專利名稱：用于鑒定選擇性抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的試劑的新篩選方法
本申請(qǐng)要求1997年3月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)60/038,596的權(quán)益。1.簡(jiǎn)介本發(fā)明涉及鑒定抗病毒試劑的新方法，該試劑可選擇性干擾病毒蛋白，該病毒蛋白可使干擾素(IFN)誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒感染的防御機(jī)制失效。本發(fā)明尤其涉及鑒定可選擇性抑制含干擾素敏感決定區(qū)(ISDR)的病毒蛋白與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶相互作用的試劑的篩選方法。本發(fā)明更具體而言涉及鑒定可選擇性抑制丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)的5A蛋白(NS5A)(含ISDR)與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶的相互作用的試劑。病毒的ISDR與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶間的相互作用導(dǎo)致IFN-誘導(dǎo)的細(xì)胞防御機(jī)制對(duì)抗病毒感染的失效。因此，采用本發(fā)明的方法鑒定的試劑可用作抗病毒劑。2.背景2.1針對(duì)病毒感染治療的IFN(干擾素)療法干擾素為胞外信號(hào)蛋白，具多種不同作用，包括免疫刺激，腫瘤抑制，和細(xì)胞增殖減少。干擾素誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中多種基因產(chǎn)物的生產(chǎn)，包括Mx蛋白，2′-5′寡腺苷酸合成酶和RNA酶L.(綜述見Sen等，1992，生物化學(xué)雜志，2675017-5020；Sen等，1993，病毒研究進(jìn)展4257)。另外，PKR，非cAMP依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶，為一種大于30的IFN誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物(Meurs等，1990，細(xì)胞62379-590)。這些蛋白表現(xiàn)出具抗病毒感染的保護(hù)作用，因此對(duì)IFN治療病毒感染的有益作用有貢獻(xiàn)。
IFN誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物提供抗病毒感染的保護(hù)作用機(jī)制很多。例如，IFN誘導(dǎo)雙鏈RNA依賴酶，2′-5′寡腺苷酸合成酶活化可裂解細(xì)胞和病毒RNA的RNA酶，從而鈍化病毒復(fù)制，如細(xì)小核酸核酸病毒復(fù)制(Kumar等，1988，病毒雜志，623175-3181)。IFN誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶抑制病毒和宿主細(xì)胞蛋白合成，通過磷酸化和鈍化翻譯起始因子eIF-2α的一個(gè)亞基。IFN也可在病毒生活周期的不同階段起抑制病毒作用。IFN抑制乙型肝炎病毒顆粒的脫殼，從而抑制病毒復(fù)制。IFN抑制皰疹性口腔炎病毒侵入細(xì)胞(Whitaker-Dowling等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊801083-1086)。IFN還抑制由病毒，如仙臺(tái)病毒引起的細(xì)胞融合(Tomita等，1981，普通病毒學(xué)雜志。55289-295)。
為抵抗IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞抵抗機(jī)制的有害作用，許多真核病毒發(fā)展了阻斷IFN誘導(dǎo)的蛋白活性的機(jī)制。一些蛋白產(chǎn)生RNA，使IFN誘導(dǎo)宿主細(xì)胞翻譯關(guān)閉無(wú)效，例如，腺病毒產(chǎn)生的VAI RNA分子，人免疫缺陷病毒(HIV)TAR區(qū)，埃-巴二氏病毒產(chǎn)生的ERER-1RNA分子(Katz等，1987，胚胎雜志，6689-697；McMillan等，1995，病毒學(xué)213413-424；Carroll等，1993；Beattie等，1995，病毒學(xué)210254-263；Beattie等，1991，病毒學(xué)183419-422)。一些病毒如牛痘病毒K3L蛋白，結(jié)合并抑制IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶(Gale Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)164172-4181)。流感病毒，募集細(xì)胞因子，如P58結(jié)合并阻斷PKR蛋白激酶(Lee等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，876208-6212；Lee等，1994，分子細(xì)胞生物學(xué)，142331-2342)。
2.2丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界性的重要臨床問題。僅在美國(guó)，就有約4百萬(wàn)人慢性感染HCV。HCV，非甲，非乙肝炎的主要病原體，主要通過血液和血液制品傳染(Cathbert等，1994，臨床微生物評(píng)論雜志，7505-532；Mansell等，1995，肝病論壇(Semin.Liver.Dis.)1515-32)。在1990年代中期進(jìn)行抗HCV篩選之前，HCV占美國(guó)輸血后肝炎的80-90％。普通應(yīng)用注射藥物是HCV感染的最常見危險(xiǎn)因素，占HCV血清反應(yīng)陽(yáng)性人群的80％。HCV感染的高幾率也可從出血紊亂和慢性腎衰竭的人看出，這些群體常接觸血液及血液制品。
HCV的急性感染在約90％病例中導(dǎo)致持久性病毒復(fù)制和慢性肝炎進(jìn)展。對(duì)很多病人而言，慢性HCV感染導(dǎo)致進(jìn)行性的肝損傷和肝硬化的發(fā)展。在侵占性感染病人中，肝硬化能在兩年中發(fā)展起來(lái)，盡管更典型的為10-20年時(shí)間跨度。30-50％的慢性HCV患者，肝損傷會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝細(xì)胞癌?？偟卣f來(lái)，肝細(xì)胞癌為較晚表現(xiàn)形式，尚需超過30年時(shí)間的發(fā)展(Bisceglie等，1995，肝病論壇。1564-69)。決定病情進(jìn)展的病毒或宿主的相關(guān)因子不詳。
HCV為有包膜病毒，包括正義單鏈RNA基因組約9.5kb。根據(jù)基因組組成和病毒粒特性，HCV被劃為黃病毒科中獨(dú)立的屬，黃病毒科為包括瘟病毒屬和黃病毒屬的科(Alter，1995，肝病論壇155-14)。病毒基因組包括長(zhǎng)5′非翻譯區(qū)(UTR)，長(zhǎng)開放閱讀框編碼約3011個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，和短3′UTR。5′UTR為HCV基因組中高度保守的區(qū)域，對(duì)起始和控制多聚蛋白的翻譯十分重要。HCV基因組翻譯起始為帽非依賴性機(jī)制，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入。該機(jī)制包括核糖體與被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的一段RNA序列結(jié)合。RNA假結(jié)結(jié)構(gòu)近來(lái)被認(rèn)為是HCV IRES的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件。盡管HCV復(fù)制的可靠組織培養(yǎng)系統(tǒng)尚需進(jìn)一步發(fā)展，但病毒蛋白已被多種技術(shù)鑒定，包括運(yùn)用重組牛痘病毒結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。多聚蛋白前體被宿主和病毒的蛋白水解酶裂解產(chǎn)生成熟病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白包括核殼核心蛋白(C)和兩個(gè)包被糖蛋白，E1和E2。HCV還編碼2個(gè)蛋白酶，一個(gè)是由NS2-NS3區(qū)編碼的鋅依賴的金屬蛋白酶，和由NS3區(qū)編碼的絲氨酸蛋白酶。這些蛋白酶要求多聚蛋白前體的特殊區(qū)域斷裂以產(chǎn)生成熟蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白5的羧基部分，NS5B包括RNA依賴的RNA聚合酶。其它非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A和NS4B以及NS5A(非結(jié)構(gòu)蛋白5的氨基端部分)的功能不詳。
對(duì)HCV復(fù)制和病理的了解因缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)而被嚴(yán)重阻礙。因此有效的對(duì)抗HCV感染的抗病毒策略仍需進(jìn)一步發(fā)展。目前唯一用于慢性HCV感染治療的方法是α-干擾素處理。但少于50％的患者在接受治療后根除HCV癥狀減弱(Hoofnagle等，1994；Lino等，1994，病毒相互關(guān)系學(xué)3787-100)。如上所述，HCV基因型和對(duì)干擾素治療的反應(yīng)間存在聯(lián)系(Enomoto等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志33477-81；Enomoto等，1995，臨床探索雜志，96224-230)。例如感染HCV-1b的患者的反應(yīng)率小于40％。感染原型美國(guó)基因型HCV-1a的患者反應(yīng)率亦低(Hoofnagle等，Lino等，1994，病毒相互關(guān)系學(xué)3787-100)。而感染HCV基因型2的患者反應(yīng)率高達(dá)80％(Fried等，1995，肝病研討會(huì)1582-91)。
基因型1b的NS5A蛋白不連續(xù)區(qū)的氨基酸序列與對(duì)干擾素的敏感性有關(guān)(Enomoto等，1996，Enomoto等，1995)。該區(qū)稱為干擾素敏感決定區(qū)(ISDR)，從NS5A的氨基酸殘基237至276，多聚蛋白的氨基酸2209至2248；根據(jù)HCV-J編號(hào)，HCV-1b株的全部基因序列決定于此(Enomoto等，1995)。干擾素抗性株(例，六個(gè)月干擾素治療后的準(zhǔn)物種)具有與原型HCV-1b鏈相同的ISDR序列(Enomoto等，1996)。相應(yīng)的，在干擾素敏感株(HCV準(zhǔn)物種，不經(jīng)六個(gè)月干擾素治療)多種氨基酸取代發(fā)生在ISDR。在此項(xiàng)研究中，感染ISDR區(qū)發(fā)生4至11個(gè)氨基酸變化的HCV的患者對(duì)干擾素治療表現(xiàn)完全的反應(yīng)。作為對(duì)照，感染僅含原型ISDR序列的HCV的患者(87％感染ISDR只有1至3個(gè)氨基酸的變化的HCV)對(duì)干擾素治療無(wú)反應(yīng)。HCV-1b的ISDR影響對(duì)干擾素的反應(yīng)，機(jī)制不詳。3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及鑒定抗病毒試劑的新方法，該抗病毒試劑可選擇性鈍化使干擾素(IFN)誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒感染的防御機(jī)制無(wú)效的病毒蛋白。特別是，本發(fā)明涉及鑒別試劑的篩選辦法，這些試劑選擇性抑制表達(dá)ISDR的病毒蛋白和IFN-誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及篩選鑒定可選擇性抑制阻止PKR二聚化的病毒蛋白的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定新的外源或內(nèi)源試劑的篩選方法，該試劑可誘導(dǎo)IFN表達(dá)至一定水平，引起NS5A對(duì)PKR蛋白激酶的抑制失效。含ISDR的病毒蛋白與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶間的相互作用導(dǎo)致IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞防御機(jī)制對(duì)抗病毒感染的失效。因此被鑒定為干擾該相互作用的試劑可用為抗病毒試劑。
該發(fā)明部分建立在以下申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)之上(1)HCV蛋白NS5A直接作用并抑制IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶；(2)ISDR為NS5A所必需以相互作用并抑制PKR蛋白激酶。
本發(fā)明進(jìn)一步包括此中所述篩選方法鑒定的新試劑。本發(fā)明涉及療法的用藥程式和藥物組成以含ISDR的蛋白作為干擾的靶治療病毒感染。本發(fā)明尤其進(jìn)一步涉及治療HCV感染，靶向NS5A和其與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶相互作用的的治療方法和藥物組成。
這些藥物會(huì)比目前使用的藥物更有效因?yàn)樗鼈儗⒕哂腥缦聝?yōu)點(diǎn)，它們不干擾細(xì)胞內(nèi)過程而阻斷病毒對(duì)細(xì)胞抗病毒感染防御機(jī)制的抑制。這些藥物會(huì)具最小的副作用因其靶向與宿主非同源的病毒蛋白，所以對(duì)宿主細(xì)胞不會(huì)有損傷。因此其最低限度的副作用允許其較高的劑量。
本發(fā)明也涉及到本發(fā)明所鑒定的抗病毒劑與其它已知抗病毒劑在抑制病毒復(fù)制時(shí)的結(jié)合治療。本發(fā)明的篩選方法鑒定的試劑在降低病毒對(duì)IFN的抗性方面亦有作用，因此于增加目前IFN療法對(duì)HCV感染的有效性有用。
3.1定義“ISDR”或“干擾素敏感性決定區(qū)”在此指蛋白的一個(gè)區(qū)域，具有如

圖1A所示的氨基酸序列，或此序列的任何衍生物，具有授與IFN抗性或結(jié)合至IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶的活性。
在此所稱的“PKR”或“IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶”指干擾素活化的宿主蛋白激酶，即所謂p68激酶，P1，DAI，dsI或elF-1激酶或其它任何PKR激酶的衍生物，或具有與PKR相應(yīng)氨基酸序列的片段或肽。
在此所稱的“篩選”或“篩選用”指大量可能有用的試劑以本發(fā)明的方法處理的過程。
在此所稱的“靶向”指抑制，阻斷或阻止基因表達(dá)，酶活化或與其它細(xì)胞或病毒因子的相互作用。
在此所稱的“處理或阻止HCV感染”指抑制HCV傳染，或阻止病毒在其宿主中復(fù)制，以及改善或減輕HCV感染引起的疾病的癥狀。如果病毒負(fù)載減少，發(fā)病率或死亡率下降，則該處理被認(rèn)為是治療性的。
在此所稱的“藥學(xué)上可接受的載體”指不干擾活性成分的生物學(xué)活性的有效性的載體介質(zhì)，它為化學(xué)惰性且對(duì)施用的患者無(wú)毒。
所謂的“治療劑”指幫助治療病毒感染或由此引起的疾病的任何分子化合物或治療物，優(yōu)選抗病毒劑。4.附圖簡(jiǎn)述圖1.(A)上幅圖，來(lái)自IFN抗性的HCV株J的NS5A原型ISDR與本研究采用的HCV株1a和1b的NS5A相應(yīng)氨基酸序列比較。下幅圖，HCV NS5A的結(jié)構(gòu)說明，代表我們采用的NS5A結(jié)構(gòu)中HCV-1a和-1b株的447個(gè)氨基酸蛋白。ISDR用黑色表示，由HCV-1a衍生的ISDR結(jié)構(gòu)缺失而來(lái)。NS5A內(nèi)的氨基酸位置用黑體表示，其它相應(yīng)HCV多聚蛋白內(nèi)的位置用普通字體表示。
(B)PKR的結(jié)構(gòu)說明。調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)兩條dsRNA結(jié)合基元的位置以黑色顯示。催化區(qū)廣度為265-551氨基酸，包括11個(gè)蛋白激酶催化區(qū)保守區(qū)域(Hanks等，1988，科學(xué)24142-52)，以羅馬數(shù)字表示。圖上也顯示與PKR抑制性分子腺病毒VAI RNA，牛痘病毒K3L和P58IPK相互作用的區(qū)域(Katze等，1987，胚胎學(xué)雜志，6689-697；Gala Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)164172-4181)。NS5A結(jié)合區(qū)亦在圖上顯示。
圖2.體外結(jié)合分析。圖2示[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記PKR的放射自顯影圖。泳道1，4和7示單獨(dú)體外翻譯產(chǎn)物或通過在天然大腸桿菌抽提物中與GST或GST-NS5A結(jié)合挑選所得PKR，如每泳道上所標(biāo)識(shí)。含PKR氨基酸1-5S1(泳道2和3)，1-242(泳道5和6)或244-551(泳道8和9)的結(jié)合化合物通過谷胱甘肽瓊脂糖選擇而被回收。結(jié)合翻譯產(chǎn)物經(jīng)SDS樣品緩沖液洗脫，12.5％丙烯酰胺SDS-PAGE分離。右邊的箭頭示PKR氨基酸244-251的位置，其遷移(位置)在泳道8和9可見的背景帶以下。分子量標(biāo)準(zhǔn)以kDa為單位標(biāo)識(shí)在左側(cè)。
圖3.酵母雙雜交分析。來(lái)自HCV-1b的NS5A體內(nèi)與PKR相互作用。來(lái)自HCV-1b的全長(zhǎng)wt NS5A融合至GAL4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(AD)，在酵母中與GAL4 DNA結(jié)合區(qū)(BD)(位置2)或BD-PKR融合構(gòu)建物BD-PKR K296R和BD-PKR98-S51(位置4和8，各自地)共表達(dá)。雙雜交分析的共表達(dá)對(duì)照GAL4構(gòu)建物包括AD載體/BD載體(位置1)，AD-載體/BD-PKR K296R(位置3)，AD-P58IPK/BD-PKR K296R(位置5)，AD-載體/BD PKR98-551(位置6)和AD-P58IPK/BD-PKR98-551(位置7)。轉(zhuǎn)染的酵母復(fù)制平板到+His(上)-His培養(yǎng)基(下)。在-His上的生長(zhǎng)指示雙雜交蛋白相互作用。
圖4.來(lái)源于HCV-1a的NS5A與PKR蛋白激酶催化區(qū)相互作用。表達(dá)BD(BD-載體)或來(lái)源HCV-1a的BD-NS5A融合蛋白(BD-NS5A)的酵母共轉(zhuǎn)染表達(dá)AD-PKR融合構(gòu)建物或?qū)φ誂D載體(底行)的質(zhì)粒，復(fù)制平板到+His(左)和-His(右)，進(jìn)行生長(zhǎng)分析。
圖5.重組NS5A體外抑制PKR活性。純化的天然PKR(1.8pmol)預(yù)培養(yǎng)在緩沖液中(泳道1)或在增加數(shù)量的重組純化GST-NS5A中(HCV1a，泳道2-5)或GST中(泳道6-9)，組蛋白H2a底物存在下體外進(jìn)行激酶活性分析。終斷激酶反應(yīng)后，磷酸化產(chǎn)物經(jīng)12.5％SDS-PAGE分離，干膠放射自顯影觀察。箭頭指向PKR和組蛋白的位置。輸入GST-NS5A或GST蛋白的摩爾數(shù)為0.2pmol(泳道2和6)，0.4pmol(泳道3和7)，0.8pmol(泳道4和8)和1.2pmol(泳道5和9)。
圖6.酵母中NS5A逆轉(zhuǎn)PKR調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)抑制。酵母株RY1-1轉(zhuǎn)染2m酵母表達(dá)構(gòu)建物pYES2-NS5A(NS5A；來(lái)源于HCV-1a)，pEMBLYex4K3L(牛痘病毒K3L；陽(yáng)性對(duì)照)或陰性對(duì)照載體pEMBLYex4(pYex)和pYes2(pYes)。轉(zhuǎn)染子在含2％右旋糖(葡聚糖)(SD，左)或10％半乳糖/2％棉子糖(SGAL，右)作為碳源的基本合成培養(yǎng)基的平板，劃板生長(zhǎng)。SGAL板示5天的生長(zhǎng)。
圖7.eIF-2α磷酸化分析。制備以上所示酵母菌株抽提物，進(jìn)行所述的等電聚焦和免疫印跡分析。20mg蛋白先經(jīng)等電聚集分離，后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以酵母eIF-2α特異性的抗血清探測(cè)。箭頭指向基礎(chǔ)磷酸化的eIF-2α(下帶)和eIF-2α在Ser 51(PKR磷酸化位點(diǎn))磷酸化(上帶)的位點(diǎn)?；A(chǔ)磷酸化的eIF-2α相對(duì)于總磷酸化的水平通過激光掃描光密度測(cè)定法測(cè)得載體，0.9％(泳道1)；NS5A9.8％(泳道2)和K3L，11.7％(泳道3)。
圖8.PKR的NS5A結(jié)合區(qū)。(上幅圖)包括AD和BD表達(dá)構(gòu)建物的Hf7c酵母菌株復(fù)制影印到+His(左)和-His(右)培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4天，生長(zhǎng)分析。免疫印跡分析確定AD-PKR和BD-NS5A 1b-wt構(gòu)建物的表達(dá)。生長(zhǎng)在-His培養(yǎng)基上的菌株通過劃板陽(yáng)性確定雙雜交蛋白相互作用。(下幅圖)PKR的結(jié)構(gòu)說明。兩個(gè)dsRNA結(jié)合基元(dsRBM)和11個(gè)蛋白激酶催化區(qū)保守區(qū)(羅馬數(shù)字)用黑色表示。PKR調(diào)節(jié)與病毒編碼抑制劑，腺病毒VA1，RNA，牛痘病毒K3L和HCV NS5A蛋白相互作用的區(qū)域下劃線標(biāo)出。
圖9.NS5A破壞PKR二聚化。AG1688大腸桿菌共轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合編碼CI-PKR K296R和GST(列1)，GST-NS5A 1b-wt(列2)，GST-K3L(列3)，或GST-NS1(列4)，與所示稀度的λKH54噬菌體混合，點(diǎn)到含瓊脂培養(yǎng)基的平皿中。列5包括含CI-Rop和GST-NS5A 1b-wt表達(dá)質(zhì)粒(對(duì)照)的大腸桿菌?？寺⌒纬墒綜I-融合蛋白二聚化。
圖10.NS5A的PKR結(jié)合區(qū)。圖10A.GAL4 DNA結(jié)合區(qū)-NS5A融合構(gòu)建物結(jié)構(gòu)說明。NS5A進(jìn)行缺失突變，除由NS5A 1a-wt制備而來(lái)的ΔISDR構(gòu)建物。ISDR和PKR-結(jié)合區(qū)各用空心，實(shí)心矩形表示。末端部氨基酸位置，編號(hào)根據(jù)原型HCV J多聚蛋白序列。圖10B.酵母雙雜交分析，包括AD-PKR K296R的Hf7c酵母以BD-NS5A缺失構(gòu)建物共轉(zhuǎn)化。圖示為30℃培養(yǎng)3天的-His平皿。圖10C.免疫印跡分析。從酵母菌株制備的抽提物經(jīng)SDS-PAGE分離，用抗NS5A單抗(泳道1-6)或抗BD單抗(泳道7-9)進(jìn)行免疫印跡。泳道1和7包括從含pGBT9BD載體的菌株中制備的抽提物(對(duì)照)。抽提物用以上相應(yīng)泳道所示的構(gòu)建物鑒別。BD-NS5A結(jié)構(gòu)1973-2419在印跡中作為陽(yáng)性對(duì)照，示于圖右側(cè)。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)位置以kDa表示。
圖11.ISDR突變?cè)贜S5A-PKR相互作用中起的作用。圖11A.酵母雙雜交分析。包括編碼AD-PKRK296R(AD-PKR)的pGAD425的Hf7c酵母菌株或僅包括AD(AD-載體)的Hf7c酵母菌株與僅編碼BD(載體)的pGBT9，編碼BD-NS5A 1a-wt，BD-NS5A-ΔISDR或具如表1所示的ISDR序列的BD-NS5A 1b-wt的等基因構(gòu)建物的pGBT9共轉(zhuǎn)染。在-His培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)示雙雜交蛋白相互作用。圖11B.免疫印跡分析。從A所示的菌株中制備各抽提物，以抗AD單抗(左圖)或抗BD單抗(右圖)進(jìn)行免疫印跡分析。泳道1和2各示AD載體(v，對(duì)照)和AD-PKR(PKR；箭頭)的表達(dá)。泳道3-9示BD-載體(V，泳道3)，BD-NS5AΔISDR(Δ，泳道4)，BD-NS5A 1a-wt(wt，泳道5)，BD-NS5A 1b-wt(wt，泳道6)，BD-NS5A 1b-2(2，泳道7)，BD-NS5A 1b-4(4，泳道8)和BD-NS5A 1b-5(5，泳道9)的表達(dá)。右邊箭頭示ΔISDR和全長(zhǎng)BD-NS5A結(jié)構(gòu)的位置。蛋白標(biāo)準(zhǔn)位置以kDa表示。
圖12.ISDR突變破壞NS5A功能。圖12-A，酵母生長(zhǎng)分析。RY-1酵母菌株的細(xì)胞等同物含有半乳糖-可誘導(dǎo)的URA3表達(dá)質(zhì)粒pYes-NS5A 1b-wt(1b-wt)，pYes-NS5A 1b-2(1b-2)，pYes-NS5A 1b-4(1b-4)，pYes-NS5A 1b-5(1b-5)，或pYes對(duì)照載體，經(jīng)連續(xù)稀釋后點(diǎn)至含葡萄糖(SD)或半乳糖(SGAL)的培養(yǎng)基上。圖示在30℃培養(yǎng)5天后的克隆形成。圖12B.從A所示酵母菌株中制備的蛋白抽提物進(jìn)行免疫印跡分析。圖示為用抗-PKR，抗NS5A或抗肌動(dòng)蛋白(對(duì)照)單抗進(jìn)行相同印跡的結(jié)果。右箭頭示PKR，NS5A和肌動(dòng)蛋白的位置。每泳道總蛋白量為50μg。
圖13.eIF-2α磷酸化。eIF-2α檢測(cè)經(jīng)與抗酵母eIF-2α血清印跡進(jìn)行。每泳道代表20μg蛋白，從含pYes(V，泳道1)，pYes-NS5A 1b-wt(1b-wt，泳道2)，pYes-NS5A 1b-2(1b-2，泳道3)，pYes-NS5A 1b-4(1b-4，泳道4)，pYes-NS5A 1b-5(1b-5，泳道5)或pYex-PKRA295-300[PKRA295-300(對(duì)照)，泳道6]的RY1-1菌株中制備。右箭頭示低磷酸化eIF-2α(下部)和過磷酸化eIF-2α(其絲氨酸51位被PKR磷酸化)。
圖14.ISDR突變?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中破壞NS5A-PKR關(guān)聯(lián)。CosI細(xì)胞共轉(zhuǎn)染編碼PKR K296R和NS5A，或PKR K296R和對(duì)照載位的CMV表達(dá)質(zhì)粒。制備抽提物并與抗-NS5A單克隆抗體(A)或抗FLAG樹脂(B)。圖14A.從含PKR K296R及對(duì)照載體(neo，泳道1)或NS5A 1a-wt(1a-wt，泳道2)的抽提物中制備抗NS5A免疫復(fù)合物，輸入抽提物(IP-輸入，泳道3和4)經(jīng)SDS-PAGE分離，以抗PKR(泳道1-3)或抗NS5A(泳道4)單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析。泳道3和4代表泳道2所示的免疫沉淀反應(yīng)中的起始物質(zhì)。左側(cè)垂直線示相應(yīng)免疫球蛋白(Ig)重鏈的寬帶。蛋白標(biāo)準(zhǔn)位置以kDa顯示。圖14B.輸入蛋白(泳道1-3)或蛋白復(fù)合物(泳道4-6)經(jīng)混合含PKR K296R的抽提物與載體(neo，泳道1和4)，F(xiàn)LAG-NS5A 1b-wt(1b-wt，泳道2和5)或FLAG-NS5A 1b-5(1b-5，泳道3和6)與抗FLAG樹脂恢復(fù)。印跡以對(duì)人PKR特異性的單克隆抗體為探針。箭頭指向PKR帶。
圖15.NS5A在細(xì)胞系和腫瘤中的表達(dá)。從NIH3T3細(xì)胞系neo5-10(neo，泳道1)和NS5A5C6(5C6，泳道2)，或體內(nèi)衍生的NS5A5C6腫瘤細(xì)胞(腫瘤，泳道3)制備的抽提物以抗NS5A單克隆抗體為探針進(jìn)行免疫印跡。箭頭示NS5A的位置。示蛋白標(biāo)準(zhǔn)位置(kDa)。5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新篩選方法，該方法用于鑒定干擾病毒對(duì)IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞防御機(jī)制的抑制作用的抗病毒試劑。本發(fā)明涉及篩選靶向ISDR區(qū)的病毒蛋白與細(xì)胞PKR蛋白激酶的相互作用的抗病毒試劑。本發(fā)明尤其涉及篩選靶向HCV NS5A和IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶的相互作用的新抗病毒劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步特別涉及篩選靶向HCV HS5A對(duì)PKR二聚化抑制作用的抗病毒劑。
本發(fā)明部分基于申請(qǐng)人在以下幾方面的驚人發(fā)現(xiàn)(1)NS5A的ISDR區(qū)功能上利于HCV的IFN抗性表型；(2)NS5A和PKR間的相互作用必須需要圍繞ISDR的附加序列；(3)NS5A通過直接相互作用作用于蛋白激酶催化區(qū)，尤其是氨基酸244-296，抑制IFN誘導(dǎo)的PKR；(4)PKR氨基酸244-296為二聚化區(qū)，NS5A與此區(qū)結(jié)合破壞PKR二聚化；(5)ISDR區(qū)在NS5A與PKR的相互作用以及導(dǎo)致的對(duì)蛋白激酶的抑制作用中必要。
本發(fā)明涉及篩選分析，用于鑒定靶向表達(dá)表達(dá)ISDR的病毒蛋白和IFN-誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白，如PKR蛋白激酶的相互作用的新抗病毒劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及篩選方法，用于鑒定可誘導(dǎo)IFN表達(dá)至一定水平，引起NS5A對(duì)PKR蛋白激酶抑制作用失效的新型外源或內(nèi)源試劑。ISDR和IFN-誘導(dǎo)的PKR的相互作用引起IFN-誘導(dǎo)的細(xì)胞防御機(jī)制失效，例如，通過抑制PKR的二聚化，因此，本發(fā)明鑒定干擾含ISDR的病毒蛋白和PKR的相互作用的篩選，可用于鑒定抑制病毒的使宿主翻譯關(guān)閉無(wú)效的藥物。進(jìn)一步的，在鑒定通過與細(xì)胞PKR相互作用而抑制含ISDR的病毒蛋白的化合物之外，本發(fā)明的篩選分析也可鑒定抑制與病毒感染有關(guān)的惡性腫瘤的發(fā)展的試劑。一系列草案和方法可用于篩選干擾和(或)抑制病毒表達(dá)蛋白的ISDR與IFN誘導(dǎo)的PKR間相互作用的試劑。這些鑒定的試劑可用于治療病毒感染的宿主，且有利于有效抗IFN-抗性病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步包含藥學(xué)組成物，其中包括在此所述的篩選方法所鑒定的新試劑。本發(fā)明涉及治療模式和藥學(xué)組合物，用于采用干擾含ISDR蛋白方式治療病毒感染。本發(fā)明尤其涉及治療方式和藥學(xué)組合物，用于運(yùn)用NS5A和它與IFN-誘導(dǎo)的PKR的相互作用治療HCV-感染。該治療法還具有增強(qiáng)HCV對(duì)干擾素的敏感性的優(yōu)點(diǎn)，因此可用于與IFN的藥物組合治療。
本發(fā)明的治療方式進(jìn)一步包括組合療法，其中一種試劑干擾NS5A和IFN-誘導(dǎo)的PKR間的相互作用，或一種試劑誘導(dǎo)IFN表達(dá)至特定水平而導(dǎo)致NS5A對(duì)PKR的抑制無(wú)效，和至少另一種治療劑同時(shí)施用，例如，作為混合物，同時(shí)地或順序地，包括周期療法。周期療法包括先施用一段時(shí)間的抗病毒化合物，而后重復(fù)該順序施用方案。即，此周期用于減少對(duì)某療法的抗性發(fā)展。
本發(fā)明的新抗病毒組合物提供了一種治療方法，不僅減少了抗病毒活性所需的藥物有效劑量，也減少了毒性，而且提高了通過多種機(jī)制攻擊病毒的絕對(duì)抗病毒效用。相似地，新抗病毒組合物提供一種方法，防止針對(duì)單一療法的病毒抗性的發(fā)展，因而提供一種更有效的臨床治療方法。用于組合物中的治療劑與靶向NS5A和PKR的相互作用的試劑共用，包括廣泛已知的一系列治療劑，包括α-IFN。
5.1HCV感染中HCV NS5A和IFN誘導(dǎo)的PKR的相互作用的作用本發(fā)明部分基于申請(qǐng)人以下的驚人發(fā)現(xiàn)(1)NS5A的ISDR區(qū)功能上有利于HCV菌株的IFN-抗性表型；(2)NS5A通過直接作用于蛋白激酶催化區(qū)域抑制TFN誘導(dǎo)的PKR；(3)對(duì)PKR的抑制作用和NS5A與PKR間的相互作用需要ISDR。這些發(fā)明在以下第6，7，8，9節(jié)中舉例說明，描述了生化的和遺傳的策略組合，說明NS5A通過直接相互作用抑制PKR。
以下描述的例子運(yùn)用體外GST結(jié)合分析和體內(nèi)酵母雙雜交分析證明NS5A和PKR的直接相互作用，發(fā)現(xiàn)NS5A直接與羧基蛋白激酶的催化部分即PKR二聚化區(qū)，氨基酸244-296相互作用，重組純化的NS5A體外可抑制PKR激酶活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染研究顯示NS5A體內(nèi)抑制PKR二聚化，導(dǎo)致PKR功能的阻抑和PKR調(diào)節(jié)的eIF-2α磷酸化的抑制。進(jìn)一步的，NS5A在酵母中表達(dá)顯示出抑制PKR-誘導(dǎo)的緩慢生長(zhǎng)表型以及降低PKR的天然底物eIF-2α的磷酸化。更重要的，NS5A缺失突變?nèi)狈SDR則無(wú)法與PKR相互作用或抑制蛋白激酶活性。進(jìn)一步，多次引入ISDR突變，發(fā)現(xiàn)在干擾素敏感的HCV-1b菌株中，該突變破壞了NS5A與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PKR結(jié)合的能力。有趣的是，僅ISDR單點(diǎn)突變足以破壞PKR對(duì)NS5A的調(diào)節(jié)功能。成功的例子進(jìn)一步證明，當(dāng)細(xì)胞系過表達(dá)NS5A，它們開始惡性轉(zhuǎn)化并在裸鼠中成瘤。這些結(jié)果首次證明，NS5A基因產(chǎn)物造成PKR的鈍化，是HCV避免IFN的抗病毒作用的機(jī)制，因此，該相互作用作為發(fā)展HCV抗病毒療法重要的靶，亦可作為治療慢性HCV感染引起的惡性腫瘤的療法。
5.2為篩選分析制備HCV NS5A和PKR組分本發(fā)明涉及篩選分析以鑒定靶向NS5A和PKR相互作用，和更特異性的ISDR和PKR催化區(qū)域間的相互作用的化合物。本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明篩選分析的重要組成物之一為編碼病毒NS5A和細(xì)胞PKR蛋白，多肽和肽的核苷酸編碼序列。尤其是，本發(fā)明包括編碼相應(yīng)于ISDR和PKR蛋白激酶催化區(qū)的多肽片段的核苷酸編碼序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括(a)DNA載體，包括任何前述的NS5A或PKR編碼序列和/或其互補(bǔ)物；(b)DNA表達(dá)載體，包括任何前述的NS5A或PKR編碼序列，有效與直接指導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件相連；和(c)基因工程宿主細(xì)胞，包括任何前述的NS5A或PKR編碼序列有效地與直接指導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件相連。
5.2.1 NS5A和PKR編碼序列本發(fā)明包含編碼NS5A蛋白，NS5A蛋白的肽片段和NS5A融合蛋白的核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如圖1A所示的編碼ISDR氨基酸序列，肽段和含此氨基酸序列的融合蛋白的核苷酸編碼序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所包含的核苷酸序列編碼編碼那些以羧基與ISDR相連，并在與PKR的相互作用中必需的蛋白肽段以及包括由這些核苷酸編碼序列編碼的氨基酸序列的融合蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含編碼IFN-敏感的HCV菌株中發(fā)現(xiàn)的多重ISDR突變，以及包括該ISDR突變體的肽段和融合蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼PKR蛋白激酶，PKR蛋白激酶肽段和PKR蛋白融合蛋白的核苷酸編碼序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼PKR催化區(qū)和包含PKR催化區(qū)的融合蛋白的核苷酸編碼序列。而在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼包含PKR二聚化區(qū)，氨基酸244至246，和包括PKR氨基酸244至296的肽段和融合蛋白的核苷酸編碼序列。
編碼融合蛋白的核苷酸包括但不限于全長(zhǎng)NSDR或PKR，NSDR或PKR的截短蛋白或片段融合至無(wú)關(guān)蛋白或肽，例如，ISDR融合至GST，酶或熒光蛋白。
該發(fā)明也包括(a)包括任何前述NS5A或PKR蛋白激酶編碼序列和(或)它們的補(bǔ)碼(即，反義)；(b)包括前述NS5A或PKR蛋白激酶編碼序列有效地聯(lián)于指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的DNA表達(dá)載體；(c)創(chuàng)造性建立的宿主細(xì)胞，包括任何前述的NS5A或PKR蛋白激酶編碼序列有效地聯(lián)于指導(dǎo)宿主細(xì)胞的編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。如此處所用的，調(diào)節(jié)元件包括但不僅于可誘導(dǎo)的或不可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，操作子和其它本領(lǐng)域內(nèi)熟知的驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)元件。這些調(diào)節(jié)元件包括但不僅限于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如熱休克蛋白啟動(dòng)子，半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，病毒的啟動(dòng)子，如煙草花葉病毒(TMV)的啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒hCMV立即早期啟動(dòng)子基因，SV40腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)，TRC系統(tǒng)、噬菌體A的主操縱子和啟動(dòng)子系統(tǒng)，fd殼蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶，酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，酵母α-交配因子的啟動(dòng)子。
5.2.2 NS5A和PKR蛋白和多肽NS5A和PKR蛋白，多肽，肽段，NS5A和PKR蛋白的突變，截短和缺失形式，以及包括PKR催化區(qū)的融合蛋白，可廣泛應(yīng)用，包括但不僅限于抗體的產(chǎn)生，病毒旁路通過IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞防御機(jī)制的其它因子的鑒定。
可對(duì)NS5A和PKR編碼系列進(jìn)行突變以產(chǎn)生在所選宿主細(xì)胞中更適合表達(dá)，擴(kuò)增的蛋白和肽。
相應(yīng)于靶的1至多個(gè)區(qū)域的肽，包括ISDR和PKR催化區(qū)的截短的或缺失的PKR蛋白，以及全長(zhǎng)NS5A或PKR融合至無(wú)關(guān)蛋白而成的融合蛋白都屬本發(fā)明的范疇。這些融合蛋白包括但不僅限于IgFc融合，用以穩(wěn)定NS5A或PKR蛋白或肽，并延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期；GST融合或融合至任何氨基酸序列，以使融合蛋白錨定至固相載體，或允許ISDR在穩(wěn)定的表面上展現(xiàn)；或融合至酶，熒光蛋白，或發(fā)光蛋白等提供標(biāo)志功能的蛋白上。
本發(fā)明的多肽和肽可被化學(xué)合成(例，見Creighton，1983，蛋白結(jié)構(gòu)和分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.)從NS5A和PKR編碼序列衍生的大多肽可通過運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)重組DNA而制備，用于表達(dá)包括NS5A和PKR編碼序列的核酸。這些方法可用于構(gòu)建包括5.2.1節(jié)中描述的核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄、翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括，例，體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，和遺傳重組。例如Sambrook等，1989，上述，和Ausubel等，1989，上述，描述的技術(shù)。編碼NS5A或PKR核苷酸序列的RNA可被化學(xué)合成。例如，運(yùn)用“寡核苷酸合成”中描述的技術(shù)，1984，Gait，M.J.等，IRL出版社，牛津，在此全部納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
許多宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明的NS5A和PKR核苷酸序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于表達(dá)NS5A和PKR編碼序列。這些包括但不限于微生物如以包括NS5A和PKR編碼序列的重組噬菌體DNA質(zhì)粒，DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌；包括NS5A和PKR編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用包括NS5A和PKR編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例，桿狀病毒)感染昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；NS5A和PKR細(xì)胞系統(tǒng)以重組病毒表達(dá)載體(例，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或以含NS5A和PKR編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化；或以重組病毒表達(dá)載體(例，腺病毒，牛痘病毒)感染動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
這些系統(tǒng)的表達(dá)元件強(qiáng)度和特性不同。依賴所用的宿主/載體系統(tǒng)，任意適合的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括基本的和誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，可應(yīng)用于表達(dá)載體。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可應(yīng)用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如噬菌體λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)等；當(dāng)在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆，可應(yīng)用于如桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子；當(dāng)在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，啟動(dòng)子衍生植物細(xì)胞的基因組(例，熱休克啟動(dòng)子；RUBISCO的小亞基的啟動(dòng)子，葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子)或來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子也可用(例，CaMV的35S RNA啟動(dòng)子；TMV的殼蛋白啟動(dòng)子)；當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，啟動(dòng)子衍生自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組(例，腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)；當(dāng)創(chuàng)建含NS5A或PKR的多拷貝DNA的細(xì)胞系時(shí)，SV40，BPV和EBV載體可與選擇性標(biāo)記共用。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，許多表達(dá)載體可供選擇，這要根據(jù)預(yù)期的NS5A和PKR的表達(dá)情況。例如，當(dāng)需要產(chǎn)生大量NS5A和PKR制備抗體或篩選肽庫(kù)時(shí)，則期望用介導(dǎo)高水平融合蛋白產(chǎn)物的載體。這些載體包括而不僅限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO.J.21791)，其中NS5A和PKR編碼序列可結(jié)扎至載體與lac Z編碼區(qū)同閱讀框，則可產(chǎn)生雜交NS5A和PKR lac Z蛋白；pIN載體(Inouye& Inouye，1985，核酸研究，133101-3109；Van Heeke &Schuster，1989，生物化學(xué)雜志，2645503-5509)；和其類似物。pGEX載體也可用于表達(dá)外來(lái)多肽，以與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)組成融合蛋白的形式。一般說來(lái)，這些蛋白為可溶的，且易從裂解的細(xì)胞中純化，利用對(duì)谷胱甘肽瓊脂糖珠的吸附作用，而后在游離谷胱甘肽存在下洗脫。pGEX載體包括凝血酶或Xa蛋白酶因子裂解位點(diǎn)，從而使感興趣的克隆多肽能從GST部分釋放。
在酵母中，可運(yùn)用許多基本和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。綜述見，分子生物學(xué)常用方法，卷2，1988，編者，Ausubel等，Greene出版社，Assoc和Wiley Interscience13章；Grant等，1987，酵母的表達(dá)和分泌載體，酶學(xué)方法，編者，Wu & Grossman，1987，學(xué)術(shù)出版社，紐約，卷153，pp.516-544；Glover，1986，DNA克隆，卷II，IRL出版社，華盛頓特區(qū)，和Bitter，1987，酵母中的異源基因表達(dá)，酶學(xué)方法，編者，Berger和Kimmel，學(xué)術(shù)出版社，紐約，卷152，pp.673-684和酵母中的分子生物學(xué)，1982，編者，Strathern等，冷泉港出版社，卷I和II。
為長(zhǎng)期，高產(chǎn)量重組蛋白制備，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例，建立穩(wěn)定表達(dá)NS5A或PKR的細(xì)胞系。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，建立穩(wěn)定表達(dá)NS5A和PKR的酵母細(xì)胞。這些細(xì)胞系可用作篩選抑制PKR的NS5A的抑制劑的體內(nèi)系統(tǒng)。除使用 包括病毒復(fù)制起始點(diǎn)的表達(dá)載體之外，酵母宿主細(xì)胞可以用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件(例，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸位點(diǎn)等)和選擇標(biāo)記控制的NS5A和PKR DNA轉(zhuǎn)化，此外，這些宿主細(xì)胞可用編碼報(bào)告基因的DNA轉(zhuǎn)化，該報(bào)告基因表達(dá)在PKR激酶活化反應(yīng)中增加。如此報(bào)告基因的例子有GCN4啟動(dòng)子融合至β半乳糖報(bào)告基因。外源DNA引入之后，建立的細(xì)胞在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1-2天，而后移至選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記賦予對(duì)選擇的抗性并允許細(xì)胞穩(wěn)定地結(jié)合質(zhì)粒至其染色體上以及生長(zhǎng)形成可在細(xì)胞系中克隆和擴(kuò)大的焦點(diǎn)。該方法可用于建立表達(dá)NS5A基因，PKR基因以及可在PKR蛋白激酶活化反應(yīng)中表達(dá)增加的報(bào)告基因的細(xì)胞系。這些工程化的細(xì)胞系對(duì)NS5A抑制劑的篩選尤其有用。
許多選擇系統(tǒng)可應(yīng)用，包括但不僅限于皰疹單純病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細(xì)胞11223)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊482026)，和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，細(xì)胞22817)基因可應(yīng)用于tk-，hgpart-或apart-細(xì)胞。同樣的，抗代謝抗性可用作dhfr選擇的基礎(chǔ)，賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性(Wigler等，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊773567；O′Hare等，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊781527)；gpt，賦予對(duì)潮霉素基因的抗性(Santerre等，1984，基因30147)。近來(lái)另外有些選擇基因被描述，trpB，允許細(xì)胞運(yùn)用吲哚以替代色氨酸；hisD，允許細(xì)胞運(yùn)用histinol以替代組氨酸(Hartman和Mulligan，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊858047)；和ODC(鳥氨酸脫羧酶)賦予對(duì)鳥苷酸脫羧酶抑制劑，2-(二氟甲基)-DL-鳥苷酸，DFMO(McConlogue L.，1987，當(dāng)代分子生物學(xué)通信，冷泉港實(shí)驗(yàn)室編)。本發(fā)明還包括(a)包括任何外源編碼序列及它們的補(bǔ)充(即，抗敏感)的DNA載體；(b)包括任何外源編碼序列有效地聯(lián)于指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的DNA表達(dá)載體；(c)基因工程化的宿主細(xì)胞，其中包括任何外源編碼序列有效地聯(lián)于宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。在此所指的調(diào)節(jié)元件包括但不僅限于可誘導(dǎo)的和非誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，操縱子和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。
進(jìn)一步的，以往未知的包括基因型的ISDR可通過進(jìn)行PCR而分離，運(yùn)用根據(jù)感興趣的基因內(nèi)的氨基酸序列設(shè)計(jì)的雙變性寡聚核苷酸引物庫(kù)或第6.1節(jié)所描述的引物。反應(yīng)的模板可為從感染已知病毒的或被猜測(cè)表達(dá)含ISDRS蛋白的細(xì)胞系或組織中制備的mRNA逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA。
PCR產(chǎn)物可被亞克隆并測(cè)序，以確定擴(kuò)增的序列代表NS5A或ISDR基因類似的核酸序列。PCR片段可被用于在多種方法中分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，擴(kuò)增片段可被標(biāo)記并應(yīng)用于篩選噬菌體cDNA庫(kù)?；蛘邩?biāo)記片段可用于篩選基因組文庫(kù)。
PCR技術(shù)也可應(yīng)用于分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，RNA可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟，從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織來(lái)源中分離。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可實(shí)施于RNA，運(yùn)用被擴(kuò)增片段5′末端特異的寡聚核苷酸引物合成第一鏈。所得RNA/DNA雜合體可運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)加鳥嘌呤尾，雜合體可用RNA酶H消化，第二鏈合成用多聚C引物。因此，被擴(kuò)增片段的上游cDNA序列易被分離。克隆策略見例Sambrook等，1989，上述。
當(dāng)ISDR序列被鑒定為正?；蛞吧突驎r(shí)，該基因可被用于分離該基因的突變等位基因。突變等位基因可從已知病毒或具有IFN抗性表型對(duì)傳染性有貢獻(xiàn)的病毒中分離。突變等位基因和突變等位基因產(chǎn)物可隨后應(yīng)用于體外分析，表達(dá)系統(tǒng)，以及以下描述的篩選分析。
突變基因的cDNA可被分離，例如使用PCR，一種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。在此例中，第一條cDNA鏈可通過雜交寡聚dT寡核苷酸至從已知或被猜測(cè)表達(dá)攜帶突變等位基因的組織分離的mRNA而合成。用逆轉(zhuǎn)錄酶延伸新鏈。cDNA的第二鏈可用寡聚核苷酸特異性雜交至正?；虻?′端。運(yùn)用雙引物，產(chǎn)物可通過PCR擴(kuò)增，克隆至合適載體，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行DNA序列分析。通過比較正?；蚝屯蛔兓虻腄NA序列，可確定負(fù)責(zé)突變基因產(chǎn)物的功能的改變或缺失的突變。
可替代地，基因組或cDNA文庫(kù)可各自通過感染IFN抗性病毒并表達(dá)含ISDR或其突變的基因的細(xì)胞構(gòu)建，并用DNA或RNA篩選。正?；蚧蛉魏芜m合的片段可被標(biāo)記并用作探針鑒定文庫(kù)中相應(yīng)的突變等位基因。包括該基因的克隆可被純化，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行序列分析。
另外，表達(dá)文庫(kù)可運(yùn)用從在已知或猜測(cè)攜帶突變等位基因的個(gè)體中，表達(dá)感興趣的基因的IFN-抗性病毒感染的細(xì)胞或組織中合成的cDNA或分離的DNA來(lái)構(gòu)建。在此方法中，由假定的突變組織制備而來(lái)基因產(chǎn)物可被表達(dá)并用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)，如以下節(jié)5.3中所述，與抗正常基因產(chǎn)物的抗體聯(lián)接而篩選。(篩選技術(shù)見Harlow，E.和Lane編，1988，“抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”，冷泉港出版社，冷泉港。)在突變導(dǎo)致功能改變的基因表達(dá)產(chǎn)物的例子中(例，畸義突變的結(jié)果)，多克隆抗體可與突變基因產(chǎn)物交聯(lián)反應(yīng)。文庫(kù)克隆通過它們與標(biāo)記抗體的反應(yīng)而探測(cè)，可被純化并根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行序列分析。
5.2.3宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)包括NS5A和PKR編碼序列以及表達(dá)生物學(xué)活性基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞可通過至少四種方法鑒定(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)標(biāo)記基因功能的存在或缺失；(c)通過NS5A和PKR mRNA轉(zhuǎn)錄本在宿主細(xì)胞中的表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)錄水平；和(d)通過測(cè)定生物活性或免疫分析探測(cè)基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，編碼NS5A和PKR的序列插入到表達(dá)載體中，可運(yùn)用包括與NS5A和PKR編碼序列，部分或衍生物同源的核苷酸序列的探針進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交探測(cè)而知。
在第二種方法中，重組表達(dá)的載體/宿主系統(tǒng)可根據(jù)標(biāo)記基因功能(例，胸苷活性，對(duì)抗體的抗性，對(duì)氨甲喋呤的抗性，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒中閉合體形成等)的存在或缺失來(lái)鑒定。例，如NS5A和PKR編碼序列在載體的標(biāo)記基因序列中，包括NS5A和PKR編碼序列的重組子可根據(jù)標(biāo)記基因功能的缺失而鑒定。任選的，標(biāo)記基因可置于NS5A和PKR序列的前后，在相同或不同的控制NS5A和PKR編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下。誘導(dǎo)或選擇導(dǎo)致的標(biāo)記的表達(dá)指示了NS5A和PKR編碼序列的表達(dá)。
第三種方法中，NS5A和PKR編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性可通過雜交分析評(píng)估。例如，可運(yùn)用與NS5A和PKR編碼序列或其特殊部分同源的探針進(jìn)行Northern印跡來(lái)分離和分析RNA。任選的，宿主細(xì)胞的總核酸可被抽提并用這些探針雜交分析。
第四種方法中，NS5A和PKR蛋白產(chǎn)物的表達(dá)可用免疫學(xué)評(píng)估，例如通過Western印跡，諸如放射免疫摻入，酶聯(lián)免疫等免疫分析。但本表達(dá)系統(tǒng)成功的最根本檢測(cè)包括對(duì)生物活性的NS5A和PKR基因產(chǎn)物的檢測(cè)。當(dāng)基因產(chǎn)物為非分泌的，可用細(xì)胞裂解物分析該活性。不論發(fā)生什么情況，許多分析可用于檢測(cè)NS5A和PKR活性，包括但不僅限于下列環(huán)加氧酶(cycloxygenase)活性可通過在培養(yǎng)基中添加外源的花生四烯酸底物(30μM 15分鐘，37℃)，而后轉(zhuǎn)化前列腺素E2產(chǎn)物至肟酸甲酯形式。該生活周期的衍生物可通過放射免疫分析測(cè)定。(試劑盒購(gòu)自Amersham公司)。
期望的NS5A和PKR細(xì)胞可通過構(gòu)建在此描述的基因結(jié)構(gòu)至不同的NS5A和PKR細(xì)胞型，包括但不僅限于，組織培養(yǎng)細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，組織和器官移植物，胚胎而至整個(gè)動(dòng)物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，構(gòu)建的物質(zhì)根據(jù)以下描述的步驟和方法為轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。(轉(zhuǎn)化子即與插入的基因結(jié)構(gòu)結(jié)合的結(jié)構(gòu))。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織或動(dòng)物可通過選擇或篩選工程化的物質(zhì)而鑒定并分離，根據(jù)標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化DNA中編碼的性狀。例如，選擇可通過在含抑制量的對(duì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因構(gòu)建物授與的抗性具抗性的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)建立的細(xì)胞而進(jìn)行。進(jìn)一步的，轉(zhuǎn)化細(xì)胞也可通過篩選任何可見的標(biāo)記基因的活性而鑒定(例，β-葡萄糖醛酸酯酶，蟲熒光素酶，B或C1基因)，這些標(biāo)記基因在本發(fā)明的重組核酸構(gòu)建物中存在。這些選擇和篩選的方法學(xué)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
物理和化學(xué)方法也可用于鑒定本發(fā)明含基因構(gòu)建物的細(xì)胞轉(zhuǎn)化子。這些方法包括但不僅限于1)檢測(cè)和確定重組DNA插入的結(jié)構(gòu)運(yùn)用的Southern分析或PCR擴(kuò)增；2)Northern印跡，S-1 RNA酶保護(hù)，引物延伸或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增，用于探測(cè)檢查基因結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄；3)酶分析用于探測(cè)酶或核酶活性。這些酶產(chǎn)物由基因構(gòu)建物編碼；4)蛋白凝膠電泳，Western印跡技術(shù)，免疫沉淀，或酶聯(lián)免疫分析，當(dāng)基因構(gòu)建物產(chǎn)物為蛋白質(zhì)；5)對(duì)引入基因的構(gòu)建物表達(dá)結(jié)果的化合物進(jìn)行生化測(cè)定。其它技術(shù)如點(diǎn)雜交，酶染色，和免疫染色，也可用于探測(cè)特殊細(xì)胞，器官和組織中重建構(gòu)建物的表達(dá)。所有這些分析中的方法都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
5.2.4 NS5A或PKR基因產(chǎn)物的純化一旦產(chǎn)生高水平具生物活性的NS5A和PKR的細(xì)胞被鑒定，細(xì)胞可免隆擴(kuò)大并用于大量制備這些蛋白質(zhì)。這些基因產(chǎn)物可運(yùn)用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行純化，包括但不僅限于免疫親合純化，色譜法包括高效液相色譜及其它。當(dāng)基因產(chǎn)物可從培養(yǎng)細(xì)胞分泌時(shí)，可容易地從培養(yǎng)基收獲NS5A或PKR多肽或肽。
當(dāng)NS5A或PKR編碼序列被設(shè)計(jì)為編碼可裂解的融合蛋白時(shí)，運(yùn)用親合純化可容易地純化NS5A或PKR。例如對(duì)異源蛋白或多肽特異性的抗體可用于捕獲持久的融合蛋白；如在固體表面，柱等。NS5A或PKR部分在合適的酶裂解連接位點(diǎn)后可釋放。
運(yùn)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建cDNA，轉(zhuǎn)染，純化表達(dá)蛋白，分離少量但足夠量的NS5A或PKR研究蛋白的生理和動(dòng)力學(xué)特性。使用定點(diǎn)突變或自然突變序列，本系統(tǒng)提供適當(dāng)?shù)牟襟E以確定改變的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白功能的作用。相對(duì)于具相反排列的構(gòu)建物在可裂解的蛋白氨基端之前具NS5A或PKR的融合構(gòu)建物可被設(shè)計(jì)用于評(píng)估對(duì)蛋白生物學(xué)功能和純化的可能性干擾最少的融合構(gòu)建物。
運(yùn)用本發(fā)明的這方面，任何裂解位點(diǎn)或酶裂解底物可被設(shè)計(jì)在NS5A或PKR序列和另一個(gè)具用于純化的結(jié)合部分(例，任意為免疫親合層析柱制備的抗原)的肽或蛋白。
5.3NS5A蛋白的抗體定義NS5A基因產(chǎn)物的抗體在本發(fā)明探討的范圍內(nèi)，包括特異性識(shí)別-至更多NS5A基因產(chǎn)物表位(如ISDR)的抗體。這些抗體可包括，但不僅限于多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)，人的或嵌合性抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab′)2片段，從Fab表達(dá)文庫(kù)中制備的片段，抗基因型(抗Id)抗體，和以上任何的表位結(jié)合片段。這些抗體可用于，例，在生物學(xué)樣品中探測(cè)NS5A基因產(chǎn)物，生物學(xué)樣品包括但不僅限于血漿和血清。該抗體也可用作抑制NS5A基因產(chǎn)物活性。
針對(duì)特殊抗原的同源種群抗體的單抗，可運(yùn)用從培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系制備抗體分子的任意方法獲得。這些方法包括但不僅限于，Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然256495-497；和美國(guó)專利號(hào)4,376,110)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1987，今日免疫學(xué)；Cole等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊802026-2030)，和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。這些抗體可為任意免疫球蛋白類包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD和其任意亞類。本發(fā)明制備mAb的雜交瘤可在體內(nèi)或體外培養(yǎng)。
另外，制備嵌合抗體的技術(shù)(Morrison等，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，816851-6855；Neuberger等，1984，自然312604-608；Takeda等，1985，自然，314452-454)進(jìn)一步發(fā)展，可將來(lái)自適當(dāng)抗原的鼠抗體分子的基因特異性與來(lái)自適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因相連。嵌合抗體分子的不同部分衍生至不同種動(dòng)物，如具有不同的區(qū)衍生自鼠單抗和人免疫球蛋白恒定區(qū)。
制備單鏈抗體的技術(shù)(U.S.專利4,946,778；Bird，1988，科學(xué)242423-426；Huston等，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊855879-5883；和Ward等，1989，自然334544-546)可用于制備抗NS5A基因產(chǎn)物的單鏈抗體。單鏈抗體的制備是通過氨基酸橋聯(lián)接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段形成單鏈多肽。
識(shí)別特殊表位的抗體片段可通過熟知的技術(shù)制備。例如，這些片段包括但不僅限于通過對(duì)抗體分子胃蛋白酶消化制備的F(ab′)2片段和通過還原F(ab′)2片段的二硫化物鍵產(chǎn)生的Fab片段。亦可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989，科學(xué)，2461275-1281)以對(duì)單克隆Fab片段期望的特異性進(jìn)行快速和簡(jiǎn)易的鑒定。
5.4用于鑒定選擇性抑制NS5A和IFN誘導(dǎo)的PKR的相互作用的試劑的篩選分析本發(fā)明涉及體外及體內(nèi)篩選靶間含ISDR的病毒蛋白和這些蛋白與IFN誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶的相互作用的試劑的篩選方法。
用于篩選能破壞或調(diào)節(jié)病毒在翻譯中作用的潛在試劑的方法可建立在申請(qǐng)人關(guān)于NS5A直接與PKR相互作用以及在此相互作用中必須ISDR和PKR的催化區(qū)的發(fā)現(xiàn)之上。篩選具破壞或調(diào)節(jié)病毒作用能力的潛在試劑的方法可進(jìn)一步根據(jù)申請(qǐng)人關(guān)于NS5A結(jié)合于PKR二聚化區(qū)，氨基酸244-296，導(dǎo)致對(duì)PKR功能的抑制的發(fā)現(xiàn)。原則上講，本領(lǐng)域熟知的許多方法可用于探測(cè)對(duì)這些組成部分相互作用的干擾。因此，例如，對(duì)測(cè)試試劑反應(yīng)而引起PKR蛋白激酶催化活性的活化會(huì)表明試劑干擾NS5A對(duì)PKR的抑制作用。
篩選的實(shí)施是通過添加檢測(cè)試劑入被病毒感染的完整細(xì)胞，而后檢查感興趣的組分，通過已被建立用以證明病毒對(duì)該組分的作用的方法。篩選的實(shí)施也可通過加入檢測(cè)試劑至體外翻譯反應(yīng)，而后進(jìn)行已既定的分析。另一選擇是，已被上述方法確定與另一組分相互作用的純化的或部分純化的組分可被置于相互作用將發(fā)生的條件下，加入或不加檢測(cè)試劑，以往建立的用于分析相互作用的步驟可用于評(píng)估檢測(cè)試劑的影響。在此方法中，純化的或部分純化的組分可通過未感染或感染的細(xì)胞的抽提物分離來(lái)制備，或者它們可通過其克隆基因或cDNA或片段的表達(dá)來(lái)獲得，按照表達(dá)物質(zhì)純化的方法。
體外選擇方法的主要策略中，幾種方法對(duì)篩選檢測(cè)試劑格外便利。這些包括但不僅限于衡量?jī)煞N以上組分的結(jié)合相互作用的方法，檢測(cè)相互作用組分之一的酶活性方法，和檢測(cè)報(bào)告蛋白表達(dá)活性的方法，即酶或其它可探測(cè)或可選擇的蛋白，被置于某一組分的控制下。
兩種以上組分之間的結(jié)合相互作用可通過許多方式測(cè)量。一種方法是以容易檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記一種組分，將其與其它組分置于正常情況下發(fā)生相互反應(yīng)的條件下，分離結(jié)合的標(biāo)記組分，測(cè)量結(jié)合組分的量。結(jié)合反應(yīng)中檢測(cè)試劑的作用可通過比較試劑存在時(shí)結(jié)合的標(biāo)記組分量與缺少試劑時(shí)的量比較而確定。
該類型方法的分離步驟可通過多種方式完成。在一種方法中，標(biāo)記組分的結(jié)合部分可在結(jié)合反應(yīng)之前被固定在固相上，未結(jié)合的標(biāo)記組分在結(jié)合反應(yīng)后沖洗固相可移走。結(jié)合部分與固相的接觸可以很多本領(lǐng)域熟知的方法完成，包括但不僅限于化學(xué)交聯(lián)，對(duì)塑料表面的非特異性附著，與固相上接的抗體的相互作用，結(jié)合配偶體上附著的配體(如生物素)與固相上附的配體結(jié)合蛋白(如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)。
或者，分離步驟可在標(biāo)記組分與結(jié)合配偶體在溶液中相互作用后完成。如果標(biāo)記組分與其結(jié)合部分間的體積差異允許分離，則可將結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物通過孔徑可讓未結(jié)合標(biāo)記通過而非其結(jié)合配偶體或標(biāo)記組分與其結(jié)合配偶體結(jié)合后的整體的超濾器。分離也可通過運(yùn)用能從溶液中捕獲標(biāo)記組分的結(jié)合配偶體的試劑而完成，如抗結(jié)合部分的抗體，能與接觸到結(jié)合配偶體的配體相互作用的配體結(jié)合蛋白等。
依賴對(duì)酶活性測(cè)量的檢測(cè)方法可根據(jù)每例中酶的特性來(lái)實(shí)施。如上所指出的，許多酶的活性可根據(jù)病毒對(duì)翻譯的作用而確定是否介入，包括但不僅限于激酶，磷酸酶，糖基化酶，去糖基化酶，轉(zhuǎn)移酶，脂酶，脫氧核糖核酸酶，核糖核酸酶，蛋白酶，合成酶，聚合酶以及其它。一般說來(lái)，酶活性的測(cè)量要求在其它物質(zhì)存在下測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物的能力，以及從反應(yīng)的底物中分辨或分離反應(yīng)產(chǎn)物的能力。用于測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物的方法包括但不僅限于測(cè)量轉(zhuǎn)移或混合的放射活性或其它標(biāo)記的原子或基團(tuán)，分光光度法或比色法測(cè)量產(chǎn)物的濃度，測(cè)量發(fā)光或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光輸出，測(cè)量熒光產(chǎn)物的熒光，免疫分析，其它免疫化學(xué)步驟，以及其它競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析。酶活性可通過剛剛提到的任何方法來(lái)探測(cè)次級(jí)反應(yīng)或依賴感興趣的反應(yīng)的產(chǎn)物為底物或輔助因子的反應(yīng)的產(chǎn)物。
在許多情況下，酶反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需將其從反應(yīng)混合物的其它成分中分離即可被探測(cè)，如當(dāng)無(wú)色底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物或產(chǎn)物的吸收光譜與底物不同，可選擇產(chǎn)物的吸收測(cè)量的波長(zhǎng)。免疫分析，其它免疫化學(xué)方法和其它競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析也可不首先分離感興趣的產(chǎn)物而實(shí)施。
在其它情況下，必須包括一個(gè)分離步驟或測(cè)量前將產(chǎn)物從反應(yīng)混合物的其它成分中分離的步驟。在這些情況下，必須的分離可通過許多方法完成，包括但不僅限于離心，三氯乙酸酸沉淀，乙醇沉淀，硫酸銨沉淀，濾紙結(jié)合，其它沉淀，凝膠過濾，離心交換層析，疏水相互作用層析，反相層析，親合層析，差別提取法，等電聚焦電泳，等速電泳等。
作為對(duì)測(cè)量代表翻譯中病毒作用的酶活性方法的補(bǔ)充，也可測(cè)量代表病毒作用控制的報(bào)告基的表達(dá)或活性，報(bào)告蛋白即為酶或其它可探測(cè)或可選擇的蛋白。例如當(dāng)激酶代表病毒作用時(shí)，激酶對(duì)特殊蛋白磷酸化導(dǎo)致該蛋白或該蛋白控制的蛋白的活化或抑制，可檢測(cè)特殊蛋白的磷酸化。例如，在酵母中GCN2蛋白(或哺乳動(dòng)物PKR激酶)磷酸化eIF2-α，導(dǎo)致對(duì)翻譯起始的抑制，繼而導(dǎo)致GCN4蛋白合成增加，繼而誘導(dǎo)氨基酸生物合成包括的進(jìn)一步的蛋白合成。報(bào)告蛋白可在遺傳水平上與GCN4蛋白融合，則這些報(bào)告者的合成可被GCN2或哺乳動(dòng)物PKR催化的初始磷酸化事件誘導(dǎo)。
相同的方法也被應(yīng)用于檢測(cè)試劑引起的突變，根據(jù)在翻譯中病毒作用引起多種其它組分活性變化。檢測(cè)試劑對(duì)蛋白酶的作用，可通過此蛋白酶的靶，報(bào)告蛋白在體外反應(yīng)中的殘存來(lái)監(jiān)測(cè)。同樣地，檢測(cè)試劑對(duì)核酸酶的作用可根據(jù)體外翻譯反應(yīng)或體外轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)中提供的從合適成形的編碼序列翻譯得到的報(bào)告蛋白的蹤跡來(lái)監(jiān)測(cè)。
在此類分析中適合作報(bào)告者的蛋白包括但不僅限于，易分析的酶，如β-半乳糖苷酶，蟲熒光素酶，β-葡萄糖醛酸酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，和分泌的初期堿性磷酸酶；易進(jìn)行免疫分析的蛋白如激素和細(xì)胞因子；使細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)的蛋白如腺苷脫氨酶，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo基因的產(chǎn)物)，二羥葉酸還原酶；潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激酶(與HAT培養(yǎng)基共用)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)，以及在營(yíng)養(yǎng)缺陷型中提供生物合成能力缺失的蛋白，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的蛋白，例如轉(zhuǎn)換非毒性底物為毒性產(chǎn)物的酶，如胸苷激酶(當(dāng)使用含溴脫氫尿核苷的培養(yǎng)基時(shí))和乳清酸苷-5′-磷酸脫羧酶(當(dāng)使用5′-氟乳清酸)；和有毒性蛋白如蓖麻蛋白，霍亂毒素或白喉病毒。
用于選擇檢測(cè)試劑描述的許多方法包括檢查這些試劑對(duì)體外反應(yīng)兩個(gè)以上組分的相互作用的影響。相互作用的組分在細(xì)胞內(nèi)亦可接觸。在此方法中，編碼部分或全部組分的序列被引入細(xì)胞的選擇型。此方法的編碼序列包括克隆基因或cDNA或片段或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的片段或天然RNA或轉(zhuǎn)錄的RNA及其它。此方法的若干變異亦可行。在一種變異方法中，編碼序列作為一種組分引入至已知含與此組分相互作用的另一種組分的細(xì)胞中。例如病毒組分的編碼序列引入至某細(xì)胞中，此細(xì)胞是研究的病毒感染的靶。試劑經(jīng)檢測(cè)，選擇在引入編碼序列的細(xì)胞可阻抑病毒組分作用的試劑。在另一種變異方法中，兩個(gè)以上可與其它組分相互作用的成分的編碼序列可引入至某細(xì)胞，試劑經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)它們調(diào)節(jié)這些組分間相互作用的能力，該相互作用通過適當(dāng)?shù)囊呀⒌姆椒ūO(jiān)測(cè)。引入編碼序列的細(xì)胞為所研究病毒正常感染的靶。細(xì)胞可為易生長(zhǎng)，控制和檢測(cè)的細(xì)胞，如酵母細(xì)胞。事實(shí)上，在異源細(xì)胞重建翻譯控制機(jī)制具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，這種條件下，組分間的相互作用較之它們處于正常環(huán)境下更易研究。以酵母為例，運(yùn)用有效的遺傳方法，使從高級(jí)真核生物中分辨和分離酵母基因的同源物較之在高等真核生物中分辨相應(yīng)基因更迅速。
顯而易見的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從多種方法中選擇方法在每個(gè)階段分離在病毒作用于翻譯過程中包括的組分，確認(rèn)這些組分間相互作用的特征，以及貫徹篩選測(cè)試以選擇調(diào)節(jié)或取消這些組分間的相互作用的化合物。
以下為本發(fā)明的特殊篩選和方法的詳細(xì)概述。描述了一種篩選方法，篩選有效干擾表達(dá)ISDR的病毒蛋白對(duì)PKR蛋白激酶的抑制的試劑。例如，在所選擇的系統(tǒng)中，病毒可產(chǎn)生干擾宿主細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA活化的蛋白激酶的活性的病毒抑制劑。如上所注意到的，本例不限于本發(fā)明，而僅為本發(fā)明廣泛范圍的舉例。
方法一般包括孵育蛋白激酶，病毒抑制劑，和待測(cè)化合物，在有效造成病毒抑制劑干擾蛋白激酶活化的條件下，檢查混合物以確認(rèn)干擾。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了4個(gè)實(shí)施方案，如以下所詳述。
5.4.1體外篩選分析實(shí)例1，該方法用于篩選有效抑制宿主細(xì)胞中產(chǎn)生可與PKR蛋白激酶結(jié)合的病毒抑制劑并阻抑PKR蛋白激酶被雙鏈RNA(dsRNA)激活的病毒的復(fù)制。在此，孵育步驟包括在有效結(jié)合病毒抑制劑至蛋白激酶的條件下培養(yǎng)混合物，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)結(jié)合病毒抑制劑的蛋白激酶。
孵育可進(jìn)行在，例如溶液相中，將混合物過濾器，僅在病毒抑制劑與蛋白激酶結(jié)合后，濾器才保留病毒抑制劑。
也可選擇將蛋白激酶結(jié)合至固體支持物上，病毒抑制劑用報(bào)告者標(biāo)記，通過檢測(cè)結(jié)合在固體支持物上的報(bào)告者實(shí)施檢測(cè)步驟。
可替代的孵育可在一定條件下進(jìn)行，無(wú)病毒抑制劑結(jié)合時(shí)，蛋白激酶自磷酸化，檢測(cè)步驟可通過確定PKR激酶磷酸化的范圍而實(shí)施。
實(shí)例2，孵育步驟包括在無(wú)病毒抑制劑時(shí)PKR激酶可活化的條件下孵育混合物，檢查步驟包括在抑制劑存在時(shí)檢查PKR激酶的活性。
孵育可通過純化或部分純化的PKR沉淀進(jìn)行，檢測(cè)步驟包括測(cè)量激酶的自磷酸化或eIF2-α的磷酸化或激酶的組蛋白底物的磷酸化。
孵育可在體外含PKR激酶的翻譯混合物中進(jìn)行，檢測(cè)步驟包括測(cè)量翻譯特殊mRNA產(chǎn)生的報(bào)告者多肽的量。該mRNA的翻譯可被PKR激酶活化所降低，或優(yōu)選地，其翻譯可被PKR激酶活化所增強(qiáng)，例如5′-非翻譯區(qū)衍生至酵母GCN4基因的嵌合RNA。
實(shí)例3，該方法可用于篩選有效阻斷病毒復(fù)制的化合物，該病毒提供病毒抑制劑，有效活化宿主細(xì)胞中可以活化形式阻斷蛋白激酶活化或抑制活化的激酶的組分。在此混合物包括宿主細(xì)胞成分(以活化形式)，孵育步驟在以下條件下進(jìn)行，其中蛋白激酶在缺乏活化組分時(shí)活化，檢測(cè)步驟包括檢查混合物對(duì)蛋白激酶活性的抑制。也可選擇混合物為以非活化形式存在的宿主細(xì)胞成分，病毒抑制劑活化宿主細(xì)胞組分；孵育步驟在以下條件進(jìn)行，蛋白激酶在無(wú)病毒抑制劑和活化的宿主組分時(shí)活化，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)混合物對(duì)蛋白激酶活性的抑制。
5.4.2體內(nèi)篩選分析本發(fā)明涉及體內(nèi)篩選分析，用以鑒定有效抑制宿主細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的化合物。在這些分析中，檢測(cè)化合物加入的宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳構(gòu)建產(chǎn)生NS5A和PKR或其片段，如節(jié)5.2所述。NS5A和PKR在宿主細(xì)胞中的表達(dá)可為瞬時(shí)的，可誘導(dǎo)的或組成性的，或穩(wěn)定的。待測(cè)化合物干擾NS5A/PKR相互作用的能力可通過加入待測(cè)化合物入宿主細(xì)胞并直接檢測(cè)PKR活性而測(cè)量，即，通過對(duì)已知底物進(jìn)行PKR激酶分析；或間接的，即，通過共轉(zhuǎn)染其表達(dá)依賴活化的PKR激酶存在的報(bào)告基因，為本發(fā)明篩選方法之目的，多種宿主細(xì)胞可采用，包括但不僅限于，組織培養(yǎng)細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母細(xì)胞和細(xì)菌。每種細(xì)胞都自有優(yōu)缺點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如培養(yǎng)的肝細(xì)胞為優(yōu)選細(xì)胞型用以進(jìn)行本發(fā)明的分析，但這些細(xì)胞型有時(shí)難以培養(yǎng)。細(xì)菌和酵母相對(duì)易培養(yǎng)但較哺乳動(dòng)物細(xì)胞難處理蛋白。體內(nèi)篩選方法可參照酵母宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)說明，但該方法的原則適用于上述節(jié)5.2描述的任何遺傳構(gòu)建的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的例證的實(shí)施方案中，病毒的或病毒活化的抑制劑在酵母細(xì)胞中表達(dá)，該酵母細(xì)胞經(jīng)構(gòu)建可在活化的PKR激酶存在下增加報(bào)告多肽的表達(dá)，檢測(cè)步驟包括檢查酵母細(xì)胞中報(bào)告多肽增加的表達(dá)。
參與翻譯控制的酵母蛋白之一為GCN2蛋白。該蛋白為激酶與未負(fù)載的tRNA結(jié)合而激活，在氨基酸供應(yīng)短缺時(shí)積累，該活化的蛋白抑制酵母的翻譯水平，通過磷酸化起始因子eIF2的α亞基。GCN2活化的另一結(jié)果是酵母GCN4蛋白產(chǎn)量增加，GCN4隨后活化氨基酸合成的合成代謝途徑。
本發(fā)明用于體內(nèi)篩選的一種構(gòu)建物為酵母細(xì)胞，其中GCN2基因在調(diào)節(jié)啟動(dòng)子控制下被哺乳動(dòng)物PKR基因所替代。該細(xì)胞還包括以下描述的額外變化。將PKR基因引入酵母可通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)進(jìn)行，將選擇編碼序列引入酵母。簡(jiǎn)要地講，PKR基因被置于下調(diào)啟動(dòng)子控制下，在下調(diào)條件下發(fā)生細(xì)胞選擇。因PKR蛋白在酵母細(xì)胞中可能被內(nèi)源dsRNA基本活化，如表達(dá)至過高水平，則抑制其活化條件下細(xì)胞翻譯。
酵母細(xì)胞而后被進(jìn)一步構(gòu)建，使PKR的調(diào)節(jié)可通過檢查報(bào)告多肽水平檢查，報(bào)告多肽的產(chǎn)量依賴于活化的PKR酶存在。這樣的報(bào)告者可通過將β-gal基因融合至GCN4酵母基因而制備。后者基因在GCN2活化的條件下表達(dá)，在酵母細(xì)胞中PKR磷酸化控制下，此酵母細(xì)胞中GCN2被PKR所取代。因此，活化的PKR的存在導(dǎo)致基本酵母翻譯的關(guān)閉，但加強(qiáng)融合的GCN4/β-gal蛋白的制備。融合蛋白的表達(dá)可通過檢測(cè)β-gal的活性來(lái)測(cè)量。
篩選系統(tǒng)經(jīng)設(shè)計(jì)用于篩選藥物，該藥物有效破壞病毒的病原體對(duì)宿主細(xì)胞試圖關(guān)閉細(xì)胞翻譯的反抵抗，通過PKR蛋白的活化。病毒的反抵抗包括(a)VA1，EBER-1或TAR病毒抑制劑RNA，可占領(lǐng)PKR的結(jié)合位點(diǎn)并阻止dsRNA結(jié)合并活化PKR，或(b)病毒的能力，例流感病毒，可誘導(dǎo)或活化細(xì)胞內(nèi)組分，此組分有效抑制PKR的活化或活化的酶失效，或(c)病毒蛋白如呼腸孤病毒σ3蛋白或牛痘蛋白K3L和E3L蛋白等阻抑PKR活化或活性的蛋白，或(d)細(xì)胞內(nèi)成分與病毒RNA的復(fù)合物，如脊髓灰質(zhì)炎病毒用于降解PKR激酶的復(fù)合物。
在病毒抑制劑的例子中，用于篩選的酵母細(xì)胞經(jīng)進(jìn)一步構(gòu)建而含有在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制下的病毒抑制劑基因。在非誘導(dǎo)的生長(zhǎng)條件下，病毒抑制劑不表達(dá)(但PKR蛋白表達(dá))，PKR蛋白可能被上述的內(nèi)源dsRNA活化，活化的PKR存在通過測(cè)量相對(duì)高水平GCN4/β-gal融合蛋白可知。在誘導(dǎo)生長(zhǎng)條件下，例如，當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包括控制病毒抑制劑表達(dá)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑時(shí)，細(xì)胞因病毒誘導(dǎo)劑的存在而表現(xiàn)較低的活化PKR水平，這可通過較低水平的GCN4/β-gal融合蛋白顯示。潛在的抗病毒劑通過評(píng)估它們對(duì)病毒抑制劑誘導(dǎo)條件下測(cè)量的GCN4/β-gal融合蛋白的水平來(lái)檢測(cè)。選擇那些允許相對(duì)高水平融合蛋白合成的試劑，作為阻止病毒抑制劑干擾內(nèi)源雙鏈RNA導(dǎo)致的PKR活化的試劑。
在細(xì)胞內(nèi)成分被病毒誘導(dǎo)或活化以阻止PKR激酶活化或抑制活化的激酶的例子中，此細(xì)胞內(nèi)成分的基因置于酵母細(xì)胞中，以用于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(替代以上所描述的病毒抑制劑RNA基因)的控制下進(jìn)行篩選。該酵母株繼而用于篩選所述的病毒抑制劑。因此，在非誘導(dǎo)的生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞組分不表達(dá)，且觀察到相對(duì)高水平的GCN4/β-gal融合蛋白，反映了內(nèi)源雙鏈RNA活化的PKR存在。在誘導(dǎo)生長(zhǎng)條件下，GCN4/β-gal融合蛋白水平較低，反映了細(xì)胞內(nèi)組分抑制PKR的活化或活性。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)組分的誘導(dǎo)條件下，選擇允許相對(duì)高水平融合蛋白合成的試劑。
在細(xì)胞內(nèi)組分和降低PKR激酶的病毒組分間形成復(fù)合物的例子中，采用相似的方法。在此例中，進(jìn)一步構(gòu)建酵母菌株，使之在可誘導(dǎo)的控制下包含細(xì)胞內(nèi)和病毒組分的基因，篩選方法如上所述而實(shí)施。
以下例子論證了上述的篩選方法，但本發(fā)明的范圍絕不僅限于此。
5.5在對(duì)HCV治療中靶向NS5A多種技術(shù)和組合物可用于靶向NS5A以抑制其活性或抑制NS5A和IFN誘導(dǎo)的蛋白的相互作用，因而抑制HCV感染。
例如，可用的化合物與本發(fā)明一致，包括任何靶向NS5A以抑制其活性或干擾NS5A和IFN-誘導(dǎo)的PKR的相互作用的化合物，包括但不僅限于抗NS5A或ISDR的中和抗體。其它化合物的例子包括但不僅限于肽(例如，代表NS5A與IFN-誘導(dǎo)的PKR相互作用所必需的區(qū)的肽，如ISDR)，磷酸肽，小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，或抗體(包括，例如，多克隆的，單克隆的，人源化的，抗遺傳型的，嵌合的或單鏈抗體，以及FAb，F(xiàn)(ab′)2和Fab表達(dá)文庫(kù)片段，和其表位結(jié)合片段)。這些化合物的有效劑量確定和施用技術(shù)如下所述，在節(jié)5.6，在下述。
另外，根據(jù)本發(fā)明所用的化合物，包括細(xì)胞內(nèi)藥物，用以抑制NS5A的活性-競(jìng)爭(zhēng)配體從而抑制IFN-誘導(dǎo)的PKR與NS5A的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明也可運(yùn)用基因治療方法以抑制NS5A和IFN-誘導(dǎo)的蛋白的相互作用。這些可破壞NS5A的相互作用，尤其是以ISDR為其細(xì)胞內(nèi)靶的化合物為反義，核酸和三螺旋結(jié)構(gòu)分子。這些分子經(jīng)設(shè)計(jì)抑制靶基因，NS5A，在HCV感染的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。制備和應(yīng)用反義核酶和/或三螺旋分子的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，且可根據(jù)編碼ISDR的氨基酸序列的核苷酸序列設(shè)計(jì)，如圖1A所示。
反義RNA和DNA分子通過與靶mRNA雜交和阻止蛋白翻譯而直接阻斷mRNA的翻譯。根據(jù)反義DNA，翻譯起始點(diǎn)衍生的寡脫氧核糖核苷，例，優(yōu)選在感興趣的靶基因核苷酸序列的-10到+10區(qū)。
核酸為酶特性的RNA分子，可催化特殊的RNA裂解(綜述見Rossi，J.，1994，普通生物學(xué))。核糖酶作用機(jī)制包括核糖酶分子序列特殊性雜交至互補(bǔ)的靶RNA，而后內(nèi)切核酶解裂解。核酶分子組成包括1至多個(gè)與靶基因mRNA互補(bǔ)序列，還包括已知的負(fù)責(zé)mRNA裂解的催化序列。此序列見美國(guó)專利號(hào)5,093,246，全文收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。本發(fā)明的范圍中包括特異并高效催化編碼靶基因蛋白的RNA序列內(nèi)切核酶解裂解的工程化錘頭基序核酶。
任何潛在的RNA靶中的特異性核酶裂解位點(diǎn)的最初鑒別可根據(jù)掃描感興趣的分子尋找核酶裂解位點(diǎn)中包括GUA，GUU和GUC進(jìn)行最初鑒別。一旦被鑒定，相應(yīng)于包含裂解位點(diǎn)的靶基因的區(qū)15至20核糖核苷酸之間的短RNA序列，可經(jīng)評(píng)估得到預(yù)期的面貌，如二級(jí)結(jié)構(gòu)，以便剔除不適當(dāng)?shù)墓押塑账嵝蛄小：蜻x序列的適應(yīng)性可通過檢測(cè)它們的接近性而評(píng)估，與互補(bǔ)寡核苷酸雜交，進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)分析。
用于抑制轉(zhuǎn)錄的形成三螺旋結(jié)構(gòu)的核酸分子可為單鏈或組合的脫氧核苷酸。這些寡核苷酸的堿基組成必須經(jīng)Hoogsteen堿基配對(duì)原則設(shè)計(jì)可促進(jìn)三螺旋形成，一般要求嘌呤或嘧啶在雙顯性組合的單鏈中具大小合適的延伸。核苷酸序列可為嘧啶組成的，導(dǎo)致穿過三螺旋的三條相關(guān)鏈的TAT和CGC+三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供與該單鏈平行的雙螺旋的單鏈中富含嘌呤的區(qū)域互補(bǔ)的堿基。另外，所述的核苷酸分子富含嘌呤，例如含一串G殘基。這些分子與富含GC堿基對(duì)的DNA雙螺旋形成三螺旋，其中嘌呤堿基主要定位在靶雙鏈體的單鏈上，導(dǎo)致CGC三聯(lián)體穿過三聯(lián)體的三條鏈。
可替代地，作為三螺旋形成的靶的潛在序列可通過產(chǎn)生所謂“switchback”的核酸分子而增加。Switchback分子以交替的5′-3′，3′-5′方式合成，這樣它們與雙螺旋的第一鏈先堿基配對(duì)，而后與另一鏈配對(duì)，則無(wú)需適當(dāng)延伸的嘌呤或嘧啶在雙鏈體一條鏈中。
此處所述的反義核酶，和/或三螺旋分子用于抑制突變基因表達(dá)時(shí)，可能運(yùn)用此技術(shù)有效地減少或抑制轉(zhuǎn)錄(三螺旋)和/或mRNA翻譯(反義核酶)，該mRNA由正常靶基因等位基因產(chǎn)生。當(dāng)正常靶基因產(chǎn)物存在濃度比正常表型所需的低時(shí)，該可能性上升。在這些例子中，為確保維持靶基因活性的實(shí)際正常水平，編碼和表達(dá)表現(xiàn)正常靶基因活性的靶基因多肽的核酸分子可通過基因治療方法引入細(xì)胞，運(yùn)用不包括對(duì)反義核酶或三螺旋處理敏感序列的核酸分子。在憑靶基因編碼細(xì)胞外蛋白的例子中，優(yōu)選共管理正常靶基因的蛋白，以保持靶基因活性的必要水平。
本發(fā)明的反義RNA和DNA，核酶和三螺旋分子可通過本領(lǐng)域已知的任何合成DNA和RNA分子的方法制備。這些方法包括化學(xué)合成寡脫氧核苷酸和寡核糖核寡酸，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成。RNA分子也可由體外或體內(nèi)編碼反義的RNA分子轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生。此DNA序列可連入至多種包括合適RNA聚合酶啟動(dòng)子如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子的載體。組成性或誘導(dǎo)性合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建物，根據(jù)所用的啟動(dòng)子，可穩(wěn)定引入細(xì)胞系。
對(duì)DNA分子多種熟知的修飾可作為增加細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和延長(zhǎng)半衰期的合法引入?？赡艿男揎棸ǖ粌H限于，添加核糖或脫氧核苷酸至分子的5′或3′端或應(yīng)用硫代磷酸酯或2′-O-甲基而非磷酸二酯酶鍵在寡脫氧核糖核苷酸主鏈中。
5.6藥物制劑和用藥方法本發(fā)明包括以本發(fā)明篩選方法鑒定新抗病毒劑，在藥物組成和治療方式上以含ISDR蛋白為干擾的靶用以治療病毒感染。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明篩選分析鑒定的新抗病毒試劑可與其它已知抗病毒劑共用治療病毒感染。
5.6.1抗病毒劑與NS5A抑制劑合用根據(jù)本發(fā)明，由本發(fā)明篩選方法鑒定的新抗病毒劑可與其它治療劑合用以增強(qiáng)抗病毒作用。優(yōu)選NS5A抑制劑與其它抗病毒劑合用。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，誘導(dǎo)IFN表達(dá)至一定水平使NS5A對(duì)PKR的抑制失效的一種試劑可與另一種抗病毒劑合用。這些與NS5A抑制劑共同使用的其它抗病毒劑包括但不僅限于，作用于病毒復(fù)制中不同靶分子的試劑，例，優(yōu)先翻譯的抑制劑；作用于病毒傳播中不同靶分子的試劑；作用于相同分子的不同位點(diǎn)的試劑；阻止或減少病毒抗性出現(xiàn)的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解多種展現(xiàn)以上活性方式的多種抗病毒療法。
在本發(fā)明的實(shí)施方案之一中，由本發(fā)明的篩選方法鑒定的新抗病毒劑與IFN療法共用。由本發(fā)明的篩選方法鑒定的抗病毒劑也可與誘導(dǎo)IFN表達(dá)的外源或內(nèi)源試劑共用。在另外的實(shí)施方案中，NS5A的抑制劑與優(yōu)先翻譯的抑制劑合用以靶向病毒生活周期中所需的兩種不同分子。
為評(píng)估NS5A抑制劑與以上描述的抗病毒療法共用的潛在治療功效，這些組合可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法檢查抗病毒活性。
本發(fā)明的化合物可單獨(dú)施用給患者或以藥學(xué)組合物形式與合適量的載體或賦形劑混合，以治療或改善包括HCV感染的多種情況。治療有效劑量指足夠抑制HCV感染的化合物量。治療有效劑量可單獨(dú)施用或在與其它針對(duì)HCV感染或相關(guān)疾病的治療聯(lián)合中作為輔助療法?；衔锝M成和施用的配制方法技術(shù)可見“Remington藥物科學(xué)”Mack出版公司，Easton，PA，最新版。
5.6.2施用途徑合適的施用途徑包括，例如，經(jīng)口的，直腸的，透過粘膜的，或腸的施用；非腸道傳遞，包括肌肉內(nèi)，皮下的，髓內(nèi)注射，或眼內(nèi)注射，可選擇以積存或持續(xù)地釋放制劑。
更進(jìn)一步的，可在靶藥物傳遞系統(tǒng)內(nèi)施用本發(fā)明的試劑，例如在靶向肝的脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體可靶向肝并被肝細(xì)胞選擇性攝取。
5.6.3組合物/制劑本發(fā)明的藥物組合物可大量生產(chǎn)，例，通過常規(guī)的混合，溶解，制糖衣，飄浮，乳化，形成膠丸，包衣或凍干過程。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的藥學(xué)組合物可以常規(guī)方式制成，采用一種或更多生理學(xué)上可接受的載體包括賦形劑和輔劑以推進(jìn)將活化的化合物藥學(xué)制備過程。根據(jù)選擇的施用途徑?jīng)Q定適合的制劑。
如注射用，本發(fā)明的試劑，可在制劑中使用水溶性溶液，優(yōu)選生理適合的緩沖液，如Hank′s液，Ringer′s液，或生理鹽緩沖液。如透過粘膜施用，制劑中使用適合透過屏障的滲透液，這些滲透液為本領(lǐng)域所通常了解的。
如口服，則化合物可制為活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受載體。
這些載體使本發(fā)明的化合物可制為片劑，藥丸，糖丸，膠囊，液體，凝膠體，糖漿，淤漿，懸浮液等，以便被治療的患者從口攝入。制備為口服的藥學(xué)制劑，可加入固體賦形劑研磨為混合物，繼而加粒劑制為粒狀混合物，加入合適的輔劑，得到片劑或糖衣丸核。合適的賦形劑為，尤其是，填充物如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，或山梨糖醇；纖維素制劑如，例，玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，土豆淀粉，明膠，樹膠，黃蓍膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入分散劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸或藻酸鹽如藻酸鈉。
糖衣丸核心可加合適外殼。為此目的，可用濃縮的糖溶液，可選擇性包括阿拉伯樹膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，Carbopol凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，lacquer溶液，和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。可加染色料或色素入片劑或糖衣劑外殼中以使活化的化合物的不同組合特征化易鑒別。
口服的藥物制劑包括明膠所制的按壓密合(push-fit)膠囊，以及由明膠和成形劑所制的柔軟、封閉膠囊。按壓密合膠囊包括混合物中的活性成分以及填充物如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂和選擇性加入穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活化的化合物可溶解或重懸在合適的液體中，如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙二醇。另外，可加入穩(wěn)定劑，用于口服的所有制劑應(yīng)為施用合適的劑量。
為口腔施用，組合物應(yīng)照常規(guī)方法制成片劑或糖錠。
為呼吸施用，根據(jù)本發(fā)明所用的化合物按常規(guī)經(jīng)壓力包或噴霧器以氣霧劑噴霧形式傳遞，且應(yīng)用合適的推進(jìn)劑，例二氯二氟甲烷，二氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適氣體。在加壓的氣霧劑中，劑量單位由提供閥門傳遞測(cè)量的量決定。用于吸入器或吹入器的膠囊和膠片(cartridges)，如明膠所制，可包括化合物的粉末混合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉。
化合物可制為非腸道用于注射的，例如注射或持續(xù)輸注。注射用制劑可以單位劑量形式存在，例，在安瓿或多劑量容器中，加入額外保腐劑，組合物可為多種形式，如懸浮液，溶液或油狀乳濁液或水媒介的乳濁液，可包括配方試劑如懸浮，穩(wěn)定和/或分散劑。
優(yōu)選施用的藥物制劑包括活化的化合物的水溶性溶液。另外的，活化化合物的懸浮液可以制備為合適的油狀注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水溶性注射懸浮液可包括增加懸浮液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或葡聚糖。懸浮液也可包括合適的穩(wěn)定劑或試劑，它們可提高化合物的可溶性，以得以制備高濃度溶液。
活化組分可為粉末形式，使用前加入合適的載體，例，無(wú)菌無(wú)熱原質(zhì)水。
化合物可制備用在直腸，組合物例栓劑，停滯灌腸劑，例，包括常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯。
除以往所述的制劑外，該化合物可制備成儲(chǔ)存制劑。這些長(zhǎng)時(shí)間作用制劑通過植入法(例皮下的或肌肉的)或通過肌內(nèi)注射施用。因此，例如，該化合物可與聚合的或疏水的物質(zhì)(例在可接受油中的乳膠或離子交換樹脂，或作為少量可溶的鹽，例，作為少量溶解的鹽，制備。
脂質(zhì)體和乳液是疏水藥物傳遞載體的眾所周知例子。特定有機(jī)溶劑如二甲基亞砜也可用，盡管高毒性。另外，化合物可用持久釋放系統(tǒng)運(yùn)送，如含治療試劑的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)。多種持久釋放物質(zhì)已被建立，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。持久釋放膠囊可根據(jù)它們的化學(xué)性質(zhì)在幾個(gè)星期至約100天時(shí)間釋放化合物。根據(jù)治療試劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可使用額外的穩(wěn)定蛋白的策略。
藥學(xué)組合物也可包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑包括但不僅限于碳酸鈣，磷酸鈣，多糖，淀粉，纖維素鹽，明膠，和聚合物如聚乙二醇。
被鑒定為NS5A和IFN誘導(dǎo)的PKR相互作用的抑制劑的本發(fā)明的許多化合物可與藥學(xué)上相容的反荷離子形成鹽提供。藥學(xué)相容鹽可由化合物與多種酸形成，包括但不僅限于鹽酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸等，或堿。鹽在水或其它相應(yīng)的自由基形式質(zhì)子溶劑中更易溶。藥學(xué)上可接受的鹽，載體或賦形劑的例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可在Remington藥物科學(xué)，18版，A.R.Gennaro.Ed.，Mack出版公司，Easton，PA，1990中找到。這些鹽包括但不僅限于，鈉，鉀，鋰，鈣，鎂，鐵，鋅，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，蘋果酸鹽等。
5.6.4有效劑量本發(fā)明所用的合適的藥物組合物包括那些化合物，其中包含有效量活性組分以達(dá)到它們的目的。更明確的，藥物有效劑量指對(duì)處理的目標(biāo)，可阻止其發(fā)展或減輕已存在癥狀的有效劑量。有效劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員能力決定，特別是根據(jù)了本文所公開的細(xì)節(jié)之后。
對(duì)于本發(fā)明的方法中所用任何化合物，其藥物有效劑量最初可從細(xì)胞培養(yǎng)分析評(píng)估。這些信息可用于更精確決定人體內(nèi)有用劑量。
藥物有效劑量指導(dǎo)致感染的密度減少或癥狀改善或延長(zhǎng)患者存活的化合物量。這些化合物的毒性和治療功效由在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)，藥理學(xué)和毒理學(xué)方法確定，例，決定LD50對(duì)群體50％的致死劑量，和ED50(對(duì)群體50％治療有效的劑量)。毒性和療效的劑量比為治療指數(shù)，它可以LD50和ED50比率表達(dá)。優(yōu)選表現(xiàn)高治療指數(shù)的化合物。從細(xì)胞培養(yǎng)分析或動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制定在人體中應(yīng)用的劑量范圍。這些化合物劑量?jī)?yōu)選在低毒或無(wú)毒的包括ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可在此范圍內(nèi)變動(dòng)，根據(jù)應(yīng)用的藥劑形式和施用途徑。精確的制劑，施用路線和劑量根據(jù)醫(yī)師綜合病人情況決定。(見例，F(xiàn)ingl等，1975，“治療的藥物學(xué)基礎(chǔ)”，第一章p.1)。
藥劑的量和間隔經(jīng)調(diào)整以提供活性成分的血漿水平，使之足夠保持期待的調(diào)整作用，或最小有效濃度(MEC)。MEC因每種化合物而不同但可從體外數(shù)據(jù)估計(jì)，例，使用在此描述的方法成功抑制50-90％HCV所需濃度。達(dá)到MEC的所需劑量根據(jù)個(gè)人特點(diǎn)和施用途徑而定。但HPLC分析，生物分析或免疫分析可用于決定血漿中濃度。
藥劑間隔可用MEC值決定?；衔飸?yīng)根據(jù)制度施用，使血漿中水平保持在MEC以上10-90％，優(yōu)選在30-90％，最優(yōu)選50-90％。
在局部施用或選擇性攝入的例子中，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無(wú)關(guān)。
組合物施用量決定于治療目標(biāo)，根據(jù)受治療者的體重，病情的嚴(yán)重，施用的方法和指導(dǎo)醫(yī)師的判斷。
在免疫接種方法中，所用抗原量和免疫接種程序表由本領(lǐng)域熟練醫(yī)師決定，參考受治療者的抗體效價(jià)和免疫反應(yīng)施用。
5.6.5包裝組合物如期望可存在于包裝或分配器裝置中，其中包含含活性組分的1或多個(gè)單位劑量形式。該包裝可包括金屬或塑料箔，如凸皰包裝。包裝或分配器可附有施用的說明。也可制備包括在相容藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明化合物的組合物，放置在適當(dāng)容器中，標(biāo)記以治療適應(yīng)癥。6.實(shí)施例體外NS5A和PKR相互作用以下在體外實(shí)驗(yàn)中證明HCV蛋白NS5A與干擾素誘導(dǎo)的PKR在體外相關(guān)并對(duì)HCV通過與激酶的物理相互作用直接抑制PKR的活性。
6.1材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建為產(chǎn)生野生型HCV 1a NS5A構(gòu)建物，來(lái)自pSPns％(HCV-1a)的完整NS5A編碼區(qū)通過PCR運(yùn)用寡核苷酸引物A，5′-GGAATTCGAGCTCGCCCG和B，5′-GCTCTAGAAGCACACGACATCTTC(EcoRI和XbaI位點(diǎn)下劃線)擴(kuò)增。所得產(chǎn)物直接克隆至pCR 2.1(Invitrogen)以產(chǎn)生質(zhì)粒pNS5A/CR 2.1。NS5A編碼區(qū)從pNS5A/CR 2.1作為EcoRI片段轉(zhuǎn)移至pBD(Strategene)插入產(chǎn)生pBD-NS5A，或作為EcoRI-XbaI片段插入至pcDNA 3.1/His和pYES2(Invitrogen)，各產(chǎn)生pcDNA 3.1/His-NS5A和pYES-NS5A。為產(chǎn)生NS5A的ISDR缺失突變，產(chǎn)生個(gè)體的N-末端和C-末端編碼片段，均缺乏SIDR。N端區(qū)，編碼氨基酸1-236，通過PCR運(yùn)用引物A和引物C，5′-CCACTCGAGCGGACAGTTGGCTGG(XhoI位點(diǎn)下劃線)。C-端區(qū)，編碼氨基酸278-447，運(yùn)用引物B和引物D，5′-CCGCTCGAGTGGTGATTCTGGTCTC(XhoI位點(diǎn)下劃線)擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物直接克隆至PCR 2.1以產(chǎn)生pN/CR 2.1和pC/CR 2.1。NS5A的N-末端編碼區(qū)從pN/CR 2.1移走插入至pcDNA-3.1/His以產(chǎn)生pcDNA 3.1/His-NS5A1-236。ISDR缺失構(gòu)建物通過將C-末端編碼插入與氨基酸278-447符合讀框的融合的pcDNA 3.1/His-NS5A 1-236的XhoI和XbaI位點(diǎn)，缺失整個(gè)ISDR。來(lái)自pcDNA 3.1/His-ΔISDR的插入片段而后亞克隆至2μ酵母表達(dá)載體pBD和pYES2以各產(chǎn)生pBD-ΔISDR和pYES2-ΔISDR。為從HCV-1b獲得NS5A編碼序列，經(jīng)一位對(duì)IFN治療無(wú)反應(yīng)的基因型1b患者同意，獲得其血清，從100μl血清中抽提病毒RNA(Chomczynski和Sacchi，1987，生物化學(xué)文選，162156-159)。對(duì)IFN的反應(yīng)由RT-PCR和bDNA分析確定，如前所述(Gretch等，1993，臨床微生物學(xué)雜志，31289-291)。HCV基因型的鑒定由RFLP和基因型特異的PCR分析聯(lián)合確定，分析病毒的5′非翻譯區(qū)和序列編碼的核心蛋白(Davidson等，1995，普通病毒學(xué)雜志，73673-679)。病毒cDNA由逆轉(zhuǎn)錄合成，運(yùn)用寡核苷酸引物5′GTGGTGACGCAGCAGAGAGT(與HCV-J核苷酸7681-7700相符)(Bukh等，1995，Semin，肝病，1541-63)，而后通過添加上游引物5′CAGCCTCACCATCACTCAGC(相應(yīng)于HCV-J核苷酸6256-6275)進(jìn)行第一循環(huán)PCR。為NS5A的定向克隆，第一循環(huán)PCR產(chǎn)物使用NS5A特異性的嵌套寡核苷酸引物對(duì)5′CCTTCCATGGGCTCCGGCTCGTGGCTAAAG和5′ATCGGATCCTTAGGACATTGAGCAGCAGACGA(NcoI和BamHI位點(diǎn)各下劃線)進(jìn)一步擴(kuò)增。限制性酶消化后，純化的PCR產(chǎn)物克隆至pACT2(Clontech)的相應(yīng)位點(diǎn)以產(chǎn)生編碼相當(dāng)于HCV-1b的AD-NS5A融合蛋白的pAD-NS5A。當(dāng)HCV-1a的ISDR氨基酸序列和IFN敏感性間的關(guān)系尚未確定時(shí)，NS5A的這個(gè)區(qū)(氨基酸237-276)與以往定義的原型IFN-抗性ISDR序列具有顯著的氨基酸一致性(Enomto等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，33477-81，Enomoto等，1995，臨床調(diào)查雜志，96224-230)，并存在于我們的HCV-1b NS5A克隆中(圖1A)。以前描述到PKR質(zhì)粒pBD-PKR K296R結(jié)構(gòu)，pAD-PKR氨基酸構(gòu)建物K296R，1-242，244-551，244-366，367-551，和pAD-P58IPK(Gale，Jr等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)，164172-4181)。pBD-PKR 99-551通過從pET11A-PKR M7中恢復(fù)1.6kb NdeI/BamHI片段(Barber等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)。153188-3146)并克隆至pGBT 10的相應(yīng)位點(diǎn)(Gale，Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)。164172-4181)。pEMBLYex4-K3L包含完整牛痘病毒K3L基因插入pEMBLYex4，在一份單獨(dú)手稿中描述。GST-NS5A通過從HCV-1a NS5克隆pSPns5引BamHI片段入質(zhì)粒pGEX2T(Smith和Johnson，1988，基因，6731-40)，以產(chǎn)生pGST-NS5A。這結(jié)構(gòu)編碼NS5A氨基酸1-427與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白符合讀框融合。本研究所用的全部構(gòu)建物的nt序列經(jīng)雙鏈DNA序列分析運(yùn)用應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)序儀確定。
體外蛋白相互作用分析包含pGEX2T或pGST-NS5A的大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，加異丙基硫代吡喃型半乳糖苷入培養(yǎng)基誘導(dǎo)GST或GST-NS5A表達(dá)。收獲細(xì)菌制備抽提物如前述進(jìn)行結(jié)合分析(Gale，Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)，164172-4181)。為結(jié)合分析，重組抽提物中GSTr或GST-NS5A的表達(dá)通過免疫分析確定，用GST特異的抗血清或?qū)Τ趸镝?NS5融合蛋白特異的抗血清(抗NS5；Chiron公司)。陽(yáng)性重組抽提物用于體外結(jié)合分析。wt人PKR和PKR缺失突變體體外轉(zhuǎn)錄自pcDNA1neo的T7啟動(dòng)子并在[35S]-甲硫氨酸存在下翻譯，如前述(Katze等，1991，分子細(xì)胞生物學(xué)，115497-5505)。為體外結(jié)合分析，來(lái)自每次翻譯反應(yīng)約1×105計(jì)數(shù)的三氯乙酸沉淀物加入到含GST或GST-NS5A的大腸桿菌粗提物中，如述而進(jìn)行(Gale，Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)，164172-4181)。結(jié)合至GST或GST-NS5A的標(biāo)記蛋白通過SDS-PAGE分離，干膠放射自顯影。
PKR功能體外分析為對(duì)PKR進(jìn)行體外激酶分析，GSTNS5A從大腸桿菌抽提物中純化，運(yùn)用谷胱甘肽-瓊脂糖親合層析。天然PKR從IFN處理的人293細(xì)胞中親合純化(Galabru和Hovanessian，1987，生物化學(xué)雜志，26215538-15544)。所有純化蛋白的濃度通過定量SDS-PAGE進(jìn)行評(píng)估，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。體外激酶分析如所述進(jìn)行(Tang等，1996，生物化學(xué)雜志)，除PKR在加入組蛋白底物和[32P]-γATP前與增加濃度的GST或GST-NS5A預(yù)培養(yǎng)。激酶反應(yīng)產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離，干膠放射自顯影以顯影磷酸化底物，以往證明在組蛋白磷酸化與純化的eIF-2α間體外通過PKR緊密聯(lián)系(Katze等，1991，分子細(xì)胞生物學(xué)，115497-5505)。
6.2結(jié)果從HCV 1-a(圖1)所獲NS5A用于檢測(cè)NS5A直接與PKR相互作用的能力。NS5A作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)(GST-NS5A)，體外與運(yùn)用GST-減弱(pulldown)分析翻譯的全長(zhǎng)PKR特異性相互作用。如圖2，PKR氨基酸244-551對(duì)與GST-NS5A形成復(fù)合物必需且足夠。因此，重組NS5A體外與PKR特異性形成復(fù)合物，位于蛋白激酶催化區(qū)，包括PKR C-末端。7.實(shí)施例NS5A體內(nèi)與PKR激酶催化區(qū)相互作用進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以確定體內(nèi)NS5A與PKR相互作用。
7.1材料和方法體內(nèi)蛋白相互作用分析在啤酒糖酵母菌株Hf7c菌株中(MATaura3-52his3-200Lys2-801ade2-101trp1-901lea2-3，112gal4-542gal80-538LYS2GAL1-HIS3URA3(GAL4 17-mers)3-cycl-lacZ)運(yùn)用雙雜交分析分析蛋白相互作用。(Fields和Song，1989，Nature340245-246)。為進(jìn)行下述的雙雜交分析和酵母分析，細(xì)胞以乙酸鋰方法被轉(zhuǎn)染所指表達(dá)構(gòu)建物。進(jìn)行雙雜交分析，首先需檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染的酵母克隆中所有AD-和BD-融合蛋白的表達(dá)，通過免疫印跡分析，如生產(chǎn)商述使用抗AD或抗BD單克隆抗體(Clontech)。在酵母菌Hf7c中，組氨酸合成依賴于雙雜交蛋白的相互作用。因此，存在2-雜交蛋白相互作用的菌可生長(zhǎng)在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中。HIS報(bào)告蛋白的合成用于分析2-雜交蛋白相互作用，如近述(Gale，Jr.等，1996，上述)。原始轉(zhuǎn)染子在缺乏氨基酸Trp和Leu的SD培養(yǎng)基(+His培養(yǎng)基)上選擇。轉(zhuǎn)染子繼而順序在缺乏氨基酸His，Trp和Leu(-His培養(yǎng)基)的SD培養(yǎng)基上劃線，生長(zhǎng)3-6天以消除組氨酸殘余?？寺≈貏澃逶?His培養(yǎng)基，3-7天后劃板生長(zhǎng)。在我們的雙雜交酵母克隆中報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)通過液體分析和產(chǎn)生熒光的底物4-甲基傘形?；?methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖苷(MUG)測(cè)量lacZ表達(dá)而確定(Cao和Geballe，1994，病毒學(xué)205151-160)。
酵母生長(zhǎng)抑制分析以確認(rèn)NS5A和PKR在體內(nèi)的功能為確認(rèn)NS5A和PKR在體內(nèi)功能，運(yùn)用啤酒糖酵母菌株RY1-1(MATa ura 3-52leu 2-3 leu 2-112 gcn 2Δtrp 1-Δ63 LEU 2(GAL-CYC1-PKR)2它攜帶人PKR的2個(gè)拷貝結(jié)合至LEU2位點(diǎn)，在半乳糖苷誘導(dǎo)的CAL1-CYC1啟動(dòng)子控制下(Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)15365-378)。當(dāng)其生長(zhǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，該菌株由于PKR介導(dǎo)的酵母eIF-2α磷酸化而表現(xiàn)出緩慢生長(zhǎng)表型。蛋白表達(dá)經(jīng)免疫印跡分析驗(yàn)證，運(yùn)用抗PKR單抗(Laurent等，1985，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊824341-4345)或產(chǎn)生的抗重組NS5蛋白(α-NS5)的抗血清。NS5A和ΔISDR構(gòu)建物均從pYes質(zhì)粒有效表達(dá)。另外，發(fā)現(xiàn)NS5A或ΔISDR的表達(dá)對(duì)PKR水平無(wú)影響，在兩個(gè)轉(zhuǎn)染的菌株中，PKR都有效表達(dá)至相同水平。為評(píng)價(jià)RY1-1轉(zhuǎn)染子的生長(zhǎng)，酵母克隆劃線至尿嘧啶缺乏的SD培養(yǎng)基和SGAL培養(yǎng)基，如Romano等所述(Romano等，1995，上述)。評(píng)價(jià)劃板3-7天后克隆的生長(zhǎng)。
7.2結(jié)果為確認(rèn)和擴(kuò)大結(jié)果，使用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行NS5A-PKR相互作用研究，在組氨酸缺乏培養(yǎng)基上劃板生長(zhǎng)作為雙雜交蛋白相互作用陽(yáng)性對(duì)照。作為對(duì)照，包括了以前所述的P58IPK-PKR相互作用的評(píng)估(Gale，Jr.等，1996，上述)。發(fā)現(xiàn)來(lái)自HCV-1b菌IFN抗性分離物的全長(zhǎng)NS5A融合至GAL4活化區(qū)(AD-NS5A)，特異性與鈍化的全長(zhǎng)PKR突變體相互作用，PKR K296R和截短的突變體PKR 98-551，均融合至GAL4 DNA結(jié)合區(qū)(BD)(圖2)。BD-PKR 98-551第一dsRNA結(jié)合區(qū)(圖1B)，無(wú)法結(jié)合dsRNA(Barber等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)153138-3146)。因此，與細(xì)胞內(nèi)PKR抑制劑相似，P58IPK，HCV-1b NS5A可與PKR相互作用。進(jìn)一步的，這些結(jié)果說明NS5A-PKR相互作用不是dsRNA介導(dǎo)事件。
來(lái)自HCV-1A分離物的BD-NS5A與AD-PKR體內(nèi)相互作用的能力用雙雜交分析。如圖4所示，在酵母共轉(zhuǎn)染子中來(lái)自HCV 1a的BD-NS5A特異性與AD-PKR K296R相互作用。因此，來(lái)自獨(dú)立的菌株HCV-1a和HCV-1b的NS5A可在體內(nèi)與PKR相互作用。為繪制出NS5A與PKR的相互作用區(qū)，一系列AD-PKR突變體用于轉(zhuǎn)染含HCV 1a BD-NS5A構(gòu)建物的酵母。BD-NS5A特異性與PKR催化區(qū)相互作用，定位于PKR氨基酸244-366，AD-構(gòu)建物PKR 244-551和PKR 244-366均調(diào)節(jié)-His培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)(圖4)。PKR的NS5A-相互作用區(qū)專有C-末端184氨基酸和N-末端242氨基酸，包含AD-PKR 367-551和AD-PKR 1-242的酵母共轉(zhuǎn)染子不能在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這些結(jié)果說明HCV NS5A與PKR蛋白激酶催化區(qū)中的結(jié)構(gòu)相互作用。PKR的NS5A相互作用區(qū)(氨基酸244-366)包括與細(xì)胞內(nèi)PKR抑制子，P58IPK相互作用的區(qū)域(圖1B)(Gale，Jr.等，1996)。蛋白激酶催化域中的該區(qū)合作作用于核苷酸結(jié)合與催化(Hanks等，1988，科學(xué)24142-52；Bossemeyer，1995，F(xiàn)EBS.Lett.36957-61；Taylar等，1993，分子細(xì)胞生物學(xué)，166295-6302)。8.實(shí)施例NS5A抑制PKR功能以下實(shí)驗(yàn)用于證明NS5A-PKR相互作用是否導(dǎo)致對(duì)PKR功能的抑制。
8.1材料和方法體外分析蛋白相互作用含pGEX2T或pGST-NS5A的大腸桿菌在液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)，添加異丙基硫代吡喃型半乳糖苷至培養(yǎng)基誘導(dǎo)GST或GST-NS5A表達(dá)。收獲細(xì)菌制備抽提物進(jìn)行前述的結(jié)合分析(Gale，Jr.等，1996)。為進(jìn)行結(jié)合分析，GSfr GST-NS5A的表達(dá)通過免疫印跡分析在重組抽提物中確定，運(yùn)用GST特異性的抗血清或超氧化物岐化酶-NS5融合蛋白特異的抗血清(抗NS5；Chiron公司)。陽(yáng)性重組抽提物用于體外結(jié)合分析。wt人PKR和PKR缺失突變體體外轉(zhuǎn)錄自pcDNA1neo的T7啟動(dòng)子，在[35S]-甲硫氨酸存在下翻譯，如前述(Katze等，1991，分子細(xì)胞生物學(xué)，115497-5505)。為體外結(jié)合分析，加約1×105計(jì)數(shù)的三氯乙酸，每個(gè)翻譯反應(yīng)的沉淀物中加入大腸桿菌粗提物，其中含GST或GST-NS5A，按所述的進(jìn)行(Gale，Jr.等，1996)。結(jié)合至GST或GST-NS5A的標(biāo)記蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，干膠放射自顯影。
PKR功能的體外分析為進(jìn)行PKR體外激酶分析，將GST NS5A從大腸桿菌抽提物中純化，運(yùn)用谷胱甘肽-瓊脂糖親合層析。天然PKR從IFN-處理的人293細(xì)胞中親合純化(Galabru和Hovanessian，1987，生物化學(xué)雜志，26215538-15544)。所有純化蛋白的濃度由定量SDS-PAGE評(píng)估，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。體外激酶分析基本如所述進(jìn)行(Tang等，1996，生物化學(xué)雜志，27128660-28666)，除PKR在加入組蛋白底物和[32P]-γATP前與增加濃度的GST或GST-NS5A預(yù)溫育。表明在體外組蛋白磷酸化和PKR純化的eIF-2α間具有正確相關(guān)作用(Katze等，1991)。
8.2結(jié)果體外進(jìn)行在重組NS5A存在下PKR活性的分析。孵育純化的天然PKR和來(lái)自HCV-1a的重組GST-NS5A導(dǎo)致對(duì)PKR自磷酸化和外源組蛋白底物的磷酸化的特異性抑制(圖5)。值得注意的是僅0.2pmolNS5A可抑制1.8pmol PKR，現(xiàn)在尚不能確定，該結(jié)果是因?yàn)橄鄬?duì)小范圍的PKR活化或是由于NS5A可低水平破壞高量的PKR二聚體。PKR活性的喪失并非由于PKR降解或NS5A介導(dǎo)的ATP水解。進(jìn)一步的，當(dāng)我們體外分析中PKR的抑制和組蛋白的磷酸化可能應(yīng)歸于GST-NS5A介導(dǎo)的磷酸酶活性時(shí)，因NS5A不具有任何利于磷酸酶功能的結(jié)構(gòu)，所以我們認(rèn)為這種分析結(jié)論是不可能的。相同克分子水平的GST對(duì)PKR活性無(wú)影響(圖5，泳道6-9)。因此，與其它病毒編碼的PKR抑制蛋白作用相同，NS5A可特異性體外抑制PKR功能，可能通過NS5A-PKR相互作用的直接影響。
PKR在酵母中的表達(dá)為直接檢測(cè)PKR活性提供了體內(nèi)功能分析(Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)，15365-378)。因其eIF-2α磷酸化活性，PKR在酵母中表達(dá)時(shí)生長(zhǎng)抑制。PKR與轉(zhuǎn)顯性抑制PKR突變體或病毒編碼的PKR抑制蛋白，如HIV Tat或牛痘病毒K3L，共表達(dá)，逆轉(zhuǎn)酵母中PKR介導(dǎo)的緩慢生長(zhǎng)表型，因PKR抑制及伴行的eIF-2α磷酸化下降(Romano等，1995，McMillan等，1995；M.Kobayashi，E.Locke，J.Silverman.T.Ung和T.Dever，已提交的手稿)。為評(píng)估NS5A對(duì)PKR功能的影響，我們?cè)诮湍妇鶵Y1-1中GAL1半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下表達(dá)NS5A。由Romano等發(fā)展(1995)。RY1-1具有GAL1-CYC1半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下人PKR的2整合的拷貝，在半乳糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，保持PKR介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制表型。作為對(duì)照，我們包括了含鑒定的牛痘病毒PKR抑制劑，K3L，也在GAL1-CYC1啟動(dòng)子控制下的PY1-1的平行分析(M.Kobayashi，E.Locke，J.Silverman，T.Ung和T.Dever，已提交的手稿)。NS5A功能的檢測(cè)始于對(duì)RY1-1轉(zhuǎn)染子生長(zhǎng)特性的確認(rèn)。當(dāng)所有轉(zhuǎn)染子在非誘導(dǎo)的葡萄糖(SD)培養(yǎng)基中保持有效的生長(zhǎng)時(shí)，僅有那些含NS5A或K3L的可在PKR表達(dá)條件下維持生長(zhǎng)(圖6，右)。轉(zhuǎn)染子的載體對(duì)照表現(xiàn)出嚴(yán)格的緩慢生長(zhǎng)表型，與高水平PKR表達(dá)相關(guān)的生長(zhǎng)抑制活性一致(圖6)(Romano等，1995)。這些結(jié)果證明NS5A足以逆轉(zhuǎn)PKR在酵母中介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。為確定NS5A存在下，PKR功能被抑制，在RY1-1轉(zhuǎn)染子中我們確定eIF-2α的磷酸化水平。與K3L相同，NS5A表達(dá)導(dǎo)致未磷酸化的eIF-2α的水平較僅含載體的對(duì)照轉(zhuǎn)染子的水平增加約11倍(圖7)。當(dāng)細(xì)胞中的大部分eIF-2α保持超磷酸化狀態(tài)時(shí)，結(jié)果說明eIF-2α磷酸化總水平的相對(duì)小變化仍對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成巨大影響?？偟恼f來(lái)，這些觀察結(jié)果說明NS5A通過與PKR的直接相互作用，可抑制PCR功能，在體內(nèi)導(dǎo)致PKR底物eIF-2α的磷酸化狀態(tài)的改變。9.實(shí)施例NS5A對(duì)PKR功能抑制的分子機(jī)制以下實(shí)驗(yàn)確認(rèn)NS5A-PKR相互作用的機(jī)制以及ISDR突變對(duì)NS5A調(diào)節(jié)PKR的影響9.1材料和方法質(zhì)粒pGBT10和pGAD425分別編碼GAL4DNA結(jié)合區(qū)(BD)和轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(AD)，(Gale，Jr.等，1966，分子細(xì)胞生物學(xué)，164172-4181)。pAD-PKR K296R，pAD-PKR244-5515，pAD-PKR244-296編碼所指的AD-PKR融合蛋白構(gòu)建物，如前述(Gale，Jr.等，1996)。所有NS5A-1b表達(dá)構(gòu)建物來(lái)自pAD-NS5A，pAD-NS5A其中包括來(lái)自IFN抗性HCV1b的臨床分離物的wt NS5A(NS5A 1b-wt)(Gale等，1997，病毒學(xué)230217-227)。為方便進(jìn)行酵母雙雜交蛋白相互作用分析，pAD-NS5A由NdeI和BamHI限制性內(nèi)切酶裂解并將1.4kb插入編碼全長(zhǎng)NS5A(氨基酸1973-2419)克隆至pGBT10的相應(yīng)位點(diǎn)以產(chǎn)生pBD NS5A 1b-wt。pBD-NS5A 1973-2361編碼NS5A的BD融合蛋白氨基酸1973-2361，通過從pBD-NS5A 1b-wt亞克隆Ndel/Sal1插入物pGBT10的相應(yīng)位點(diǎn)而產(chǎn)生。pBC-NS5A 2120-2274編碼NS5A的BD-融合體氨基酸2120-2174，通過連接來(lái)自pBD-NS5A 1b-wt的EcoRI/BstY1片段至pGBT10的EcoRI/BamHI位點(diǎn)構(gòu)建。pBD-NS5A1973-2208，pBD-NS5A 2209-2274和pBD-NS5A 2180-2251。通過運(yùn)用如表3(上面的)所示的限制性位點(diǎn)連接的寡核苷酸引物對(duì)針對(duì)相應(yīng)pBD-NS5A 1b-wt編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生。PCR產(chǎn)物直接克隆至pCR2.1(Invitrogen)，如質(zhì)粒制造商所述。編碼NS5A氨基酸1973-2208和2209-2274的PCR產(chǎn)物通過各自的限制酶組合Nde1/SalI或EcoRI/SalI消化而從pCR2.1釋放。反應(yīng)得到的插入DNA連接至pGBT10和pGBT9(Clontech)的各自的位點(diǎn)以產(chǎn)生pBD-NS5A 1973-2208和pBD 2209-2274。編碼NS5A氨基酸2180-2251的PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco/BamHI消化從pCR2.1釋放，得到的213bp片段連接到pAS2-1(Clontech)的理想位點(diǎn)以產(chǎn)生pBD-NS5A 2180-2251。pBD-λISDR編碼來(lái)自IFN抗性HCV-1a的ISDR缺失的NS5A突變體(Gale等，1997，病毒學(xué)230217-227)。
定點(diǎn)誘變(Chameleon雙鏈定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?，Strategene)用于介導(dǎo)相應(yīng)HCV-1b的IFN-敏感株的ISDR突變?chǔ)藀BD-NS5A 1b-wt。誘變反應(yīng)如制造者所述，使用如表3(下面)所示的誘變引物。模板DNA在100℃孵育5分鐘變性，而后誘變引物和Scal至Stul選擇引物5′GTGACTGGTGAGGCCTCAACCAAGTC(Stul限制性位點(diǎn)下劃線)退火。T7DNA聚合酶引物延伸產(chǎn)物經(jīng)Scal限制性酶消化并順序轉(zhuǎn)化至Xlmuts大腸桿菌中(Stratagene)，被連接和選擇。通過此方法一系列同基因的NS5A構(gòu)建物被構(gòu)建為與NS5A 1b-wt相同的，除了引入ISDR的確定突變(見表1)。pBD-NS5A 1b-2和pBD-NS5A 1b-4直接從pBS-NS5A 1b-wt產(chǎn)生并各編碼單個(gè)(A2224V)，或多個(gè)(P2209L，T2214A，和T2217G)ISDR突變(表1)。pBD-NS5A-5編碼ISDR突變P2209L，T2214A，T2217G和A2224V，通過將A2224V突變引入pBD-NS5A-4產(chǎn)生。
為NS5A在啤酒糖酵母中的表達(dá)，整段pBD-NS5A 1b-wt的1.4kb經(jīng)運(yùn)用如表3(上部)所示的限制性酶聯(lián)寡核苷酸，經(jīng)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物克隆至pCR-Script(Stratagene)的Srfl位點(diǎn)，經(jīng)HindIII消化從產(chǎn)物質(zhì)粒釋放。凝膠純化的插入DNA克隆至pYES2(Invitrogen)的HindIII位點(diǎn)以產(chǎn)生pYES-NS5A 1b-wt，在半乳糖誘導(dǎo)的GALI啟動(dòng)子控制下表達(dá)NS5A。為方便起見pYES-NS5A 1b-2，pYES-NS5A 1b-4和pYES-NS5A 1b-5的pYES-NS5A 1b-wt的內(nèi)1.1kb SacII/SalI片段被各自的pBD構(gòu)建物的內(nèi)SacII/SalI片段置換。
為NS5A在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，pYES-NS5A 1b-wt和pYES-NS5A 1b-5的完整1.4kb NS5A編碼區(qū)被HindIII消化釋放，克隆至pFLAG-CMV2(Eastman Kodak公司)的HindIII位點(diǎn)。產(chǎn)物質(zhì)粒pFlagNS5A 1b-wt和pFlagNS5A 1b-5分別編碼全長(zhǎng)wt和N-末端融合至CMV立即早期啟動(dòng)子控制下的8氨基酸FLAG表位標(biāo)記序列的突變NS5A(FLAG-NS5A)。pNeo-NS5A 1a-wt通過克隆pYES-NS5A(Gale等，1997，病毒學(xué))的1.4kb HindIII/XbaI插入物至pcDNA1NEO的相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建而成。pNeo-PKR K296R編碼全長(zhǎng)鈍化的人PKR K296R突變體(Barber等，1993，生物化學(xué)雜志，17017423-17428)。為構(gòu)建pGST-NS5A 1b-wt，pAD-NS5A的1.4kb NcoI/XhoI插入DNA(Gale等，1997，病毒學(xué)230217-227)被分離，3′凹陷端以Klenow聚合酶補(bǔ)齊(Sambrook等，1989，分子克隆，第二版，冷泉港出版社)。結(jié)果的平端DNA克隆至pGex-2TK(Pharmacia Biotech)Small位點(diǎn)，符合讀框地融合NS5A編碼區(qū)至質(zhì)粒編碼GST蛋白。pGST-K3L編碼GST與88氨基酸牛痘病毒K3L的融合蛋白。pGST-NS1編碼GST與流感病毒NS1的融合蛋白。噬菌體λcI阻抑蛋白的N-末端132氨基酸與PKR催化遲鈍的PKRK296R融合構(gòu)建至pcI168以產(chǎn)生pcI-PKR K296R。
每個(gè)新構(gòu)建物的凈序列通過雙脫氧核苷酸序列分析鑒定(AppliedBiosystems)。
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染NIH3T3，Cos-1細(xì)胞(ATCC)和腫瘤衍生細(xì)胞系在Dulbecco的改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長(zhǎng)，其中含10％胎牛血清(Tang等，1996，生物化學(xué)雜志27128660-28666)。為瞬間轉(zhuǎn)染，將表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合物通過DEAE-葡聚糖/氯喹方式引入Cos-1細(xì)胞。如前述(Tang等，1996，生物化學(xué)雜志，271-28660-28666)或運(yùn)用Superfect轉(zhuǎn)染試劑，按制造商提供方法轉(zhuǎn)染(Qiagen)。每套轉(zhuǎn)染包括半?yún)R合的25cm2培養(yǎng)的約6×105細(xì)胞與5μg每種表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒聯(lián)合物包括pcDNA1neo/pNeoPKR K296R和pNeo NS5A 1a-wt/pNeoPKR K296R，或pFlag/pNeoPKR K296R，pFlagNS5A 1b-wt/pNeoPKR K296R或pFlagNS5A 1b-5/pNeoPKR K296R。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲，抽提物如所述進(jìn)行免疫沉淀或免疫分析。NIH3T3細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)PKR抑制蛋白P58IPK，如前述(Barber等，1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊。914278-4282)。載體對(duì)照的NIH3T3細(xì)胞系或表達(dá)NS5A 1a-wt的細(xì)胞系由轉(zhuǎn)染細(xì)胞而衍生，各通過DEAE-葡聚糖/氯喹方式轉(zhuǎn)染3-10μgpcDNA1neo或pNeoNS5A 1a-wt。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含600μg/ml新霉素類似物G418的培養(yǎng)基中選擇。藥物抗性克隆經(jīng)分離，擴(kuò)大，對(duì)NS5A的穩(wěn)定表達(dá)檢測(cè)。通過這種方式，分離若干表達(dá)高或低NS5A的克隆。選擇2個(gè)代表克隆，5C6(高表達(dá))和4A1(低表達(dá))作進(jìn)一步分析。
蛋白分析從20ml液體培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，冰冷水洗1次，冰預(yù)冷的酵母裂解緩沖液中[40mM PIPES(pH6.6)，100mM NaCl，1mMDTT，50mM NaF，37mM β-甘油磷酯，120mM AMSO4，10mM 2-氨基嘌呤，15mM EDTA，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)]，通過玻璃珠方式裂解制備酵母抽提物(Gale，Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)164172-4181)。3T3，Cos-1和腫瘤衍生細(xì)胞的抽提物制備在BufferI[50mM KCl，50mM NaCl，1mMEDTA，1mM DTT，20％甘油，0.5％Triton X-100單位/ml抑蛋白酶肽，1mM PMSF，20mM Tris(pH7.5)]中(Tang等，1996，生物化學(xué)雜志27128660-28666)。抽提物4℃12,000×g離心取上清，-70℃保存。細(xì)胞提取蛋白濃度使用BioRad Bradford分析確定，根據(jù)生產(chǎn)商所述(BioRad)。
通過對(duì)25-50μg來(lái)自細(xì)胞抽提物的總蛋白進(jìn)行免疫分析以確定蛋白的表達(dá)，如前述。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。結(jié)合蛋白通過對(duì)膜探測(cè)而得，使用對(duì)NS5A(抗NS5A)，人PKR(抗PKR(Laurent等，1985，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，824341-4345)，F(xiàn)LAG表位(抗FLAG；Eastman Kodak公司)，GAL4活化區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)[抗AD和抗BD(Clontech)])特異性的初級(jí)單抗。蛋白經(jīng)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL)和放射自顯影顯影。為控制蛋白加樣的潛在錯(cuò)誤，印跡還通過肌動(dòng)蛋白-特異性的單克隆抗體(抗肌動(dòng)蛋白；ICN)探測(cè)。
2×106轉(zhuǎn)染的Cos-1細(xì)胞的抽提物進(jìn)行免疫沉淀。抽提物(150μl)在冰上解凍并與蛋白G-瓊脂糖珠孵育在4℃1小時(shí)預(yù)清除。4℃離心(12,000×g)重獲上清，與抗NS5A(1∶500)混合或與抗FLAGM2親合膠混合(Eastman Kodak公司)在終體積600μl緩沖液1中，4℃孵育2小時(shí)或16小時(shí)?？筃S5A免疫復(fù)合物通過另外與蛋白G-瓊脂糖珠孵育，在Buffer1中平衡而回收。免疫復(fù)合物每次用1ml冰冷Buffer1沖洗，共5次?？笷LAG M2親合凝膠復(fù)合物進(jìn)一步用冷TBS[50mMTris(pH7.5)]沖洗3遍。以競(jìng)爭(zhēng)者FLAG肽洗脫，如制造商所述(Eastman Kodak公司)。免疫復(fù)合物通過離心重獲，在SDS-樣品緩沖液中稀釋，100℃孵育5分鐘。免疫沉淀產(chǎn)物通過電泳溶解在12％丙烯酰胺/SDS凝膠中如上述進(jìn)行免疫印跡分析。
對(duì)eIF-2α等電聚焦，酵母菌在尿嘧啶缺乏的含2％葡萄糖合成定義培養(yǎng)基(SD)中生長(zhǎng)16小時(shí)，在含2％raffifiose和10％半乳糖的尿嘧啶缺失合成定義的培養(yǎng)基(SGAL)中稀釋至OD6000.4，30℃生長(zhǎng)4-9小時(shí)。如所述制備酵母提交物免疫分析用。蛋白(16μg)通過垂直等電聚焦分離(Dever等，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，904616-4620)，印跡至硝酸纖維素膜。eIF-2α通過免疫印跡分析探測(cè)，使用酵母eIF-2α特異的兔多克隆抗血清。這些實(shí)驗(yàn)中，少酸性的，基礎(chǔ)磷酸化形式的eIF-2α水平增高意味著超磷酸化eIF-2α的相應(yīng)下降，eIF-2α由PKR在絲氨酸51位磷酸化(Dever等，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，904616-4620；Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)15315-378)。相應(yīng)于總體的基礎(chǔ)磷酸化eIF-2α水平由激光掃描光密度儀定量，并給出每個(gè)樣品相應(yīng)于總eIF-2α的百分比。
酵母方法酵母雙雜交分析的細(xì)節(jié)已被詳述(Gale，Jr.等，1996)。本分析利用His報(bào)告基因的特異誘導(dǎo)以支持酵母菌Hf7c(Clontech)在組氨酸缺乏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，作為雙雜交蛋白相互作用的指示劑。啤酒糖酵母菌株Hf7c[MATa ura3-52his3-200lys2-801ade2-101trp1-901lea2-3，112gal4-542gal80-538LYS2GAL1-HIS3URA3(GAL4 17-mers)3-CYC1-lacZ]以含相應(yīng)GALA AD和BD融合構(gòu)建物的2μTrp1和Leu2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌鋪皿在缺乏酪氨酸和亮氨酸(+His)的SD培養(yǎng)基上，30℃3天后，菌株劃板至缺乏酪氨酸，亮氨酸和組氨酸(-His)的SD培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-6天。得到的組氨酸排除克隆重劃板至+His和-His培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3-6天。在-His培養(yǎng)基上的特異性生長(zhǎng)為雙雜交蛋白相互作用的陽(yáng)性結(jié)果。
為確定PKR和NS5A在體內(nèi)的功能，wt或突變NS5A Ura3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至啤酒酵母菌RY1-1(MATa ura3-52leu2-3leu2-112gcn2Δtrp1-Δ63 LEU2(GAL-CYC1-PKR)2(Romano等，1995)。該菌株缺乏酵母eIF-2α激酶GCN2，并含有結(jié)合至在半乳糖誘導(dǎo)的GAL/CYC1雜交啟動(dòng)子控制下LEU2位點(diǎn)的wt人PKR2個(gè)拷貝。當(dāng)在SGAL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，PKR表達(dá)并在絲氨酸51位磷酸化內(nèi)源eIF2α，導(dǎo)致mRNA翻譯的抑制和生長(zhǎng)抑制(Dever等，1993，Romano等，1995)。相反的，共表達(dá)wt NS5A抑制此系統(tǒng)與PKR功能相關(guān)的毒性作用，使共表達(dá)功能性NS5A的菌株得以在SGAL培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(Gale等，1997)RY1-1菌含所指的NS5A表達(dá)構(gòu)建物，鋪皿至非誘導(dǎo)的尿嘧啶缺陷SD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3天。挑選單克隆，30℃培養(yǎng)16小時(shí)于尿嘧啶缺陷液體SD培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)物的等分標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化至OD6000.2，連續(xù)以無(wú)菌H2O稀釋至10倍量中，每2μl稀釋液同樣用到尿嘧啶缺陷SD和SGAL培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3-6天。菌株劃板至SGAL培養(yǎng)基高稀釋度生長(zhǎng)，意味著NS5A介導(dǎo)的PKR的抑制(Gale等，1997)。
二聚化破壞分析如所述對(duì)二聚作用破壞進(jìn)行測(cè)量(Hu，1990，科學(xué)2501400-1403；Hu，1995，結(jié)構(gòu)3431-433)該分析利用對(duì)噬菌體λ介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的敏感性作為大腸桿菌中pcI-PKR K296R表達(dá)的cI-PKR K296R融合蛋白二聚化狀態(tài)的指示劑。pcI-PKR K296R在p15Aori控制下復(fù)制，與含ColEiori的質(zhì)粒，包括pGEX系列載體，相比。為低拷貝復(fù)制子(Smith等，1988，基因67，31-40)。大腸桿菌菌株AG1688(Hu，1990)共表達(dá)c1-PKR K296R，評(píng)估所指GST融合蛋白對(duì)噬菌體λcI-缺失突變體λKH54(Hu，1990)介導(dǎo)的細(xì)胞融解的抗性。AG1688大腸桿菌在包括Luria液體培養(yǎng)基，10mMMgSO4和0.2％麥芽糖的液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期。細(xì)菌(2.5μl每分)與等體積連續(xù)10倍稀釋的λKH54混合，λKH54中每份含102-106噬斑形成單位。細(xì)菌噬菌體混合物應(yīng)用至每個(gè)抗生素瓊脂形成單位。細(xì)菌噬菌體混合物加入到含0.1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的抗生素瓊脂皿中以誘導(dǎo)質(zhì)粒編碼的融合蛋白的表達(dá)。平皿在空氣中干燥，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，劃板求抗λKH54介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的細(xì)胞，即為體內(nèi)功能性cI-PKR K296R二聚體形成的指示劑。每個(gè)質(zhì)粒編碼的融合蛋白的表達(dá)由免疫印跡分析檢驗(yàn)。
細(xì)胞生長(zhǎng)分析和致瘤性分析穩(wěn)定NIH3T3細(xì)胞系組成性表達(dá)轉(zhuǎn)染的NS5A或P58IPK(對(duì)照)(Barber等，1994)的生長(zhǎng)特征如表2所述被確定。為分析腫瘤表型，腫瘤在無(wú)菌條件下從nu/nu小鼠切除，PSB洗，切碎為1-5mm小塊。腫瘤小塊首先通過與1％膠原酶/0.1％分散酶(Gibco BRL)在PBS孵育，而后混合在Dounce容器勻漿器中得到勻漿。勻漿的腫瘤37℃培養(yǎng)2小時(shí)，600×g離心10分鐘，重懸在含10％FCS的新鮮DMEM中。細(xì)胞懸浮液種至多孔皿中以產(chǎn)生腫瘤衍生細(xì)胞系的克隆。
8.2結(jié)果NS5A調(diào)節(jié)PKR的機(jī)制蛋白激酶二聚化的破壞病毒控制的PKR在多個(gè)水平產(chǎn)生，在PKR成熟，活化和催化過程定義特殊步驟。這些步驟包括但不僅限于，PKR水平調(diào)節(jié)，dsRNA結(jié)合事件的調(diào)節(jié)，蛋白激酶二聚化，PKR催化活性的調(diào)節(jié)。在此如申請(qǐng)人所述，NS5A結(jié)合至PKR的區(qū)被定位在PKR催化區(qū)(PKR氨基酸244-355)的廣大區(qū)域。為了解NS5A介導(dǎo)的PKR的調(diào)節(jié)，調(diào)查NS5A在蛋白激酶上結(jié)合區(qū)的分子機(jī)制。為鑒定蛋白激酶上NS5A結(jié)合區(qū)，進(jìn)行蛋白相互作用分析，運(yùn)用野生型(wt)NS5A(來(lái)自HCV-1b的IFN抗性分離物1b-wt，見表1)融合至GAL4 DNA結(jié)合區(qū)(BD-NS5A1b-wt)。該構(gòu)建物介導(dǎo)與融合至GAL4轉(zhuǎn)染活化區(qū)(AD)的PKR缺失突變體的相互作用的能力在酵母雙雜交分析中檢驗(yàn)。雙雜交蛋白相互作用通過共轉(zhuǎn)化的酵母在組氨酸缺陷(-His)培養(yǎng)基上的能力確認(rèn)，該生長(zhǎng)是由于Hf7c His啟動(dòng)子的活化。確認(rèn)每種構(gòu)建物在相應(yīng)菌株中有效表達(dá)。如圖8所示，Hf7c酵母菌共表達(dá)BD-NS5A 1b-wt和AD-PKR(PKR K296R)或AD-PKR缺失構(gòu)建物，PKR244-551或PKR244-296，在-His培養(yǎng)基均生長(zhǎng)，證明這些菌株中雙雜交蛋白相互作用。因此，可確認(rèn)由PKR氨基酸244-296定義的PKR52氨基酸序列足以介導(dǎo)與NS5A的相互作用。這些結(jié)果確定NS5A在PKR的結(jié)合區(qū)在氨基酸244-296之間，此處所謂關(guān)鍵的PKR二聚化區(qū)。
NS5A 1b-wt干擾PKR二聚化的能力運(yùn)用在大腸桿菌中噬菌體λ基礎(chǔ)的遺傳分析體內(nèi)檢驗(yàn)。在此分析中，二聚化蛋白，符合讀框的與噬菌體λCI阻抑物的DNA結(jié)合區(qū)融合，介導(dǎo)CI DNA結(jié)合區(qū)的二聚化，此二聚化為結(jié)合至λ啟動(dòng)子所需(Hu，1995，結(jié)構(gòu)3431-433)。當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，雜交的CI阻抑蛋白介導(dǎo)對(duì)由二聚化并結(jié)合至λ啟動(dòng)子的λ噬菌體[λKH54；(Hu，1990，科學(xué)2501400-1403)]的CI缺失突變體誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解的抗性。這導(dǎo)致在表達(dá)雜交CI阻抑蛋白的λKH54感染的大腸桿菌中，噬菌體基因表達(dá)抑制。相反地，該系統(tǒng)中共表達(dá)二聚化抑制劑，通過破壞CI二聚體釋放λ基因抑制，導(dǎo)致大腸桿菌裂解。全長(zhǎng)遲鈍的PKR K296R以N-末端融合至CI DNA結(jié)合區(qū)(CI-PKR)的表達(dá)足以抑制λKH54感染大腸桿菌后的λ基因表達(dá)。圖9證明這結(jié)論，如圖所示，GST的共表達(dá)對(duì)CI-PKR介導(dǎo)的λ基因抑制無(wú)影響，而即使暴露在高濃度噬菌體中(圖9，泳道1)，也可觀察到對(duì)細(xì)胞裂解的抗性。因此CI-PKR的PKR組分體內(nèi)促進(jìn)蛋白二聚化和λ基因抑制。對(duì)λKH54介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的抗性在表達(dá)CI-PKR和GST-NS5A的大腸桿菌中減小的1000倍(圖9，比較泳道1和2)，說明NS5A破壞CI-PKR的二聚化過程。此GST-NS5A 1b-wt的作用顯示特異性針對(duì)CI-PKR，因此，NS5A體內(nèi)特異性破壞PKR二聚化過程。
進(jìn)一步的，NS5A介導(dǎo)的PKR二聚化的破壞的區(qū)域與NS5A與PKR結(jié)合定位于PKR二聚化區(qū)的靶向區(qū)一致(見圖8)。事實(shí)上GST構(gòu)建物還編碼PKR的其它抑制劑，包括牛痘病毒K3L(GST-K3L，泳道3)和流感病毒NS1(GST-NS1；泳道4)，均各自靶向PKR底物(Craig等，1996，生物化學(xué)雜志，271-24526-24533；Gale，Jr.等，1996，分子細(xì)胞生物學(xué)164172-4181)和-dsRNA結(jié)合作用(Katze等，1991)，而在與CI-PKR共表達(dá)時(shí)，對(duì)大腸桿菌抗λKH54介導(dǎo)的細(xì)胞裂解能力無(wú)。因此，NS5A代表一組新的PKR抑制劑，它們通過破壞PKR二聚化抑制PKR功能，從而決定了二聚化步驟為PKR成熟活化和催化功能過程中關(guān)鍵組分是進(jìn)行篩選分析以鑒定新抗病毒試劑的關(guān)鍵靶。9.實(shí)施例NS5A，PKR調(diào)節(jié)，和IFN敏感性自定義ISDR最近分子流行病學(xué)研究驗(yàn)明ISDR與HCV-1b的IFN抗性株的HCV基因組保守區(qū)。申請(qǐng)人已確認(rèn)來(lái)自HCV基因型1a和1b之IFN抗性株的NS5A可與PKR結(jié)合體內(nèi)抑制激酶活性，此過程獨(dú)立于NS5AISDR。使用一系列與NS5A 1b-wt同基因的NS5A ISDR變異體。申請(qǐng)人已證明ISDR之中的突變可廢除在體內(nèi)NS5A的PKR的調(diào)解特性。
9.1NS5A的PKR相互作用區(qū)的鑒定ISDR對(duì)NS5A-PKR復(fù)合物形成必須但不充分NS5A-PKR相對(duì)作用的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析，使用酵母雙雜交分析以確定相互作用中ISDR的角色。編碼BD-NS5A 1b-wt全長(zhǎng)或缺失突變體的TRP1質(zhì)粒(圖10A，見表1)，被引入含編碼AD-PKR的LEU質(zhì)粒的酵母菌株Hf7c中。所有構(gòu)建物在共轉(zhuǎn)化菌株中有效表達(dá)(圖10C)。含每種BD-NS5A構(gòu)建物和AD-PKR或AD-載體(相互作用陰性對(duì)照)的菌株都生長(zhǎng)在含組氨酸的培養(yǎng)基中。相對(duì)作用陰性對(duì)照菌株不能生長(zhǎng)在-His培養(yǎng)基中，說明所述相互作用的特殊性。重要的是，發(fā)現(xiàn)NS5A包含ISDR的66氨基酸區(qū)在體內(nèi)與PKR復(fù)合結(jié)構(gòu)中不可缺少(圖10)。僅有NS5A N-末端236氨基酸不足以與AD-PKR相互作用，含此構(gòu)建物菌株不能在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的事實(shí)證實(shí)此項(xiàng)結(jié)論(圖10B)。更進(jìn)一步的，還發(fā)現(xiàn)含ISDR、編碼NS5A氨基酸2180-2251的構(gòu)建物，當(dāng)其與AD-PKR表達(dá)時(shí)，不能在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。相反地，含BD-NS5A的構(gòu)建物1973-2419，1973-2361，或2120-2274可在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，暗示雙雜交蛋白的相互作用。通過這些分析，可確定NS5A的PKR結(jié)合區(qū)定位于66氨基酸區(qū)，該66氨基酸區(qū)包括ISDR和鄰近的C-末端26氨基酸(圖10B，下部)。因此，ISDR對(duì)于NS5A-PKR相互作用必需但不充分。
9.2NS5A-PKR相互作用依賴于ISDR的序列體內(nèi)NS5A和PKR之間的復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)生確定的ISDR突變，用酵母雙雜交分析檢驗(yàn)其作用。與HCV的IFN抗性和敏感菌株相應(yīng)的一系列編碼野生型(wt)和NS5A ISDR變異體的NS5A表達(dá)載體。ISDR突變并非為隨機(jī)的，在以往鑒定HCV IFN敏感菌臨床分離物中的確定突變的基礎(chǔ)上，實(shí)施定點(diǎn)誘變以構(gòu)建NS5A的ISDR變異體(Enomoto等，1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，33477-81)。這些突變，如表1所示，引入到NS5A 1b-wt的ISDR中，NS5A 1b-wt在此之前分IFN抗性的HCV中分離(Gale等，1997)。產(chǎn)生一套等基因NS5A構(gòu)建物，1b-2，1b-4和1b-5，其中IFN抗性HCV的原型ISDR序列各包含2個(gè)、4個(gè)和5個(gè)氨基酸變換。這些構(gòu)建物NS5A 1b-wt的序列相同，除了ISDR內(nèi)確定的突變，因此可確定特異ISDR突變對(duì)HCV 1b NS5A功能的作用。表1中比較了原型IFN抗性HCV-J菌株的ISDR序列和IFN反應(yīng)(Kato等，1990，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊879524-9528)與來(lái)自每種wt和突變NS5A構(gòu)建物的相應(yīng)病毒分離物的ISDR序列和對(duì)IFN的反應(yīng)。
BD-NS5A構(gòu)建物編碼全長(zhǎng)1b-wt NS5A和同基因的ISDR突變體(表1)，它們經(jīng)轉(zhuǎn)化至含質(zhì)體編碼的AD-PKR或AD對(duì)照載體的Hf7c酵母中。作為另外對(duì)照，包括一系列平行菌株，其中含質(zhì)體編碼AD-PKR和HCV-1a NS5A構(gòu)建物BD-1a-wt(陽(yáng)性對(duì)照)，或BD-ΔISDR(陰性對(duì)照)，后者缺乏相應(yīng)于1a-wt構(gòu)建物的完整ISDR(Gale等，1997)。得到的酵母菌株影印到+His和-His培養(yǎng)基上。如圖11所示，所有菌株在+His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但是，僅有表達(dá)BD-NS5A構(gòu)建物1b-wt，1b-2或1a-wt對(duì)照的菌株在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明這些構(gòu)建物可體內(nèi)與PKR結(jié)合。與ΔISDR對(duì)照相同，BD-NS5A，1b-4和1b-5的ISDR變異體不能與AD-PKR相互作用，含這些構(gòu)建物的菌株無(wú)法在-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖11A)。免疫分析證明所有BD-NS5A構(gòu)建物和AD-PKR構(gòu)建物在共轉(zhuǎn)化的酵母中有效表達(dá)(圖11B)。因此，ISDR序列區(qū)別的同基因NS5A構(gòu)建物體內(nèi)與PKR相互作用有差別。單獨(dú)ISDR點(diǎn)突變引入(NS5A 1b-2)不足以消除NS5A-PKR相互作用。相反地，多ISDR突變能廢除與PKR的復(fù)合體結(jié)構(gòu)(圖11A)。ISDR中多突變使NS5A無(wú)法結(jié)合PKR，這與IFN敏感性HCV相關(guān)聯(lián)。
9.3ISDR突變廢除NS5A功能NS5A通過與蛋白激酶的直接相互作用抑制PKR功能(Gale等，1997b)。多ISDR突變破壞NS5A-PKR復(fù)合結(jié)構(gòu)(圖11)。因此，可在體內(nèi)比較NS5A的wt和ISDR變異體調(diào)節(jié)PKR功能的能力。表達(dá)質(zhì)粒編碼在Gal啟動(dòng)子控制下的NS5A構(gòu)建物1b-wt，1b-2，1b-4和1b-5，質(zhì)粒被引入到gcn2Δ啤酒糖酵母菌RY-1中(Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)。15365-378)。該菌株缺乏內(nèi)源GCN2蛋白激酶并包含在半乳糖苷誘導(dǎo)的GAL/CYC雜交啟動(dòng)子控制下的wt人PKR的2個(gè)整合拷貝。當(dāng)置于半乳糖培養(yǎng)基中，PKR表達(dá)并磷酸化eIF-2α的絲氨酸51位，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)，15365-378)。如圖12A，包含各自的NS5A表達(dá)質(zhì)?；騼H表達(dá)質(zhì)體(載體；對(duì)照)的菌株，當(dāng)細(xì)胞等位物置于包含葡萄糖僅為碳源的非誘導(dǎo)性培養(yǎng)基中，細(xì)胞均生長(zhǎng)良好(左圖)相比之下，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，僅有共表達(dá)NS5A 1b-wt的菌株表現(xiàn)明顯生長(zhǎng)(圖12A，右圖)。通過此法可確定，共表達(dá)NS5A 1b-wt和PKR的菌株比那些共表達(dá)NS5A 1b-4或1b-5與PKR的株，平皿接種效率高出100倍。同時(shí)也觀察到，在共表達(dá)PKR與NS5A 1b-2的菌株中，平皿接種效率下降，相應(yīng)減少10-100倍(圖12A)。在酵母雙雜交分析中，該結(jié)構(gòu)能與PKR結(jié)合(見圖11)，所述這一現(xiàn)象令人吃驚。這些結(jié)果表明，在1b-wt的ISDR內(nèi)，單個(gè)氨基酸點(diǎn)突變(A252V)的引入足以從NS5A-PKR復(fù)合結(jié)構(gòu)中解除對(duì)PKR的抑制。多ISDR氨基酸突變，相應(yīng)與HCV的IFN敏感株，導(dǎo)致與同基因NS5A 1b-wt相關(guān)的生長(zhǎng)恢復(fù)表型缺失。這些結(jié)果表明NS5A 1b-wt抑制體內(nèi)PKR的翻譯調(diào)節(jié)特性，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，刺激蛋白合成。與NS5A ISDR變異體相關(guān)的功能缺失說明NS5A的PKR調(diào)節(jié)特性被ISDR內(nèi)突變引入所破壞。
為確定ISDR突變對(duì)NS5A的PKR調(diào)節(jié)功能的影響，分析內(nèi)源PKR底物的體內(nèi)磷酸化狀態(tài)，處理eIF-2α。RY1-1酵母菌株中，PKR功能的抑制導(dǎo)致eIF-2α超磷酸化形式(僅51Ser被PKR磷酸化)水平下降(Romano等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)，15365-378)。運(yùn)用單向等電聚焦(IEF)，eIF-2α的超磷酸化形式可從低酸性，低磷酸化形式(其缺少絲氨酸51位磷酸化)中電泳分離(Dever等，1993)。圖10顯示從圖12中描述的RY1-1菌中制備的抽提IEF凝膠的免疫印跡，運(yùn)用對(duì)酵母eIF-2α特異性的抗血清探測(cè)。作為對(duì)照，包括來(lái)自含表達(dá)質(zhì)體，缺乏插入物(V，泳道1)，或轉(zhuǎn)決定陰性PKR突變體，PKRΔ295-300(圖12，泳道6)的菌株抽提物。PKRΔ295-300在酵母中共表達(dá)時(shí)，抑制wt PKR，導(dǎo)致絲氨酸51位磷酸化水平的下降和在半乳糖培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)(Romano等，1995)。如圖13，表達(dá)NS5A 1b-wt或PKRΔ295-300的菌株，表現(xiàn)超磷酸化eIF-2α水平的顯著下降，可由與相對(duì)于載體對(duì)照菌株的低磷酸化eIF-2α的多度的伴隨增加確認(rèn)(比較泳道1和2)。表達(dá)同基因NS5A變異體1b-2，1b-4或1b-5的菌株，具有占優(yōu)勢(shì)的超磷酸化的eIF-2α，與載體對(duì)照菌相同(圖13，比較泳道3-5與1)。各自的絲氨酸51位磷酸化的eIF-2α的水平與半乳糖培養(yǎng)基每種菌的生長(zhǎng)表型一致(圖12A)，NS5A 1b-wt的表達(dá)促進(jìn)半乳糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和絲氨酸51位磷酸化的下降。此表型可由引入NS5A ISDR突變至NS5A而逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果綜合起來(lái)，證明相應(yīng)IFN敏感的HCV的ISDR突變(表1)可破壞NS5A的PKR調(diào)節(jié)特性。此外，NS5A指導(dǎo)的PKR抑制中PKR結(jié)合事件的解偶聯(lián)在我們對(duì)NS5A 1b-2構(gòu)建物的分析中可見(見圖11和12)，說明NS5A功能的取消可發(fā)生在多個(gè)水平且不限于NS5A-PKR復(fù)合結(jié)構(gòu)的破壞。9.4哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NS5A-PKR相互作用被ISDR突變破壞來(lái)自IFN抗性HCV的NS5A在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，抑制PKR的翻譯調(diào)解特性(Gale等，1997)。如酵母雙雜交(圖11)和生長(zhǎng)分析(圖12)的結(jié)果所暗示，申請(qǐng)人懷疑哺乳動(dòng)物中NS5A指導(dǎo)的PKR抑制通過直接NS5A-PKR相互作用相似地介導(dǎo)。申請(qǐng)人尋求確定是否由NS5A和PKR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成穩(wěn)定的復(fù)合體，如果存在ISDR突變對(duì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)有何作用。Cos-1細(xì)胞瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染編碼NS5A的wt或ISDR突變體和全長(zhǎng)遲鈍人PKR，進(jìn)行共免疫沉淀分析。在這些分析中，質(zhì)粒用于編碼來(lái)自IFN抗性HCV-1a(1a-wt)，1b-wt和1b同基因突變體的1b-5的NS5A，后者相應(yīng)于IFN敏感HCV(表1)。從共轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備提取物，免疫印跡分析，分析表明所有構(gòu)建物在轉(zhuǎn)染48小時(shí)內(nèi)有效表達(dá)(圖14)。從共轉(zhuǎn)染1a-wt的細(xì)胞制備抗-NS5A免疫沉淀物，從含F(xiàn)LAG-標(biāo)記的1b-wt制備抗FLAG免疫沉淀物，從中回收PKR(圖14A和B)。在比較中，從Flag標(biāo)記的1b-5的免疫沉淀物未探測(cè)到PKR(比較泳道5和6，圖14)。PKR的回收依賴于NS5A在提取物中存在，因此，從缺乏wt NS5A的提取物中制備時(shí)NS5A特異性免疫沉淀物中無(wú)法探測(cè)到PKR(圖10A和10B，泳道1和4)。這些結(jié)果表明來(lái)自IFN抗性菌HCV-1a和HCV-1b的NS5A在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能與PKR形成穩(wěn)定而特殊的復(fù)合體。與酵母雙雜交結(jié)果相同(圖11)，與IFN抗性HCV一致的ISDR內(nèi)的突變(表1)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中破壞NS5A-PKR的相互作用。這些結(jié)果與在酵母研究中觀察到的結(jié)果的一致性(見圖11和12)證明酵母系統(tǒng)為研究NS5A-PKR相互作用的可行系統(tǒng)以及該相互作用對(duì)PKR功能的作用。10.實(shí)施例NS5A具致癌潛能因?yàn)镻KR調(diào)節(jié)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)的控制有關(guān)，申請(qǐng)者提出問題NS5A對(duì)PKR的調(diào)節(jié)在慢性HCV感染的癌的發(fā)展中是否起作用。在此研究中，提出致癌轉(zhuǎn)化通過對(duì)PKR-依賴的eIF-2α磷酸化的抑制和mRNA翻譯的脫調(diào)節(jié)發(fā)生。來(lái)自IFN抗性HCV的NS5A與PKR結(jié)合(圖14)并抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PKR的翻譯調(diào)節(jié)特性(見圖12和13)。為確定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，是否NS5A對(duì)PKR的抑制使生長(zhǎng)刺激，建立組成性表達(dá)來(lái)自CMV立即早期表達(dá)啟動(dòng)子的NS5A 1a-wt的NIH3T3細(xì)胞系。選擇2種此類細(xì)胞系NS5A 5C6和NS5A 4A1用于研究。免疫印跡分析揭示NS5A表達(dá)高水平NS5A(圖15)而NS5A 4A1細(xì)胞明顯低表達(dá)NS5A(此處未示數(shù)據(jù))。
檢驗(yàn)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，包括注射到無(wú)胸腺裸鼠中成瘤的能力(表2)。以下對(duì)照細(xì)胞系可作為此分析的對(duì)照，包括含空轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞(neo5-10)，或以往描述的細(xì)胞系，P58-20，它過表達(dá)PKR抑制蛋白P58IPK(Barber等，1994)。與P58-20細(xì)胞系相似，NS5A 5C6細(xì)胞較neo5-10對(duì)照倍增時(shí)間約下降40％且培養(yǎng)飽和密度增加2.5-3倍。NS5A低表達(dá)細(xì)胞，NS5A 4A1的生長(zhǎng)速率與neo5-10對(duì)照相比，不表現(xiàn)明顯區(qū)別(表2)。但是，這些細(xì)胞與對(duì)照培養(yǎng)物相比，其培養(yǎng)飽和密度2倍增加(表2)。因此，NIH3T3細(xì)胞中NS5A組成性表達(dá)在匯合后培養(yǎng)物中支持細(xì)胞分裂，與細(xì)胞生長(zhǎng)增加的速率有關(guān)，這些結(jié)果伴隨有惡性轉(zhuǎn)化的P58-20對(duì)照細(xì)胞的表型(Barber等，1994)。
為進(jìn)一步特征化NS5A細(xì)胞系的表型，評(píng)估這些細(xì)胞體外忍受貼壁不依賴性生長(zhǎng)和無(wú)胸腺小鼠中成瘤的能力。與P58-20對(duì)照相似，在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，NS5A 5C6細(xì)胞形成克隆，與neo5-10細(xì)胞相比，克隆形成率提高14倍。在NS5A 4A1細(xì)胞中，同樣觀察貼壁非依賴性生長(zhǎng)，生長(zhǎng)率顯著較低(表2)。重要的是，兩個(gè)NS5A細(xì)胞系均在裸鼠注射后成瘤。NS5A 5C6細(xì)胞在5/5小鼠中侵占性成瘤，潛伏期為注射后17-25天。在接受NS5A 4A1細(xì)胞的小鼠中，成瘤潛伏期(22-44天)明顯變長(zhǎng)，那些接受對(duì)照P58-20細(xì)胞的鼠表現(xiàn)侵占性腫瘤生長(zhǎng)，潛伏期12-20天，與以前結(jié)果相似(Barber等，1994)。從NS5A5C6(圖15)和4A1小鼠收獲的腫瘤制備的腫瘤衍生細(xì)胞，確定其中NS5A的表達(dá)。此外，對(duì)這些細(xì)胞初步的檢查揭示內(nèi)源的eIF-2α磷酸化被明顯抑制，伴隨NS5A介導(dǎo)的PKR的抑制。此研究證明NS5A的組成性表達(dá)，相應(yīng)于IFN抗性的HCV-1a，可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)脫調(diào)節(jié)和在NIH3T3細(xì)胞中的惡性轉(zhuǎn)化。
結(jié)果說明NS5A指導(dǎo)的PKR的抑制不僅具有HCV如何反應(yīng)IFN療法的結(jié)論，還說明此過程促進(jìn)慢性HCV感染相關(guān)的惡性發(fā)展。因此，這些發(fā)現(xiàn)證明，用于鑒定抑制NS5A對(duì)PKR二聚化破壞作用的抗病毒試劑的篩選分析，也可鑒定抑制慢性HCV感染相關(guān)的惡性發(fā)展的試劑。
一定數(shù)量的參考文獻(xiàn)被引用，其完整內(nèi)容在此納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
本發(fā)明不僅限于特殊實(shí)施方案中描述的本發(fā)明單方面的單個(gè)舉例，而且包括功能相當(dāng)?shù)姆椒ê徒M分。事實(shí)上在此已描述和顯示之外本發(fā)明多種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員，可從前述的描述及附圖中看出。這些修改在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。表1.ISDR序列和相應(yīng)等基因NS5A表達(dá)構(gòu)建物的IFN敏感性名 ISDR序列(氨基酸2209-2248) IFN 參考文獻(xiàn)反應(yīng)b1b-pt PSLKATCTTHHDSPDADLIEANLLWRQEMGGNITRV R (Enomoto etESEN al.，1996)1b-wt ---------R-------------------------- R (Clements---- and Zink，1996)1b-2 ---------R-----V-------------------- R/S (Enomoto et---- al.，1996；Zeuzem etal.，1997)1b-4 L----A--GR-------------------------- S1b-5 L----A--GR-----V-------------------- S (Enomoto et---- al.，1996)1a-wt --------AN------E------------------- S (Gale et---- al.，1997b)apt，HCV-J原型參考序列(GenBankTM登記號(hào)D90208)；wt野生型親代HCV-1b克隆[GenBankTM登記號(hào)AF034151(僅NS5A編碼區(qū))]。bR，IFN抗性；S，IFN敏感；R/S在單獨(dú)研究中獨(dú)立報(bào)道為IFN敏感。相應(yīng)于1b-4的IFN反應(yīng)表型尚未確定。但根據(jù)已發(fā)表的研究(Enomoto等，1996；Kurosaki等，1997)，我們推斷此序列與對(duì)IFN敏感性有關(guān)。表2.表達(dá)NS5A的細(xì)胞的生長(zhǎng)特性克隆a倍增時(shí)間飽合密度克隆 小鼠 潛伏(小時(shí))b(細(xì)胞×10/cm2)b效率腫瘤/總量d(天)d(％)cneo5-1027.6±0.11.6±0.10 0/5-NS5A 5C6 17.7±0.64.0±0.2145/5 17-25NS5A 4A1 22.4±2.13.3±0.14 4/5 22-44P58-20 17.3±1.53.7±0.2155/5 12-20aneo5-10和P58-20各代表-和+對(duì)照細(xì)胞系，NS5A 5C6細(xì)胞表達(dá)NS5A比NS5A 4A1細(xì)胞表達(dá)水平高5倍。b細(xì)胞以105細(xì)胞/55mm培養(yǎng)皿接種在含10％胎牛血清(FBS)和400μg/ml G418的選擇DMEM中。細(xì)胞每24小時(shí)計(jì)數(shù)，通過測(cè)量達(dá)到匯合后4天的總細(xì)胞數(shù)決定飽合密度。示數(shù)為4個(gè)實(shí)驗(yàn)平均值。c5×102，5×103或104細(xì)胞在有20％FBS的0.35％瓊脂/DMEM溶液中重懸，重復(fù)涂抹至6-孔培養(yǎng)皿，其中含10％FBS+0.7％瓊脂/DMEM?？寺÷?4天后確定，以觀察到的克隆數(shù)/總鋪皿細(xì)胞數(shù)百分比顯示。克隆被定義為4個(gè)或更多細(xì)胞的分離的群。d4-6周齡無(wú)胸腺裸鼠[nu/nu(Charles River)]被皮下注射在左后肢，2×106細(xì)胞(PBS中)。小鼠關(guān)在無(wú)病原體的微隔離蘢中，觀察至100天。潛伏期為形成3mm直徑的腫瘤的時(shí)間，以天計(jì)。表3.表達(dá)NS5A的細(xì)胞的生長(zhǎng)特性構(gòu)建物a正義b反義 ntNS5A 1b-wt 5′TAAGCTTATGGGCT 5′CAAGCTTGGATCCT 6260-75981973-2419 CCGGCTCGTGGCTTAGGACATTGAGCNS5A 5′CATATGGGCTCCGG 5′GTCGACCGCAGACA 6260-69651973-2208 CTCGTGGCTA ACTGGCTAGCTGANS5A 5′GAATTCCCTTCCTT 5′ATCGGATCCTTATA 6966-71652209-2274 GAAGGCAACATGCCCACCTTATTCTCTGANS5A 5′CCTTCCATGGCCCA 5′ATCGGATCCTTATA 6877-70942180-2251 CATTACAGCAGAGACG CCACCTTATTCTCTGA構(gòu)建物 誘變引物c突變NS5A 1b-2 5′GACTCCCCAGATGTTGACCTCATC A2224VNS5A 1b-5NS5A 1b-4 5′TTGTCTGCGCTTTCCTTGAAGGCAGCATGCACTP2209L，GGCCGTCACGAC T2214A，T2217Ga氨基酸和nt位置與PCR擴(kuò)增區(qū)一致。編號(hào)根據(jù)原型HCV-J序列(Kato等，1990)。b下劃線序列標(biāo)明克隆限制位點(diǎn)(文中述)。c下劃線密碼與所指氨基酸突變一致。
權(quán)利要求
1.一種篩選潛在的新型抗病毒劑的方法，這種抗病毒劑能夠有效抑制 包含干擾素敏感決定部位(ISDR)的病毒蛋白的活性，該方法包括培養(yǎng)含PKR蛋白激酶、病毒蛋白和待測(cè)試劑的混合物；以及測(cè)量PKR蛋白酶活性；與缺乏待測(cè)試劑時(shí)PKR蛋白酶活性相比較。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗病毒試劑抑制丙型肝炎病毒復(fù)制。
3.權(quán)利要求1的方法，其中病毒蛋白為NS5A。
4.一種篩選潛在的抗病毒劑的方法，該抗病毒劑能有效抑制包含ISDR的病毒蛋白與干擾素誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶間的直接相互作用，包括培養(yǎng)含ISDR的蛋白，PKR蛋白激酶和待測(cè)試劑的混合物；以及測(cè)量含ISDR的蛋白與PKR蛋白間的結(jié)合；并與在缺少待測(cè)試劑時(shí)結(jié)合的程度進(jìn)行比較。
5.權(quán)利要求4的方法，其中病毒蛋白為NS5A。
6.權(quán)利要求4的方法，其中抗病毒劑抑制丙型肝炎病毒復(fù)制。
7.權(quán)利要求1的方法，其中在遺傳工程化酵母細(xì)胞中表達(dá)PKR蛋白激酶和含ISDR的蛋白，以增加在活化的PKR蛋白激酶存在下報(bào)告基因的表達(dá)；并進(jìn)一步包括在存在和不存在待測(cè)試劑的情況下測(cè)量報(bào)告基因表達(dá)水平的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中報(bào)告基因融合至GCN4/β-gal蛋白。
9.一種用于篩選抗病毒劑的酵母細(xì)胞，它經(jīng)遺傳工程化表達(dá)(a)含ISDR區(qū)的多肽，和(b)干擾素誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶，和(c)報(bào)告基因，其表達(dá)因PKR蛋白激酶的活化而增加。
10.權(quán)利要求9中的酵母細(xì)胞，其中含ISDR區(qū)的多肽為NS5A。
11.權(quán)利要求10中的酵母細(xì)胞，其中報(bào)告基因是融合的GCN4/β-gal基因。
12.一種抑制丙型肝炎病毒(HCV)在HCV感染的細(xì)胞中復(fù)制的方法，包括施用有效數(shù)量，干擾在所述細(xì)胞中NS5A和PKR間的相互作用的藥劑。
13.權(quán)利要求13的方法，其中藥劑為NS5A抑制劑。
14.權(quán)利要求14的方法，其中試劑為與ISDR互補(bǔ)的反義分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)抗病毒試劑的新方法,此抗病毒試劑選擇性干擾病毒蛋白,其中該病毒蛋白可使干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒感染的防御機(jī)制失效。公開了鑒定可選擇性抑制含干擾素敏感決定區(qū)的病毒蛋白與干擾素誘導(dǎo)的PKR蛋白激酶之間的相互作用的試劑的篩選分析。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1268980SQ98804841
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期1998年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月5日
發(fā)明者M·G·卡策, 小M·J·加萊 申請(qǐng)人:華盛頓州大學(xué)