專利名稱：母體免疫分泌物及其在治療和/或預(yù)防人體病癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和預(yù)防以正常粘膜分泌物流量或其正常保護(hù)特性減少或喪失為特征的人體病癥或者對(duì)此類粘膜分泌物敏感的人體病癥。
這里所說粘膜分泌物尤其是指唾液、淚液、鼻腔分泌物、腸分泌物和生殖器分泌物。
背景技術(shù)：
粘膜分泌物具有多種性能，包括機(jī)械潤滑和清潔、免疫保護(hù)作用，當(dāng)分泌物是唾液時(shí)的緩沖能力及對(duì)牙齒的再-礦物化作用，以及作為神經(jīng)刺激的溶媒作用。
除外作為粘多糖(粘蛋白)特性之一的水合和潤滑性能外，唾液還含有大量特異和非特異的調(diào)節(jié)微生物菌群的抗微生物物質(zhì)。
分泌型免疫球蛋白提供特異保護(hù)作用，所述分泌型免疫球蛋白由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生并以對(duì)特定微生物種屬應(yīng)答的細(xì)胞表面抗原為靶向。一些生物活性分子，其中一些目前尚不甚了解，提供更廣泛的保護(hù)作用；這些生物活性分子包括構(gòu)成天然免疫系統(tǒng)的肽和蛋白質(zhì)。酶、溶菌酶、涎過氧化物酶和淀粉酶參與唾液非-特異性抗微生物作用，通過凝集蛋白質(zhì)和薄膜形成蛋白和所有起源于唾液分泌的乳鐵蛋白。
乳鐵蛋白是鐵結(jié)合蛋白質(zhì)，它有效排除口腔微生物菌群的營養(yǎng)供應(yīng)品中的鐵；它也調(diào)節(jié)鐵在胃腸道(GI)的生物利用度并且具有控制該金屬過量吸收的治療功能。
唾液具有維持口腔健康的基本功能。正常唾液量或其正常組分的減少對(duì)于個(gè)體口腔健康具有顯著影響并導(dǎo)致念珠菌感染、牙齦炎、牙周炎、齲齒、潰瘍和口臭的發(fā)病率增加。唾液保護(hù)和預(yù)防性能與前述感染之間的關(guān)系主要是預(yù)防性的。健康個(gè)體的正常唾液流量不能完全防止任何感染的發(fā)生，但正常唾液的減少或喪失將誘使感染的頻率和復(fù)發(fā)率大大增加。
口腔感染的嚴(yán)重性在很大程度上也受個(gè)體唾液的量和質(zhì)的影響。牙齦炎和齲齒是全球性最常見疾?。凰鼈兊钠毡榇嬖谛灾率菇】祵＜覍⑺鼈儎澐值叫l(wèi)生保健或美容之列。在唾液功能嚴(yán)重缺失的患病個(gè)體中，齲齒可變成迫使重大牙科或醫(yī)學(xué)干預(yù)的嚴(yán)重的容顏損毀和衰弱性疾病。
正常唾液腺功能缺失的癥狀在醫(yī)學(xué)上被描述為口腔干燥或“口腔干燥綜合征”。它是由多種因素引起的最普通癥狀。許多老年人患有常常由其它醫(yī)藥物質(zhì)如抗-感染、抗-組胺、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、抗高血壓藥、利尿劑、治療精神病的藥物、抗精神病藥和抗-帕金森氏病藥物引起的進(jìn)展性口腔干燥?？谇桓稍镆彩撬挂駛愂暇C合征(Sjogren’s syndrome)的一個(gè)特征，斯耶格倫氏綜合征是與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的自身-免疫性疾病。受累最嚴(yán)重個(gè)體是那些接受頭部和頸部腫瘤放療治療的個(gè)體，放射線破壞唾液腺功能的結(jié)果是不可避免的副作用。
盡管通常描述為“口腔干燥綜合征”的口腔干燥也常常影響其它區(qū)域粘膜的干燥，特別是當(dāng)它是斯耶格倫氏綜合征的一個(gè)癥狀時(shí)。不考慮其病原學(xué)。病癥嚴(yán)重影響患病個(gè)體的生命質(zhì)量并導(dǎo)致齲齒、牙齦疾病、潰瘍和鵝口瘡發(fā)病率增加。
口腔干燥或其它任何導(dǎo)致粘膜分泌減少的病癥可誘發(fā)個(gè)體由念珠菌屬致病性酵母菌引起的口腔鵝口瘡的發(fā)病率大大增加。這些誘發(fā)病癥包括免疫抑制、細(xì)胞毒和放射治療、HIV感染、白血病和糖尿病。對(duì)于酵母菌感染最不明顯和可能最普遍的誘因是由過量使用抗菌藥和類固醇而引起的。
口腔鵝口瘡，或該感染的其它表現(xiàn)如酵母菌牙齦炎通常稱作念珠菌??；最常見菌屬是白色念珠菌。Coleman等在AIDS(1997)11，5，557-567中描述了在為防止口腔念珠菌病預(yù)先長(zhǎng)期預(yù)防性使用抗真菌藥物治療的HIV感染個(gè)體中出現(xiàn)了新種的念珠菌。
更為普遍存在的口腔健康問題包括下面將要討論的齲齒、牙齦炎、牙周炎和口臭。大多數(shù)個(gè)體在其一生中會(huì)患有部分或者所有這些病癥，病癥的嚴(yán)重程度取決于多種因素，包括宿主特異性免疫機(jī)制、影響牙釉質(zhì)和牙齦形成的遺傳因素、影響微生物斑數(shù)量和類型的飲食與衛(wèi)生保健因素。盡管在對(duì)這些感染的微生物病因?qū)W的認(rèn)識(shí)上有一些不同觀點(diǎn)，但眾所周知特定微生物與這些疾病的進(jìn)展有關(guān)。例如，有三組微生物通常與齲齒有關(guān)，它們是鏈球菌乳酸桿菌和放線菌。
對(duì)粘膜分泌物的正常流量或其正常免疫性能減少或缺失引起的病癥的治療有許多療法。例如，使用多種抗體，包括抗真菌藥和抗菌劑。
抗體，無論是否是抗真菌或抗菌劑，由于總是存在受治療微生物發(fā)生抗藥性和出現(xiàn)難治性感染的風(fēng)險(xiǎn)，所以給藥應(yīng)當(dāng)保守。大多數(shù)抗體具有限制它們用于急性治療的副作用；副作用可包括惡心和食欲不振以至肝臟損害以及與其它藥物的相互作用。
用于治療口腔干燥的植物小葉毛果蕓香的提取物毛果蕓香堿，是目前可利用的最有效的催涎劑，由于它的副作用包括流淚、頭暈、出汗、鼻炎、視力模糊，所以該藥的使用需要個(gè)體化劑量控制。毛果蕓香堿對(duì)毒蕈堿受體具有膽堿樣活性并擬似副交感神經(jīng)乙酰膽堿的作用。乙酰膽堿刺激水和電解質(zhì)分泌；另一獨(dú)立的神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素通過交感神經(jīng)起作用并刺激蛋白質(zhì)和大分子的分泌。理論上毛果蕓香堿應(yīng)當(dāng)僅僅影響水和電解質(zhì)的分泌。然而，在細(xì)胞水平存在一定量的交叉作用，細(xì)胞水平共同的激活劑-環(huán)AMP，對(duì)液體和蛋白質(zhì)的分泌也有一定程度的影響。然而，對(duì)毛果蕓香堿反應(yīng)而產(chǎn)生的唾液或其它粘膜分泌液的質(zhì)量中所含的基本大分子，特別是分泌型免疫球蛋白的量有限。唾液中所含分泌型免疫球蛋白和其它免疫成分通過入胞作用和胞裂外排作用而由血清通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，并且主要由不直接受神經(jīng)遞質(zhì)影響的小粘液腺生成。
認(rèn)識(shí)到毛果蕓香堿經(jīng)常被用于減輕因其它原因引起免疫系統(tǒng)受損個(gè)體的口腔干燥也是很重要的。在這些患者中液體分泌的刺激不能矯正免疫成分的缺失。
配制鈣和鉀鹽的飽和溶液代替唾液中的離子組分是相對(duì)簡(jiǎn)單的事。此類溶液在抗原制藥有限公司(Antigen Pharmaceuticals Limited)已作為“Luborant”(商標(biāo))市售，溶液由鉀、鎂和氯化鈣組成，還含有磷酸鉀緩沖液、氟化鈉和羧甲基纖維素。已經(jīng)開發(fā)的大量類似再-礦物化產(chǎn)品包括”Remodent”(商標(biāo))，一種骨鈣溶液。所有這些產(chǎn)品的問題是唾液飽和狀態(tài)的脆弱平衡不能被在齲病變處起作用的適宜結(jié)晶抑制劑重現(xiàn)。因此，形成不可控制的小管沉積的可能性是很大的。
多數(shù)人可以耐受經(jīng)常作為食物消耗的卵蛋白，同樣，大多數(shù)人可以耐受各種反芻動(dòng)物的乳品。
已知通過事先分別免疫?；蚰鸽u可以增加乳和蛋的特異抗體含量。由于它們的食物來源，此類抗體為人粘膜的長(zhǎng)期被動(dòng)免疫提供了吸引人的選項(xiàng)。Hatta H等齲齒研究(Caries Research)，199731268-278描述了超免疫卵免疫球蛋白作為預(yù)防齲齒的潛在用途。
EP-A 0 152 270公開了被動(dòng)免疫哺乳動(dòng)物對(duì)抗由抗原引起的病癥的方法，所述方法包括將從用抗原免疫過的家禽或牛中提取的免疫有效量的抗體施予哺乳動(dòng)物；哺乳動(dòng)物由于曾經(jīng)食用過來自家禽蛋或牛乳的含抗體物質(zhì)，所以能夠耐受抗體。
65218號(hào)愛爾蘭(Irish)專利說明書描述了使用卵和乳的分泌型免疫球蛋白來預(yù)防真菌感染，特別是粘膜上皮白色念珠菌感染。該文獻(xiàn)已經(jīng)證明白色念珠菌免疫過的母雞卵中的免疫球蛋白成分抑制實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的白色念珠菌株的生長(zhǎng)、頰細(xì)胞粘附和菌絲小管形成。
Ikemori等(1992)在美國獸醫(yī)研究雜志(American Journal of VeterinaryResearch)；53，2005描述了卵免疫球蛋白在被動(dòng)免疫中的應(yīng)用。Mastecky等在臨床調(diào)查研究雜志(J.Clin.Invest.)(1978)61，731-737中證明了分泌型免疫球蛋白的作用和免疫對(duì)抗變異鏈球菌的可能性。
被動(dòng)免疫過程，是指直接針對(duì)特異微生物種屬并特意地將之清除，而不影響可能存在的其它種屬。如前所述，大多數(shù)粘膜特別是口腔被多種微生物種屬病理性占據(jù)。指出哪個(gè)，若有的話，或全部已知病原菌將在某特定時(shí)間影響某一個(gè)體是困難的，因此，最好將被動(dòng)免疫技術(shù)局限在預(yù)防和治療特定病癥上。
粘膜保健中應(yīng)用被動(dòng)免疫的合理性是建立在模擬粘膜天然存在的分泌型免疫球蛋白的基礎(chǔ)上。眾所周知人唾液中存在分泌型免疫球蛋白，Brandtzaeg對(duì)此進(jìn)行了適當(dāng)綜述人唾液(Human saliva)臨床化學(xué)和微生物學(xué)(Clinical Chemistry and Microbiology)，第2卷第1-55頁，J Tenovuo主編，1989年CRC出版。在同一出版物中，J Tenovuo對(duì)人唾液中非-免疫球蛋白性防御因素進(jìn)行了綜述，第55-93頁。
非-免疫球蛋白性防御因素包括溶菌酶、乳鐵蛋白和唾液過氧化物酶以及其它天然免疫系統(tǒng)成分。天然免疫系統(tǒng)提供廣譜抗微生物活性而不象特異適應(yīng)性反應(yīng)那樣需要事先與抗原接觸，特異適應(yīng)性反應(yīng)中抗體是主要組分。
已報(bào)道人唾液分泌物中存在其它的天然免疫成分(Wolff等，組織化學(xué)細(xì)胞化學(xué)雜志(J.Histochem.Cytochem.)(1990)，38，1531-1534)。有效的抗微生物活性歸因于由許多不同脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物粘膜分泌物中分離出的數(shù)種多肽(Mahada等，腸(Gut)(1997)，40，161-163)。已鑒定的分子實(shí)體是爪蟾抗菌肽、殺菌肽、防御素、collectins和富含脯氨酸和精氨酸的多肽。
抗微生物多肽在牙科保健中的潛在用途是Miyasaki和Lehrer一篇綜述的主題國際抗微生物劑雜志(Int’J.Antimicrobial Agents)9(1998)269-280。作者提供了當(dāng)前已知抗微生物多肽和其來源的綜合清單，其中沒有一個(gè)是得自乳或卵的。
需要避免傳統(tǒng)治療的副作用的治療或預(yù)防前述人體病癥的可選擇的和改進(jìn)的治療方法發(fā)明公開本發(fā)明提供具有人粘膜分泌物生物活性特征的母體免疫分泌物的應(yīng)用，所述母體免疫分泌物在制備治療和/或預(yù)防以喪失所述粘膜分泌物或分泌物正常生物性能為特征的或?qū)λ稣衬し置谖锩舾械娜梭w病癥的藥物中能夠被人耐受。
這里使用的術(shù)語人可以包括遺傳上與人近緣的動(dòng)物，所述人將受益于本文所描述的治療和預(yù)防處理。
這里使用的母體免疫分泌物是指任何由母體為保護(hù)或發(fā)育胚胎或新生兒的目的而產(chǎn)生的生物分泌物。這些分泌物的實(shí)例是母雞卵的流體基質(zhì)或牛乳。除外它們的營養(yǎng)功能，這些流體通過它們的分泌型免疫組分，包括但不限于抗體，而參與雞胚或新生小牛發(fā)育的被動(dòng)免疫。
適宜的粘膜分泌物選自唾液、淚液、鼻腔分泌物、腸道分泌物和生殖器分泌物。
在下面描述中，本發(fā)明主要以稱為卵流體物質(zhì)的單個(gè)母體免疫分泌物及其在治療和/或預(yù)防口腔病癥中的應(yīng)用來進(jìn)行描述。
因此，本發(fā)明一方面是提供具有人粘膜分泌物生物活性特征的母體免疫分泌物的應(yīng)用，所述母體免疫分泌物在制備治療和/或預(yù)防以喪失正常唾液或喪失唾液正常生物性能為特征的人口腔病癥的藥物中能夠被人耐受。
當(dāng)母體免疫分泌物是卵流體時(shí)，優(yōu)選卵流體取自家養(yǎng)母雞。
在一實(shí)施方案中，卵流體取自卵黃。
優(yōu)選地，卵黃是脫脂的(delipidised)。
在另一供選擇的實(shí)施方案中，卵流體取自卵白。
卵的天然免疫能力并不限于卵黃的成分，卵白蛋白顯示出抑制微生物生長(zhǎng)及粘附的抗微生物活性，因此，根據(jù)本發(fā)明它們?cè)谀M粘膜分泌物特性方面具有很大的實(shí)用性。
優(yōu)選地，卵白是脫去卵白蛋白(de-ovalbuminised)的卵白。
為了利用卵白蛋白的抗微生物性質(zhì)，優(yōu)選去除主要結(jié)構(gòu)蛋白卵白蛋白。蛋白質(zhì)分離方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。只要剩余少量成分按接近其在完整卵白的原始比例的比例回收的話，基于凝膠過濾、離子交換、選擇沉淀或其它制備性色譜技術(shù)的任何常規(guī)方法均能滿足。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，卵流體是脫脂卵黃和去卵白蛋白卵白的混合物。
如本文所描述，卵黃提取物和卵白提取物是提供唾液和其它粘膜分泌物樣成分的豐富來源，包括但不限于，卵溶菌酶(溶解活性)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(結(jié)合鐵)、抗生物素蛋白(凝集素和生物素絡(luò)合物)、類卵粘蛋白(蛋白酶抑制劑)、粘蛋白卵磷脂和過氧化物酶活性，以及特異和非特異免疫球蛋白及天然免疫系統(tǒng)的非特異抗微生物成分。
許多脊椎動(dòng)物的體外分泌物中存在類似的生物活性實(shí)體，特別是哺乳動(dòng)物的體外腺體分泌物，包括乳腺。體外分泌物是生物性流體，它們?cè)鎏砘盍?、健壯生命和保護(hù)機(jī)體與外界環(huán)境的接觸面。在體外分泌物是乳腺分泌物和雞卵的成分時(shí)，體外分泌物也是將接觸面?zhèn)鬟f給新生兒的母系載體。
根據(jù)另一實(shí)施方案，分泌物是乳，尤其是山羊乳(caprine milk)。
來源于任何反芻動(dòng)物的乳汁將同樣地含有母體動(dòng)物表達(dá)的分泌型免疫球蛋白。初乳，分娩后的最初乳汁，特別富含免疫球蛋白；在新生兒的隱性免疫系統(tǒng)成熟之前，初乳天然地旨在為新生兒提供被動(dòng)免疫。卵、乳和特別是初乳含有母體動(dòng)物曾感染過的任何抗原的特異性分泌型抗體。
選擇家禽卵和牛乳或羊乳作為這些成分的可接受來源。由于這些物質(zhì)通常作為食物消耗，它們不僅不象例如猴乳或鴿卵那樣不具有全球的可接受性，而且它們是本發(fā)明所用類似物質(zhì)的十分充足的來源。
正如前面所指出的那樣，這些分泌物在本文是指“母體免疫分泌物”。分泌物提取物可用于復(fù)制人粘膜分泌物的基本成分，以及根據(jù)本發(fā)明可用于治療和/或預(yù)防以正常粘膜液流或其正常保護(hù)特性減少或缺失為為特征的人體病癥。
這里使用的術(shù)語預(yù)防包括母體免疫分泌物在制備可用于增強(qiáng)或基本代替正常粘膜分泌物的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所用藥物是模擬全部粘膜分泌物作用的天然來源的生物活性組分的組合物，特別是通過替代免疫成分(既替代特異性又替代非-特異性)、潤滑和水合粘蛋白以及需要時(shí)唾液復(fù)制品中的磷酸鈣結(jié)晶抑制劑。使用其大分子成分的天然存在的復(fù)制物，組合物可復(fù)制全部粘膜分泌物的已知生物功能，這樣，適宜于在本文所描述的保健應(yīng)用中長(zhǎng)期預(yù)防性給藥。
這里的藥物也指特別的飲食制劑。
例如，這里描述的藥物可包括治療或預(yù)防胃腸道感染的嬰兒乳制品。
優(yōu)選地，母體免疫分泌物包括它們的天然免疫系統(tǒng)成分。
天然免疫系統(tǒng)與特異或獲得性免疫系統(tǒng)的區(qū)別是天然免疫系統(tǒng)的成分對(duì)于任何一種微生物種屬或抗原類型均是非特異性的，同時(shí)也不需要任何事先與抗原的接觸(使免疫)以引發(fā)反應(yīng)。
另外，優(yōu)選地，天然免疫系統(tǒng)成分的抗體由非-免疫的天然抗體組成。
還有，優(yōu)選地，天然免疫系統(tǒng)成分的抗體成分包括多特異抗體。
為了特定應(yīng)用，可通過在收集分泌物之前先將動(dòng)物免疫而增強(qiáng)母體免疫分泌物，然而，一般不需要這樣。
因此，母體免疫分泌物或其一部分可得自超免疫動(dòng)物。
優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明藥物是唾液復(fù)制品時(shí)，藥物將包括分泌型免疫球蛋白作為它的組分，從而模擬人唾液的分泌型IgA和IgG。如果需要，可通過用得自下列口腔病原菌的任何一個(gè)或聯(lián)合抗原接種供體動(dòng)物而增強(qiáng)免疫性能鏈球菌屬；變異鏈球菌、鼠鏈球菌、大鼠鏈球菌、表兄鏈球菌、野生鏈球菌、彌猴鏈球菌、汗毛鏈球菌或它們的血清型，血鏈球菌，口腔鏈球菌，緩癥鏈球菌，唾液鏈球菌，前庭鏈球菌。
乳酸桿菌屬；鼠李糖乳桿菌，嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌放線菌屬；衣氏放線菌、內(nèi)氏放線菌和粘放線菌二氧化碳嗜纖維菌屬；生痰二氧化碳嗜纖維菌，黃褐二氧化碳嗜纖維菌和牙齦二氧化碳嗜纖維菌具核梭桿菌屬伴放線放線桿菌。
假絲酵母屬；白色假絲酵母，dublinensis，glabrata，熱帶假絲酵母，克魯斯氏假絲酵母，乳酒假絲酵母和星形假絲酵母。
正如上面所指出的那樣，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，藥物是所述人粘膜分泌物的復(fù)制品。
為開發(fā)預(yù)防或治療粘膜的有效制劑，復(fù)制品盡可能接近天然分泌物的所有特性是必要的。最需要的制劑將包括廣譜抗微生物活性而不是完全抗菌，從而清除機(jī)會(huì)病原菌的過度定居，同時(shí)促進(jìn)天然微生物菌群的再-平衡。唾液天然促進(jìn)口腔正常微生物菌群的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制粘膜的過度定居。參見，唾液和口腔健康(Saliva and Oral Health)；Edgar和O’Mullane編寫大不列顛牙科協(xié)會(huì)(British Dental Association)出版；第100-101頁。天然分泌物的水合和潤滑性能是粘膜保健的基礎(chǔ)，在唾液，調(diào)節(jié)鈣結(jié)晶的獨(dú)特性能對(duì)于保養(yǎng)牙釉質(zhì)很關(guān)鍵。也需要為長(zhǎng)期預(yù)防設(shè)計(jì)沒有傳統(tǒng)抗生素或抗菌劑副作用的制劑。
優(yōu)選地，所述分泌物富含天然免疫成分中的一種或多種成分。
因此，本發(fā)明提供i)非-免疫的‘天然’或‘初始’抗體；ii)與任選地包括非免疫抗體的天然免疫系統(tǒng)成分聯(lián)合；和iii)天然免疫系統(tǒng)成分與免疫抗體(超免疫抗體)聯(lián)合；在母體免疫分泌物或其復(fù)制品中在預(yù)防或治療前面提到的并將在后面更加詳細(xì)介紹的病癥中的應(yīng)用。
正如這里所描述的，通過從母體免疫分泌物中提取各種天然免疫成分和接下來將該免疫成分或每一個(gè)提取的免疫系統(tǒng)成分加入到含母體免疫分泌物或它們的復(fù)制品中，可以增強(qiáng)分泌物或復(fù)制品的作用，視情況而定。因此，此過程可能獲得具有接近超免疫免疫球蛋白效能的天然或‘背景’免疫球蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，基于蛋白質(zhì)粘附于微生物細(xì)胞表面的生物特性，天然免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)通常是從卵黃中提取和濃縮的。由于在食品中使用，在這點(diǎn)上發(fā)面酵母菌是適用的。對(duì)微生物細(xì)胞具有親和力的天然免疫系統(tǒng)成分，粘附于酵母菌并可通過離心而收集。通過控制pH和離子強(qiáng)度，可將天然免疫系統(tǒng)成分從酵母菌上解吸附。由于天然系統(tǒng)的多特異性，從發(fā)面酵母菌上解吸附的破片成分將強(qiáng)烈地粘附于各種微生物種屬，結(jié)果將抑制這些微生物種屬與粘膜上皮細(xì)胞的粘附。
將卵黃脫脂并非必要，但是脫脂可提高收率并便于測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)需要時(shí)，可使用超臨界二氧化碳溶解卵黃脂或者通過用9倍體積的蒸餾水稀釋卵黃并于-70℃冷凍24小時(shí)而更簡(jiǎn)單地將卵黃脂去除。融化，離心將脂部分分離。收集經(jīng)平紋細(xì)布(muslin cloth)過濾的上清液而去除仍漂浮著的低密度脂部分。
微生物細(xì)胞可被有效地用作天然免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的誘餌。這樣，利用蛋白質(zhì)粘附于微生物細(xì)胞表面的生物特性的過程，這些蛋白質(zhì)全部被濃縮；與此同時(shí)，使得所有分子實(shí)體的提取物和濃縮物分享此特性。
除外使用微生物細(xì)胞本身，使用適宜微生物種屬的細(xì)胞壁成分與內(nèi)表面鍵合如聚苯乙烯珠也是可能的。
卵黃是由懸浮于水性蛋白質(zhì)溶液(漿)中的粒狀和球狀體構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，卵黃通過卵黃膜而與卵白分隔。卵黃的大分子成分由脂、蛋白質(zhì)、脂蛋白和磷脂蛋白、低聚糖和糖蛋白組成，每一種成分具有不同的水溶解度，彼此之間有不同程度的親和力，因而一些聚集成球狀體。有一篇對(duì)卵蛋白的全面綜述卵科學(xué)和技術(shù)(Egg Science and Technology)，Staedelman和Cotterill編寫，Hayworth出版，國際標(biāo)準(zhǔn)書號(hào)156022 8555，第105-175頁。
卵黃漿的水溶性蛋白質(zhì)區(qū)分為與雞血清蛋白相對(duì)應(yīng)的α、β、γ和δ卵黃球蛋白。Chang，P.K.等((1977)，食品科學(xué)雜志(J.Food Sci.)35，87-88)報(bào)道脫脂卵黃提取物中確定有19種獨(dú)立蛋白質(zhì)，而卵漿部分α和β中有9種蛋白質(zhì)；γ部分是單個(gè)蛋白質(zhì)，相當(dāng)于血清γ球蛋白。1969年Leslie，G.A.和Clem，L.W.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)130，1337-1352)確定此γ球蛋白為免疫球蛋白IgY。
使用等電聚焦(IEF)技術(shù)顯示，從發(fā)面酵母菌上解吸附的天然系統(tǒng)成分由高達(dá)11條分離蛋白帶組成；其中兩條是高度磷?；幕騡lycosylate的，因?yàn)樗鼈冎皇窃谙跛徙y或酰氨黑染色時(shí)才可見到。至少一種IEF帶代表γ球蛋白(抗體)，其它是非免疫球蛋白。
如前所述，天然免疫系統(tǒng)能力不限于卵黃成分，也包括卵白的成分。使用本領(lǐng)域任何常規(guī)的方法可將天然免疫系統(tǒng)的獨(dú)立成分分餾以提供呈現(xiàn)分立的生物功能的純化組分。
純化成分包括蛋白質(zhì)、脂蛋白、肽、肽聚糖、脂、烴、低聚糖或任何其它大分子成分或顯示類似于粘膜分泌物性能的生物功能成分的聯(lián)合。
如這里描述的，在為構(gòu)建人造粘膜或人粘膜其它預(yù)防性應(yīng)用而使用天然免疫成分時(shí)，可能希望校準(zhǔn)各個(gè)成分的相對(duì)濃度。通過純化各個(gè)組分的量和將這些成分加回到一批去卵白蛋白的卵白或脫脂卵黃或它們的混合物中而完成校準(zhǔn)。
這樣，從卵和乳提取、純化和再-配制以提供模擬唾液功能的唾液復(fù)制品成分的生物特性，將在下面詳細(xì)描述，此后也稱為唾液復(fù)制品。
盡管不希望受任何理論說明的限制，本發(fā)明非特異免疫成分如低聚糖可能通過結(jié)合個(gè)別組分而加強(qiáng)其它成分包括免疫球蛋白的作用，因而，有利于在微生物細(xì)胞表面聯(lián)合作用。
定義的卵天然免疫系統(tǒng)包括下述模擬人唾液類似因子的實(shí)體溶菌酶卵白富含溶菌酶，溶菌酶很容易提取和純化。每升唾液通常含有約100mg溶菌酶。眾所周知，該酶的抗微生物功能是水解細(xì)菌細(xì)胞壁的胞壁質(zhì)，特別是革蘭氏陽性細(xì)菌包括變異鏈球菌，在低滲溶液中引起細(xì)胞溶解。溶菌酶也被認(rèn)為增強(qiáng)分泌型免疫球蛋白的功能。
乳鐵蛋白每升唾液含有10-20mg此種鐵結(jié)合蛋白，已證實(shí)乳鐵蛋白是螯合鐵，它不是口腔微生物菌群的營養(yǎng)素。卵白含有約13％卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，現(xiàn)在已知卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能類似于唾液乳鐵蛋白和人血清鐵蛋白。
生長(zhǎng)因子抑制Tenovuo，J.O.((1989)supra)提出唾液中存在類似于乳鐵蛋白的結(jié)合因子但功能是沒收維生素B12。卵白含有抗生物素蛋白，已知后者與生物素結(jié)合到這樣的程度以致于可引起大鼠此維生素的營養(yǎng)性缺乏。生物素是念珠菌和其它致病性酵母種屬的基本生長(zhǎng)因子(F.C.Odds；念珠菌和念珠菌病(Candida和Candidosis.)第13頁)。
酶抑制也已知唾液含有一定量的酶抑制劑。因此，已證實(shí)唾液含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白，細(xì)菌蛋白酶活性的抑制劑(Saitoh.E.和Isemura S.口腔生物醫(yī)學(xué)的評(píng)論性綜述(Crit.Rev.Oral Biol.Med.)(1993)4，487-493)。也如抑半胱氨酸蛋白酶蛋白那樣，卵白含有稱為類卵粘蛋白的胰蛋白酶抑制劑，類卵粘蛋白呈現(xiàn)出不同于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和其它唾液成分的強(qiáng)的蛋白水解抑制作用。
卵黃蛋白卵黃的非特異和多特異成分包括γ卵黃蛋白，γ卵黃蛋白作用方式類似于分泌型抗體，通過與微生物細(xì)胞表面結(jié)合，從而建立分子屏障以阻止微生物細(xì)胞與宿主組織粘附。
這里描述的視情況而定的唾液和其它粘膜分泌物的復(fù)制性能，包括但不限于分泌型免疫球蛋白的特異和非特異/多特異免疫特性；溶菌酶、涎過氧化物酶、histatins、粘蛋白、粘附素、防衛(wèi)素、爪蟾抗菌肽、collectin和殺菌肽的天然免疫特性；卵類粘蛋白和其它因子的蛋白水解抑制作用；乳鐵蛋白、抗生物素蛋白和其它生長(zhǎng)因子沒收劑的代謝調(diào)節(jié)作用；statherins、富含脯氨酸蛋白(PRP)和磷蛋白的鈣結(jié)晶抑制和表膜形成特性；粘蛋白和糖蛋白的水合和潤滑特性；碳酸鈣的再礦物化特性；磷酸鈣和鉀的緩沖特性；和葡萄糖、尿素和游離氨基酸的微生物營養(yǎng)特性。
根據(jù)本發(fā)明，為了預(yù)防或治療口腔感染，唾液復(fù)制品可被增強(qiáng)。
可制備針對(duì)特定微生物的增加個(gè)別組分濃度的特定制劑。
從用適宜抗原超免疫過的動(dòng)物提取的特異免疫球蛋白也可與本文描述的提取的天然系統(tǒng)成分聯(lián)合。
本發(fā)明抗念珠菌制劑通常包括特異抗念珠菌免疫球蛋白與濃度增加了的抗生物素蛋白聯(lián)合。該制劑中的抗生物素蛋白將與念珠菌基本生長(zhǎng)因子-生物素結(jié)合。增加制劑中沒收鐵的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度將使酵母菌既喪失鐵又喪失生物素，因而導(dǎo)致抗微生物活性大大增加。
應(yīng)認(rèn)識(shí)到該制劑在治療普通念珠菌病有效并特異地對(duì)鞘鵝口瘡有效。
本發(fā)明抗口臭制劑通常包括對(duì)抗常常與口腔中蛋白水解活性有關(guān)的革蘭氏陰性厭氧微生物的特異免疫球蛋白與卵類粘蛋白聯(lián)合，所述革蘭氏陰性厭氧微生物包括Treponema denticola，Porphyromonas gingivalis，Prevotellaintermedia、Bacterides forsythus和Fusobacterium，所述卵類粘蛋白抑制這些微生物的蛋白水解活性。
增加上述制劑中溶菌酶的濃度將進(jìn)一步增強(qiáng)抗微生物活性，甚至對(duì)革蘭氏陰性微生物有效，而溶菌酶本身通常對(duì)革蘭氏陰性微生物沒有影響。
本發(fā)明抗斑制劑通常包括對(duì)變異鏈球菌種屬特異的免疫球蛋白與增濃的溶菌酶的聯(lián)合，后者具有強(qiáng)的抗這些革蘭氏陽性球菌的溶菌活性。
增加唾液復(fù)制品中上述鑒定的每一個(gè)獨(dú)立成分的濃度，是指通過將各成分的純化提取物加入到一批唾液復(fù)制品中，使所述成分的量相對(duì)于唾液復(fù)制品中已存含量增加。優(yōu)選地，加入抗生物素蛋白的量不大于1mg/ml，加入的溶菌酶或卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的量不大于5mg/ml。
盡管不是必需的，但是上述制劑中，組合物在全卵的水性提取物的稀釋溶液中制備是優(yōu)選的。
發(fā)現(xiàn)個(gè)別成分所顯示的生物活性被全卵的稀釋性水性提取物增強(qiáng)。盡管不希望受任何理論解釋限制，但是提議某些水溶性組分作為凝集因子起作用，促進(jìn)該個(gè)別組分在微生物細(xì)胞表面結(jié)合。
本發(fā)明唾液復(fù)制品成分通常是家禽卵的成分，根據(jù)打算應(yīng)用的目的將家禽卵成分提取、純化、在特定特性的制劑中再集合，并制成最適于應(yīng)用的劑型?；钚越M分可以配制成用于牙膏內(nèi)含物的冷凍-干燥粉末形式，或是打算用作漱口劑而配制成液體形式。也可將活性組分在用作牙線包衣或托牙固定劑的蠟或聚合物中包膠囊或乳化。其它適宜制劑包括托牙分離劑或潤喉糖錠。
在本發(fā)明使用的任何制劑中，各種組分可與賦形劑聯(lián)合以增強(qiáng)活性組分與口腔或其它粘膜粘附或在計(jì)劃起作用的部位提供組分的持續(xù)或控制釋放。
在一口腔應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，活性組分制劑是持續(xù)釋放的口香糖制劑。
本發(fā)明由母體免疫分泌物制備的藥物可用于口腔的多種病癥和疾病。
本發(fā)明使用的唾液復(fù)制品制劑可用于常規(guī)預(yù)防齲齒和牙齦疾病，用于患其它口腔疾病而沒有預(yù)-處理的個(gè)體，或者，更特異地配制以補(bǔ)償正常唾液流量從而預(yù)防其他健康個(gè)體的復(fù)發(fā)感染如鵝口瘡。唾液復(fù)制品也配制成完全替代免疫損害個(gè)體的正常唾液中減弱的免疫成分。唾液復(fù)制品還可配制成補(bǔ)充或完全替代口腔干燥癥的衰弱的唾液腺體功能。甚至用于細(xì)菌性口臭的涉及個(gè)別組分如蛋白酶抑制劑(類卵粘蛋白)的更特異制劑也是可能的。
如上面所指出，這里描述的藥物可用于治療和/或預(yù)防口腔感染。
例如，藥物可用于預(yù)防和治療口腔鵝口瘡，鵝口瘡可能是口腔干燥引起的復(fù)發(fā)性感染。
本發(fā)明藥物可用于預(yù)防齲齒。
本發(fā)明藥物也可用于治療和/或預(yù)防以牙齦炎癥為特征的口腔病癥。
本發(fā)明藥物另外一個(gè)用途是治療和/或預(yù)防口臭。
用于口腔干燥和口臭時(shí)，優(yōu)選的制劑是上面提到的漱口劑和口香糖。
本發(fā)明藥物也可用于減輕某些代謝障礙的影響。
因此，本發(fā)明藥物可用于限制食物中鐵的攝取。
唾液是咀嚼潤滑劑，由此而浸濕所有咀嚼食物。唾液淀粉酶的作用已被很好地闡明，它通常在口腔中啟動(dòng)淀粉的消化。很少了解其它唾液成分與食物的相互作用，特別是在調(diào)節(jié)食物成分吸收方面。乳鐵蛋白調(diào)節(jié)鐵攝取作用被認(rèn)為是患血色素沉著個(gè)體的顯著特征，血色素沉著是缺乏對(duì)過量吸收鐵控制調(diào)節(jié)而導(dǎo)致鐵的過量吸收。可以特異配制通過增加卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵黃高磷蛋白含量來減少鐵從飲食中攝取的藥物。
這樣，鐵與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵黃高磷蛋白結(jié)合的特性可用于沒收飲食中的鐵，從而就象在治療血色素沉著時(shí)希望的那樣限制鐵的系統(tǒng)吸收。制劑中加入蛋白水解抑制劑-類卵粘蛋白，將進(jìn)一步抑制胰蛋白酶消化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵絡(luò)合物，從而進(jìn)一步限制鐵的飲食攝取。
類似地，分泌型IgA在調(diào)節(jié)食物中抗原攝取方面起作用。本發(fā)明藥物可用于抑制食物中可能引起某些個(gè)體過敏的成分的吸收。用特異過敏原將供體動(dòng)物免疫，免疫球蛋白成分可直接對(duì)抗這些致過敏成分，由此將這些過敏原從消化道的吸收減至最少。
所以，使用本發(fā)明藥物影響食物中特定成分的吸收是可能的。
另外，藥物可包括一種或多種唾液特有的無機(jī)鹽。
本發(fā)明唾液復(fù)制品的治療特性可通過摻入已知在口腔保健中具有修復(fù)特性的中草藥提取物而更進(jìn)一步地增強(qiáng)。
因此，本發(fā)明藥物可與增強(qiáng)所述分泌物作用的植物提取物同時(shí)、分開或順次給藥。
適宜地，植物提取物可得自歐洲越桔(Vaccinium myrtillis)、玉米、香蜂花(Melissa officinalis)或小葉毛果蕓香(Pilocarpus microphylus)。
科學(xué)文獻(xiàn)和藥典參考支持歐洲越桔提取物在口腔保健中的治療價(jià)值Morazzoni，P和Bombardelli，E.，F(xiàn)itoterapia(1996)LXVII，1。
發(fā)現(xiàn)花色甙(anthocyanin)在其中提供如下特性刺激粘多糖生物合成刺激糖胺聚糖生物合成抗炎作用，這是由于降低了毛細(xì)血管通透性，而降低毛細(xì)血管通透性可能是與膠原交聯(lián)從而增加對(duì)膠原酶活性的抵抗力的結(jié)果。
標(biāo)準(zhǔn)提取物的總抗收斂性引起口腔中唾液和粘液分泌增加。
由香蜂花(香峰葉(lemon balm))提取的rosmarinic酸已被清楚地證實(shí)在治療單純性皰疹中具有治療價(jià)值Wolbling，R.H.和Leonhardt，K.，植物醫(yī)學(xué)(phytomedicine)(1994)1，25-31。
據(jù)報(bào)道玉米的不可皂化成分通過刺激成骨細(xì)胞而刺激牙槽骨生長(zhǎng)，所以在修復(fù)牙周骨缺損上是有價(jià)值的。(Nuova Linnea Sa，Locarno，Switzerland)。
藥物毛果蕓香堿以膠囊形式常規(guī)地給予那些患口腔干燥的患者，5mg每日3次。該藥物是膽堿能激動(dòng)劑，增加液體的產(chǎn)生但對(duì)唾液生物功能所必要的大分子成分則很少有改善。該治療的副作用是頻繁的，包括發(fā)汗、流淚和惡心。為例將這些副作用減至最少，通常將劑量個(gè)體化給藥；個(gè)體化有效劑量可從1mg到15mg，每日3次。
南美印地安人常常咀嚼稱為Joborandi的植物以利用其生涎特性。以與作為煙草替代物而使用尼古丁口香糖的同樣方式，將毛果蕓香堿摻入口香糖中，促進(jìn)個(gè)體化劑量控制。本發(fā)明描述的母體免疫系統(tǒng)分泌物提取物與口香糖中的毛果蕓香堿一起將增加液量及替代正常唾液所必需的大分子成分。
另一方面，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防口腔病癥的制劑，制劑包括此前定義的母體免疫分泌物和多元醇，所述病癥以缺失正常唾液或喪失的唾液正常生物特性為特征。
優(yōu)選地，多元醇選自赤蘚醇、甘露醇、山梨醇和木糖醇。
已知該多元醇用于牙科保健產(chǎn)品并干擾微生物轉(zhuǎn)化飲食中的糖類，由此而防止牙斑中酸的形成。
還有，制劑是口香糖、潤喉糖錠、漱口劑或牙膏形式。
再一方面，本發(fā)明提供用于治療/或預(yù)防以正常機(jī)體產(chǎn)生的粘液分泌物或粘液分泌物的正常生物特性缺失為特征的或?qū)λ稣衬し置诿舾械娜梭w病癥的組合物，所述組合物包括具有所述粘膜分泌物生物活性特征的母體免疫分泌物的天然免疫物質(zhì)。
本發(fā)明使用的藥物可以能有效地達(dá)到所需治療或預(yù)防作用的任何劑型給藥或施用。
上述制劑通常是那些適于口腔治療的制劑。然而，包括口服給藥、非腸道給藥和局部應(yīng)用、鼻腔噴霧、陰道栓劑的其它應(yīng)用也是可取的。
如果是眼部病癥，可使用滴眼劑、軟膏、眼睛植入體等等。
對(duì)母體免疫分泌物敏感病癥包括創(chuàng)傷和擦傷的治療、燒傷和皮膚感染。
因此，這里描述的藥物可摻入調(diào)味品中。
根據(jù)本發(fā)明，可治療的典型皮膚感染包括唇皰疹、皮炎、痤瘡和感染。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示在單獨(dú)存在濃縮卵黃蛋白時(shí)或在卵黃蛋白與去卵白蛋白卵白聯(lián)合存在時(shí)與超免疫抗念珠菌免疫球蛋白和實(shí)施例6描述的對(duì)照相比，粘附于口腔上皮細(xì)胞的白色念珠菌細(xì)胞數(shù)量的曲線圖。
圖2是在培養(yǎng)介質(zhì)中按實(shí)施例7描述的那樣接種后9小時(shí)時(shí)600nm處的O.D.對(duì)去卵白蛋白的卵白(mg/ml)劑量的曲線圖；圖3是在培養(yǎng)介質(zhì)中按實(shí)施例7描述的那樣接種后9、12和15小時(shí)時(shí)600nm處的O.D.對(duì)去卵白蛋白的卵白(mg/ml)劑量的曲線圖。
圖4是顯示實(shí)施例7描述的在添加了溶菌酶(1mg/ml)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(1mg/ml)或抗生物素蛋白(0.1mg/ml)或它們聯(lián)合的的2％葡萄糖的酵母菌氮基上生長(zhǎng)的白色念珠菌600nm處的O.D.對(duì)時(shí)間(小時(shí))的曲線圖；圖5.是顯示實(shí)施例7描述在添加了去卵白蛋白的卵(1mg/ml)或者卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(0.25mg/ml)、溶菌酶(0.1mg/ml)和抗生物素蛋白(0.05mg/ml)聯(lián)合的2％葡萄糖酵母氮基上生長(zhǎng)的白色念珠菌600nm處的O.D.對(duì)時(shí)間(小時(shí))的曲線圖；圖6是表示實(shí)施例9描述的在存在唾液、卵天然免疫成分和空白時(shí)飽和溶液(飽和溶液的％)中鈣的缺失對(duì)時(shí)間(分)的復(fù)合曲線圖；圖7表示實(shí)施例10描述顯示在不同濃度木糖醇和卵天然免疫成分的80％SBNB中生長(zhǎng)的變異鏈球菌600nm處的O.D.對(duì)時(shí)間(小時(shí))的系列曲線圖；圖8是實(shí)施例10描述的600nm處O.D.對(duì)遞增濃度的去卵白蛋白的卵(mg/ml)和在存在木糖醇(0.5％)時(shí)的去卵白蛋白卵的系列直方圖；圖9表示實(shí)施例10描述顯示在80％SBNB中，在各種多元醇(0.5％)和卵天然免疫系統(tǒng)提取物(0.075％)存在時(shí)變異鏈球菌的生長(zhǎng)的600nm處O.D.對(duì)時(shí)間(小時(shí))的系列曲線圖；和圖10顯示實(shí)施例12描述的與超免疫抗變異鏈球菌卵IgY相比，在存在來源于卵和乳的天然免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)時(shí)變異鏈球菌與羥磷灰石粒相對(duì)粘附％。
下述實(shí)施例將進(jìn)一步闡述本發(fā)明完成本發(fā)明的模式實(shí)施例1該實(shí)施例描述全卵的水性級(jí)分將抑制變異鏈球菌與唾液飽和的實(shí)驗(yàn)性牙釉質(zhì)(羥磷灰石粒)的結(jié)合。這是由于與表膜層競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合還是由于特異性抑制作用尚不知道。
在2小時(shí)的期間在冰上從一個(gè)體收集大約100ml的唾液；通過咀嚼一片‘Parafilm’來刺激唾液流量(Parafilm是商標(biāo))。
卵提取物制備將一個(gè)卵打破倒入1升無菌蒸餾水中，攪拌1分鐘，在電冰箱中放置12小時(shí)。從不溶性凝結(jié)物中輕輕倒出水溶性部分用作流體。將一半唾液樣本用生理鹽水稀釋，另一半用非特異全卵的水性部分稀釋。兩部分均用0.2微米的濾膜過濾滅菌。
每50ml部分中加入1g滅菌羥磷灰石粒(BDH)并水化12小時(shí)。兩部分均接種上在充氮(為了刺激細(xì)胞外多糖生成)二氧化碳條件下在蔗糖血液瓊脂上生長(zhǎng)的變異鏈球菌培養(yǎng)物懸浮液并于30℃孵育12小時(shí)。
用等體積無菌生理鹽水沖洗兩種樣本的羥磷灰石粒兩次，用標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色法染色。雖然羥磷灰石粒染上一些染料，但是在顯微鏡下粒上的革蘭氏陽性球菌清晰可辨。利用這種目視分析，很顯然卵黃提取物抑制變異鏈球菌的粘附，因?yàn)閺膯渭兺僖旱牧u磷灰石粒上可見到的細(xì)胞數(shù)量大約大100倍。
在含唾液蛋白的條件下，未免疫卵的水性提取物抑制變異鏈球菌粘附于羥磷灰石粒的事實(shí)需要進(jìn)一步研究。由于雞在環(huán)境中暴露于鏈球菌屬微生物，所以卵含有鏈球菌屬的背景免疫球蛋白是可能的?；蛘撸旅孀C實(shí)的抑制鈣沉淀的卵黃成分也可能與唾液的statherin和PRP成分結(jié)合產(chǎn)生位阻而進(jìn)一步被變異鏈球菌結(jié)合。也可能是卵中的天然免疫成分起到了抑制粘附的作用。
實(shí)施例2本實(shí)施例證實(shí)全卵的水溶性部分具有抑制鈣沉積作用。
全卵的水溶性提取物按照實(shí)施例1制備。將溶液放置在20℃水浴中而保持卵溶液的溫度。將碳酸氫鈣加入到卵的粗溶液中直到獲得飽和溶液；與燒瓶底部未溶解的碳酸鈣結(jié)合而形成沉淀。12小時(shí)后將清澈的上清液輕輕倒入新的燒瓶中并保持在20℃的水浴中。用蒸餾水和碳酸鈣而不使用卵來制備類似的溶液，將上清液以類似方式從未溶解的結(jié)晶中傾析出來。兩種溶液放置在分別盛有500mg作為結(jié)晶啟動(dòng)子的羥磷灰石粒(BDH)的上端開口的500ml燒杯中。溶液在20℃水浴中保持3天，在此期間觀察結(jié)晶速度。不含有卵的溶液在24小時(shí)后出現(xiàn)結(jié)晶，而卵溶液直到16小時(shí)仍無結(jié)晶出現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相似。
卵為什么具有結(jié)晶抑制特性的確切機(jī)理尚不知道。推測(cè)這可能是一種生物機(jī)制，所述機(jī)制適用于許多不同功用包括鈣在蛋殼的沉積或在雞胚發(fā)育中的作用。無論緣何原因使得該特征存在，它提供自身在制成唾液替代產(chǎn)品中的偶然發(fā)現(xiàn)的用途。
實(shí)施例3作為口腔保健常規(guī)預(yù)防劑的人唾液復(fù)制品取自未免疫母雞的卵黃用作上述實(shí)施例目的的起始物料。通過僅僅去除膽固醇成分而將全部水溶性成分進(jìn)行純化。此過程可通過任何一個(gè)工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來完成；液態(tài)二氧化碳的使用是得到食品工業(yè)認(rèn)同并且是從卵黃水性溶液中去除脂類和脂溶性成分而不損傷蛋白成分的非常適宜的方法。冷凍干燥該殘留的含有免疫球蛋白成分和非特異免疫組分，以及其它活性成分的水溶性部分。
冷凍干燥的粗提物可摻入任何適宜的釋放系統(tǒng)包括口香糖并用來提供前述口腔保健的常規(guī)預(yù)防作用。
實(shí)施例4
為在口腔保健中常規(guī)預(yù)防設(shè)計(jì)的唾液復(fù)制品使用前面所指出的微生物抗原的任何一種或其聯(lián)合，或者由于經(jīng)口吸收引起疾病所暗示的任何抗原而將家養(yǎng)母雞免疫。當(dāng)卵抗體效價(jià)最大時(shí)，收集卵并將免疫成分純化。
使用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白分餾技術(shù)，包括凝膠過濾色譜，可以將卵白的水溶性成分分離。使用離子交換色譜和分子篩技術(shù)可以將包括溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗生物素蛋白和類卵粘蛋白在內(nèi)的特異成分進(jìn)一步純化。也可將特異性糖蛋白成分分離，這些糖蛋白成分包括粘蛋白和凝集蛋白。
從卵黃和卵白中均已分離出顯示鈣結(jié)晶抑制作用的成分，表明它們是具有相似性能的獨(dú)立的分子實(shí)體，或者它們是卵黃膜的成分。
冷凍干燥每一獨(dú)立成分并根據(jù)蛋白含量和特異活性進(jìn)行分類。純化的成分可用于配制標(biāo)準(zhǔn)制劑。
然后在全卵的滅菌的水性提取物中配制下述成分的溶液。
組分 大約濃度非特異免疫組分 2000mM特異免疫球蛋白 200mM糖蛋白 200mM脂多糖 200mM粘蛋白 200mM卵類粘蛋白 100mM溶菌酶 100mM抗生物素蛋白 100mM卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 100mM尿素 10mM必需氨基酸 10mM必需脂肪酸 10mM鈣 2mM鎂 0.2mM鈉 20mM鉀 20mM氨 5mM
磷酸氫鹽(二價(jià))20mM磷酸二氫鹽(單價(jià)) 20mM碳酸氫鹽 20mM使用0.1摩爾鹽酸或0.1摩爾的氫氧化銨溶液將pH滴定到6.7。
將該溶液冷凍干燥并在制備終制劑口香糖、潤喉糖錠、牙膏、牙線托牙分離劑和漱口劑中用作活性成分，它也可摻入特異的飲食配方中。
實(shí)施例5取自卵黃天然免疫系統(tǒng)的組分的提取和濃縮40g新鮮發(fā)面酵母菌(釀酒酵母菌)通過懸浮在1升10mM pH7.0磷酸緩沖液中并加熱到60℃1小時(shí)而滅活。滅活是必需的以防止提取過程中的蛋白酶活性。由于發(fā)面酵母是食物成分，所以它是優(yōu)選的，并因而無需考慮安全性或毒性問題。滅活酵母菌然后經(jīng)離心洗滌制備，首先在pH4.0含0.01％吐溫80(吐溫是一個(gè)商標(biāo))的1.0mM磷酸鉀緩沖液中離心洗滌，然后在pH7.0 10mM磷酸鉀緩沖液中離心洗滌2次。高離子強(qiáng)度、低pH緩沖液與吐溫的作用是去除可能干擾提取過程的任何松散粘附的囊蛋白或細(xì)胞表面大分子。
用上述方法制備卵黃的不含脂提取物，用pH7 10mM磷酸鉀緩沖液將蛋白濃度調(diào)節(jié)到10mg/ml。
按每25mg蛋白質(zhì)加入1克濕重細(xì)胞的量將制備的酵母菌加入到卵黃溶液中。懸浮液在30℃孵育1小時(shí)，在此期間天然免疫系統(tǒng)組分結(jié)合到酵母細(xì)胞表面。用pH7.0 10mM磷酸鉀緩沖液離心洗滌2次來回收酵母菌與結(jié)合物質(zhì)，用含0.01％吐溫的pH4.0 1.0mM磷酸鉀緩沖液重新懸浮，并劇烈振蕩30分鐘以將結(jié)合卵成分解吸附。離心除去廢酵母菌，用pH7.0 10mM磷酸鉀緩沖液透析上清液。
用Lowry分析法測(cè)定蛋白質(zhì)，牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)品。
蛋白質(zhì)的收率為卵溶液蛋白含量的48％。使用新鮮酵母菌在同樣的卵黃溶液中重復(fù)此過程或者在較低pH下解吸附可稍稍提高收率。使用所述方法得到的最大收率是54％，說明40％的卵黃蛋白質(zhì)沒有結(jié)合到酵母細(xì)胞上。
用4％聚丙烯酰胺凝膠(Pharmacia，Sweden)等電聚焦技術(shù)，比較脫脂卵蛋白質(zhì)與從發(fā)面酵母菌上解吸附下來的成分的分布。使用微量吸管(50μg蛋白質(zhì)/20μl)將樣本材料加到凝膠中，凝膠在非-還原條件下使用BioRad(BioRad是一個(gè)商標(biāo))電源組在100瓦特按常規(guī)的方式走電泳。使用考馬斯藍(lán)和硝酸銀聯(lián)合染色，在脫脂卵成分中可見19條分離的蛋白帶；這與Chang，P.K.等((1970)supra)報(bào)道的一致。在解吸附(濃縮的)蛋白成分中見到9條帶，另有2條代表酸性磷蛋白的窄帶只在用硝酸銀染色時(shí)可見。注意到蛋白帶的數(shù)量并不直接與從卵溶液濃縮的蛋白總量相等是重要的，因?yàn)橐恍┣逦梢姷牡鞍讕Э赡苁窃诮馕竭^程中分離的個(gè)別球蛋白的亞基。
實(shí)施例6濃縮卵黃成分在體外的效力實(shí)施例5制備的濃縮卵蛋白的顯著特性是與各種微生物種屬的結(jié)合能力。為了證明濃縮卵黃蛋白的多特異結(jié)合能力，用pH7.0 10mM磷酸鉀緩沖液制備熱滅活的下述微生物的懸浮液釀酒酵母菌、白色念珠菌、變異鏈球菌、糞鏈球菌、干酪乳桿菌、狗齒齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、艱難梭菌和綠膿桿菌。微生物的肉湯培養(yǎng)基按下述接種，用高離子強(qiáng)度緩沖液離心洗滌，然后用低強(qiáng)度緩沖液平衡，并稀釋到600nm的光密度為1.0。
微生物細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠菌酵母菌接種到購自O(shè)xoid的薩布羅氏葡萄糖瓊脂(Sabouraud Dextrose)上。當(dāng)細(xì)胞用于口腔細(xì)胞粘附分析或在這里為評(píng)價(jià)任何天然免疫系統(tǒng)提取物的抗-粘附特性時(shí)，則制備薩布羅氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基。用購自Difco添加了2％葡萄糖的酵母菌氮基評(píng)價(jià)生長(zhǎng)抑制。
細(xì)菌，變異鏈球菌、糞鏈球菌、狗齒齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和艱難梭菌在購自O(shè)xoid的添加了去纖維馬血(購自O(shè)xoid)的哥倫比亞血瓊脂基上培養(yǎng)。梭狀芽胞桿菌和狗齒齦卟啉單胞菌是專性厭氧菌，于厭氧條件下在使用購自O(shè)xoid的填充厭氧氣的“氣瓶”中培養(yǎng)。當(dāng)用變異鏈球菌進(jìn)行抗-粘附研究時(shí)，該生物體首先在厭氧環(huán)境下在氣瓶中腦心肉浸汁中培養(yǎng)，以促進(jìn)細(xì)胞表面聚糖形成，所述聚糖被認(rèn)為與該生物體的粘附有關(guān)。
每一熱滅活培養(yǎng)物5.0ml加入5.0ml的每毫升含10mg總蛋白的濃縮卵蛋白溶液并于30℃孵育1小時(shí)。按照實(shí)施例5所描述的方式將培養(yǎng)物熱滅活。按照實(shí)施例5所述方法離心、洗滌收取微生物細(xì)胞并解吸附結(jié)合蛋白質(zhì)。作為測(cè)定孵育后在上清液中的殘留蛋白質(zhì)和經(jīng)過解吸附收取的量的指標(biāo)，結(jié)合到每一細(xì)胞上的蛋白質(zhì)的結(jié)果由表1所示。
表1濃縮卵黃蛋白自一系列生物體的吸附和解吸附作用

在每種情況下，均發(fā)現(xiàn)大約15％-20％的所用蛋白質(zhì)消失，最可能的解釋是蛋白質(zhì)仍結(jié)合在微生物細(xì)胞上。
面頰上皮細(xì)胞粘附為了證實(shí)濃縮卵黃蛋白在體外與面頰細(xì)胞粘附的效力，按照下述方式進(jìn)行了研究。
使用‘Costar’細(xì)胞刮刀(或用匙的鋒利邊沿)由頰的內(nèi)側(cè)刮取面頰上皮細(xì)胞。用pH7的磷酸鹽緩沖液稀釋細(xì)胞，并通過18微米的濾布洗滌以除去細(xì)胞碎片和細(xì)菌。在顯微鏡下使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)玻片計(jì)數(shù)洗滌后的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞與新鮮生長(zhǎng)(洗滌的)酵母菌按每個(gè)面頰細(xì)胞100個(gè)酵母菌的比例混合，在含或不含測(cè)試物質(zhì)的情況下在輕輕振蕩下于30℃孵育1小時(shí)。使用‘Cytospin’(Cytospin是一商標(biāo))振蕩器時(shí)，將轉(zhuǎn)速調(diào)至200轉(zhuǎn)/分。
孵育后將細(xì)胞混合物經(jīng)18微米濾布過濾并轉(zhuǎn)移到潔凈的顯微鏡玻片上空氣干燥過夜。將干燥的玻片短暫通過本生氏燈焰(Bunsen flame)進(jìn)行‘熱固定’。龍膽紫水溶液(1％w/v)滴到玻片上，1分鐘后漂凈并干燥。在放大500倍的顯微鏡下檢測(cè)粘附到每一頰細(xì)胞上的酵母菌細(xì)胞數(shù)量是相對(duì)容易計(jì)數(shù)的。粘附100頰細(xì)胞的平均酵母細(xì)胞數(shù)量作為測(cè)定粘附因素的指標(biāo)。
濃縮卵黃蛋白與由免疫了熱滅活白色念珠菌的母雞所產(chǎn)卵的超免疫抗-念珠菌免疫球蛋白提取物比較。超免疫抗-念珠菌免疫球蛋白按如下制備。
制備超免疫抗體用磷酸鹽緩沖液將新鮮生長(zhǎng)的白色念珠菌稀釋到在600nm光密度為1的濃度。通過加熱到60℃1小時(shí)而將細(xì)胞懸浮液減毒，并立即使用。
在8周期間內(nèi)以2周的間歇期給產(chǎn)卵雞在兩個(gè)部位肌內(nèi)注射在Freund’s完全佐劑中1ml減毒細(xì)胞。使用ELISA技術(shù)與過氧化物酶結(jié)合的山羊抗-雞免疫球蛋白(Sigma，英國)測(cè)定抗體滴度(原文第38頁)。
按照下述方法將超免疫卵抗體從卵中分離將卵黃從卵白中分離出來倒在潔凈的棉紙上，以從卵黃膜的外表面上吸去任何殘留的稀薄卵白。將取得的卵黃在玻璃燒杯中打碎，加入9倍體積的蒸餾水稀釋。溶液在-70℃冷凍過夜。離心融化溶液，通過平紋細(xì)布傾析上清液以除去仍漂浮著的低密度脂。
以遞增方式將12％聚乙二醇(分子量8000)加入到脫脂卵中，在室溫下平衡1小時(shí)。離心收集沉淀，用冰冷的乙醇補(bǔ)足到起始體積，20分鐘后離心溶液并用小量10mM磷酸緩沖液重新懸浮沉淀。用磷酸緩沖液將溶解部分透析過夜。
對(duì)照卵是沒有濃縮的脫脂卵黃，所有三部分均以1.0mg/ml和10mg/ml的濃度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見圖1。
圖1表明超免疫卵免疫球蛋白在10mg/ml時(shí)使得粘附每100頰細(xì)胞的酵母菌數(shù)量減少79％。10mg/ml濃縮卵蛋白減少達(dá)70％，而如實(shí)施例7中所描述的，1.0mg/ml濃縮卵蛋白與1.0mg/ml去-卵白蛋白卵白(DeOEW)聯(lián)合時(shí)，減少達(dá)95％。
實(shí)施例7去-卵白蛋白(DeOEW)卵制備如下制備9份去離子水的新鮮卵白的水性溶液，加入硫酸氨使得終濃度為90％w/v。平衡30分鐘后，離心收集蛋白質(zhì)沉淀，在去離子水中重新懸浮。用pH5.5 10mM乙酸銨緩沖液透析重新懸浮的沉淀，用同樣的緩沖液將濃度調(diào)整至10mg蛋白質(zhì)/ml。
制備的卵白溶液用于Whatman DE-52樹脂柱(Whatman是商標(biāo))，所述樹脂柱預(yù)先用10g/ml蛋白的pH5.5 10mM乙酸銨緩沖液的柱填充物平衡。在此條件下，溶菌酶、抗生物素蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白不與樹脂結(jié)合而以起始洗脫液形式從柱中回收。梯度增加洗脫液的離子強(qiáng)度(10mM到500mM乙酸銨)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑、卵抑制劑、G2和G3球蛋白在洗脫液中洗出。由于等電點(diǎn)相似，后期從柱中洗脫出的洗脫液中含有卵白蛋白中的類卵粘蛋白、卵粘蛋白、卵糖蛋白、卵黃素蛋白和卵巨球蛋白的混合成分。
使用10,000Kda排阻膜超濾將由DE-52柱洗脫出來的后期洗脫液濃縮，然后用于以pH5.5 10mM乙酸銨作載體的S-100凝膠過濾柱中。基于分子量分離出起始洗脫液中所含的卵粘蛋白和卵巨球蛋白，隨后是含卵白蛋白的大的成分，然后在后期洗脫液中的是類卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵糖蛋白。
在卵白蛋白洗脫之前和之后從S-100柱收集的蛋白質(zhì)與在出現(xiàn)混合卵白蛋白成分之前從DE-52柱洗脫下來的物質(zhì)結(jié)合。通過加入pH7.0 10mM磷酸鉀緩沖液在UF藥筒中經(jīng)超濾和透析法而將結(jié)合的溶液濃縮。
該實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入細(xì)菌或酵母菌時(shí)，去-卵白蛋白卵白顯示出獨(dú)特的劑量反應(yīng)關(guān)系。物料的抑制活性受培養(yǎng)介質(zhì)的強(qiáng)度、接種物的齡期和劑量影響。不象大多數(shù)抑制物質(zhì)那樣，作用不隨劑量增加而增加；在濃度大于1.0mg/ml時(shí)，存在反向反應(yīng)，即物料刺激生長(zhǎng)。在1.0/ml和0.1mg/ml之間時(shí)(取決于介質(zhì)強(qiáng)度)，抑制生長(zhǎng)。此獨(dú)特的劑量反應(yīng)可能是去-OEW或者其中個(gè)別組分的溶解特性。已知唾液顯示出類似的生長(zhǎng)刺激和抑制作用，這被認(rèn)為是維持口腔正常微生物菌群的先決條件見唾液和口腔健康(Saliva and Oral Health)；Ed’Edgar和O’Mullane；大不列顛牙科協(xié)會(huì)出版；第100-101頁。長(zhǎng)期使用抗生素和抗菌劑導(dǎo)致整個(gè)口腔抗菌，清除了唾液自然支持的健康微生物菌群，由此提供了支持后來的不適當(dāng)種屬菌群的機(jī)會(huì)。
研究了去-OEW對(duì)變異鏈球菌的作用，結(jié)果見圖2和圖3。
圖2描述去-OEW對(duì)接種后9小時(shí)時(shí)在80％SBNB中變異鏈球菌生長(zhǎng)的抑制作用。80％SBNB是購自O(shè)xoid的營養(yǎng)肉湯在正常強(qiáng)度的80％時(shí)添加了2％蔗糖并用pH6.8 0.5％磷酸二氫鉀緩沖。濃度在0.2mg/ml～1.0mg/ml時(shí)清楚地證實(shí)有抑制作用。如圖3所示，正如在分開的試驗(yàn)中所證實(shí)的那樣，樣本在9、12和15小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，抑制作用貫穿整個(gè)生長(zhǎng)周期。
不象抗生素或抗菌素，天然免疫系統(tǒng)不具有殺菌作用。抑制和刺激的二重性是反映人粘液(唾液)性能的獨(dú)特性，而不期望口腔的整體抗菌。
卵白的一些個(gè)別成分較卵黃的更具完整特性，(見Staedelman和Cotterill，卵科學(xué)和技術(shù)(Egg Science and Technology)第119-137頁)。主要組分與它們通常所具有的特性總結(jié)在表2中。
表2卵白組分卵白蛋白 54％磷酸糖蛋白卵轉(zhuǎn)鐵蛋白12％結(jié)合金屬離子卵類粘蛋白11％胰蛋白酶抑制劑卵粘蛋白 3.5％ 粘性涎蛋白溶菌酶3.4％ 對(duì)一些細(xì)菌的溶菌活性G2球蛋白 4％ 未知G3球蛋白 4％ 未知卵抑制劑 1.5％ 抑制絲氨酸蛋白酶卵糖蛋白 1％ 未知卵黃素蛋白0.8％ 結(jié)合核黃素卵巨球蛋白0.5％ 抗原半胱氨酸蛋白酶抑制劑 0.05％ 抑制巰基蛋白酶抗生物素蛋白 0.05％ 結(jié)合生物素總計(jì) 96％已知3種成分抑制微生物生長(zhǎng)，它們是溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和抗生物素蛋白。溶菌酶的抑制特性歸因于對(duì)特定細(xì)菌(非酵母菌)胞壁的酶解作用。已知卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與包括鐵在內(nèi)的許多金屬離子結(jié)合，因此剝奪了離子在介質(zhì)中的可利用性?？股锼氐鞍捉Y(jié)合生物素因而使得以生物素為必需生長(zhǎng)因子的生物體(包括酵母菌)不能利用生物素。每種組分對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的相對(duì)效力由圖4顯示。溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白本身均不抑制生長(zhǎng)，而抗生物素蛋白則大約使生長(zhǎng)減少50％。三者聯(lián)合時(shí)，生長(zhǎng)減少80％，故證實(shí)它們之間具有協(xié)同作用。去-卵白蛋白卵白降低生長(zhǎng)達(dá)98％。
去-卵白蛋白卵白的已知成分的相對(duì)百分濃度列于表3。
表3去-卵白蛋白卵白已知組分的大約相對(duì)百分濃度卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 24％卵類粘蛋白 24％卵粘蛋白8％溶菌酶 8％G2球蛋白8％G3球蛋白8％卵抑制劑4％卵糖蛋白3％卵黃素蛋白 2.5％卵巨球蛋白 2％半胱氨酸蛋白酶抑制劑0.2％抗生物素蛋白0.2％總計(jì)91.9％根據(jù)表3，1.0mg去-卵白蛋白卵白含有不到0.25mg的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、不到0.1mg的溶菌酶和不到0.05mg的抗生物素蛋白。
圖5描述卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(0.25mg/ml)、溶菌酶(0.1mg/ml)和抗生物素蛋白(0.05mg/ml)聯(lián)合時(shí)與1.0mg/ml去-卵白蛋白卵白對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的作用相比較，證明去-卵白蛋白卵白更大的抑制作用并不僅僅歸因于這三種成分。
實(shí)施例8合成唾液制劑去-卵白蛋白卵白(按照實(shí)施例7制備)和濃縮的脫-脂卵黃(如實(shí)施例5所描述的)等重量結(jié)合并溶于具有下述終濃度的有機(jī)鹽溶液中。
成分 每升濃度天然免疫系統(tǒng) 10克鈣 2mM鎂 0.2mM鈉 20mM鉀 20mM氨 5mM磷酸氫鹽(二價(jià)) 20mM磷酸二氫鹽(單價(jià)) 20mM碳酸氫鹽 20mM使用0.1摩爾鹽酸或0.1摩爾氫氧化銨將溶液pH值滴定到6.7。
制劑具有與新鮮全唾液相似的粘稠度，具有與唾液可比的流變學(xué)和抗干燥性。
實(shí)施例9抑制鈣沉積鈣將從飽和的氯化鈣或碳酸鈣溶液中出來沉積到任何提供了啟動(dòng)結(jié)晶生長(zhǎng)的晶種的適宜表面上。
用pH7.2 50mM HEPES緩沖液配制4mM氯化鈣溶液。向溶液中加入等重量的去-卵白蛋白卵白(如在實(shí)施例7制備的)和脫-脂濃縮卵黃(如在實(shí)施例5制備的)得到終濃度為0.01％w/v(0.1mg/ml)的溶液。取該溶液8ml加入到盛有1.6g BDH羥磷灰石粒的25ml‘Sterilin’通用瓶中。室溫下平衡后，加入含有15mM磷酸二氫鉀的pH7.2 50mM HEPES 8.0ml。溶液中磷酸鉀的作用是產(chǎn)生鈣的飽和溶液。
使用Hanna離子選擇性計(jì)量器與Hanna試劑測(cè)定溶液中鈣的損失，根據(jù)Van der Reijden，W.A.描述的方法(齲齒研究(Caries Research)1997；31216-223)進(jìn)行鈣的測(cè)定。溶液中鈣損失的百分比與不加蛋白質(zhì)的空白溶液、唾液飽和的羥磷灰石粒的對(duì)照溶液進(jìn)行比較，測(cè)試溶液由前述卵的天然成分組成。結(jié)果由圖6所示。40分鐘后，空白溶液中鈣濃度下降65％，存在唾液時(shí)下降百分比為35％，而卵蛋白顯示出出眾的溶液維護(hù)能力，鈣濃度僅下降18％。
實(shí)施例10摻入多元醇這里描述的天然免疫成分制劑具有取代氟作為牙膏和其它牙粉或提供廣譜抗微生物作用的口腔衛(wèi)生制劑中活性成分的潛在可能性，在用于齲齒時(shí)，與氟具有同等的益處，而在控制牙齦疾病、鵝口瘡和口臭時(shí)具有更廣泛的益處。
該實(shí)施例顯示卵的天然免疫組分增強(qiáng)木糖醇的作用，木糖醇放寬天然卵蛋白的抑制濃度。因此，二者之間具有協(xié)同作用，在卵天然免疫組分制劑中摻入低濃度多元醇，增加有益效果。
在80％蔗糖緩沖的營養(yǎng)肉湯(SBNB)介質(zhì)中培養(yǎng)(試管培養(yǎng))變異鏈球菌。介質(zhì)是80％SBNB，因?yàn)闋I養(yǎng)肉湯的終濃度時(shí)正常的80％。
介質(zhì)按如下配制Oxoid營養(yǎng)肉湯20.8克磷酸氫二鉀 17.9克蔗糖 40克蒸餾水 1升用鹽酸將上述溶液的pH值調(diào)至6.8。
上述5.0ml的等份溶液分配到25ml試管中，然后用脫脂棉封口并加壓滅菌。
測(cè)試物料溶液，即卵的天然免疫系統(tǒng)蛋白加或不加不同濃度的多元醇，在pH6.8 0.1mM磷酸緩沖液中配制，用0.2微米膠囊濾器過濾滅菌。
測(cè)試物料以無菌形式加入到滅菌介質(zhì)試管中，所加入的容量是當(dāng)每個(gè)試管中裝有總體積為10ml滅菌的pH6.8 0.1mM磷酸緩沖液時(shí)，使測(cè)試物料達(dá)到其特定濃度。
制備管接種0.1ml變異鏈球菌，在不含測(cè)試物料的80％SBNB中培養(yǎng)生長(zhǎng)12小時(shí)。接種管在37℃水浴孵育，用帶適宜濾光片的EEL比色計(jì)測(cè)得600nm處的光密度增加。每一測(cè)定系列均有一個(gè)由未接種介質(zhì)組成的空白管和一個(gè)由不含測(cè)試物料的接種介質(zhì)組成的對(duì)照管。
結(jié)果見圖7-9。
圖7代表80％SBNB摻入木糖醇時(shí)對(duì)變異鏈球菌的作用。0.25％w/v～1.0％w/v木糖醇增加生長(zhǎng)抑制作用。相同系列顯示從0.025％w/v至高達(dá)0.075％w/v卵天然免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的抑制作用。如圖所示，0.5％木糖醇與0.075％卵白提取物的天然免疫系統(tǒng)成分(按照實(shí)施例7制備)聯(lián)合增大抑制作用。應(yīng)當(dāng)注意該系列也證實(shí)前面所述的天然免疫系統(tǒng)蛋白的反向抑制作用。
圖8代表變異鏈球菌在80％SBNB中在增加實(shí)施例7制備的提取物的濃度的條件下9小時(shí)生長(zhǎng)的結(jié)果。相同系列鄰管添加0.5％木糖醇。木糖醇提高抑制濃度‘窗’，卵提取物本身時(shí)抑制濃度為0.2-1.0mg/ml，加入0.5％木糖醇時(shí)抑制濃度為0.2-5.0mg/ml。
圖9描述甘露醇、山梨醇、赤蘚醇和木糖醇和0.5％w/v與0.075％w/v實(shí)施例7制備的提取物對(duì)在80％SBNB中生長(zhǎng)的變異鏈球菌的作用。在測(cè)試條件下，木糖醇提供最適抑制作用，其它多元醇可能提供類似的抑制作用并且具有不同的抑制濃度。
實(shí)施例11乳天然免疫系統(tǒng)成分的提取和濃縮乳的蛋白含量與卵不同，天然系統(tǒng)蛋白質(zhì)在非功能性物質(zhì)的分散也不同，因而有必要對(duì)在卵提取中所使用的提取過程進(jìn)行變改以慮及這些個(gè)別不同之處。
乳的脂成分通過在-70℃冷凍24小時(shí)然后凍融后離心并過濾上清液而去除。對(duì)卵而言不必要去-脂，但對(duì)乳來說天然系統(tǒng)蛋白質(zhì)的分散需要將脂滴破碎和分離。
用烏頭酸將所得上清液的pH降至3.5并用去離子水透析以除去金屬離子和與許多乳天然系統(tǒng)蛋白質(zhì)的功能團(tuán)結(jié)合的低分子量成分。使用排阻膜(“濾掉”分子量不超過10000的成分)經(jīng)超濾將去離子蛋白溶液濃縮。用10mM磷酸鉀緩沖液將蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至10mg/ml。然后按照實(shí)施例5所描述的方法使用發(fā)面酵母菌進(jìn)行天然系統(tǒng)蛋白質(zhì)的提取。
實(shí)施例12卵和乳的濃縮提取物與卵的超免疫抗體在體外抗變異鏈球菌的效力比較進(jìn)行了卵的濃縮天然系統(tǒng)成分與乳的濃縮天然系統(tǒng)成分以及超免疫卵抗體在體外抗變異鏈球菌的效力的研究。變異鏈球菌以與粘附于牙釉質(zhì)表面同樣的方式強(qiáng)烈地粘附到唾液包被的羥磷灰石粒上。首先用新鮮全唾液將羥磷灰石包被是必要的，因?yàn)樽儺愭溓蚓耐２刺幨茄例X表面的唾液蛋白質(zhì)。
0.1克羥磷灰石粒等分試樣稱重后放入‘Sterilin’(Sterilin是商標(biāo))離心管中并與2.0ml新鮮唾液一起在輕輕振蕩下于30℃孵育2小時(shí)。水合羥磷灰石粒在蒸餾水中洗滌2次以去除殘留的唾液。
變異鏈球菌在添加了2％蔗糖的腦心肉湯汁中培養(yǎng)12小時(shí)。肉湯培養(yǎng)基用pH7.0的磷酸緩沖鹽液離心洗滌2次。將收集到的細(xì)胞用磷酸緩沖鹽液重新懸浮并稀釋到在600nm時(shí)的光密度為1.0。
按照實(shí)施例6描述的方法制備抗變異鏈球菌超免疫卵抗體。用pH7 10mM的磷酸緩沖液將抗體稀釋到10g/ml。用10mM磷酸緩沖液將由等重量濃縮卵黃提取物(按照實(shí)施例5所述方法制備)和去卵白蛋白卵白(按照實(shí)施例7所述方法制備)組成的溶液稀釋到10mg/ml。由乳提取的濃縮天然系統(tǒng)蛋白，(按照實(shí)施例11所描述的方法制備)稀釋到10mg/ml。將1.0ml的每一測(cè)試溶液加入到1.0ml制備的變異鏈球菌細(xì)胞中并于30℃孵育1小時(shí)。使用磷酸緩沖鹽液代替測(cè)試蛋白溶液作為空白管進(jìn)行測(cè)定。
孵育后用磷酸緩沖鹽液將測(cè)試溶液洗滌2次，在1.0ml相同的緩沖液中重新懸浮并加入唾液包被的羥磷灰石粒。羥磷灰石粒與測(cè)試溶液一起在30℃孵育2小時(shí)，然后用滅菌磷酸緩沖鹽液仔細(xì)地洗滌5次以除去未粘附于羥磷灰石粒的任何細(xì)菌細(xì)胞。
用龍膽紫染色羥磷灰石粒并用乙醇洗滌，接著在放大500倍的顯微鏡下檢測(cè)可大致估算出來粘附于每個(gè)羥磷灰石粒上的細(xì)菌數(shù)量。標(biāo)準(zhǔn)的格蘭氏染色技術(shù)也是適宜的。
用Hatta，H.等((1997)supra)報(bào)道的方法可更精確地測(cè)得粘附于每個(gè)羥磷灰石粒的細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量；一個(gè)超聲探針用于分離粘附著的細(xì)菌。
在該實(shí)施例中，用與在實(shí)施例5中為從酵母菌上解吸附濃縮卵蛋白所用緩沖液相同的高離子強(qiáng)度緩沖液來分離細(xì)菌。對(duì)每一個(gè)測(cè)試樣本，均加入含0.01％吐溫pH41摩爾的磷酸緩沖液1.0ml。劇烈振蕩30秒后，立即將上清液進(jìn)行順次稀釋。使用標(biāo)準(zhǔn)平皿計(jì)數(shù)技術(shù)，將每一稀釋液的1ml等份試樣鋪在新鮮血瓊脂平皿的表面。孵育平皿后檢查和計(jì)數(shù)菌落數(shù)量；基于稀釋的倍增系數(shù)用于確定原始樣本的可見細(xì)胞數(shù)量。
表4顯示三個(gè)試驗(yàn)的平均值。
表4變異鏈球菌與羥磷灰石粒粘附的相對(duì)抑制粘附到粒上的細(xì)菌數(shù)量細(xì)胞懸浮液60×108空白 120×106乳提取物 175×105超免疫卵抗體 105×104濃縮卵提取物 80×104該結(jié)果也由圖10顯示。
權(quán)利要求
1.具有人粘膜分泌物生物活性特性并被人耐受的母體免疫分泌物在制備治療和/或預(yù)防以所述粘膜分泌物缺失或所述粘膜分泌物的正常生物性能缺失或者對(duì)所述粘膜分泌物敏感為特征的病癥的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中粘膜分泌物選自唾液、淚液、鼻腔分泌物、腸分泌物和生殖器分泌物。
3.具有人唾液分泌物生物活性特性并被人耐受的母體免疫分泌物在制備治療和/或預(yù)防以正常唾液或唾液的正常生物性能缺失為特征的口腔病癥的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中母體免疫分泌物是卵流體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中卵流體得自家養(yǎng)母雞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其中卵流體取自卵黃。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中卵黃是脫脂的。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其中卵流體取自卵白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中卵白是去-卵白蛋白卵白。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中卵流體是脫脂卵黃和去-卵白蛋白卵白的混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中分泌物取自乳。
12.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中母體免疫分泌物包括它們的天然免疫系統(tǒng)成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中天然免疫系統(tǒng)成分的抗體內(nèi)容物由非免疫的天然抗體組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中天然免疫系統(tǒng)成分的抗體內(nèi)容物包括多特異抗體。
15.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中藥物是所述人粘膜分泌物的復(fù)制品。
16.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述分泌物富含其一種或多種天然免疫成分。
17.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中藥物用于治療口腔干燥。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于局部治療皮膚感染。
19.根據(jù)權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于治療和/或預(yù)防口腔感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于預(yù)防齲齒。
21.根據(jù)權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于治療/或預(yù)防以牙齦感染為特征的口腔病癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于治療和/預(yù)防口臭。
23.根據(jù)權(quán)利要求16和19-22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物以漱口劑的形式使用。
24.根據(jù)權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物用于限制鐵從食物中攝取。
25.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中藥物包括一種或多種所述人粘膜分泌物特性的無機(jī)鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求3-16和19-25中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物與增強(qiáng)所述分泌物作用的植物提取物同時(shí)、分開或順次施予。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其中植物提取物選自歐洲越桔、玉米、香蜂花和小葉毛果蕓香。
28.用于治療和/或預(yù)防以正常唾液或其正常生物性能缺失為特征的口腔病癥的制劑，包括前述權(quán)利要求定義的母體免疫分泌物和多元醇。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述制劑，其中多元醇選自赤蘚醇、甘露醇、山梨醇和木糖醇。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述制劑，制劑是口香糖形式。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述制劑，制劑是牙膏形式。
32.用于治療和/或預(yù)防以人機(jī)體產(chǎn)生的粘膜分泌物缺失或所述粘膜分泌物的正常生物性能缺失為或者對(duì)所述粘膜分泌物反應(yīng)為特征的人體病癥的組合物，所述組合物包括具有所述粘膜分泌物生物活性特性的母體免疫分泌物的天然免疫物質(zhì)。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，大體上是此前所描述和例證的。
34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，大體上是此前所描述和例證的。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，大體上時(shí)此前所描述和例證的。
全文摘要
由具有人唾液或其它粘膜分泌物生物活性特性并被人耐受的母體免疫分泌物制備的藥物,可用于治療和/或預(yù)防以正常粘膜分泌物或其正常生物性能缺失為特征的人體病癥如口腔病癥。適宜分泌物是家養(yǎng)動(dòng)物的卵流體或乳或它們的復(fù)制品?？梢詫⑦@些分泌物中發(fā)現(xiàn)的天然免疫球蛋白濃縮,由此使分泌物具有接近超免疫免疫球蛋白的潛能。藥物特別用于治療和/或預(yù)防口腔感染、齲齒、以炎癥、口腔干燥和口臭為特征的口腔病癥。
文檔編號(hào)A61P1/02GK1269723SQ98808994
公開日2000年10月11日 申請(qǐng)日期1998年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月25日
發(fā)明者邁克爾·A·福蘭 申請(qǐng)人:邁克爾·A·福蘭