備sc-IAd/OVA分子和IgG Cκ片段的基因融合體(見實施例3)。將此構(gòu)建體按以下步驟轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞系在冰冷PBS中洗1×107NSO細胞兩次，重懸于790μl冷PBS中，并與10μg(1μg/μl)Pvu I線性化質(zhì)粒pIADKDNA混合。冰置10分鐘后，用Gene Pulser(Biorad)傳遞250伏特、960μ Fd的脈沖，電穿孔細胞。將經(jīng)過脈沖的細胞冰置10分鐘，再加入10ml IMDM培養(yǎng)基(IMDM，10％FBS，2mM谷氨酰胺，5000單位/ml青霉素，5000μg/ml鏈霉素)中。將細胞在37℃、5％二氧化碳條件下于T25組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24小時后，加入20ml新霉素選擇培養(yǎng)基(IMDM培養(yǎng)基，1.5mg/ml G418)。然后將細胞以200μl/孔轉(zhuǎn)移至96孔平底組織培養(yǎng)皿中，溫育于37℃、5％二氧化碳中，并每3-7天換入新霉素選擇培養(yǎng)基。pIADK載體帶有可允許穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞選擇生長的新霉素抗性基因。被載體轉(zhuǎn)染了的細胞集落在14-21天后變得明顯。增殖帶pIADK載體的轉(zhuǎn)染子，并且用前述IAd特異性ELISA篩選轉(zhuǎn)染子表達可溶性sc-分類II-Cκ分子的情況。由昆蟲細胞產(chǎn)生的純化sc-IAd/OVA用作參照標準。來自4個pIADK轉(zhuǎn)染細胞系的培養(yǎng)物上清液的該試驗結(jié)果示于表5中。表5
這些結(jié)果表明可溶性sc-IAd-Cκ融合分子以能被兩種構(gòu)象特異性抗體識別的形式產(chǎn)生?；谶@些結(jié)果，在裝有2升新霉素選擇培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)瓶中增殖和培養(yǎng)NSOE2轉(zhuǎn)染子。
如以下實施例7所述純化sc-IAd-Cκ融合分子。
另外，在哺乳動物細胞中檢測人sc-II類-Cκ融合蛋白的可溶性生產(chǎn)。用pDRHK表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞，并對其在新霉素選擇性培養(yǎng)基(參閱上文)中的生長進行篩選。用兩種不同的ELISA形式篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子生產(chǎn)可溶性sc-DR2/MBP-Cκ分子的情況。在第一種形式中，用抗人κ抗體作為捕獲抗體，HRP偶聯(lián)的L243(ATCC HB-55)作為探測單抗L243單抗特異于HLA-DR分子上的構(gòu)象表位。因此，此試驗形式可檢測正確折迭的DR2-Cκ融合體。在第二種形式中，用抗-HLA-DR L227單抗(ATCCHB-96)作為捕獲抗體，HRP偶聯(lián)的L243(ATCC HB-55)作為探測單抗。L227和L243單抗分別特異于HLA-DR分子上的線性和構(gòu)象表位。此試驗形式可檢測分子上正確折迭的DR2部分。通過與親和素過氧化物酶溫育、隨后與ABTS底物(Kirkegaard和Perry)溫育，檢測抗體的結(jié)合。這些試驗的結(jié)果顯示于表6。<
>結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生了可溶性sc-DR2/MBP-Cκ融合分子，并釋放入培養(yǎng)基中。可溶性DR2/MBP-Cκ分子折迭成構(gòu)象正確的形式。
2.在哺乳動物細胞中大規(guī)模表達MHC復合體本文所述NSO和CHO細胞表達系統(tǒng)可用于生產(chǎn)大量sc-MHC II類分子(空的或與肽共價連接的分子)。例如，可選擇表達se-DR2/MBP-Cκ分子的轉(zhuǎn)染CHO細胞系，并在三個分離的中空纖維生物反應(yīng)器中生長至匯合。按標準生物反應(yīng)器技術(shù)，將約1×109CHO細胞接種入中空纖維生物反應(yīng)器柱體(Unisyn)的毛細管外空間(EC)。在轉(zhuǎn)染CHO細胞生長期間，新鮮的加氧培養(yǎng)基連續(xù)循環(huán)通過中空纖維。然后從EC室中收獲可溶性sc-MHC II類分子(每天)30-120天。預期每個生物反應(yīng)器將得到約0.1-1g量的各種可溶性MHC II類分子。實施例7 可溶性sc-MHC I類和II類分子的純化將來自以上實施例5的昆蟲細胞培養(yǎng)上清液通過蛋白A瓊脂糖柱。然后將未結(jié)合物質(zhì)過MK-D6單抗(參閱Kappler，J.W.，B.Skidmore，J.White，P.Marrack.1981.實驗醫(yī)學雜志，1531198)蛋白A瓊脂糖柱。用20mM Tris-HCl(pH8.0)和1M NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)洗滌柱。用50mM甘氨酸-HCl(pH11.0)洗脫sc-IAd融合蛋白并立即中和至pH8.0。用Centricon 30濃縮融合蛋白質(zhì)并將緩沖液更換為20mM Tris-HCl(pH8.0)。這些方法可容易地應(yīng)用于從攜有sc-II類基因之哺乳動物細胞產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液中大規(guī)模純化可溶性sc-II類分子。一般地，此純化方法得到200-1000μg sc-IAd/肽分子/升昆蟲細胞培養(yǎng)基。
通過親和柱洗脫物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)評估制劑的純度。凝膠顯示主要帶約為50kDa(圖5A，泳道1、2和3)。如所預期的，這些分子被糖基化，并由于連接肽而顯示質(zhì)量稍有不同。蛋白質(zhì)印跡分析證實了在sc-IAd/OVA蛋白質(zhì)樣品中存在OVA323-339肽(圖5A，泳道5)。在其它蛋白質(zhì)檢測試驗中，純化的固定sc-IAd/OVA和sc-IAd/空蛋白質(zhì)獨立地被特異結(jié)合IAd的單克隆抗體(如，MK-D6，M5/114，AMS-32.1，39-10-8或34-5-3)結(jié)合。能特異結(jié)合MHC分子的其它單克隆抗體可公開獲自數(shù)種來源，諸如上述地址的ATCC和Linscott’s Directory。
在另一實例中，利用使用MK-D6單抗的親和層析方法從哺乳動物組織培養(yǎng)基中純化sc-IAd/OVA-Cκ融合分子(見實施例6)。
用于MHC II類分子免疫親和純化的方法以前已有描述(Gorga，J.C.，V.Horejsi，D.R.Johnson，R.Raghupathy和J.L.Strominger。(1987)生物化學雜志，26216087)。這些方法通?？蓱?yīng)用于純化本發(fā)明的可溶性sc-MHC I類或II類蛋白質(zhì)。例如，對于帶有HLA-DR或HLA-DQ結(jié)構(gòu)域的sc-MHC II類融合蛋白質(zhì)，可利用單克隆抗體L243和G2a.5(分別對DR和DQ具免疫特異性，可獲自ATCC)免疫純化含這些結(jié)構(gòu)域的sc-MHC II類分子。在一實例中，這些方法被用于純化昆蟲細胞中產(chǎn)生的sc-DR2Δβ2/MBP分子(見實施例5)。純化結(jié)果如圖5B所示。
如上所提到，可溶性sc-II類分子可被設(shè)計為含標志。這樣的“標記”分子可用標準技術(shù)方便地純化。例如，含6×His標志的分子可按前述方法在Ni-IDA Sepharose Fast Flow柱上親和純化。簡單地說，用PBS、0.5M NaCl、0.2％(v/v)吐溫20，pH8.0平衡柱。粗洗滌之后，可以用通過混合不同部分緩沖液A(20mM Na2HPO4，pH7.0，0.2M NaCl)和緩沖液B(20mM NaH2PO4，pH3.0，0.2M NaCl)產(chǎn)生的逐步pH降低洗脫sc-MHC II類蛋白質(zhì)。另一實例中，可以通過常規(guī)免疫親和層析，使用抗EE標志單抗-蛋白質(zhì)A Sepharose柱純化含EE標志的可溶性sc-MHC II類分子?？梢杂玫鞍踪|(zhì)A Sepharose柱通過常規(guī)親和層析純化sc-II類/IgG融合分子。參閱Ausubel等人，見上文；和Sambrook等人，見上文。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，前述sc-MHC II類分子純化方案可容易地適用于本發(fā)明其他MHC分子的大規(guī)模制備和純化。實施例8 sc-MHC II類/肽復合體的形成為了檢測實施例7中產(chǎn)生的sc-IAd/空融合分子是否能有效地結(jié)合肽，將sc-IAd/空分子固定，然后與50倍摩爾過量的OVA323-339在檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)中于37℃溫育20小時。用PBS將這些復合體洗兩次，并通過上述試驗檢測其刺激T-細胞應(yīng)答的能力。裝載肽于MHCII類分子上的方法已有報道(見例如Stern，L.J.等人，見上文)。這些方法可容易地應(yīng)用于裝載基本上任何呈遞肽至MHC II類復合體上。通常，這些方法包括將純化的II類分子與20-50倍摩爾過量的肽在37℃溫育20-60小時。這些反應(yīng)的最適pH依所用的具體MHC II類分子和肽而變化，然而，很好地裝載呈遞肽的最適pH一般在約pH4.5-pH7之間(Sette，A.，S.等人(1992)免疫學雜志，148844)。用HPLC凝膠過濾、膜過濾、免疫吸收或旋轉(zhuǎn)超濾可將MHC II類/肽復合體與游離肽分開。
我們發(fā)現(xiàn)實施例7中產(chǎn)生的固定化sc-IAd/空分子能有效地結(jié)合肽。見圖6C。實施例9可溶性sc-MHC II類/肽復合體的功能按本文所述方法檢測以上實施例4、5和6中產(chǎn)生的可溶性sc-IAdII類分子刺激T-細胞雜交瘤細胞系釋放IL2的能力。用可溶性sc-IAd/OVA和sc-IAd/gD分子(PBS，pH7.0)包被96孔Immulon II平板(Dynatech)中的孔過夜。然后將T-細胞雜交瘤DO11.10細胞系加入用sc-IAd/OVA分子包被了的孔中，將GD12雜交瘤細胞系加入用sc-IAd/gD包被了的孔中(1×105細胞/孔)。當DO11.10細胞上的TcR與IAd/OVA復合體相互作用時，細胞將分泌白介素-2(IL-2)和IL-4。如圖6A中所示，固定化的sc-IAd/OVA誘導DO11.10細胞劑量依賴性地釋放IL-2。這些結(jié)果證實實施例5中產(chǎn)生的sc-IAd/肽融合分子能被DO11.10細胞的TcR識別。如所預期的，DO11.10細胞對sc-IAd/空分子無應(yīng)答。對IL-4的產(chǎn)生可見相似結(jié)果。
用GD12 T-細胞雜交瘤獲得抗原特異性的進一步證據(jù)。如圖6B中所示，GD12細胞對固定的sc-IAd/gD應(yīng)答很好，但不被sc-IAd/OVA分子刺激，而DO11.10細胞顯示相反的應(yīng)答特異性。
以前的研究已顯示昆蟲細胞中產(chǎn)生的II類雜二聚體分子可結(jié)合外源加入的肽(Stern，L.J.，和D.C.Wiley(1992)細胞68465，Scheirle，A.，B.等(1992)免疫學雜志1491994，Kozono，H.，見上文)?？墒?，也發(fā)現(xiàn)IAdα和β鏈發(fā)生解離并不能呈遞肽(Kozono，H.，見上文)。為了檢測實施例5中產(chǎn)生的sc-IAdMHC II類分子是否穩(wěn)定并能負載合適呈遞肽，按本文所述方法將純化的sc-IAd/空分子與OVA323-339肽溫育(如，見實施例8)。隨后洗滌去除未結(jié)合肽，發(fā)現(xiàn)固定化復合體能激活DO11.10細胞(圖6C)。這些結(jié)果一起表明單鏈形式可穩(wěn)定IAd分子，可用于純化和裝載外源加入的或共價連接的肽。
在另一實例中，利用DO11.10細胞因子釋放試驗檢測實施例6中產(chǎn)生的sc-IAd-Cκ融合分子的功能性。簡潔地說，將純化的sc-IAd-Cκ融合蛋白質(zhì)(1.1μg/孔)包被到96孔板上。昆蟲細胞來源的sc-IAd分子(1.1μg/孔)用做對照。或者，最初將多克隆抗小鼠κ抗體(200ng/孔)包被到平板上，然后加入融合蛋白質(zhì)(1.1μg/孔)并用抗κ抗體捕獲。用PBS洗平板兩次并加入1×105個DO11.10 T-細胞(200μl)。37℃24小時后，收集培養(yǎng)上清液并用ELISA(PharMingen)測定DO11.10T-細胞釋放入培養(yǎng)基中的IL-2量。IL-2的釋放量是DO11.10 T-細胞受體和IAd/OVA復合體之間發(fā)生有功能的相互作用后T-細胞活化水平的度量。IL-2 ELISA的結(jié)果顯示于表7中。
結(jié)果表明，sc-IAd/OVA-Cκ被固定化或被抗κ抗體捕獲時都是有功能活性的。這些結(jié)果出乎預料，因為我們以前發(fā)現(xiàn)sc-IAd和IgGCH2-CH3結(jié)構(gòu)域之間的類似融合得到的分子不被IAd特異性ELISA試驗或T-細胞刺激試驗所識別。實施例10可溶性sc-IAd/肽融合復合體誘導細胞凋亡利用DO11.10細胞檢測可溶性sc-IAd融合分子誘導T-細胞凋亡的能力。與上述可溶性sc-IAd/OVA分子溫育過夜后，DO11.10細胞顯示細胞形態(tài)學方面的顯著變化，包括核濃縮、細胞凋亡體的出現(xiàn)及DNA降解成寡核小體帶(圖7，泳道4)。這些改變是細胞凋亡的特征[P.Walker等人，生物技術(shù)(BioTechniques)，151032(1993)]。在與抗TcR和抗CD3單抗溫育的細胞中觀察到相似的結(jié)果，而在與固定化sc-IAd/空分子溫育的細胞中觀察到細胞形態(tài)學或DNA降解方面無變化(與圖7的泳道3和5相比)。
圖7解釋如下將DO11.10細胞溫育于未處理的孔中或用100ng/孔抗TcR單抗(H57-597，PharMingen)或250ng/孔sc-IAd分子包被的孔中。24小時后，收獲細胞(1.2×106/樣品)并分離Triton X-100可溶性DNA[P.Walker等人，生物技術(shù)，151032(1993)]。用2％瓊脂糖凝膠電泳分析樣品，并溴化乙錠染色以檢測染色體DNA梯狀化現(xiàn)象。泳道2來自未處理的DO11.10細胞。泳道1和6顯示DNA分子量標準。實施例11 用含可溶性sc-IAdMHC融合分子的載體進行DNA接可抑制體內(nèi)T-細胞增殖T-細胞的活化，例如在T細胞的增殖中，至少需要2個信號。通過TcR和MHC II類/肽融合復合體運送至T-細胞的一個信號將殺死T-細胞或使其無反應(yīng)性。已發(fā)現(xiàn)在缺乏添加共刺激信號的條件下，可溶性sc-IAd/OVA融合分子選擇性殺死體內(nèi)抗原特異性T-細胞。這些結(jié)果表明單鏈MHC分子，尤其是單鏈MHC II類分子特別適于抑制體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能。這些結(jié)果還表明，當單鏈MHC分子與共刺激信號共表達于細胞中或單鏈MHC分子表達于已存在合適共刺激信號的細胞中時，免疫系統(tǒng)功能可被誘導。
為了抑制體內(nèi)T-細胞的克隆擴充，我們利用了哺乳動物表達載體pEE13，該載體可通過標準方法修飾，以攜帶sc-IAd/OVA融合基因。由表達載體的CMV啟動子驅(qū)動sc-IAd/OVA基因的轉(zhuǎn)錄。用100μg質(zhì)粒DNA(1mg/ml于PBS中)肌內(nèi)注射(IM)BALB/C小鼠后腿。14或28天后再重復注射兩次。對照組是在0周肌內(nèi)注射鹽水，并在2周和4周肌內(nèi)注射編碼sc-IAd/空分子的100μg質(zhì)粒。
然后兩組均在最終DNA接種后23和30天從尾根部皮下注射OVA323-339肽(在完全弗氏H37Ra佐劑中100μg/小鼠)。一周后，殺死小鼠并收集腹股溝和主動脈旁淋巴結(jié)。制備淋巴結(jié)細胞懸液，并通過溫育于尼龍絨和葡聚糖G-10柱上除去抗原呈遞細胞，將所得到的純化T-細胞群與用OVA323-339肽脈沖過的APC溫育。來自BALB/C小鼠的脾B細胞用作APC。用絲裂霉素C(50-100μg/ml于4×106脾細胞/ml的懸液中)固定這些細胞以抑制B細胞的增殖，粗洗并將OVA323-339肽(0-50μg/孔)加入純化的T-細胞(2×105細胞/孔)中。使這些細胞在37℃、5％二氧化碳條件下于96孔圓底微量滴定板上增殖4天。這次，在培養(yǎng)終止前用MTS(40μl/孔)(Promega)脈沖處理這些孔4-6小時。通過檢測490nm的吸光度測定MTS的摻入，這是T-細胞增殖的度量。
圖8A和8B顯示用來自被注射小鼠和對照小鼠的細胞進行的T-細胞增殖試驗的結(jié)果。圖8A中，T-細胞分離自接受sc-IAd/空質(zhì)粒(和鹽水)IM注射的小鼠。圖8B中，小鼠接受sc-IAd/OVA質(zhì)粒的IM注射。用OVA肽攻擊小鼠兩次，一周后從淋巴結(jié)中分離T-細胞。如上所述進行OVA特異性T-細胞增殖試驗。與分離自注射有sc-IAd/空質(zhì)粒的對照組之T-細胞相比，分離自注射有sc-IAd/OVA質(zhì)粒的小鼠之T-細胞顯示OVA特異性增殖量方面有顯著降低。這些結(jié)果證明可溶性sc-IAd/OVA分子的表達抑制了體內(nèi)抗原特異性T-細胞的克隆擴充。
施用可溶性單鏈MHC分子(如可溶性sc-MHC II類肽融合復合體或可溶性的有負載sc-MHC II類復合體)或編碼這些分子的DNA表達載體將減輕哺乳動物內(nèi)，尤其是人的免疫失調(diào)，所述疾病涉及不期望有的抗原特異性T-細胞存在或增殖。例如，可以將可溶性單鏈MHC分子(如可溶性sc-MHC II類肽融合復合體)或編碼這些分子的DNA表達載體與藥學可接受載體物質(zhì)，如生理鹽水混合，并施用于患有或可能患有免疫失調(diào)的哺乳動物，如人，所述免疫失調(diào)包括不期望有的抗原特異性T-細胞存在或增殖。其它藥學可接受載體的例子是眾所周知的(參閱，如Remington藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)。用藥的一種特殊方式是肌肉內(nèi)方式，盡管還可用其它方式(如口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腸胃外或經(jīng)皮方式)，選擇哪一種方式將取決于被治療的疾病和動物的總體狀況，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的?？扇苄詥捂淢HC融合分子的劑量也將依據(jù)諸如免疫疾病的類型和嚴重性之類的因素變化，但通常是足以抑制體內(nèi)諸如抗原特異性T-細胞之類免疫細胞增殖的劑量。一般的劑量范圍將是1ng-10mg可溶性MHC II類分子/kg體重。可以按料想所需重復治療，如每天治療。類似的合適劑量可用于本文所公開之多特異性MHC復合體(負載或有重組融合的呈遞肽)的給藥。
還應(yīng)當理解，帶所有或大部分本發(fā)明MHC分子的細胞可以足夠抑制或誘導T-細胞的劑量施用于哺乳動物?？梢杂么颂幩鲈囼灆z測T-細胞活性。
顯而易見，也可使用其他可溶性的有負載單鏈MHC分子治療體內(nèi)不期望有的抗原特異性T-細胞存在或增殖。例如，可以將約6-30個氨基酸長(包括在內(nèi))的呈遞肽以至少等摩爾比率與合適的可溶性空單鏈MHC分子混合，以形成相應(yīng)的有負載分子。然后可以將此有負載分子與藥學可接受載體混合并施用于哺乳動物，如人，以治療如上所述的免疫系統(tǒng)失調(diào)。實施例12 通過用表達肽連接的單鏈MHC分子的載體進行DNA接種進行免疫抑制的方法檢測DNA接種方法(尤其是肌內(nèi)或皮內(nèi))效果的一個模型系統(tǒng)例子如下。對三組BALB/c小鼠在兩后腿肌內(nèi)注射(IM)100μg(a)SCE1，(b)SCT1，或(c)鹽水。在0、2和4周分別注射。首次DNA注射后4和5周，在尾根部皮下注射OVA肽323-339(100μg/小鼠，于完全弗氏H37Ra佐劑中)。兩周后(8周)，通過尾部放血從每只小鼠收集血液，隨后以約14,000G離心3-5分鐘獲得血清。如上所述測定OVA特異性IgG和IgM抗體的效價。OVA特異性IgG抗體的水平是用肽免疫后小鼠中發(fā)生的TH細胞介導性免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的指示。因此，用肽連接的單鏈MHC表達載體進行DNA接種可引起肽特異性IgG抗體水平降低，而不影響IgM抗體水平。
一可替代實驗是檢測OVA特異性TH細胞克隆擴充或增殖。簡潔地說，在第二次OVA免疫后7天，從腹股溝和主動脈旁淋巴結(jié)制備細胞懸液。通過溫育于尼龍絨和葡聚糖G-10柱上去除懸液中的抗原呈遞細胞，將所得的純化T-細胞群與用OVA323-339肽脈沖過的APC一起溫育。脾B細胞用作抗原呈遞細胞。用絲裂霉素C固定這些細胞(在4×106脾細胞/ml懸液中濃度為50-100μg/ml)，以抑制B細胞的增殖，粗洗滌并將各種濃度的OVA323-339肽加入純化的T-細胞中。如上所述進行OVA特異性T-細胞增殖試驗。肽反應(yīng)性T-細胞增殖的程度是用肽免疫后小鼠中發(fā)生的TH細胞應(yīng)答(即克隆擴充)的指示。因而，用肽連接的單鏈MHC表達載體進行DNA接種可引起肽特異性TH細胞增殖水平降低。實施例13 用可溶性的肽連接單鏈M-HC II類分子進行免疫抑制按以上實施例4、5和6產(chǎn)生的可溶肽連接sc-II類分子適于誘導TH細胞中的變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。為了檢測這點，用以下方法可檢查該分子對TH細胞依賴型免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(即IgM至IgG)和肽特異性T細胞系克隆擴充的影響。
a)IgG類別轉(zhuǎn)換為了檢查IgM到IgG的類別轉(zhuǎn)換，建立如下兩個檢測組i)用完全弗氏佐劑H37Ra中的100pg OVA323-329在尾根部注射10只BALB/c小鼠，7天后加強注射以誘導對OVA323-339肽的免疫應(yīng)答。在每次用OVA免疫的前一天和當天，用PBS中的10-100μg可溶性sc-IAd/OVA靜脈內(nèi)注射其中5只小鼠。此可溶性融合蛋白質(zhì)可與展示于OVA323-339特異性TH細胞上的T-細胞受體TcR結(jié)合。由于缺少共刺激信號，這些TH細胞被誘導為變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)。因為免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換是TH細胞依賴性過程，預期在sc-IAd/OVA處理過的小鼠中抗OVA121-339 IgG抗體的誘導顯著減少。剩下的5個小鼠用作對照并將接受PBS。由于存在未受阻的TH細胞，這些小鼠預期將積累抗OVA323-339 IgG抗體。
第二次免疫10天后，通過尾部放血從每只小鼠中收集血液。于約14,000G離心血液3-5分鐘并收集血清。在用Tris-HCl包被緩沖液(pH8.5)中1-50μg/ml卵清蛋白包被的96孔微量滴定板(MaxisorpF8；Nunc，Inc.)上完成試驗。然后用壓力敏感型薄膜(Falcon，BectonDickinson，Oxnard，CA)覆蓋平板并4℃溫育過夜。然后用洗滌液(咪唑/NaCl，0.4％吐溫-20)洗平板并以100μl/孔加入3％BSA溶液進行封閉。在平板旋轉(zhuǎn)器上室溫溫育30分鐘后，用洗滌液洗平板5次。然后將小鼠血清1∶500稀釋于樣品/偶聯(lián)稀釋劑(2％明膠+0.1％吐溫20于TBS中)中，然后在平板上連續(xù)稀釋兩份。對每種包被蛋白質(zhì)建立兩塊相同的平板，一塊用于測定IgM效價，而另一塊用于測定IgG效價。室溫溫育30分鐘后，用洗滌液洗平板5次。將山羊抗小鼠IGM-HRP和山羊抗小鼠IgG-HRP偶聯(lián)物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，1∶100稀釋于樣品/偶聯(lián)稀釋劑中)加入適當?shù)钠桨逯?。室溫溫?0分鐘后，用洗滌液洗平板5次，然后與100μl/孔ABTS顯色底物(Kirkgaard &amp; Perry實驗室，Inc.，Gaithersburg，MD)一起室溫溫育10分鐘。用100μl/孔猝滅緩沖液(Kirkgaard &amp; Perry實驗室，Inc.，Gaithersburg，MD)終止反應(yīng)，并用自動微量平板ELISA讀數(shù)器(Ceres UV900HI，Bioteck，Winooski，Vermont)讀405nm處的吸光度。將讀出的吸光度對樣品稀釋度對數(shù)作圖，確定效價。然后比較IgM與IgG的效價。
由于在相應(yīng)肽反應(yīng)性TH細胞中誘導的變態(tài)反應(yīng)，預計實施例4，5和6中產(chǎn)生的可溶性肽連接單鏈MHC II類分子以肽特異性方式抑制IgG類別轉(zhuǎn)換。
b)體內(nèi)肽特異性T-細胞系的克隆擴充實施例10-11中產(chǎn)生的可溶性肽連接單鏈II類分子對肽特異性T-細胞系的克隆擴充的作用可在體內(nèi)檢測如下。治療組(每組4只小鼠)與上述的相同。免疫接種方案如下用10-100μg在PBS中的可溶性sc-IAd/OVA融合蛋白質(zhì)靜脈內(nèi)注射小鼠，24小時后在尾根部皮下注射50μg在完全弗氏佐劑H37Ra中的OVA323-339。6和7天后重復這兩種注射。第二套注射完成后7天，處死小鼠。取出腹股溝和主動脈旁淋巴結(jié)，并制成單細胞懸液。
懸液通過溫育于尼龍絨和Sephadex G-10柱上除去抗原呈遞細胞，將所得的純化T-細胞群與用OVA323-339肽脈沖過的APC一起溫育。脾B細胞用作抗原呈遞細胞。用絲裂霉素C固定這些細胞(50-100μg/ml于4×106脾細胞/ml懸液中)以抑制B細胞增殖，粗洗滌，然后將各種濃度的OVA323-329肽加入純化的T-細胞中。增殖試驗在96孔圓底微量滴定板中于37℃、5％二氧化碳中進行3-5天。在培養(yǎng)終止前18小時用1μCi 3H-胸苷脈沖處理各孔，并用Skatron細胞收獲器收獲細胞。用LKB液閃光譜計測定DNA中的3H-胸苷摻入量，作為T-細胞增殖的度量。肽反應(yīng)性T-細胞增殖的程度是免疫接種后小鼠中發(fā)生的TH細胞應(yīng)答(即克隆擴充)的指示。
預期共注射實施例4、5和6中產(chǎn)生的可溶性單鏈MHC II類分子(與OVA免疫結(jié)合)將限制OVA反應(yīng)性T-細胞系的克隆擴充及隨后體外增殖的量。實施例14 多特異性MHC II類復合體的制備如上所述，本發(fā)明的完全可溶并有功能的MHC復合體包括多特異性復合體。以下為制備含sc-MHC II類分子和配基結(jié)合分子的多特異性MHC分子的典型方法。
1.雙特異性復合體A.免疫球蛋白連接分子圖9A和9B分別顯示含兩個sc-MHC II類肽融合分子或一個sc-MHCII類肽融合分子和一單鏈抗體的雙特異性復合體的例子。
按本文所述方法可制備含兩個sc-MHC II類肽復合體的雙特異性復合體(圖9A)。例如，在一種方法中，構(gòu)建了含有依次共價連接的sc-MHC分子(如II類sc-MHC分子)、連接分子(如Ig-CL鏈)和任選的效應(yīng)分子的第一種融合分子。此融合分子可與含有依次共價連接的sc-MHC II肽融合分子、連接分子(如Ig-CL鏈)和任選效應(yīng)分子的第二種融合分子結(jié)合。如早先所提及，若期望，sc-MHC II類分子可包括諸如基本上整條β2鏈缺失之類的β2 II類鏈修飾以提高可溶性表達。該第一和第二融合分子可由DNA序列編碼，優(yōu)選由編碼兩分子的載體所編碼?；蛘?，該第一和第二融合分子可由分開的DNA序列編碼，優(yōu)選由包括在兩個DNA載體上的DNA序列編碼，這種情況下每個DNA序列編碼其中一種融合分子。在任一種情況中，第一個或第二個融合分子都是作為分離的鏈表達的，并能在體外或在合適哺乳動物細胞中結(jié)合而形成雙特異性復合體。如果需要，可按上述分離和純化方法純化雙特異性復合體以形成基本純的復合體。
圖9B中所述含sc-MHC II類肽融合分子和單鏈抗體的雙特異性復合體通?？砂瓷鲜龇椒ㄖ苽?，不同之處在于第二融合分子將包含按順序共價連接的sc-Fv抗體、連接分子(如IgG CH′分子)和任選的效應(yīng)分子。
B.其他連接分子如上所提及，有多種多肽已顯示可形成特異結(jié)合對。例如，卷曲螺旋(如亮氨酸拉鏈)、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋多肽基元及相關(guān)結(jié)構(gòu)已顯示可促進單鏈抗體Fv片段、T-細胞受體分子α和β鏈及MHC II類分子α和β鏈的二聚化和寡聚化。參閱如，Pack等人，生物技術(shù)，111271(1993)；Pack等人，分子生物學雜志，24628(1995)；Chaing等人，美國國家科學院院報9111408(1994)；Scott等人，實驗醫(yī)學雜志，1832087(1996)。
按制備和使用卷曲螺旋和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的已知方法，構(gòu)建含這種卷曲螺旋或螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋連接分子的雙特異性復合體是本發(fā)明的目的之一?？捎脭?shù)個分子通過以下步驟制備雙特異性復合體。首先，用標準合成方法制備一對寡核苷酸DNA引物，每個引物編碼以下卷曲螺旋序列1.NH2-SSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ-COOH(SEQ ID NO33)2.NH2-SSADLVPRGSTTAPRAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKLAQ-COOH(SEQ ID NO34)參閱Scott等人，實驗醫(yī)學雜志，1832087(1996)。
或者，每個DNA寡核苷酸引物可編碼SEQ ID NO33和SEQ ID NO34之卷曲螺旋序列的合適部分，條件是所編碼的該對序列按測定能形成特異結(jié)合對，如通過Pack等人(見上文)、Chaing等人(見上文)和Scott等人(見上文)所報道方法檢測。
然后，為構(gòu)建含卷曲螺旋連接分子或其合適片段的雙特異性MHC復合體，將DNA寡核苷酸引物之一共價連接至編碼一個或多個目的sc-MHC分子(如sc-MHC II類分子)之DNA區(qū)段的3′端。然后將這樣制備的DNA構(gòu)建體任選地在引物3′端連接至編碼所需的任選效應(yīng)分子的DNA序列5′端。第二個DNA寡核苷酸引物共價連接于編碼所需配基結(jié)合分子之DNA區(qū)段、諸如編碼目的單鏈抗體的DNA區(qū)段的3′末端。這樣制備的DNA構(gòu)建體可進一步融合至編碼所需的任選效應(yīng)分子之DNA區(qū)段的5′端。一個具體例子是，該DNA區(qū)段可包括按順序共價連接的sc-MHC II類分子/卷曲螺旋序列；sc-MHC II類分子/卷曲螺旋序列/效應(yīng)分子；單鏈抗體/卷曲螺旋序列；單鏈抗體/卷曲螺旋序列/效應(yīng)分子。
所選擇的一對DNA區(qū)段一般是能編碼可二聚化的蛋白質(zhì)的那些DNA區(qū)段。通常將所選的一對DNA區(qū)段引入一對合適載體中，以便在目的細胞類型中表達。或者，可以將所述DNA區(qū)段按需要插入到單個DNA載體上。按本發(fā)明的雙特異性復合體可用其它策略生產(chǎn)。在一方法中，將編碼復合體諸鏈中之一的每個載體引入細胞，于產(chǎn)生所編碼蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)細胞。再分別自各細胞培養(yǎng)物中分離蛋白質(zhì)，然后在控制溫度、鹽、蛋白質(zhì)和離子濃度等的條件下體外結(jié)合以最大限度地形成雙特異性MHC復合體?；蛘撸梢詫蓚€載體引入同一合適細胞中，在有助于預期雙特異性MHC復合體表達和裝配的條件下培養(yǎng)細胞。如果需要，可按本文所述方法將雙特異性MHC復合體以基本純的形式從細胞中分離出來。合適細胞和載體的例子上文已論述。
本發(fā)明已參照其優(yōu)選實施方案進行了敘述。然而，應(yīng)當理解，通過對此內(nèi)容的考慮，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行修飾和改進。
序列表(1)一般資料(i)申請人Rhode，Peter R.
Acevdo，JorgeBurkhardt，MartinJiao，Jin-anWong，Hing C.(ii)發(fā)明題目可溶性MHC復合體及其使用方法(iii)序列數(shù)35(iv)通訊地址(A)地址Dike，Bronstein，Roberts &amp; Cushman，LLp(B)街名130 Water Street(C)城市Boston(D)州名MA(E)國家美國(F)郵編02109(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機可兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ的Windows 2.0版(vi)當前申請信息(A)申請?zhí)?B)存檔日期(C)分類(Vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)存檔日期(Viii)代理人代理機構(gòu)信息
(A)姓名Corless，Peter F(B)登記號33,860(C)參考/文檔號47594-PCT(iX)電信信息(A)電話617-523-3400(B)電傳617-523-6440(C)電報(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度8個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO1CCACCATG 8(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCCCCAAGC TTCCGGGCCA CCATGGCTCT GCAGATCCCC AGC43(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCCCCACTT AAGGTCCTTG GGCTGCTCAG CACC 34(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO4GGGGGGGCCA TGGCCGGAAA CTCCGAAAGG CATTTCG 37(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO5GCGGCGACTA GTCCACTCCA CAGTGATGGG GC32(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO6GGGGGGGCCA TGGCCGAAGA CGACATTGAG GCCGAC36(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征
(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGCGACTAG TCCAGTGTTT CAGAACCGGC TC32(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO8GGGGGGGATA TCTCTCAGGC TGTTCACGCT G 31(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ 1D NO9GGGGGGTTCG AAAAGTGTAC TTACGGGGGG CTGGAATCTC AGGTTC 46(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO10GGGGGGCTCG AGTATCAAAG AAGAACATGT GATCATC 37(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO11GCGGCGGGAT CCGTTCTCTG TAGTCTCTGG GAGAGG36(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO12GATAAGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AACCCGGGTG AG 42(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO13AATTCTTCAC CCGGGTTCCA TCGGCATGTA CTCTTCTTCC TCG43(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度75個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO14CCCCCCGCTA GCGGAGGGGG CGGAAGCGGC GGAGGGGGGG ACACCCGACC ACGTTTCCTG 60TGGCAGCCTA AGAGG 75(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO15CCCCCCGAAT TCCCCACTAG TCCATTCCAC TGTGAGAGGG CTTGTCAC 48(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO16GGGGGGGCCA TGGCCTACGA CAGAACCCCG TGGTG 35(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO17GGGGGGACTA GTTCGCCGCT GCACTGTGAA GC32(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO18GGGGGGTATG CATACGACGA GAACCCCGTG GTG 33(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO19GGGGGGACTA GTCCACTTCG AGGAACTGTT TCC 33(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO20CCTCCTGGTC TCCTCTGTGA GTGG 24(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO21CCACTCACAG AGGAGACCAG GAGG 24(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO22CCCCCCACCG GTTACGACAA GCCCGTGGTG 30(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO23CCCCCCATCG ATAAGTGTAC TTACGTGGGA GAGGGCTTGG AGCAT 45(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度1508個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置6...1505(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO24CCACC ATG GCT CTG CAG ATC CCC AGC CTC CTC CTC TCA GCT GCT GTG GTG 50Met Ala Leu Gln Ile Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Val1 5 10 15GTG CTG ATG GTG CTG AGC AGC CCA AGG ACC TTA AGT ATC TCT CAG GCT 98Val Leu Met Val Leu Ser Ser Pro Arg Thr Leu Ser Ile Ser Gln Ala20 25 30GTT CAC GCT GCT CAC GCT GAA ATC AAC GAA GCT GGT CGT GCT AGC GGA 146Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Ala Ser Gly35 40 45GGG GGC GGA AGC GGC GGA GGG GGA AAC TCC GAA AGG CAT TTC GTG GTC 194Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asn Ser Glu Arg His Phe Val Val50 55 60CAG TTC AAG GGC GAG TGC TAC TAC ACC AAC GGG ACG CAG CGC ATA CGG 242Gln Phe Lys Gly Glu Cys Tyr Tyr Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile Arg65 70 75CTC GTG ACC AGA TAC ATC TAC AAC CGG GAG GAG TAC GTG CGC TAC GAC 290Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Val Arg Tyr Asp80 85 90 95AGC GAC GTG GGC GAG TAC CGC GCG GTG ACC GAG CTG GGG CGG CCA GAC 338Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp100 105 110GCC GAG TAC TGG AAC AGC CAG CCG GAG ATC CTG GAG CGA ACG CGG GCC 386Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg Ala115 120 125GAG GTG GAC ACG GCG TGC AGA CAC AAC TAC GAG GGG CCG GAG ACC AGC 434Glu Val Asp Thr Ala Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Pro Glu Thr Ser130 135 140ACC TCC CTG CGG CGG CTT GAA CAG CCC AAT GTC GCC ATC TCC CTG TCC 482Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu Ser145 150 155AGG ACA GAG GCC CTC AAC CAC CAC AAC ACT CTG GTC TGT TCG GTG ACA 530Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val Thr160 165 170 175GAT TTC TAC CCA GCC AAG ATC AAA GTG CGC TGG TTC AGG AAT GGC CAG 578Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln180 185 190GAG GAG ACA GTG GGG GTC TCA TCC ACA CAG CTT ATT AGG AAT GGG GAC 626Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly Asp195 200 205TGG ACC TTC CAG GTC CTG GTC ATG CTG GAG ATG ACC CCT CAT CAG GGA 674Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln Gly210 215 220GAG GTC TAC ACC TGC CAT GTG GAG CAT CCC AGC CTG AAG AGC CCC ATC 722Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro Ile225 230 235ACT GTG GAG TGG ACT AGT GGT GGC GGT GGC AGC GGC GGT GGT GGT TCC 770Thr Val Glu Trp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser240 245 250 255GGT GGC GGC GGT TCT GGC GGT GGC GGT TCC TCG AGT GAA GAC GAC ATT 818Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Ile260 265 270GAG GCC GAC CAC GTA GGC TTC TAT GGT ACA ACT GTT TAT CAG TCT CCT 866Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Gln Ser Pro275 280 285GGA GAC ATT GGC CAG TAC ACA CAT GAA TTT GAT GGT GAT GAG TTG TTC 914Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Leu Phe290 295 300TAT GTG GAC TTG GAT AAG AAG AAA ACT GTC TGG AGG CTT CCT GAG TTT 962Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg Leu Pro Glu Phe305 310 315CGC CAA TTG ATA CTC TTT GAG CCC CAA GGT GGA CTG CAA AAC ATA GCT 1010Gly Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro Gln Gly Gly Leu Gln Asn Ile Ala320 325 330 335GCA GAA AAA CAC AAC TTG GGA ATC TTG ACT AAG AGG TCA AAT TTC ACC 1058Ala Glu Lys His Asn Leu Gly Ile Leu Thr Lys Arg Ser Asn Phe Thr340 345 350CCA GCT ACC AAT GAG GCT CCT CAA GCG ACT GTG TTC CCC AAG TCC CCT 1106Pro Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr Val Phe Pro Lys Ser Pro355 360 365GTG CTG CTG GGT CAG CCC AAC ACC CTT ATC TGC TTT GTG GAC AAC ATC 1154Val Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Phe Val Asp Asn Ile370 375 380TTC CCA CCT GTG ATC AAC ATC ACA TGG CTC AGA AAT AGC AAG TCA GTC 1202Phe Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu Arg Asn Ser Lys Ser Val385 390 395ACA GAC GGC GTT TAT GAG ACC AGC TTC CTC GTC AAC CGT GAC CAT TCC 1250Thr Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn Arg Asp His Ser400 405 410 415TTC CAC AAG CTG TCT TAT CTC ACC TTC ATC CCT TCT GAT GAT GAC ATT 1298Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp Asp Asp Ile420 425 430TAT GAC TGC AAG GTG GAG CAC TGG GGC CTG GAG GAG CCG GTT CTG AAA 1346Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro Val Leu Lys435 440 445CAC TGG GAA CCT GAG ATT CCA GCC CCC ATG TCA GAG CTG ACA GAA ACT 1394His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr450 455 460GTG GTG TGT GCC CTG GGG TTG TCT GTG GGC CTT GTG GGC ATC GTG GTG 1442Val Val Cys Ala Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val465 470 475GGC ACC ATC TTC ATC ATT CAA GGC CTG CGA TCA GGT GGC ACC TCC AGA 1490Gly Thr Ile Phe Ile Ile Gln Gly Leu Arg Ser Gly Gly Thr Ser Arg480 485 490 495CAC CCA GGG CCT TTA TGA 1508His Pro Gly Pro Leu500(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度500個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO25Met Ala Leu Gln Ile Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Val1 5 10 15Leu Met Val Leu Ser Ser Pro Arg Thr Leu Ser Ile Ser Gln Ala Val20 25 30His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Ala Ser Gly Gly35 40 45Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asn Ser Glu Arg His Phe Val Val Gln50 55 60Phe Lys Gly Glu Cys Tyr Tyr Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile Arg Leu65 70 75 80Val Thr Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Val Arg Tyr Asp Ser85 90 95Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala100 105 110Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu115 120 125Val Asp Thr Ala Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Pro Glu Thr Ser Thr130 135 140Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu Ser Arg145 150 155 160Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val Thr Asp165 170 175Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu180 185 190Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp195 200 205Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln Gly Glu210 215 220Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro Ile Thr225 230 235 240Val Glu Trp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly245 250 255Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Ile Glu260 265 270Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Gln Ser Pro Gly275 280 285Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Leu Phe Tyr290 295 300Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg Leu Pro Glu Phe Gly305 310 315 320Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro Gln Gly Gly Leu Gln Asn Ile Ala Ala325 330 335Glu Lys His Asn Leu Gly Ile Leu Thr Lys Arg Ser Asn Phe Thr Pro340 345 350Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr Val Phe Pro Lys Ser Pro Val355 360 365Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Phe Val Asp Asn Ile Phe370 375 380Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu Arg Asn Ser Lys Ser Val Thr385 390 395 400Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn Arg Asp His Ser Phe405 410 415His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp Asp Asp Ile Tyr420 425 430Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro Val Leu Lys His435 440 445Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val450 455 460Val Cys Ala Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val Gly465 470 475 480Thr Ile Phe Ile Ile Gln Gly Leu Arg Sar Gly Gly Thr Ser Arg His485 490 495Pro Gly Pro Leu500(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO26Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO27Ala Pro Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro1 5 10 15(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO28Tyr Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro1 5 10 15Arg Thr Pro Pro20(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO29Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser1 5 10(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO30Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu Pro Gly1 5 10(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ IDNO31TSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSSS24(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO32Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg1 5 l0 15Thr Pro Pro(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO33Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala1 5 10 15Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu20 25 30Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln35 40 45(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長度44個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO34Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Arg Ala1 5 10 15Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu20 25 30Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Ala Gln35 40(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征
(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xi)序列描述SEQ ID NO35ASSGGGSGGG 10
權(quán)利要求
1.含有肽結(jié)合溝和具有至少一個氨基酸取代或缺失的II類β2鏈的空sc-MHC II類分子。
2.權(quán)利要求1的空sc-MHC II類分子，其中還含有免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段。
3.含肽結(jié)合溝和共價連接的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或片段的空sc-MHC II類分子。
4.通過在呈遞肽和空sc-MHC分子之間能形成復合體的條件下，使呈遞肽與權(quán)利要求1、2、或3的空sc-MHC II類分子接觸而產(chǎn)生的有負載sc-MHC分子。
5.含有重組融合的呈遞肽和具有至少一個氨基酸取代或缺失的II類β2鏈的sc-MHC II類融合蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的sc-MHC II類融合蛋白質(zhì)，其中還含有免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段。
7.含有重組融合的呈遞肽和共價連接的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)或片段的sc-MHC II類融合蛋白質(zhì)。
8.含肽結(jié)合溝的空sc-MHC II類分子，其中所述分子包含依次共價連接的a)MHC II類β1鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，b)具有至少一個氨基酸取代或缺失的II類β2鏈，c)肽接頭序列，和d)MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分。
9.權(quán)利要求8的空sc-MHC II類分子，其中的II類β2鏈氨基酸缺失是基本上整條II類β2鏈的缺失。
10.權(quán)利要求9的空sc-MHC II類分子，其中還含有共價連接至MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段。
11.含肽結(jié)合溝的空sc-MHC II類分子，其中所述分子包括依次共價連接的a)MHC II類β1β2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，b)肽接頭序列，c)MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，和d)免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段。
12.權(quán)利要求11的空sc-MHC II類分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段是鼠或人的Cκ鏈。
13.權(quán)利要求11的空sc-MHC II類分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段是鼠或人的Cλ鏈。
14.通過在呈遞肽和空sc-MHC II類分子之間能形成復合體的條件下，使呈遞肽與權(quán)利要求8或11的空sc-MHC II類分子接觸而產(chǎn)生的有負載sc-MHC分子。
15.含肽結(jié)合溝的sc-MHC II類融合分子，其中所述sc-MHC II類融合分子含有依次共價連接的a)呈遞肽，b)MHC II類β1鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，c)具有至少一個氨基酸取代或缺失的MHC II類β2鏈，d)肽接頭序列；和e)MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分。
16.權(quán)利要求15的sc-MHC II類融合分子，其中所述II類β2鏈缺失包括II類β2鏈中至少2、5、10、25、50、60、70、80、90或更多氨基酸的缺失。
17.權(quán)利要求16的sc-MHC II類融合分子，其中所述II類β2鏈氨基酸缺失是基本上整條II類β2鏈的缺失。
18.權(quán)利要求15的sc-MHC II類融合分子，其中所述II類β2鏈取代包括II類β2鏈中2、5、10、25、50、60、70、80、90或更多氨基酸的取代。
19.權(quán)利要求18的sc-MHC II類融合分子，其中所述II類β2鏈取代包含Cys117至Ser117的取代。
20.權(quán)利要求15的sc-MHC II類融合分子，其中還含有共價連接至MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段。
21.含肽結(jié)合溝的sc-MHC II類融合分子，其中所述融合分子含有依次共價連接的a)呈遞肽，b)MHC II類β1β2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，c)肽接頭序列，d)MHC II類α1α2鏈或其呈遞肽結(jié)合部分，和e)免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(Ig-CL)或片段。
22.權(quán)利要求21的sc-MHC II類融合分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段是鼠或人的Cκ鏈。
23.權(quán)利要求21的空sc-MHC II類分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)片段是鼠或人的Cλ鏈。
24.權(quán)利要求22或23的sc-MHC II類融合分子，其中所述免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(Ig-CL)片段長度約在80-130、90-120或100-110個氨基酸之間。
25.含有下式之sc-MHC類的空多特異性MHC復合體
其中，a)A代表至少1個空sc-MHC II類分子，b)B1、B2各自獨立地是相同或不同的連接分子，c)C1，C2各自獨立地是相同或不同的效應(yīng)分子或是-H；和d)D代表至少1個空sc-MHC II類分子、配基結(jié)合分子或-H。
26.包括含肽結(jié)合溝之空sc-MHC II類分子的多特異性MHC復合體，該復合體用式A-B-C、B-A-C或A-C-B表示，其中A是至少一個sc-MHC II類分子，B是連接分子而C是效應(yīng)分子或-H，條件是當復合體由A-C-B表示時，-C-不是-H。
27.通過在呈遞肽和至少一個空sc-MHC II類分子之間能形成特異結(jié)合復合體的條件下使呈遞肽與權(quán)利要求25或26的多特異性MHC復合體接觸而形成的有負載多特異性MHC復合體。
28.包含具有肽結(jié)合溝之sc-MHC分子的多特異性MHC復合體融合分子，該復合體用下式表示
其中，a)A代表至少一個含有重組融合呈遞肽的sc-MHC II類分子，b)B1、B2各自獨立地是相同或不同的連接分子，c)C1、C2各自獨立地是相同或不同的效應(yīng)分子或是-H；和d)D代表至少一個含重組融合呈遞肽的sc-MHC II類分子、配基結(jié)合分子或是-H。
29.包含具有肽結(jié)合溝之sc-MHC II類分子的多特異性MHC融合分子，該復合體用式A-B-C、B-A-C或A-C-B表示，其中A是至少一個含重組融合呈遞肽的sc-MHC II類分子，B是連接分子而C是效應(yīng)分子或-H，條件是當復合體由式A-C-B表示時，-C-不是H。
30.編碼權(quán)利要求1、3、5或7之sc-MHC II類分子的DNA區(qū)段。
31.編碼權(quán)利要求22和26之多特異性MHC分子至少一部分的DNA區(qū)段。
32.含權(quán)利要求27之DNA區(qū)段的DNA載體。
33.含權(quán)利要求29之DNA區(qū)段的DNA載體。
34.制備具有β2 II類鏈修飾之sc-MHC II類分子的方法，該方法包括a)提供含DNA載體的細胞，其中該DNA載體包括編碼具有β2 II類鏈修飾的sc-MHC II類分子之DNA序列，b)在允許sc-MHC II類分子表達的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞；并c)從細胞或培養(yǎng)基中純化sc-MHC II類分子。
35.權(quán)利要求34的方法，其中具有β2 II類鏈修飾的sc-MHC II類分子是權(quán)利要求1、3、5或7中所述的sc-MHC II類分子。
36.制備多特異性MHC II類復合體的方法，該方法包括a)提供含一種或多種DNA載體的細胞，該載體含編碼多特異性MHC復合體或其能特異結(jié)合連接分子的部分的DNA序列，b)在允許多特異性MHC分子表達的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞；并c)從細胞或培養(yǎng)基中純化多特異性MHC分子。
37.抑制哺乳動物內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括給哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求4、5、7、17或28的sc-MHC復合體。
全文摘要
本發(fā)明涉及主要組織相容性復合體(MHC)分子的新復合體及這些復合體的用途。一方面,本發(fā)明涉及包括有Ⅱ類β2鏈修飾,如刪除了基本上整個Ⅱ類β2鏈的單鏈 MHC Ⅱ類復合體。另一方面,本發(fā)明描述了含免疫球蛋白恒定鏈或片段的單鏈MHC Ⅱ類復合體的特征。本發(fā)明進一步提供了含至少一個單鏈MHC Ⅱ類分子的多特異性MHC復合體。本發(fā)明的MHC復合體可用于多種應(yīng)用中,包括:1)鑒定和分離可調(diào)節(jié)所選T細胞之活性的肽,包括是T細胞受體桔抗劑和部分激動劑的肽的體外篩選,及2)抑制或誘導哺乳動物體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號A61P37/06GK1278183SQ98810746
公開日2000年12月27日 申請日期1998年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月29日
發(fā)明者P·R·羅德, J·阿塞維多, M·布克哈特, 焦進安, 黃慶祥 申請人:蘇諾爾分子公司