專利名稱：治療性分子與產(chǎn)生和/或選擇所述治療性分子的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體涉及可用于誘導(dǎo)例如但不限于癌細(xì)胞這樣的特定細(xì)胞凋亡的治療性分子，以及產(chǎn)生和/或選擇治療性分子的方法。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)例如癌細(xì)胞這樣的細(xì)胞發(fā)生凋亡的方法以及可用于此的藥物組合物。本發(fā)明還提供通過選擇性抑制促生存(pro-survival)蛋白質(zhì)來產(chǎn)生或選擇能夠誘導(dǎo)特定細(xì)胞凋亡的治療劑的方法。本發(fā)明還提供基于結(jié)構(gòu)結(jié)合特征設(shè)計(jì)治療性分子的計(jì)算機(jī)方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述本說明書中的任何現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)均不是，也不應(yīng)被視作，對該現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成了任何國家的公知常識(shí)的承認(rèn)或任何形式的暗示。
本文中所引用參考文獻(xiàn)的著錄項(xiàng)目列于本說明書末尾。
癌癥是發(fā)展中國家的第二大死亡原因。除了使患者及其家屬遭受痛苦之外，癌癥也是在治療上最為昂貴的疾病之一(Zhang，Nat RevDrug Discov 1101-102，2002)。因此，盡管已經(jīng)付出了人類生命的代價(jià)，如果同時(shí)考慮治療費(fèi)用以及由于使經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力降低而造成的損失，到2010年對社會(huì)的年度經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)預(yù)計(jì)約為20～50億美元。
程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的擾亂是包括癌癥在內(nèi)的許多重要疾病發(fā)展過程中的一個(gè)中心步驟。Bcl-2蛋白家族是一個(gè)凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子家族。研究表明，人濾泡淋巴細(xì)胞瘤中發(fā)生的Bcl-2過表達(dá)會(huì)抑制凋亡并促使腫瘤形成(Vaux等人，Nature 335440-442，1988；Strasser等人，Nature 348331-333，1990)。在高達(dá)90％的乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中也注意到了Bcl-2過表達(dá)(Zhang，2002，出處同前)，這些癌癥代表了一些最為普通的癌癥。Bcl-2的促生存家族成員也在許多腫瘤中過表達(dá)。毫無疑問，凋亡受損目前已被視為大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生過程中的中心步驟(Cory等人，Nat Rev Cancer 2647-656，2002)。
凋亡受損也是細(xì)胞毒性癌癥療法效力的一個(gè)主要障礙(Cory等人，2002，出處同前；Johnstone等人，Cell 108153-164，2002)。大多數(shù)細(xì)胞毒性試劑，包括許多化療藥物和放射，通過比如腫瘤抑制因子p53來間接啟動(dòng)凋亡(Cory等人，2002，出處同前)。然而，在多數(shù)腫瘤中p53途徑是失活的，阻止了該信號引發(fā)凋亡。因此，p53功能的喪失或者Bcl-2的過表達(dá)均能激發(fā)化學(xué)抗性，這是治療失敗的一個(gè)常見原因。
Bcl-2蛋白家族中促進(jìn)細(xì)胞存活的那些成員，包括哺乳動(dòng)物Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1，含有三或四個(gè)具有序列相似性的BH(Bcl-2homology，Bcl-2同源物)區(qū)，并發(fā)揮功能直至被它們的BH3-only家族成員中和。這些促凋亡拮抗劑，包括哺乳動(dòng)物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa，彼此間以及與更大的家族之間僅通過短BH3結(jié)構(gòu)域相關(guān)(Huang和Strasser，Cell 103839-842，2000)。相反，Bax和Bak，促凋亡家族成員的一個(gè)亞組，卻與Bcl-2共有三個(gè)BH結(jié)構(gòu)域，且可能在細(xì)胞內(nèi)膜透化中具有關(guān)鍵的下游作用(Wei等人，Science 292727-730，2001)。
BH3-only蛋白質(zhì)控制細(xì)胞穩(wěn)定，損傷信號啟動(dòng)它們與促生存類Bcl-2蛋白質(zhì)的結(jié)合，由此引發(fā)細(xì)胞死亡(Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出處同前)。它們的由轉(zhuǎn)錄信號(例如Bim、Puma、Noxa)或多種不同的翻譯后機(jī)制(例如Bim、Bmf、Bad、Bid)所誘導(dǎo)的差異活化，賦予了它們某些信號特異性(Putha lakath等人，Cell Death Differ 9505-512，2002)。然而通常認(rèn)為，各種不同的BH3-only一旦被激活則通過靶向所有的促生存類Bcl-2蛋白質(zhì)來發(fā)揮類似的功能(Adams等人，Genes Dev 172481-2495，2003；Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出處同前)。然而，它們的相互作用未得到系統(tǒng)的特征描述，少量的定量研究也限于Bcl-xL或Bcl-2(Letai等人，Cancer Cell 2183-192，2002；Petros等人，2000，出處同前；Sattler等人，1997，出處同前)。確定多樣變化的BH3-only蛋白質(zhì)與促生存家族成員是否選擇性地或混雜地相互作用，對于澄清細(xì)胞死亡是如何引發(fā)的是非常重要的(Adams，2003，出處同前；Cory等人，2003，出處同前；Danial和Korsmeyer，Cell 116205-219，2004)且對于目前開發(fā)模擬BH3-only蛋白質(zhì)起作用的化合物作為新抗癌劑的努力是非常相關(guān)的。
根據(jù)降低毒性和更好的靶向治療這一要求，顯然需要鑒定能夠與類Bcl-2蛋白質(zhì)相互作用并抑制其促生存功能的分子。
發(fā)明概述在本說明書中，除非另有要求，詞語“包括”及其變體如“包含”或“含有”應(yīng)理解為意指包含所述整數(shù)或步驟或所述的多個(gè)整數(shù)或步驟的組，但卻不排除任何其它整數(shù)或步驟或所述多個(gè)其它的整數(shù)或步驟的組。
本文中所使用的縮略語如表1所定義。
本發(fā)明提供促生存分子的小分子拮抗劑，尤其是促生存分子或其它相關(guān)促生存分子的Bcl-2家族中的一個(gè)或多個(gè)成員的小分子拮抗劑。拮抗劑的產(chǎn)生和/或選擇以Bcl-2家族蛋白質(zhì)(BH3-only蛋白質(zhì))的天然拮抗劑的模擬物和/或具有僅被小范圍BH3-only蛋白質(zhì)抑制的Bcl-2分子之間的結(jié)構(gòu)相似性的模擬物為基礎(chǔ)。
結(jié)構(gòu)研究揭示，由促凋亡蛋白質(zhì)BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋的疏水表面插入到由促生存蛋白質(zhì)的BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域形成的疏水溝中，并抑制它們的促生存功能。促凋亡蛋白質(zhì)中的α-螺旋在其螺旋外部含有名稱為H1、H2、H3和H4的疏水區(qū)。氨基酸序列形成七個(gè)重復(fù)。H1至H4外表面與Bcl-2蛋白質(zhì)上的口袋(溝)相互作用。
根據(jù)本發(fā)明，BH3-only蛋白質(zhì)可以依據(jù)與之相互作用的Bcl-2靶分子譜在功能上相區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明將這些組分作混雜型和限制型。通過鑒定混雜型和限制型BH3-only蛋白質(zhì)(尤其是圍繞BH3結(jié)構(gòu)域的α-螺旋與Bcl-2蛋白質(zhì)疏水溝間的相互作用)的氨基酸電荷、大小、構(gòu)象、溶解度、極性、疏水性、親水性以及氨基酸對三級結(jié)構(gòu)差異的貢獻(xiàn)，可以產(chǎn)生或選擇出模擬這些組中的一個(gè)組或其它組的模擬物。Bcl-2蛋白質(zhì)還帶有促進(jìn)BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型或限制型活性的結(jié)構(gòu)特征。
例如，可以對促凋亡分子上的七聯(lián)體重復(fù)中的氨基酸進(jìn)行修飾，以減弱該氨基酸或在三級結(jié)構(gòu)上與之最接近的氨基酸適配插入Bcl-2蛋白質(zhì)上由三級結(jié)構(gòu)形成的口袋中的能力。
限制型BH3-only蛋白質(zhì)由此提供具有賦予其選擇性拮抗特定Bcl-2蛋白質(zhì)能力的構(gòu)象的支架(scaffold)。根據(jù)本發(fā)明，該支架可用作設(shè)計(jì)模擬物或模仿包括混雜型BH3-only蛋白質(zhì)在內(nèi)的化合物的模板，從而產(chǎn)生具有限制型結(jié)合譜型的拮抗劑。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，制備了能夠在所選定的例如但不限于癌細(xì)胞這樣的細(xì)胞類型中誘導(dǎo)凋亡的限制型BH3-only蛋白質(zhì)的模擬物。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，混雜型和限制型BH3-only蛋白質(zhì)在與存在于促生存Bcl-2蛋白質(zhì)上的結(jié)合溝之間的相互作用水平上有所不同。
本發(fā)明還提供用于預(yù)測模擬限制型BH3-only蛋白質(zhì)支架的分子構(gòu)象從而產(chǎn)生和/或選擇和/或篩選候選化合物的計(jì)算方法，之后制備候選化合物并對其誘導(dǎo)凋亡的能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評估。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生或選擇促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；選擇一或多個(gè)與BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型結(jié)合表型相關(guān)的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bcl-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合模式的氨基酸或其化學(xué)類似物；分析各次替換后的相互作用其誘導(dǎo)更為限制的Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的能力。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生或選擇促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇限制型BH3-only蛋白質(zhì)作為支架蛋白質(zhì)，確定賦予該支架限制型表型的構(gòu)象，產(chǎn)生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的構(gòu)象部分的化合物。
因此，本發(fā)明提供一種根據(jù)帶有賦予其限制型表型的殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的計(jì)算機(jī)方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質(zhì)；對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對，和將這些蛋白質(zhì)與限制型BH3-only蛋白質(zhì)作同樣的比較；根據(jù)所述比對得到各氨基酸在一或多個(gè)帶來與Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合的混雜特性或限制特性的位置上的出現(xiàn)頻率；利用所述頻率產(chǎn)生一個(gè)選自電荷、大小、構(gòu)象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)的計(jì)分函數(shù)；用所述計(jì)分函數(shù)和/或至少一種另外的計(jì)分函數(shù)來產(chǎn)生一套優(yōu)選蛋白質(zhì)序列或其構(gòu)象等價(jià)物，產(chǎn)生或選擇出一種具有與Bcl-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合表型的化合物或蛋白質(zhì)。
在又一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供混雜型BH3-only蛋白質(zhì)在產(chǎn)生或選擇賦予所述BH3-only蛋白質(zhì)或其化學(xué)或構(gòu)象等價(jià)物以限制型結(jié)合表型的氨基酸替換變體中的用途。
另一方面，本發(fā)明構(gòu)思了一種產(chǎn)生或選擇Bcl-2蛋白質(zhì)拮抗劑的方法，所述方法包括確定選自以下的一系列參數(shù)(1)鑒定混雜型和限制型Bcl-2蛋白質(zhì)間的結(jié)構(gòu)差異；(2)鑒定混雜型和限制型BH3-only蛋白質(zhì)間的結(jié)構(gòu)差異；和(3)鑒定Bcl-2-BH3-only蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征，然后設(shè)計(jì)與有限范圍內(nèi)的Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合的BH3-only蛋白質(zhì)模擬物。
BH3-only蛋白質(zhì)的模擬物也可以通過例如但不限于在芯片上(insilico)篩選、高通量化學(xué)篩選、基于功能的檢測方法或結(jié)構(gòu)活性關(guān)系這樣的方法來產(chǎn)生或選擇。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的BH3-only模擬物易于以比如藥物組合物這樣的藥物形式提供。
本發(fā)明的組合物尤其適用于治療患有癌癥或有患癌癥傾向的受試者。
附圖簡述

圖1是顯示競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)的圖形。(A)將Mcl-1注射進(jìn)固定有突變體4EBimBH3(藍(lán)色)或wtBimBH3(紅色)的傳感器芯片。為獲得絕對結(jié)合(黑色)，從與wtBimBH3的反應(yīng)中扣除了與4EBimBH3的基線反應(yīng)。(B)促生存蛋白質(zhì)等同地與Bim結(jié)合。傳感圖，其顯示將促生存蛋白質(zhì)注射到固定化的wtBimBH3上時(shí)發(fā)生類似的反應(yīng)。(C)溶液競爭實(shí)驗(yàn)。提高競爭肽濃度(2)使Bcl-xL與固定化配體的結(jié)合減弱(1)。(D)與競爭劑BH3肽的預(yù)溫育使生物傳感器反應(yīng)減弱。在將Bcl-xL與BikBH3的混合物注射到wtBimBH3傳感器芯片上之前，先將Bcl-xL與濃度逐漸升高的BikBH3進(jìn)行了預(yù)溫育。線條(430秒處)表示用于計(jì)算IC50的反應(yīng)。(E)BikBH3有效地與固定化的BimBH3競爭與Bcl-xL的結(jié)合。相對反應(yīng)(％)顯示，在給定濃度的BikBH3存在下仍然與固定化肽結(jié)合的Bcl-xL與無BikBH3存在下的Bcl-xL(100％)的比率。(500秒后的不規(guī)律反應(yīng)是由分析物解離后洗滌芯片引起的)。向?qū)＠麢?quán)人提出請求可以獲得彩色復(fù)印件。
圖2是顯示促凋亡BH3-only和促生存類Bcl-2蛋白質(zhì)具有顯著相互作用的圖形。(A)利用競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測定了所示相互作用的IC50(nM)。所示結(jié)果得自代表性實(shí)驗(yàn)；多次實(shí)驗(yàn)間觀察到的差異小于兩倍(用不同的芯片或不同批次的蛋白質(zhì))。(B)對相互作用的相對結(jié)合親和力(列表于A)反向作圖。顯示了促生存蛋白質(zhì)的BH3結(jié)合圖。(C)中比較了形成其BH3結(jié)合溝的(α-螺旋2～8；Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003)人Bcl-2(殘基93-202)、人Bcl-xL(86-195)、人Bcl-w(42-151)、小鼠Mcl-1(190-300)和小鼠A1(33-148)的序列，并示為系統(tǒng)發(fā)生樹。向?qū)＠麢?quán)人提出請求可以獲得彩色復(fù)印件。
圖3是顯示Bad、Bik和Noxa在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有選擇性促生存靶的照片。借助共免疫沉淀測試了FLAG(FL)-標(biāo)記的促生存蛋白質(zhì)(人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1)和HA-標(biāo)記的BH3-only蛋白質(zhì)(A，人Bim；B，人Puma；C，人Bik；D和E，小鼠Bad；F和G，小鼠Noxa)間的相互作用。將收獲自293T細(xì)胞的等量35S-標(biāo)記裂解物與HA、FLAG(FL)或?qū)φ?C)標(biāo)記的抗體進(jìn)行共免疫沉淀。Bim(A)或Puma(B)與Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1結(jié)合良好。在A的頂部圖版中，為從大小上使Bim與Bcl-2相區(qū)分，用BimL代替了BimEL。(C)Bik偏好與Bcl-xL結(jié)合。(D)Bad結(jié)合Bcl-2和Bcl-xL，但不與Mcl-1結(jié)合，正如用同一濾膜與所示抗體做的免疫印跡(E)證實(shí)的。**內(nèi)源14-3-3，與Bad結(jié)合，如免疫印跡(E)所證實(shí)的。(F)Noxa只結(jié)合Mcl-1，如免疫印跡(G)所證實(shí)。*Mcl-1的降解產(chǎn)物不能發(fā)生結(jié)合。
圖4是顯示促生存類Bcl-2蛋白質(zhì)通過BH3-only蛋白質(zhì)發(fā)生不同靶向的圖形。BH3-only蛋白質(zhì)對促生存蛋白質(zhì)的親和力(列于圖2)反向作圖以便能夠比較BH3結(jié)構(gòu)域。向?qū)＠麢?quán)人提出請求可以獲得彩色復(fù)印件。
圖5是顯示BH3肽具有成為α-螺旋傾向的圖形。(A)BH3肽和馬心臟肌球蛋白在30mM磷酸鈉(pH7)中的CD譜，其顯示所使用的BH3肽大部分是無結(jié)構(gòu)的(一些具有低％的螺旋性)，而對照蛋白質(zhì)馬心臟肌球蛋白在緩沖條件下形成了所預(yù)期的α-螺旋。208nM和222nM處所指的最小值(箭頭)對于α-螺旋多肽是典型的。(B)BH3肽和肌球蛋白在添加了30％(v/v)TFE的20mM磷酸鈉(pH7)中的CD譜，其顯示所有的BH3肽都具有與馬心臟肌球蛋白在螺旋穩(wěn)定溶劑TFE存在下的構(gòu)象相似的α-螺旋構(gòu)象(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989)。向?qū)＠麢?quán)人提出請求可以獲得彩色復(fù)印件。
圖6是顯示促凋亡Bad和Noxa靶選擇性的促生存類Bcl-2肽的圖形。注射重組促生存類-Bcl-2蛋白質(zhì)(Bcl-2ΔC22、Bcl-xLΔC24、Bcl-wΔC29、Mcl-1ΔN151ΔC23、A1ΔC20)或無關(guān)蛋白質(zhì)(GST和LIF-受體)時(shí)，對(A)BadBH3或(B)固定有NoxaBH3的芯片的生物傳感器反應(yīng)。Mcl-1和A1對BadBH3無親和力，而Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w積極結(jié)合BadBH3(A)。用NoxaBH3觀察到了互補(bǔ)模式(B)。向?qū)＠麢?quán)人提出請求可以獲得彩色復(fù)印件。
圖7是顯示結(jié)合選擇性靶的BH3-only蛋白質(zhì)具有弱殺傷活性的圖形。(A)對BH3-only肽對促生存蛋白質(zhì)的親和力(列于圖3A)反向作圖以利于比較BH3的結(jié)合模式。(B)Bim和Puma(而非Bmf、Bad、Bik、Hrk或Noxa)對MEFs的有效殺死。用只表達(dá)GFP(對照)、或表達(dá)BH3-only蛋白質(zhì)之一和GFP的反轉(zhuǎn)錄病毒感染永生化3T9 MEF。感染后24小時(shí)利用PI排斥測定了被感染(GFp+ve)細(xì)胞的活力。柱狀圖表示至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值±1SD。(C)用共免疫沉淀測試了FLAG(FL)-標(biāo)記的促生存蛋白質(zhì)(Bcl-xL和Mcl-1)與Bims(或其變體)間的相互作用。將等量來自被感染293T細(xì)胞的裂解物與Bim、FLAG(FL)標(biāo)記或?qū)φ諢o關(guān)抗原的抗體進(jìn)行共免疫沉淀(C)。用大鼠單克隆抗-FLAG抗體探測濾膜。*Mcl-1的降解產(chǎn)物。(D)與促生存蛋白質(zhì)的結(jié)合受到限制的Bims變體是弱殺傷劑。感染后24小時(shí)分析了被編碼所示蛋白質(zhì)(GFP+ve)的反轉(zhuǎn)錄病毒感染的MEFs的活力。柱狀圖表示至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值±1SD。(E)被表達(dá)BH3的反轉(zhuǎn)錄病毒感染的MEF的長期存活。用一百個(gè)被反轉(zhuǎn)錄感染的細(xì)胞鋪板，六天后計(jì)數(shù)所形成的GFP+ve克隆的絕對數(shù)量。用Bims(+)感染后未得到集落，而Bims4E未影響長期活力。Bik、Noxa、BimsBadBH3或BimsNoxaBH3有中度影響。數(shù)據(jù)表示來自至少3次實(shí)驗(yàn)所形成的GFp+ve集落的平均數(shù)量±1SD。
圖8是顯示不同類別的BH3-only蛋白質(zhì)間的合作的圖形。(A)基于結(jié)合數(shù)據(jù)給出的一個(gè)模型，用于解釋具有選擇性靶的特定BH3-only蛋白質(zhì)的弱殺傷活性。(B)促凋亡BH3-only蛋白質(zhì)間的合作。用共表達(dá)BH3-only蛋白質(zhì)(Bims、Bik、Noxa或Noxa3E)和GFP、或共表達(dá)BH3-only蛋白質(zhì)和GFP-標(biāo)記-Bims、-BimsBadBH3或-BimsNoxaBH3的反轉(zhuǎn)錄病毒感染MEFs。感染后24小時(shí)對細(xì)胞活力計(jì)數(shù)；數(shù)據(jù)表示至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值±1SD。
圖9是顯示選擇性較低的Noxa突變體是有效的殺傷劑的圖形。(A)α-螺旋化的BimBH3區(qū)(編號指小鼠BimL)與Bcl-xL的靶溝(關(guān)鍵殘基以黑體標(biāo)記)之間的相互作用。(B)人Bim(BimL)和人Noxa的核心BH3區(qū)的比對。突變的Noxa殘基框出。(C)Noxa突變體與Bcl-xL和Bcl-w的增強(qiáng)結(jié)合。在溶液競爭實(shí)驗(yàn)中測試了野生型或突變Noxa肽結(jié)合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w或Mcl-1的能力。柱形圖顯示各相互作用的IC50(nM)。+IC50＞100μM。(D)Noxa m3與Bcl-xL和Mcl-1都結(jié)合。通過共免疫沉淀測試了Bcl-xL或Mcl-1，與BimsNoxaBH3m3之間的相互作用。*Mcl-1降解產(chǎn)物。(E)NoxaBH3 m3是一種有效的殺傷劑。用所示反轉(zhuǎn)錄病毒感染后24小時(shí)MEFs的存活。(F)NoxaBH3m3的劑量依賴型殺傷。用NoxaBH3或NoxaBH3 m3感染的MEFs的活力分作低、中或高GFP表達(dá)；(E，F(xiàn))中的數(shù)據(jù)表示至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值±1SD。
發(fā)明詳述本發(fā)明設(shè)想用于產(chǎn)生BH3-only蛋白質(zhì)模擬物的方法，所述模擬物計(jì)劃可用于誘導(dǎo)選擇性細(xì)胞尤其是在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。提出了利用氨基酸電荷、大小、構(gòu)象、溶解度、極性、疏水性、親水性以及對限制型BH3-only蛋白質(zhì)和它們各自的靶Bcl-2蛋白質(zhì)之間的三級結(jié)構(gòu)相似性的貢獻(xiàn)，以產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡的BH3-only蛋白質(zhì)的模擬物。
在詳細(xì)描述標(biāo)題發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明不限于特定的治療成分、生產(chǎn)方法、劑量方案等，可以做許多的變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明中所使用的術(shù)語是為僅為描述特定的實(shí)施方案而不意指對其進(jìn)行限制。
必須注意，如在本說明書中所使用的，單數(shù)形式的“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)的方面，除非上下文中另外指明。因此，例如，“治療劑”的含義包括單一試劑，以及兩種或多種治療劑；“方法”的含義包括一種單一的方法，以及兩種或多種方法；“殘基”包括單個(gè)殘基，以及兩個(gè)或多個(gè)殘基，等等。
本文中的“凋亡”的含義意指細(xì)胞死亡的形式，其中發(fā)生一系列程序化的事件導(dǎo)致細(xì)胞的消除。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，制備了能夠在所選定的例如但不限于癌細(xì)胞這樣的細(xì)胞類型中誘導(dǎo)凋亡的限制型 BH3-only蛋白質(zhì)的模擬物。
本文中的“癌細(xì)胞”的含義指，任何表現(xiàn)出不正常的生長、且傾向于以失控的方式增殖、并且在某些情況下發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。本文中所考慮的癌癥包括但不限于ABL1原癌基因、AIDS相關(guān)癌癥、聽神經(jīng)瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺樣癌、腎上腺皮質(zhì)癌、起因不明的骨髓化生、脫發(fā)、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星細(xì)胞瘤、共濟(jì)失調(diào)-毛血管擴(kuò)張、基底細(xì)胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、類癌瘤、宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、皮膚纖維肉瘤-隆凸、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、導(dǎo)管細(xì)胞癌、內(nèi)分泌腺癌、子宮內(nèi)膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、惡性骨髓瘤、肝外膽小管癌、眼癌、眼黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、輸卵管癌、先天性骨髓發(fā)育不全、纖維肉瘤、膽汁膀胱癌、胃癌、胃腸道癌、胃腸道類癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)層疾病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、婦科癌、血液惡性腫瘤、毛細(xì)胞性白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細(xì)胞增多病、霍奇金氏病、人視神經(jīng)乳頭水腫病毒、水泡狀胎塊、血鈣過多、咽喉癌、眼內(nèi)黑素瘤、島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、Langerhan′s-Cell-組織細(xì)胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni綜合癥、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、惡性棒狀腎腫瘤(Malignant-Rhabdoid-Tumor-of-Kidney)、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、Merkel細(xì)胞癌、間皮瘤、遷移癌、口癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤、蕈樣霉菌病、骨髓異常增生綜合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失調(diào)、鼻癌、鼻咽癌、腎母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤病遺傳性疾病、Nijmegen Breakage綜合征、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘺術(shù)卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周神經(jīng)外胚層腫瘤、垂體癌、紅血球增多癥、前列腺癌、罕見癌及其相關(guān)病癥(Rare-cancers-and-associated-disorders)、腎細(xì)胞肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、白內(nèi)障-毛細(xì)血管擴(kuò)張-色素沉著綜合征、唾液腺癌、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、惡性皮膚網(wǎng)狀細(xì)胞增多綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊索腫瘤、鱗片細(xì)胞肉瘤(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、遷移性細(xì)胞癌(膀胱)、遷移性細(xì)胞癌(腎-骨盆-/-輸尿管)、胚胎滋養(yǎng)層癌、尿道癌、泌尿系統(tǒng)癌、Uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、陰戶癌、瓦爾登斯特倫病(股骨小頭的骨軟骨病)巨球蛋白血癥、腎母細(xì)胞瘤。
作為本發(fā)明特定靶的癌癥是那些產(chǎn)生過量Bcl-2蛋白質(zhì)或促生存家族成員和/或減少量的抑制Bcl-2蛋白質(zhì)的促凋亡分子的癌癥。
在本發(fā)明的又一種實(shí)施方案中，BH3-only蛋白質(zhì)可以是混雜型或限制型。本文中的“混雜型”的含義是指，該蛋白質(zhì)結(jié)合許多種靶(即，結(jié)合全部或多種Bcl-2蛋白質(zhì))。本文中的“限制型”是指，該蛋白質(zhì)僅結(jié)合特定靶(即，僅結(jié)合一種或幾種Bcl-2蛋白質(zhì))。混雜型和限制型BH3-only蛋白質(zhì)在存在于促生存Bcl-2蛋白質(zhì)上的結(jié)合溝的相互作用的水平方面可以不同。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“靶”用于指比如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl和A1這樣的Bcl-2蛋白質(zhì)或任何其它含有三或四個(gè)Bcl-2同源(BH)區(qū)的促生存分子。
“靶結(jié)合物”用于描述分子和或模擬BH3-only蛋白質(zhì)，其抑制促生存蛋白質(zhì)。天然存在的靶結(jié)合物包括Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa。
本發(fā)明的目的是產(chǎn)生或選擇高度限制型或特異性的模擬物，其作為特定細(xì)胞(比如癌細(xì)胞)的凋亡抑制劑的靶結(jié)合物。
本發(fā)明在另一種實(shí)施方案中，提供一種產(chǎn)生或選擇促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋之殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；選擇一或多個(gè)與BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型結(jié)合表型相關(guān)的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bcl-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合模式的氨基酸或其化學(xué)類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導(dǎo)更為限制的Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的能力。
本文中的“支架蛋白”的含義是指期望其變體文庫的蛋白質(zhì)(也即BH3-only蛋白質(zhì))。該支架蛋白質(zhì)用作蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)計(jì)算方法中的輸入，且常用于促進(jìn)實(shí)驗(yàn)文庫的形成。支架蛋白可以是具有已知結(jié)構(gòu)的或者可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算、估計(jì)、模型化或?qū)嶒?yàn)測定的任何蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生或選擇促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇一種限制型BH3-only蛋白質(zhì)作為支架蛋白質(zhì)，確定賦予該支架限制型表型的構(gòu)象，產(chǎn)生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的構(gòu)象部分的化合物。
在又一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供混雜型BH3-only蛋白質(zhì)作為氨基酸殘基替換基質(zhì)在產(chǎn)生或選擇替換變體中的用途，所述變體賦予所述BH3-only蛋白質(zhì)或其化學(xué)或構(gòu)象等價(jià)物以限制型結(jié)合表型。
在一個(gè)實(shí)施例中，描述了Noxa BH3-only蛋白質(zhì)選擇性的分子基礎(chǔ)。
Noxa BH3選擇性地結(jié)合Mcl-1和A1，且不結(jié)合Bcl-2、Bcl-w或Bcl-xL。
一項(xiàng)對Noxa BH3結(jié)構(gòu)域序列的研究揭示，在人Noxa和兩個(gè)鼠NoxaBH3結(jié)構(gòu)域中緊鄰在H4前方的氨基酸非常獨(dú)特地是一個(gè)堿性氨基酸(表3)。有人提出，如果將該位置恢復(fù)為在其它BH3結(jié)構(gòu)域序列中更常見的酸性殘基，則會(huì)恢復(fù)其與Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的結(jié)合。一項(xiàng)對突變?nèi)薔oxa BH3結(jié)構(gòu)域的實(shí)驗(yàn)(其中將相關(guān)賴氨酸替換為谷氨酸)顯示，突變肽的IC50為5.8μM，也即比野生型肽緊密至少17倍。
人Noxa BH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)獨(dú)特特性是在H3位置存在有芳香氨基酸苯丙氨酸。這是帶有支鏈γ碳原子的唯一一次出現(xiàn)(表3)，提示在靶Bcl-2家族蛋白中該位置需要更多的空間來接收較大的氨基酸。若將Bcl-2家族蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比對，很明顯，Mcl-1和A1在BH3結(jié)構(gòu)域H3氨基酸的受體位點(diǎn)包含較小的氨基酸。通過在已經(jīng)發(fā)表的與Bim BH3結(jié)構(gòu)域的復(fù)合Bcl-xL的三維結(jié)構(gòu)(Liu，X.等人，Immunity 19341-352，2003)上繪圖以及利用上述序列比對，這一結(jié)論是有可能的。人Noxa BH3在H3位置從F突變?yōu)镮導(dǎo)致突變肽的IC50為1.1uM，也即比野生型緊密至少90倍。K突變?yōu)镋加上F突變?yōu)镮的雙突變顯示該變化產(chǎn)生協(xié)同作用，其IC50為0.1μM。
這解釋了本發(fā)明如何能夠?qū)⑦x擇性的BH3結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)變?yōu)榛祀s型的BH3結(jié)構(gòu)域。
本文中的“試劑”應(yīng)理解為，源自天然、重組或合成途徑的任何蛋白性或非蛋白性分子這一含義?？衫玫膩碓窗êY選天然產(chǎn)生的文庫、化學(xué)分子文庫以及組合文庫、噬菌體展示文庫以及基于體外翻譯的文庫。尤其有用的來源是對混雜型BH3-only蛋白質(zhì)支架進(jìn)行修飾從而產(chǎn)生限制型分子。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于完全抑制或部分降低Bcl-2或促生存家族成員的促生存功能的活性的試劑可以是蛋白質(zhì)性的或化學(xué)分子。所有這樣的對Bcl-2家族蛋白的促生存活性的降低、抑制、減弱或下調(diào)均包括在術(shù)語“拮抗劑”或“拮抗”內(nèi)。
對于蛋白質(zhì)性分子試劑，這樣的分子包括肽、多肽和蛋白質(zhì)。此外，術(shù)語突變體、部分、衍生物、同源物、類似物或模擬物意指包括各種不同形式的完全抑制或基本上降低Bcl-2家族蛋白質(zhì)的促生存功能的試劑。
試劑可以是天然存在的或人工產(chǎn)生的分子。試劑可以是包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的BH-3 only蛋白質(zhì)。試劑可以是通過突變或其它化學(xué)方法產(chǎn)生的，或重組或合成產(chǎn)生的。丙氨酸掃描是一種鑒定重要的氨基酸的有效技術(shù)(Wells，Methods Enzymol 2022699-2705，1991)。該技術(shù)中，用丙氨酸替換氨基酸殘基，并測定其對肽活性的影響。通過這種方法對試劑中的每個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行分析以確定重要的結(jié)構(gòu)和/或電荷和/或構(gòu)象和/或疏水/親水區(qū)域。測試試劑與Bcl-2結(jié)合的能力以及其它性質(zhì)，比如壽命、結(jié)合親和力、解離速率、跨膜能力或誘導(dǎo)凋亡的能力。
本發(fā)明的試劑還可以包括全長BH3-only蛋白質(zhì)的Bcl-2結(jié)合部分。這些部分是至少1個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)和至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個(gè)氨基酸，其定義一個(gè)比如兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)的Bcl-2結(jié)合片段。建議該結(jié)構(gòu)與Bcl-2蛋白質(zhì)的疏水溝相互作用。該類型的肽可以通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸技術(shù)獲得或用常規(guī)液相或固相合成技術(shù)合成。例如，對于液相合成或固定合成，可以參考由Blackwell科技出版社出版、Nicholson編輯、名稱為“合成疫苗”中的Atherton和Shephard描述的第九章“肽合成”?；蛘撸梢酝ㄟ^用比如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶這樣的蛋白酶消化本發(fā)明的氨基酸序列來制備肽。消化片段可以通過，例如，高效液相色譜(HPLC)技術(shù)純化。任何這樣的片段，無論其產(chǎn)生的途徑如何，均應(yīng)理解為包含在本文所使用的術(shù)語“拮抗劑”中。
因此拮抗劑可能包含混雜型BH3-only蛋白質(zhì)的衍生物。這樣的一種衍生物包括部分、突變體、同源物、片段、類似物以及雜交體或融合分子以及混雜型BH3-only蛋白質(zhì)的糖基化變體。衍生還包括在進(jìn)行優(yōu)化比對后在比較框中具有百分比氨基酸序列同一性的分子。優(yōu)選地，特定序列和對照序列間的相似性百分?jǐn)?shù)至少約為60％或至少約70％或至少約80％或至少約90％或至少約95％或更高，比如至少約96％、97％、98％、99％或更高。優(yōu)選地，本試劑的種間、功能或結(jié)構(gòu)同源物間的相似性百分?jǐn)?shù)為至少約60％或至少約70％或至少約80％或至少約90％或至少約95％或更高，比如至少約96％、97％、98％、99％或更高。介于60％和100％之間的相似性或同一性百分?jǐn)?shù)也是預(yù)期的，比如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
本文中所構(gòu)思的蛋白質(zhì)拮抗劑(比如BH3-only蛋白質(zhì)的衍生物)中的殘基類似物包括但不限于對側(cè)鏈的修飾，在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成過程中摻入非天然氨基酸和/或它們的衍生物，以及使用交聯(lián)劑和其它的對蛋白質(zhì)性分子或其類似物施加構(gòu)象約束的方法。該術(shù)語也不排除對多肽進(jìn)行修飾，例如，糖基化、乙?；?、磷酸化等。該定義中包括，例如，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括，例如，比如表1中所列的那些非天然氨基酸)的多肽，或具有替換的連鍵的多肽。這樣的多肽可能需要能夠進(jìn)入細(xì)胞。
本發(fā)明所構(gòu)思的側(cè)鏈修飾的例子包括氨基基團(tuán)修飾，比如通過與醛反應(yīng)之后用NaBH4還原進(jìn)行的還原性烷基化；用甲基亞氨逐乙酸酯進(jìn)行脒化；用乙酸酐進(jìn)行酰基化；用氰酸鹽使氨基基團(tuán)甲氨?；挥?，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基基團(tuán)三硝基苯基化；用琥珀酸酐和四羥基鄰苯二甲酸酐使氨基基團(tuán)?；停缓陀眠炼呷?5-磷酸使賴氨酸吡啶化，之后再用NaBH4還原。
精氨酸殘基的胍基可以通過用比如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛這樣的試劑形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物進(jìn)行修飾。
羧基可以通過碳二亞胺活化、形成O-?；愲濉⒅笱苌鸀槔鐚?yīng)的氨基化合物來進(jìn)行修飾。
巰基可以通過，比如用碘乙酸或碘乙酰胺進(jìn)行羧甲基化；過甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其它取代馬來酰亞胺反應(yīng)；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯汞氯化物、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞劑形成含汞衍生物；用氰酸鹽在堿性pH下甲氨?；瘉磉M(jìn)行修飾。
色氨酸殘基可以通過例如用N-溴琥珀酰亞胺氧化或用2-羥基-5-溴化硝基苯或硫苯基鹵化物使吲哚環(huán)烷基化進(jìn)行修飾。另一方面，酪氨酸殘基可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物進(jìn)行改變。
對組氨酸的咪唑環(huán)的修飾可以這樣實(shí)現(xiàn)用碘乙酸衍生物使其烷基化或用二乙基焦碳酸使其N-乙酯基化。
肽合成中摻入的非天然氨基酸及其衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。本文所考慮的非天然氨基酸的清單示于表1。這樣的非天然氨基酸可用于形成類似于限制型BH3-only支架的三級結(jié)構(gòu)。
表1非常規(guī)氨基酸代碼
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
例如，可以使用交聯(lián)劑來穩(wěn)定3D構(gòu)象，用比如帶有n＝1至n＝6的(CH2)n間隔基團(tuán)的雙功能酰亞胺酯、戊二醛、N-羥琥珀酰亞胺酯這樣的同-雙功能交聯(lián)劑，和通常含有比如N-羥琥珀酰亞胺這樣的氨基-反應(yīng)性部分以及另一個(gè)比如馬來酰亞胺或巰基(SH)或碳二亞胺(COOH)這樣的基團(tuán)特異性反應(yīng)部分的雜-雙功能試劑。此外，可以通過，例如，摻入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸Cα和Cβ原予之間引入雙鍵，和通過比如在N和C末端之間、兩條側(cè)鏈之間或側(cè)鏈和N或C末端之間形成氨基化合物這樣在導(dǎo)入共價(jià)鍵來形成環(huán)肽或類似物，來限制肽的構(gòu)象。
BH3-only蛋白質(zhì)的模擬物的含義包括結(jié)構(gòu)和/或功能水平上的靶結(jié)合物(也即BH3-only蛋白質(zhì))且抑制促生存Bcl-2-蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，提出產(chǎn)生經(jīng)過選擇的BH3-only蛋白質(zhì)模擬物。根據(jù)靶間的結(jié)構(gòu)差異以及靶結(jié)合物間的結(jié)構(gòu)差異設(shè)計(jì)了一種BH3-only蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明以及如上文所定義的，后一種可以分為混雜型(也即結(jié)合所有或多種Bcl-2蛋白質(zhì))或限制型(也即只結(jié)合一種或幾種Bcl-2蛋白質(zhì))。
肽模擬物可以是模擬蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組件的含肽分子(Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993)。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質(zhì)肽骨架的存在主要是為了以有利于比如抗體和抗原、酶和底物這樣的分子相互作用的方式確定氨基酸側(cè)鏈的方向或支撐蛋白質(zhì)。設(shè)計(jì)了一種能夠發(fā)生與天然分子類似的分子互作的肽模擬物。BH3-only蛋白質(zhì)的肽或非肽模擬物在本發(fā)明中可用作降低Bcl-2促生存功能的試劑。
將模擬物設(shè)計(jì)成藥學(xué)活性化合物是本領(lǐng)域已知的一種根據(jù)“先導(dǎo)”化合物開發(fā)藥物的方法。當(dāng)活性化合物難以合成或合成花費(fèi)昂貴或者它不適于特定的給藥方式時(shí)，這種方法則比較令人滿意，例如肽不是口服組合物的活性試劑，因?yàn)閮A向于在食道中被蛋白酶快速降解。模擬物設(shè)計(jì)、合成和測試通常用于避免為尋找靶特性而隨機(jī)篩選大量的分子。
從具有給定靶特性的化合物設(shè)計(jì)模擬物通常采取幾個(gè)步驟。首先，確定該化合物中對于確定該靶特性來說是關(guān)鍵和/或重要的特定部位。就肽而言，這可以通過系統(tǒng)地改變該肽中的氨基酸殘基來完成，例如依次替換各殘基。如上文所述，肽的丙氨酸掃描常用于提煉這樣的肽基序。這些構(gòu)成該化合物的活性區(qū)域的部位或殘基已知為其“藥效團(tuán)”。
一旦發(fā)現(xiàn)了藥效團(tuán)，則利用多種來源的數(shù)據(jù)，例如分光鏡技術(shù)、x-射線衍射數(shù)據(jù)和NMR，根據(jù)其物理特性，例如立體化學(xué)、鍵、大小和/或電荷，將其結(jié)構(gòu)建立模型。模型建立過程中可以利用計(jì)算機(jī)分析、相似性作圖(其模擬藥效團(tuán)的電荷和/或體積而非各原子間的鍵)和其它技術(shù)。
在該方法的一種變化中，建立了配體及其結(jié)合伴侶的三維結(jié)構(gòu)。這在配體和/或結(jié)合伴侶在結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變的情況尤其有用，它使得該模型在設(shè)計(jì)模擬物中能夠考慮到這一點(diǎn)。模型可用于產(chǎn)生與線性序列或三維構(gòu)型相互作用的抑制劑。
之后選擇一種在其上可以移植模擬藥效團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)之模板分子?？梢苑奖愕剡x擇該模板分子和移植到它上面的化學(xué)基團(tuán)，從而使得該模擬物易于合成、可能是藥學(xué)可接受的、且在體內(nèi)不會(huì)降解而同時(shí)保持先導(dǎo)化合物的生物學(xué)活性。或者，如果該模擬物是以肽為基礎(chǔ)的，則可以通過使肽環(huán)化從而提高其剛性來使其更加穩(wěn)定。之后可以對用這種方法找到的模擬物進(jìn)行篩選以觀察它們是否具有靶特性，或它們表現(xiàn)到什么程度。之后可以進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化或修飾得到一個(gè)或多個(gè)最終的模擬物用于體內(nèi)或臨床實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)本發(fā)明合理的藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是為制備藥物而利用計(jì)算機(jī)方法產(chǎn)生和/或選擇限制型BH3-only蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，例如，所述類似物是多肽的更具活性或穩(wěn)定的形式，且具有限制性結(jié)合譜。在一種方法中，首先借助X射線晶體照相術(shù)、計(jì)算機(jī)模型或最典型地通過組合方法確定目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。關(guān)于多肽的有用信息也可以通過以同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的模型來獲得。一個(gè)合理的藥物設(shè)計(jì)的例子是開發(fā)HIV蛋白酶抑制劑(Erickson等人，Science 249527-533，1990)。
一種藥物篩選方法，優(yōu)選在競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，利用了用表達(dá)多肽或片段的重組多核苷酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核細(xì)胞。這樣的細(xì)胞，無論是存活的或固定的，均可用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)?？梢詼y定，例如，靶或片段與被測試劑間的復(fù)合物形成，或檢查靶或片段與已知配體的復(fù)合物的形成受被測試劑的輔助或干擾到何種程度。
篩選程序包括檢測(i)藥物和靶之間復(fù)合物的存在，或(ii)編碼靶的核酸分子的表達(dá)水平的變化。一種檢測形式涉及競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在這樣的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，典型地對靶進(jìn)行標(biāo)記。從任何推定的復(fù)合物中分離出游離靶，游離(也即未復(fù)合的)標(biāo)記的量是被測試劑與靶分子的結(jié)合度量。也可以測定結(jié)合靶的量，而不是游離靶的量。也可能對化合物而非靶進(jìn)行標(biāo)記，以及測定在被測試藥物存在或不存在的情況下與靶結(jié)合的化合物的量。
藥物篩選的另一種技術(shù)提供為對具有適宜親和力的化合物提供高通量篩選，該技術(shù)詳細(xì)描述于Geysen(國際專利公布號WO 84/03564)。簡言之，在固相基質(zhì)，比如塑料插腳或一些其它表面，上合成了大量不同的小肽測試化合物。使肽測試化合物與靶反應(yīng)，并洗滌之。之后用本領(lǐng)域已知的方法檢測結(jié)合的靶分子。該方法可適于篩選非肽、化學(xué)基團(tuán)。因此，這一方面延展到了篩選靶拮抗劑或激動(dòng)劑的組合方法。
可將純化的靶物直接包被到平板上用于上述藥物篩選技術(shù)中。然而，也可以使用靶的非中和抗體來將靶固定到固相上。為利于結(jié)合和鑒定，也可以將靶與容易選擇的標(biāo)簽表達(dá)為融合蛋白。
在另一種實(shí)施方案中，可以對Bcl-2和Bcl-w抑制劑實(shí)施高通量化學(xué)篩選(HTCS)。如果BH3-only蛋白質(zhì)，比如Bim，與促生存分子(Bcl-2或Bcl-w)的相互作用促成凋亡，則可以在文庫中篩選以預(yù)防BH3結(jié)合的方式與促生存蛋白質(zhì)結(jié)合的小有機(jī)分子。為鑒定靶向一種或同時(shí)靶向兩種抗凋亡分子的化合物，可以實(shí)施多次篩選活動(dòng)。
可以在細(xì)菌中產(chǎn)生高容量實(shí)驗(yàn)所需的蛋白質(zhì)，用光學(xué)生物傳感器(BiaCore)所作的一項(xiàng)初期研究顯示，生物素化的BimBH3肽以高親和力與His6-標(biāo)記的Bcl-wΔC10(Kd～11nM)結(jié)合(Hinds等人，EMBOJ221497-1507，2003)。利用AlphaScreenTM(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)技術(shù)(Glickman等人，J Biomol Screen73-10，2002)已經(jīng)開發(fā)出了一種HTCS所需的高容量結(jié)合實(shí)驗(yàn)。通過揭示兩個(gè)伴侶蛋白質(zhì)相互作用時(shí)發(fā)生的熒光輸出量變化，可以高靈敏度地監(jiān)控蛋白質(zhì)的相互作用。AlphaScreenTM非常適于HTCS，因?yàn)樗浅Ｓ行乙子谠诤軐挼膭?dòng)態(tài)范圍內(nèi)作為同源實(shí)驗(yàn)以小體積實(shí)施。
在一種實(shí)施方案中，將His6Bcl-wΔC10結(jié)合到鎳包被的受體珠上，將生物素化的BimBH3肽結(jié)合到鏈霉抗生物素包被的供體珠。之后將這些珠與測試化合物在384-孔微量滴定板的板孔中孵育(每孔一種化合物)，并用Fusion alpha平板閱讀器讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)蛋白質(zhì)配體和珠的濃度、孵育時(shí)間和實(shí)驗(yàn)體積進(jìn)行優(yōu)化，以使得實(shí)驗(yàn)主要產(chǎn)生信號與背景的比率大于30∶1。該檢測已經(jīng)被證實(shí)有效，因?yàn)榈米砸幌盗须牡腎C50值與用光學(xué)傳感器得到的數(shù)值相當(dāng)。盡管肽親和力跨越三個(gè)數(shù)量級(8nM-35μM)，在兩組結(jié)果中觀察到的強(qiáng)相關(guān)性(R2＝0.9983)表明這些實(shí)驗(yàn)測定出相同的相互作用。也可以對His6Bcl-2ΔC22/Bim BH3的結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。一旦該實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化，即可對其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制從而評估板-板或天-天的重復(fù)性。之后可用各次實(shí)驗(yàn)篩選一個(gè)獨(dú)特的探索文庫。為消除假陽性，可在二次競爭實(shí)驗(yàn)中對滿足靶效力(IC50＜25μM)的所有抑制化合物進(jìn)行確認(rèn)(AlphaScreenTM，熒光極化和BiaCore光學(xué)生物傳感器)。光學(xué)生物傳感器可以使得對Bcl-2家族成員間的相互作用的定量更為便利，可以容易地在強(qiáng)候選物的親和力和BH3-only蛋白質(zhì)的生理結(jié)合間作比較。
可以通過尤其是液相色譜-質(zhì)譜來鑒定已通過這些初期測試的化合物的同一性和純度，之后測試它們的靶特異性，也即對Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w的親和力?；钚曰衔镞€要在設(shè)計(jì)用于預(yù)測腸道吸收(Wohnsland等人，J Med chem 44923-930，2001)和肝中毒進(jìn)行測試。此外，可以用在芯片上(in silico)的方法來預(yù)測它們的生物分布特性，以及排除可能存在代謝或毒性問題的藥效團(tuán)(DrugMetabolism Databases and High-Throughput Testing During DrugDesign and Development，Ed Erhardt，Blackwell Science，Malden，MA，USA，1999)?？梢愿鶕?jù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的效力、靶選擇性、令人滿意的預(yù)測ADMET(吸收、分布、代謝、分泌和毒性)特性(van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2192-204，2003)和化學(xué)易處理性，將所有活性化合物的數(shù)據(jù)分級。然后，可以得到頂級化合物的所有可獲得的相近結(jié)構(gòu)類似物，并測試它們在結(jié)合和殺傷實(shí)驗(yàn)中的抑制活性從而確定各結(jié)構(gòu)系列的初步結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。
關(guān)于先導(dǎo)化合物的生物活性的實(shí)驗(yàn)，若尋找到了有前景的先導(dǎo)物，則可以評估它們對培養(yǎng)物中的細(xì)胞活力的活性?？梢栽谝话迮囵B(yǎng)的腫瘤發(fā)生和非腫瘤發(fā)生細(xì)胞系，以及原發(fā)級小鼠和人細(xì)胞群體，例如淋巴細(xì)胞，上測試多達(dá)50種根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化的先導(dǎo)化合物。與1nM-100μM的化合物孵育3～7天可以監(jiān)控細(xì)胞活力。當(dāng)然最大的注意力將放在比它們的正常細(xì)胞對應(yīng)物更為有效地殺死腫瘤細(xì)胞的化合物上?？梢栽u估在＜10μM水平上殺死的化合物對其靶物的特異性以及作用方式。驗(yàn)證它們的作用模式是重要的，因?yàn)闇y試化合物也可能間接地殺死細(xì)胞。例如，如果先導(dǎo)化合物以高度的選擇性與Bcl-2結(jié)合，它不應(yīng)當(dāng)殺死缺乏Bcl-2的細(xì)胞。因此，可以通過比較化合物在野生型細(xì)胞和缺少Bcl-2的細(xì)胞中的活性來驗(yàn)證作用特異性。
可以對最有前景的候選物徹底分析其在小鼠模型中的抗腫瘤效力。在兩種已經(jīng)被充分描述過的模型中，用源自myc轉(zhuǎn)基因小鼠(Adams等人，Nature 318533-538，1985)或myc/bcl-2雙重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Strasser等人，出處同前)的B淋巴細(xì)胞瘤注射過的免疫競爭小鼠，均快速、可重復(fù)地死于白血病/淋巴瘤綜合征。盡管兩種腫瘤都對標(biāo)準(zhǔn)化療(環(huán)磷酰胺)有反應(yīng)，用myc/bcl-2腫瘤細(xì)胞注射的小鼠總是會(huì)復(fù)發(fā)。這兩種移植的腫瘤使得能夠在治療這些非常模擬人淋巴瘤的惡性增生過程中，單獨(dú)或與環(huán)磷酰胺結(jié)合，測試任何化合物。
關(guān)于先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)及其優(yōu)化，從初篩中選擇出的先導(dǎo)物進(jìn)行相當(dāng)多的修飾以增強(qiáng)它們的生物化學(xué)、生物學(xué)和藥學(xué)特性(Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2369-378，2003)。為輔助這些化合物的優(yōu)化，可以在生物化學(xué)或結(jié)構(gòu)研究中驗(yàn)證它們的作用模式。此外，可以通過NMR分光術(shù)分析試劑與促生存分子間形成的復(fù)合物。因?yàn)镹MR能夠探測低親和力的配體，并揭示它們結(jié)合在靶蛋白質(zhì)上的什么地方，它能夠極大地輔助對結(jié)合的優(yōu)化并加速藥物探索過程(Hajduk等人，J Med Chem 422315-2317，1999；Pellecchia等人，Nat Rev Drug Discov 1211-219，2002)。利用比如化學(xué)位移作圖這樣的技術(shù)可以監(jiān)控測試化合物與Bcl-2蛋白質(zhì)的結(jié)合，并且可以選擇那些模擬BH3結(jié)構(gòu)域的測試化合物進(jìn)行優(yōu)化。
在一種相關(guān)方法中，可以建立先導(dǎo)試劑的分子模型以利用改編的DOCK程序評估它們在芯片上的結(jié)合(Kuntz，Science 2571078-1082，1992)。將先導(dǎo)化合物的模型建立到靶Bcl-2溝上，并用計(jì)分函數(shù)預(yù)測最可能的結(jié)合模式。這將指導(dǎo)對能夠提供附加的相互作用從而增強(qiáng)結(jié)合的衍生物的設(shè)計(jì)。源自NMR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可獲得性也使得為預(yù)測改良配體而錨定配體和靶物靈活性成為可能(Lugovskoy等人，J AmChem Soc 1241234-1240，2002)。
該信息以及那些來自生物實(shí)驗(yàn)的信息可用于合成用于進(jìn)一步測試的衍生化合物。對于各類先導(dǎo)化合物，合成衍生物的策略。例如，典型的成功化合物由兩個(gè)或單個(gè)連接環(huán)系統(tǒng)組成，各系統(tǒng)各自可用大量官能團(tuán)取代。通過系統(tǒng)地取代各官能團(tuán)，可以制備和測試具有廣泛化學(xué)特性的化合物。
本發(fā)明還提供用于預(yù)測分子構(gòu)象從而產(chǎn)生和/或選擇和/或篩選候選試劑的的計(jì)算方法，所述分子模擬限制型BH3-only蛋白質(zhì)支架，所述候選試劑隨后被制備并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室評估其誘導(dǎo)凋亡的能力。
本發(fā)明由此提供一種根據(jù)帶有賦予其限制型表型的殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)促生存Bcl-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的計(jì)算方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質(zhì)；對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對，和將這些蛋白質(zhì)與限制型BH3-only蛋白質(zhì)作比較；根據(jù)所述比對得到各氨基酸在一或多個(gè)帶來與Bcl-2蛋白質(zhì)結(jié)合的混雜特性或限制特性的位置上的出現(xiàn)頻率；利用所述頻率產(chǎn)生一個(gè)選自電荷、大小、構(gòu)象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)的計(jì)分函數(shù)；用所述計(jì)分函數(shù)和至少一種另外的計(jì)分函數(shù)來產(chǎn)生一套優(yōu)化蛋白質(zhì)序列或其構(gòu)象等價(jià)物，產(chǎn)生或選擇出一種具有與Bcl-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合表型的化合物或蛋白質(zhì)。
對限制型BH3-only蛋白質(zhì)拮抗Bcl-2蛋白質(zhì)和誘導(dǎo)凋亡的能力作評估對于選擇適宜的治療方案是重要的。這種的一種評估可以適當(dāng)?shù)亟柚浖幊痰挠?jì)算機(jī)來簡化，所述軟件尤其增加了一個(gè)關(guān)于至少一種與限制型BH3-only蛋白質(zhì)有關(guān)的特征之計(jì)分函數(shù)(SF)，從而提供對應(yīng)于所誘導(dǎo)的Bcl-2拮抗程度的效力值(PA)。SF尤其選自(a)酸性殘基的數(shù)量和位置；或(b)堿性殘基的數(shù)量和位置；或(c)極性殘基的數(shù)量和位置；或(d)非極性殘基的數(shù)量和位置；或(e)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；或(f)不帶電荷的殘基的數(shù)量和位置；或(g)親水殘基的數(shù)量和位置；或(h)疏水殘基的數(shù)量和位置；或(i)殘基的水平；或(j)殘基的溶解度水平；或(k)殘基的大小；或(l)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。因此，根據(jù)本發(fā)明，這樣的特征的SF存儲(chǔ)于一中機(jī)器可讀存儲(chǔ)介質(zhì)中，該介質(zhì)能夠處理數(shù)據(jù)從而提供特定限制型BH3-only蛋白質(zhì)或化學(xué)等價(jià)物的PA。
因此，另一方面，本發(fā)明構(gòu)思了一種用于確定在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的試劑的結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括(1)被接收為輸入計(jì)分函數(shù)(SF)的至少兩種與所述BH3-only或Bcl-2蛋白質(zhì)相關(guān)的特征的代碼，其中所述特征尤其選自(a)酸性殘基的數(shù)量和位置；(b)堿性殘基的數(shù)量和位置；(c)極性殘基的數(shù)量和位置；(d)非極性殘基的數(shù)量和位置；(e)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(f)不帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(g)親水殘基的數(shù)量和位置；(h)疏水殘基的數(shù)量和位置；(i)殘基的水平；(j)殘基溶解度水平；(k)殘基的大??；(l)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)(2)為提供一個(gè)對應(yīng)于BH3-only蛋白質(zhì)的PV的總數(shù)而疊加所述SF的代碼；和(3)儲(chǔ)存所述代碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明延展至一種用于評估BH3-only蛋白質(zhì)或化學(xué)等價(jià)物在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的可能用途的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)包括(1)機(jī)器可讀數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)，該介質(zhì)包括編碼有機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)材料，其中所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)包含至少兩種與所述BH3-only或Bcl-2蛋白質(zhì)相關(guān)的特征IV，其中所述特征尤其選自(a)酸性殘基的數(shù)量和位置；
(b)堿性殘基的數(shù)量和位置；(c)極性殘基的數(shù)量和位置；(d)非極性殘基的數(shù)量和位置；(e)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(f)不帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(g)親水殘基的數(shù)量和位置；(h)疏水殘基的數(shù)量和位置；(i)殘基的水平；(j)殘基溶解度水平；(k)殘基的大??；(l)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)(2)用于存儲(chǔ)處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的指令的工作存儲(chǔ)器；(3)與所述工作存儲(chǔ)器以及所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)相耦連的中央處理單元，用于處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)以提供對應(yīng)于所述化合物PV的所述SF的總和；和(4)與所述中央處理單元相耦連的輸出硬件，用于接收所述PV。
本發(fā)明構(gòu)思了任何一般或特定用途的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括與存儲(chǔ)器和至少一個(gè)輸入\輸出設(shè)備，比如終端，電子聯(lián)通的處理器。這樣的系統(tǒng)可以包括，但不限于，個(gè)人計(jì)算機(jī)、工作站或大型機(jī)。處理器可以是執(zhí)行位于RAM存儲(chǔ)器中的程序的一般目的的處理器或者微處理器或者特定處理器。程序可位于比如硬盤或預(yù)程序化的ROM存儲(chǔ)器這樣的存儲(chǔ)裝置的RAM中。在一種實(shí)施方案中，RAM存儲(chǔ)器同時(shí)用作數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和程序執(zhí)行。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)也包括處理器和存儲(chǔ)器位于不同的物理實(shí)體中但通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行電子聯(lián)通的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明鑒定的試劑可用于治療癌癥。
本文中的“治療”的含義是指減輕已有狀態(tài)的嚴(yán)重程度。術(shù)語“治療”也包括為預(yù)防某種狀況發(fā)作的“預(yù)防性治療”。術(shù)語“治療”不必意味著接復(fù)試者被治療至完全康復(fù)。類似地，“預(yù)防性治療”不必意味著復(fù)試者最終不會(huì)發(fā)生某種狀況。
本文中所使用的復(fù)試者指，人和非人靈長類(例如大猩猩、短尾猿、狨猴)、家畜動(dòng)物(例如綿羊、奶牛、馬、驢、豬)、伴侶動(dòng)物(例如狗、貓)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠)、被俘野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)、爬行動(dòng)物或兩棲動(dòng)物(例如cane蟾蜍)、魚(例如斑馬魚)和任何其它能夠受益于本發(fā)明試劑的生物(例如c.elegans)。對于能夠受益于目前描述的試劑的動(dòng)物類型沒有限制。最優(yōu)選的本發(fā)明的復(fù)試者是人。受試者，無論其是人或非人生物，可以指患者、個(gè)體、動(dòng)物、宿主或受體。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面提供一種預(yù)防或減輕受試者的癌癥的方法，所述方法包括在足以預(yù)防或減輕癌癥的狀況下向所述受試者施用有效量的Bcl-2蛋白質(zhì)拮抗劑一定時(shí)間。
對能夠拮抗Bcl-2并誘導(dǎo)凋亡的試劑的鑒定提供了用于治療性治療癌癥的藥物組合物。
本發(fā)明的試劑可以與一種或多種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑結(jié)合形成一種藥物組合物。藥學(xué)可接受載體可包括一種其作用為穩(wěn)定、或增強(qiáng)或降低本發(fā)明的藥物組合物的吸收或廓清速率的生理可接受的化合物。生理接受的化合物可包括，例如，比如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷這樣的碳水化合物，比如抗壞血酸、谷胱甘肽這樣的抗氧化劑，鰲合劑，低分子量蛋白質(zhì)，減少肽或多肽的廓清或水解的組合物，賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖液。也可以用去污劑來穩(wěn)定或提高或降低藥物組合物的吸收，包括脂質(zhì)體載體。肽或多肽的藥學(xué)可接受載體或劑型是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并詳細(xì)描述于科技和專利文獻(xiàn)中，參見例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，MackPublishing Company，Easton，PA，1990(“Remington′s”)。
其它的生理學(xué)可接受化合物包括濕潤劑、乳化劑、分散劑或?qū)τ陬A(yù)防微生物生長和起作用尤其有用的防腐劑。各種防腐劑是本領(lǐng)域熟知的，包括例如苯酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對藥學(xué)可接受載體包括藥學(xué)可接受化合物的選擇依賴于，例如，本發(fā)明的調(diào)節(jié)試劑的常規(guī)給藥途徑及其獨(dú)特的生理-化學(xué)特征。
藥物組合物形式的試劑的施用，可以通過本領(lǐng)域已知的任何便利的方法來完成。給藥途徑包括但不限于呼吸道、氣管內(nèi)、鼻咽、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、小腦內(nèi)、鼻內(nèi)、灌注、口服、直腸、貼片和植入給藥。
對于口服給藥，可將化合物配制成固態(tài)或液態(tài)制劑，比如膠囊、藥丸、片劑、錠劑、粉末、懸浮液或乳劑。在制備口服劑量形式的組合物時(shí)，可以使用任何有用的藥學(xué)介質(zhì)，比如，對于液態(tài)口服制劑(比如懸浮液、酏劑或溶液)使用水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、色素、懸浮劑等；或者對于固態(tài)口服制劑(比如粉末、膠囊和片劑)使用比如淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤滑劑、粘合劑、裂解劑等這樣的載體。由于片劑和膠囊易于施用，因此它們代表最有力的口服劑量單位形式，此時(shí)顯然采用了固體藥學(xué)可接受載體。如果需要的話，片劑可以是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)糖包衣的或腸包衣的?？梢詫⒒钚栽噭┠z囊化從而使它穩(wěn)定地穿過胃腸道而同時(shí)也允許穿過血腦屏障，參見，例如國際專利公布號WO 96/11698。
若口服給藥，可以將本發(fā)明的試劑保護(hù)起來以防止其被消化。這可以通過將核酸、肽或多肽與一種組合物混合從而使其能夠抗酸和酶解或者將核酸、肽或多肽包裝在比如脂質(zhì)體這樣的適宜抗性載體中來實(shí)現(xiàn)。保護(hù)化合物使其免遭消化的方法是本領(lǐng)域熟知的，參見，例如Fix，Pharm Res 131760-1764，1996；Samanen等人，J PharmPharmacol 48119-135，1996；美國專利號5 391 377，其中描述了用于口服運(yùn)送治療劑的脂質(zhì)組合物(下文中詳細(xì)描述了脂質(zhì)體運(yùn)送)。
適于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(若為水可溶的)或分散劑和用于與無菌注射液或分散劑臨時(shí)配制的無菌粉末或者可以是乳膏或其它適于局部使用的形式。它必須在制備和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的，且必須能夠抵御比如細(xì)節(jié)和真菌這樣的微生物的污染作用進(jìn)行保存。載體可以是含有，例如水、乙二醇、多元醇(例如丙三醇、丙烯乙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、或其適宜的混合物、以及植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？梢酝ㄟ^，例如，使用比如卵磷脂這樣的包衣，對于分散劑維持所需顆粒的大小，以及使用超微油膏來保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^各種抗細(xì)菌抗真菌劑，比如氯丁醇、對羥苯甲酸酯、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，來預(yù)防微生物的作用。在許多情況中，其優(yōu)選包括等滲劑，例如，蔗糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和凝膠，來延長對可注射組合物的吸收。
將所需量的試劑和各種其它以上列舉的成分摻入到適宜的溶劑中，如果需要的話，之后再進(jìn)行無菌過濾，可以制備出無菌注射溶液。通常，分散劑是通過將各種無菌活性成分摻入到包含基本分散介質(zhì)和所需的以上列舉的其它成分的無菌載體中來制備的。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術(shù)，通過這種方法可以從其無菌過濾溶液得到活性成分與任何其它所需成分的粉末。
對于非胃腸道給藥，可將試劑溶解于藥學(xué)載體中，并以溶液或懸液的形式給藥。適宜載體的例子是水、鹽、葡萄糖液、果糖溶液、乙二醇或動(dòng)物油、植物油或合成油。載體可以包含其它成分，比如防腐劑、懸浮劑、溶解劑、緩沖液等。若要經(jīng)鞘施用試劑，還可以將它們?nèi)芙庠谀X脊液中。
對于經(jīng)黏膜或經(jīng)皮給藥，可以用適于載體滲透的滲透劑來運(yùn)送試劑。這樣的滲透劑是本領(lǐng)域已知的，例如用于經(jīng)黏膜給藥的膽汁鹽和褐霉酸衍生物。此外，滲透劑可用于促進(jìn)滲透。經(jīng)黏膜給藥方式可以通過鼻噴霧或使用栓劑例如Sayani和Chien，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 1385-184，1996。對于局部、經(jīng)皮給藥，可以將試劑配制成藥膏、乳膏、油膏、粉末和凝膠。經(jīng)皮運(yùn)送系統(tǒng)還可以包括貼片。
對于吸入，本發(fā)明的試劑可以用本領(lǐng)域已知的任何系統(tǒng)來運(yùn)送，包括干粉氣霧劑、液體運(yùn)送系統(tǒng)、空氣噴射噴霧劑、推進(jìn)系統(tǒng)等，參見例如Patton，Nat Bioteeh 16141-143，1998；用于多肽分子的產(chǎn)品和吸入系統(tǒng)，例如Dura Pharmaceuticals(San Diego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、InhaleTherapeutic Systems(San Carlos，CA)等。例如，藥物劑型可以以氣體或薄霧形式施用。對于氣體給藥，劑型可以與表明活性劑極細(xì)的形式提供，并配以推進(jìn)器。另一方面，用于將制劑運(yùn)送至呼吸組織的裝置是一種制劑在其中蒸發(fā)的吸入器。其它的液體運(yùn)送系統(tǒng)包括，例如，極度分散的形式空氣噴射噴霧劑。
本發(fā)明的試劑可以以持續(xù)運(yùn)送或持續(xù)釋放機(jī)制施用，其能夠在體內(nèi)運(yùn)送制劑。例如，本發(fā)明的劑型中可包括可生物降解的微球體或膠囊或其它能夠持續(xù)運(yùn)送多肽的可生物降解的聚合物結(jié)構(gòu)(例如Putney和Burke，Nat Biotech 16153-157，1998)。
在制備本發(fā)明的藥物時(shí)，可以作各種劑型變化并對劑型進(jìn)行操作從而改變藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多改變藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物分布的方法。這樣的方法的例子包括在由比如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(例如，脂質(zhì)體，參見下述)、碳水化合物、或合成聚合物(上述)這樣的載體中保護(hù)本發(fā)明的組合物。對藥物代謝動(dòng)力學(xué)的討論參見例如Remington′s。
在一個(gè)方面，將含有本發(fā)明試劑的藥物劑型摻入單層脂質(zhì)或比如脂質(zhì)體這樣的雙層脂質(zhì)中，參見例如美國專利號6 110 490、6096 716、5 283 185和5 279 833。本發(fā)明還提供這樣的劑型，該劑型中本發(fā)明的水可溶性調(diào)節(jié)試劑已經(jīng)被附著到單層或雙層表面。例如，可以將肽附著到含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰)乙醇胺的脂質(zhì)體中(例如Zalipsky等人，Biocojug Chem 6705-708，1995)?？梢允┯弥|(zhì)體或任何形式的脂質(zhì)膜，比如平面脂質(zhì)膜或完整細(xì)胞的細(xì)胞膜，例如血紅細(xì)胞。脂質(zhì)體劑型可以通過任何途徑給藥，包括靜脈內(nèi)、經(jīng)皮(Vutla等人，J Pharm Sci 855-8，1996)、經(jīng)黏膜或口服。本發(fā)明還提供這樣的藥物制劑，其中將本發(fā)明的核酸、肽和/或多肽整合進(jìn)了微囊和/或脂質(zhì)體(Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 4623-28，1994；Woodle等人，Pharm Res 9260-265，1992)。脂質(zhì)體和脂質(zhì)體劑型可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備，參見例如Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1197-210，1995；Alving等人，Immunol Rev 1455-31，1995；Szoka和Papahadjopoulos，AnnRev Biophys Bioeng 9467-508，1980，美國專利號4 235 871、4 501728和4 837 028。
根據(jù)施用方法，可以以各種單位劑量形式施用本發(fā)明的藥物組合物。藥物組合物的典型劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常這樣的劑量依性質(zhì)而定并根據(jù)特定的治療狀況、患者的耐受能力等進(jìn)行調(diào)整。適于實(shí)現(xiàn)這一目的的試劑量定義為“有效量”。為此目的的劑量進(jìn)度和有效率，也即“劑量方案”依賴于各種因素，包括疾病的階段或狀況、疾病或狀況的嚴(yán)重程度、患者的整體健康狀態(tài)、患者的物理狀態(tài)、年齡、藥物劑型、活性試劑濃度等。在計(jì)算患者的給藥方案時(shí)，還應(yīng)當(dāng)考慮給藥模式。劑量方案還必須考慮藥物代謝動(dòng)力學(xué)，也即藥物組合物的吸收、生物可接近性、代謝、清除等的速率。參見，例如Remington′s；Egleton和Davis，Peptides 18143-1439，1997；Langer，Science 2491527-1533，1990。
根據(jù)這些方法，根據(jù)本發(fā)明定義的試劑和/或藥物組合物可以與一種或多種其它試劑同時(shí)施用。本文中的“共同施用”的含義指，以相同的劑型或兩種不同的劑型經(jīng)相同或不同的途徑或給藥順序通過相同或不同的途徑同時(shí)施用。本文中的“順序”給藥的含義是指，兩種類型的試劑和/或藥物組合物在給藥時(shí)間上的秒、分、小時(shí)或天差異。試劑和/或藥物組合物的共同施用可以以任意順序進(jìn)行。
或者，通過使用比如抗體或細(xì)胞特異性配體或特異性核酸分子這樣的靶向系統(tǒng)可以用靶向療法更特異地將活性試劑運(yùn)送至特定類型的細(xì)胞。由于許多原因，靶向都是人們所希望的，例如如果試劑具有不能接受的毒性或者它另外需要太高的劑量或者如果它不能進(jìn)入靶細(xì)胞。
不直接施用試劑的話，也可以在靶細(xì)胞中產(chǎn)生這些試劑，例如在比如上述的病毒載體中，或者在比如面美國專利號5 550 050和國際專利公布號WO 92/19195、WO 94/25503、WO 95/01203、WO 95/05452、WO 96/02286、WO 96/02646、WO 96/40871、WO 96/40959和WO 97/12635中所描述的基于細(xì)胞的運(yùn)送系統(tǒng)中?？梢允馆d體靶向靶細(xì)胞。將基于細(xì)胞的運(yùn)送系統(tǒng)設(shè)計(jì)成被植入患者體內(nèi)的目的靶位且其中包含靶試劑的編碼序列?；蛘?，試劑也可以以前體的形式施用，該前體被在所靶向或治療的細(xì)胞中產(chǎn)生的激活劑轉(zhuǎn)化為活性形式。參見，例如，歐洲專利公布號0 425 731A和國際專利公布號WO 90/07936。
又一方面，本發(fā)明提供含有組合物，例如本發(fā)明試劑，的試劑盒。該試劑盒還包含教導(dǎo)如本文中描述的方法和本發(fā)明用途的說明材料。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文所描述的發(fā)明除了以上特別描述的之外易于進(jìn)行變化或修改。應(yīng)理解，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修改。本發(fā)明還包括本說明書中單獨(dú)或總體提及或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任意兩種或多種所述步驟或特征的任何和全部組合。
通過以下非限制性實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)方法以下實(shí)驗(yàn)方法用于下述實(shí)施例中。
表達(dá)構(gòu)建體將人Bcl-2(登錄號登錄號NP_000624；殘基1-217)和人Bcl-w(登錄號NP_004041；殘基1-164；C29S A128E)克隆進(jìn)pQE-9(Qiagen)；所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有附加的N-末端殘基(MRGSHHHHHHGS，SEQ ID NO1)。將人Bcl-xL(登錄號NP_612815；殘基1-209)、小鼠Mcl-1(登錄號NP_031588；殘基152-308)和小鼠A1(登錄號NP_033872；殘基1-152)克隆進(jìn)pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)，在經(jīng)過PreScission蛋白酶消化的蛋白質(zhì)中僅有五個(gè)附加的從載體衍生而來的殘基(GPLGS)(參見下述)。人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1的FLAG(DYKDDDDK，SEQ ID NO2)-標(biāo)記的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體描述于Huang等人，EMBO J 164628-4638，1997。將N-末端HA(YPYDVPDYA，SEQ ID NO3)-標(biāo)記的全長人BimEL、人BimL、人Puma、小鼠Bad、人Bik和小鼠Noxa亞克隆進(jìn)pEF PGKhygro(Huang等人，出處同前；O′Conner等人，EMBO J 17384-395，1998)。用校正閱讀Pfu聚合酶(Stratagene)進(jìn)行PCR，并通過自動(dòng)測序驗(yàn)證構(gòu)建體。關(guān)于所使用的寡核苷酸和構(gòu)建體的細(xì)節(jié)可以從發(fā)明人處獲知。
pQE-9(Qiagen)中的構(gòu)建體包括人(h)Bcl-2(登錄號NP_000624；殘基1-217)和帶有C29S和A128E突變以提高其穩(wěn)定性(Hinds等人，2003)的hBcl-w(NP_612815；殘基1-209)。六組氨酸標(biāo)簽(HHHHHH)使其能夠在鎳柱上純化。重組hBcl-xLΔC24、小鼠(m)Mcl-1ΔN151ΔC23和mA1ΔC20表達(dá)為GST融合蛋白，并根據(jù)(Day等人，1999；Hinds等人，2003)的描述用PreScission蛋白酶谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠柱上切割下來及純化。所使用的pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)中的構(gòu)建體，包括來自Bcl-xL(NP_612815；殘基1-209)、Mcl-1(NP_031588；殘基152-308)、和A1(NP_033872；殘基1-152)的序列。蛋白酶切割后，它們保留了五個(gè)N-末端由載體衍生的殘基(GPLGS)。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽(附圖2A)由Mimotopes(Victoria，澳大利亞)合成。所有肽都經(jīng)反相HPLC純化，且除hBik(87％)、mBmf(85％)和mNoxa B(78％)之外，純度均大于90％。通過電霧化質(zhì)譜法鑒定了它們的同一性。將這些根據(jù)其重量和在分析HPLC柱上214nM處的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的儲(chǔ)存液；將hBimBH3溶解于DMSO中。這些肽所依據(jù)的登錄號是mBimL(AAC40030)、hBimL(AAC39594)、hPuma(AAK39542)、mBmf(AAK38747)、hBad(NP_004313)、hBik(NP_001188)、hHrk(NP_003797)、hBid(NP_001187)、hNoxa(NP_066950)、mNoxa(NP_067426)。
重組蛋白質(zhì)和肽根據(jù)Wilson-Annan等人，J cell Biol 162877-888，2003描述的方法制備表達(dá)為N-末端六組氨酸融合蛋白的重組人Bcl-2ΔC22和人Bcl-wΔC29(包含C29S和A128E突變以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性但不影響其結(jié)合特性)。根據(jù)(Day等人，Cell Death Differ 61125-1132，1999；Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003)的描述將重組人Bcl-xLΔC24、小鼠Mcl-1ΔN151ΔC23和小鼠A1ΔC20表達(dá)為GST融合蛋白，并從谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱上切下。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽由Mimotopes合成。所有肽都經(jīng)反相HPLC純化，且除Bik(87％)、mBmf(85％)和mNoxa2(78％)之外，純度均大于90％。通過電霧化質(zhì)譜分析鑒定了它們的同一性。將這些根據(jù)其重量和在分析HPLC柱上214nM處的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的儲(chǔ)存液。這些肽的登錄號是小鼠BimL(AAC40030)、人BimL(AAC39594)、人Puma(AAK39542)、小鼠Bmf(AAK38747)、人Bad(NP_004313)、人Bik(NP_001188)、人Hrk(NP_003797)、人Bid(NP_001187)、人Noxa(NP_066950)和小鼠Noxa(NP_067426)。
圓二色(CD)譜學(xué)為進(jìn)行圓二色(CD)測定，將肽貯存液和馬心臟肌球蛋白在添加了30％(v/v)(2，2，2-三氟乙醇)(TFE)的30mM磷酸鈉(pH 7)或20mM磷酸鈉(pH 7)稀釋至終濃度為0.15mg/ml。室溫下用0.1cm的小試管在AVIV 62DS型分光偏振計(jì)記錄CD譜。記錄了兩次連續(xù)掃描，且扣除了緩沖液單獨(dú)的背景譜。
親和測定和溶液競爭性檢測法室溫下在Biacore 3000生物傳感器(Biacore)上以HBS(10mMHEPES pH 7.2，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20為流動(dòng)緩沖液完成親和測定。采用胺-耦聯(lián)化學(xué)法(Wilson-Annan等人，出處同前)將小鼠26-merwtBimBH3、4EBimBH3突變體、BadBH3、NoxaBH3或無關(guān)肽對照固定到CM5傳感器芯片上。為評定促生存類Bcl-2蛋白質(zhì)對BimBH3的直接親和力，直接將該蛋白質(zhì)以20μl/min注射到傳感器芯片中。用50mM NaOH或6M GuHCl(pH 7.2)將剩余的殘留結(jié)合蛋白釋放出來，之后用流動(dòng)緩沖液洗滌兩次?？鄢€反應(yīng)后，用BIA評估軟件(第三版，Biacore)(Wilson-Annan等人，出處同前)從傳感圖得到結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
通過比較它們與固定化的wtBimBH3肽競爭結(jié)合類Bcl-2蛋白質(zhì)的能力來評估BH3肽對促生存Bcl-2蛋白質(zhì)的相對親和力(Wilson-Annan等人，出處同前)。將固定亞飽和量(10nM)的促生存Bcl-2蛋白質(zhì)與不同量的競爭劑BH3肽在HBS中冰浴超過2小時(shí)。之后將該混合物注射到一片傳感器表面，該傳感器包含一個(gè)固定有小鼠wtBimBH3的通道和一個(gè)固定有小鼠4EBimBH3的對照通道。扣除基線反應(yīng)(對照通道)后得到絕對結(jié)合反應(yīng)。以對促生存蛋白的反應(yīng)作為最大反應(yīng)(100％)，之后在給定注射時(shí)間(430s)內(nèi)提高競爭肽含量的情況下計(jì)算相對殘余結(jié)合(％)。以初始肽濃度對相對殘余反應(yīng)(f)作圖，并將其代入方程f＝100/(1+(c/IC50)m)，其中c＝競爭肽的濃度，m＝曲率常數(shù)，以及IC50＝將結(jié)合降低50％所需的競爭肽濃度。理論上，IC50＝[A]/2+KD，其中[A]是分析物濃度。
所研究的一些重組蛋白質(zhì)(Bcl-2、Bcl-xL、A1)包含半胱氨酸殘基，但Bcl-2或Bcl-xL的表現(xiàn)卻不受二硫蘇糖醇(DTT)的影響。A1的孵育混合物中包括2.5mM Tris-(羧乙基)膦氯化氫(TCEP)，A1包含兩個(gè)半胱氨酸且似乎比所研究的其它蛋白質(zhì)都更加不穩(wěn)定。
瞬間轉(zhuǎn)染、免疫沉淀和免疫印跡人胚腎(HEK)293T細(xì)胞的維持、轉(zhuǎn)染和用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(NEN)對人胚腎(HEK)293T細(xì)胞的代謝標(biāo)記以及共免疫沉淀已得到描述(Huang等人，出處同前；Moriishi等人，Proc Natl Acad SciUSA 969683-9688，1999；O′Conner等人，出處同前)。簡言之，用HA(HA.11；CRP)、FLAG(M2；Sigma)和對照Glu-Glu(CRP)標(biāo)簽的小鼠單克隆抗體對等量的TCA-可沉淀裂解物進(jìn)行免疫沉淀。用SDSPAGE裂解蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用熒光照相術(shù)(Amplify；Amersham Biosciences)檢測。免疫印跡用HA(3F10；Roche)、FLAG(9H1；(Wilson-Annan等人，出處同前)的大鼠單克隆抗體或小鼠單克隆抗-14-3-3β(H-8；Santa Cruz)完成，用HRP-耦聯(lián)的抗大鼠(Southern Biotechnology)或抗小鼠(Silenus)抗體檢測。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光來顯露這些蛋白質(zhì)(ECL；AmershamBiosciences)。
實(shí)施例2BimBH3緊密結(jié)合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1產(chǎn)生體外比較結(jié)合研究所需的可溶、單體、等量重組促生存蛋白質(zhì)需要除去它們的疏水C-末端結(jié)構(gòu)域(例如Hinds等人，出處同前)和Mcl-1的N-末端PEST區(qū)(Kozopas等人，Proc Natl Acad Sci 903516-3520，1993)。同樣，由于無法可靠地產(chǎn)生全長BH3-only蛋白質(zhì)，因此我們使用了長肽(24-26殘基；表3)，因?yàn)檩^短的肽具有減弱的螺旋傾向這會(huì)使結(jié)合減弱(Petros等人，2000，出處同前)。由于跨小鼠BimBH3結(jié)構(gòu)域(BimBH3)的26-mer肽與較長的Bim多肽同樣易于結(jié)合Bcl-w(Wilson-Annan等人，出處同前)，因此我們用它來測定Bim對其他哺乳動(dòng)物促生存分子的親和力。例如Mcl-1，它流經(jīng)固定化的野生型BimBH3肽而非突變BimBH3肽(不結(jié)合)時(shí)表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合反應(yīng)(圖1A)。確實(shí)，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1均顯示與wtBimBH3的強(qiáng)1∶1化學(xué)計(jì)量式結(jié)合(圖1B)，0.2～4.5nM的解離平衡常數(shù)(KD)(表2)。因此，Bim類似地靶向全部五種哺乳動(dòng)物促生存蛋白質(zhì)。
表2BIM對促生存蛋白質(zhì)的比較結(jié)合
如Hinds等人，出處同前；Wilson-Annan等人，出處同前所述，利用生物傳感器實(shí)驗(yàn)在傳感器芯片上測定了促生存分子對wtBimBH3的結(jié)合常數(shù)。
實(shí)施例3特定的BH3結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合促互存靶為評估其它的BH3肽是否類似地結(jié)合促生存蛋白質(zhì)，我們用競爭結(jié)合檢測法直接比較了它們在溶液中的結(jié)合親和力。在這樣的檢測法中，靶蛋白的質(zhì)量和絕對量不如在直接結(jié)合中那么重要，且溶液結(jié)合排除了一些固定化肽所遭遇的空間障礙。圖1C顯示這一過程Bcl-xL在溶液中和逐漸增加量的BikBH3預(yù)培養(yǎng)減弱了其與wtBimBH3的結(jié)合(圖1D)。從結(jié)合的衰減可以計(jì)算出BikBH3的IC50(半數(shù)結(jié)合時(shí)的競爭肽濃度)(圖1E)。由于IC50值反映相對結(jié)合親和力(參見實(shí)驗(yàn)方法)，我們用該檢測法來比較八種BH3肽(表3)與五種促生存蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。
令人吃驚的是，BH3肽對不同的促生存蛋白質(zhì)的相對親和力相差10,000倍(圖2A和表2)。它們的結(jié)合特性分作幾類(圖2B和圖4)。只有BimBH3和PumaBH3對所有的促生存蛋白質(zhì)具有相當(dāng)?shù)挠H和力。其它的BH3肽對其特定的亞組具有驚人的選擇性。例如，相比A1(～15μM)或Mcl-1(＞100μM)，BadBH3強(qiáng)烈偏好Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w(5.3～30nM)(圖2A和B)，BmfBH3也表現(xiàn)出類似的偏好。與此截然相反，NoxaBH3對Mcl-1和A1(nM范圍)具有高度的選擇性，但是與其它的促生存蛋白質(zhì)卻不發(fā)生可檢測的結(jié)合(＞100μM)。最后，目比Bcl-2或Mcl-1，BikBH3、HrkBH3和BidBH3更偏好Bcl-xL、Bcl-w和A1。與主流觀點(diǎn)相反，促生存蛋白質(zhì)還具有獨(dú)特的BH3結(jié)合模式Bcl-xL與Bcl-w表現(xiàn)類似，Bcl-2較為獨(dú)特，而Mcl-1和A1構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組(附圖2B)。
表3BH3肽
固定化的肽(頂部2行)源自小鼠(m)BimL。4EBimBH3有四個(gè)對于與促生存蛋白質(zhì)(參見文本)相互作用非常關(guān)鍵的疏水殘基(H1～H4)突變?yōu)楣劝彼?E)。除注明“m”(小鼠)之外，競爭肽均源自人蛋白質(zhì)。按照Huang和Strasser，出處同前所述用GCG“PILEUP”程序進(jìn)行序列比對。
由于全部的BH3肽都易于結(jié)合至少兩種促生存蛋白質(zhì)(附圖2)，因此它們的完整性和構(gòu)象不太可能影響我們的結(jié)果。盡管如此，由于較短的BadBH3肽與Bcl-xL的結(jié)合依賴于它們的螺旋性(Petros等人，2000，出處同前)，我們評估了CD(圓二色)譜學(xué)中所使用的肽的構(gòu)象。在水性環(huán)境下，所有的肽似乎大部分都無結(jié)構(gòu)(圖5A)。然而，在加入30％TFE(2，2，2-三氟乙醇)后，一種穩(wěn)定α-螺旋形成的溶劑(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989)，它們很容易α-螺旋化(補(bǔ)充圖S2B)，這表明它們的螺旋化潛力。我們觀察到，它們在TFE中的螺旋化傾向與結(jié)合親和力無相關(guān)性。
對Bad和Noxa觀察到的與眾不同的互補(bǔ)結(jié)合模式尤其驚人(圖2)。Noxa的結(jié)果與另一溶液競爭檢測中的一致(Letai等人，出處同前)，但是有報(bào)道稱Noxa在免疫沉淀檢測法中與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合(Oda等人，Science 2881053-1058，2000)。為解釋這一矛盾，我們還做了與固定化BadBH3或NoxaBH3肽的直接結(jié)合試驗(yàn)。與溶液競爭結(jié)果一致，只有Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w與BadBH3結(jié)合(圖6A)，且只有Mcl-1和A1與NoxaBH3結(jié)合(圖6B)。與人Noxa不同，小鼠Noxa包含兩個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域(Oda等人，出處同前)，但兩個(gè)小鼠NoxaBH3肽(表2)都結(jié)合Mcl-1(IC5087和109nM)，而不結(jié)合Bcl-2、Bcl-xL或Bcl-w。因此，推測Noxa特異性拮抗Mcl-1和A1。
實(shí)施例4Bad、Bik和Noxa在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有選擇性生理靶在不同的試驗(yàn)中對選擇性相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。用可以制備的重組BH3-only蛋白質(zhì)完成(Bim、Bmf、Bad和Bid)的GST下調(diào)(pull-down)實(shí)驗(yàn)，給出的結(jié)果與溶液競爭試驗(yàn)一致。最確切的是，GST Mcl-1緊密結(jié)合Bim，弱結(jié)合Bmf，而不結(jié)合Bad。為驗(yàn)證該體外結(jié)果，用共免疫沉淀法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)查了所選擇的成對全長N-末端標(biāo)記的蛋白質(zhì)間的相互作用。HA-Bim、Puma、Bad、Bik或Noxa在HEK293T細(xì)胞中與作為所描述的三類促生存蛋白質(zhì)代表的FLAG-Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1共表達(dá)(圖2B)。細(xì)胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標(biāo)記從而可以對共相關(guān)放射標(biāo)記蛋白質(zhì)間的任何相互作用做半定量評估。對于所測試的任何一對，通過免疫沉淀所檢測的相互作用(圖3)與之前的親和力測定同時(shí)進(jìn)行(圖2)。尤其是，Bad與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合得很好，但卻一點(diǎn)兒都不與Mcl-1結(jié)合(圖3D、3E)(Opferman等人，Na ture 426671-676，2003)，而Noxa(帶有兩個(gè)BH3的全長小鼠Noxa)僅與Mcl-1互作(圖3F、3G)。Bik與Bcl-xL的程度大于Bcl-2或Mcl-1(圖3C)，而Bim和Puma如同所預(yù)期的，與全部三種促生存蛋白質(zhì)結(jié)合良好(圖3A和3B)。
實(shí)施例5特定殘基對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的比較BH3結(jié)構(gòu)域的序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，似乎F32和K35對于確定Noxa對Mcl-1的結(jié)合是重要的。野生型Noxa不與Bcl-xL結(jié)合，但F32或K35突變均增強(qiáng)Bcl-xL結(jié)合，雙重突變則結(jié)合更加增強(qiáng)(表4)。這強(qiáng)烈暗示，Noxa的F32和K35對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的。
表4特定殘基對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的
實(shí)施例6Bad、Bik和Noxa在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有不同的靶為驗(yàn)證體外結(jié)果，用共免疫沉淀法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)查了所選擇的成對全長N-末端標(biāo)記的蛋白質(zhì)。作為所描述的三類促生存蛋白質(zhì)代表(圖4)，Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1在293T細(xì)胞中與Bim、Puma、Bik、Bad或Noxa共表達(dá)。細(xì)胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標(biāo)記從而可以對放射標(biāo)記蛋白質(zhì)間的任何相互作用做半定量評估或者通過更為敏感的蛋白質(zhì)印跡法對相互作用進(jìn)行測定。
值得注意的是，對于每一受測試對，通過免疫沉淀所檢測到的相互作用與從在先的親和力測定預(yù)計(jì)的相同(圖4)。尤其是，Bad與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合良好，但不與Mcl-1結(jié)合，而Noxa(帶有兩個(gè)BH3的全長小鼠Noxa)僅與Mcl-1相互作用。此外，Bik與Bcl-xL的結(jié)合大于Bcl-2或Mcl-1，而Bim，如同所預(yù)期的，同Puma一樣易于與全部三種促生存蛋白質(zhì)結(jié)合。
實(shí)施例7具有限制性靶的BH3-only蛋白質(zhì)是較弱的殺傷物質(zhì)為評估選擇性結(jié)合的生物相關(guān)性，采用反轉(zhuǎn)錄病毒遞送來比較不同的BH3-only蛋白質(zhì)殺死野生型小鼠胚纖維原細(xì)胞(MEFs)的能力。為監(jiān)控所導(dǎo)入基因的表達(dá)，使用了載體(pMIG)，在該載體中所導(dǎo)入基因的表達(dá)通過經(jīng)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)與綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)耦聯(lián)(Van Parijs等人，Immunity 11281-288，1999)。細(xì)胞被有效感染(＞90％)且所導(dǎo)入的BH3-only蛋白質(zhì)被有效表達(dá)。感染后24小時(shí)(圖7A，7B)以及在長期克隆檢測中(圖7E)對所感染的(GFP+ve)細(xì)胞的活力進(jìn)行記分。
盡管采用親本病毒所作的感染引起最小程度的凋亡，但大多數(shù)用表達(dá)Puma或各種Bim異構(gòu)體(Bims、BimL或BimEL)的病毒感染的細(xì)胞以劑量依賴的方式迅速死亡(圖7B)，并且未能形成集落(圖7E)。重要的是，其它被測試的BH3-only蛋白質(zhì)(Bmf、Bad、Bik、Hrk、Noxa)，盡管得到了充分的表達(dá)，其作為殺傷劑的潛力卻低得多(圖7B)，這可能是因?yàn)檫@些BH3-only蛋白質(zhì)中沒有一個(gè)能夠中和在MEFs中基本表達(dá)的所有促生存分子(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)。
特定BH3-only蛋白質(zhì)的較弱的促凋亡活性，通常歸因于特定的負(fù)調(diào)控機(jī)制，比如Bad被14-3-3蛋白質(zhì)結(jié)合。為排除這樣的影響并允許對不同的BH3結(jié)構(gòu)域作直接比較，對其中用Puma、Bad或Noxa的BH3替換了BimsBH3嵌合分子作了分析。之所以選擇Bims作為基本骨架，是因?yàn)锽ims，最有效的Bim異構(gòu)體，不是通過與動(dòng)力蛋白運(yùn)動(dòng)復(fù)合物的相互作用來調(diào)控的。其促凋亡活性僅依賴于BH3區(qū)域，因?yàn)锽ims4E，其BH3已突變，不與任何一種促生存分子結(jié)合并缺乏促凋亡功能。與嵌合蛋白的天然對應(yīng)物不同，嵌合蛋白的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是均以相當(dāng)量的水平表達(dá)。
值得注意的是，Bims與PumaBH3的嵌合體保留了Puma結(jié)合所有受試促生存分子的能力，且其殺傷效力與天然Bim或Puma相同。相反，Bims與BadBH3或NoxaBH3的嵌合體的表現(xiàn)分別與天然Bad或Noxa相似。BimsBadBH3結(jié)合Bcl-xL，但不結(jié)合Mcl-1，而BimsNoxaBH3相反卻結(jié)合Mcl-1。相應(yīng)地，這兩種嵌合體在短和長期的試驗(yàn)中均表現(xiàn)出弱的促凋亡活性。因此，由各BH3-only蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的殺傷似乎反映出其緊密結(jié)合細(xì)胞中存在的所有促生存類-Bcl-2分子的能力。
實(shí)施例8Bad和Noxa間的功能互補(bǔ)由于結(jié)果顯示，凋亡需要中和所有的相關(guān)促生存蛋白質(zhì)，因此具有互補(bǔ)結(jié)合譜的BH3-only蛋白質(zhì)(圖8A)應(yīng)當(dāng)合作殺死細(xì)胞。因此，Noxa對Mcl-1的中和應(yīng)當(dāng)由BadBH3的共表達(dá)來補(bǔ)充以中和MEF中的Bcl-2和Bcl-xL(圖8A)。同樣地，NoxaBH3應(yīng)當(dāng)增強(qiáng)由Bik誘導(dǎo)的殺傷，Bik結(jié)合Mcl-1比結(jié)合Bcl-xL弱40倍。為了能夠做互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過用Bims的GFP融合物、或嵌合BimsBadBH3和BimsNoxaBH3替換GFP，在pMIG載體中共表達(dá)幾對BH3-only蛋白質(zhì)。這樣的融合體表現(xiàn)類似于它們的親本BH3-only對應(yīng)物，因?yàn)镚FP Bims融合體是強(qiáng)殺傷物(圖8B)。
重要的是，Noxa與BadBH3的共表達(dá)導(dǎo)致與僅表達(dá)Bims同樣多的細(xì)胞死亡(圖8B)。類似地，NoxaBH3被Bik有效地增強(qiáng)殺傷。所觀察到的協(xié)同作用反映出互補(bǔ)的BH3功能，因?yàn)镹oxaBH3的共表達(dá)不會(huì)增強(qiáng)Noxa殺傷，而且當(dāng)與GFP融合的BimsBadBH3與不結(jié)合Mcl-1的惰性形式的Noxa(3EBH3突變體；參見實(shí)驗(yàn)方法)共表達(dá)時(shí)未觀察到顯著的殺傷(圖8B)。因此，當(dāng)三種BH3-only蛋白質(zhì)中的任意一種單獨(dú)在纖維原細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，主要與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合的Bad和Bik能夠有效地與選擇性結(jié)合Mcl-1的Noxa共同作用從而增強(qiáng)所觀察到的弱殺傷。
實(shí)施例9由混雜型Noxa突變體誘導(dǎo)的有效殺傷隨后探究了Noxa的選擇性結(jié)合譜和弱殺傷活性的分子基礎(chǔ)。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8)提示，結(jié)合額外的促生存蛋白質(zhì)的Noxa形式有可能是一種有效的殺傷劑。Bcl-xLBim復(fù)合物的高分辨率X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)指導(dǎo)了尋找該變體的研究(圖9A)。BimBH3的疏水殘基(包括亮氨酸L94、異亮氨酸I97、苯丙氨酸F101；基于小鼠BimL編號)結(jié)合Bcl-xL表面的疏水口袋。Bcl-xL(和Bcl-2)上對應(yīng)Bim I97(h3)的口袋部分地由苯丙氨酸(F97)和酪氨酸(Y101)殘基形成，它們比Mcl-1(纈氨酸、組氨酸)或A1(纈氨酸、纈氨酸)中相應(yīng)的殘基大，這提示，Mcl-1和A1能夠容易地容納在人NoxaBH3中發(fā)現(xiàn)的γ-支鏈苯丙氨酸(F32)(圖9B)。此外，在Bim的帶負(fù)電荷的谷氨酸(E100)和Bcl-xL上的帶正電的精氨酸(R100)之間形成了一個(gè)共有電荷對，但是這一在Bcl-2和Bcl-w中保守的精氨酸，在Mcl-1中被中性的天冬酰胺所替換、在A1中被谷氨酸所替換。因此，從BimBH3中的谷氨酸(E100)到Noxa中的賴氨酸(K35)的電荷改變(附圖9B)可能是削弱NoxaBH3與Bcl-xL結(jié)合的一個(gè)因素。
基于這些考慮，在溶液競爭試驗(yàn)中測試了帶有突變K35E(m1)、F32I(m2)或這二者(m3)的Noxa(圖9B)對促生存蛋白質(zhì)的結(jié)合。它們與Bcl-2的結(jié)合仍然很弱，但與Bcl-xL和Bcl-w的結(jié)合卻顯著增強(qiáng)(圖9C)。對于Bcl-xL，電荷改變突變K35E(m1)使結(jié)合增強(qiáng)了20倍以上；F32I替換(m2)使結(jié)合增強(qiáng)了超過100倍；雙突變(m3)更進(jìn)一步使結(jié)合得到增強(qiáng)(圖9C)。而wtNoxaBH3對Bcl-xL和Bcl-w二者的IC50均大于100,000nM，m3突變體表現(xiàn)對Bcl-xL的IC50為110nM、對Bcl-w的是410nM，而Mcl-1結(jié)合得到輕微地提高(圖9C)。共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Noxa m3在細(xì)胞中結(jié)合Bcl-xL(圖9D)，而野生型Noxa不結(jié)合(圖7C)。因此，兩個(gè)關(guān)鍵BH3殘基的改變足夠拓寬Noxa的特異性。
值得注意的是，當(dāng)在纖維原細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，Noxa m3被證實(shí)是一種比野生型Noxa更有效的殺傷劑(圖9E、9F)。因此，Noxa只與Mcl-1結(jié)合不足以殺死MEFs。Noxa對凋亡的有效誘導(dǎo)需要其它的BH3與Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w類蛋白質(zhì)之間的互作，或者通過Bad-類蛋白質(zhì)的共表達(dá)(圖8)或者通過降低Noxa選擇性的突變(m3；圖9)來提供這種相互作用。
參考書目Adams等人，Nature 318533-538，1985Adams等人，Genes Dev 172481-2495，2003Alving等人，Immunol Rev 1455-31，1995Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2369-378，2003Cory等人，Nat Rev Cancer 2647-656，2002Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003Danial和Korsmeyer Cell 116205-219，2004Day等人，Cell Death Differ 61125-1132，1999Day等人，1999；Hinds等人，2003Erickson等人，Science 249527-533，1990Fix，Pharm Res 131760-1764，1996Glickman等人，J Biomol Screen 73-10，2002Hajduk等人，J Med Chem 422315-2317，1999Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003Huang和Strasser，Cell 103839-842，2000Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology andPharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993Kozopas等人，Proc Natl Acad Sci 903516-3520，1993Kuntz，Science 2571078-1082，1992Langer，Science 2491527-1533，1990Letai等人，Cancer Cell 2183-192，2002Liu，X等人，Immunity 19341-352，2003Lugovskoy等人，J Am Chem Soc 1241234-1240，2002Moriishi等人，ProcNatl Acad Sci USA 969683-9688，1999Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989Opferman等人，Nature 426671-676，2003Patton，Nat Biotech 16141-143，1998
Pellecchia等人，Nat Rev Drug Discov 1211-219，2002Petros等人，2000，出處同前Puthalakath等人，Cell Death Differ 9505-512，2002Putney和Burke，Nat Biotech 16153-157，1998Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1197-210，1995Remington′s；Egleton和Dayis，Peptides 181431-1439，1997Samanenet A1，J Pharm Pharmacol 48119-135，1996Sattler等人，1997，出處同前Sayani和Chien，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1385-184，1996Strasser等人，Nature 348331-333，1990Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 4623-28，1994Szoka和Papahadjopoulos，Ann Rev Biophys Bioeng 9467-508，1980van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2192-204，2003Van Parijs等人，Immunity 11281-288，1999Vaux等人，Nature 335440-442，1988Vutla等人，J Pharm Sci 855-8，1996Wei等人，Science 292727-730，2000Wells，Methods Enzymol 2022699-2705，1991Wilson-Annan等人，J Cell Biol 162877-888，2003Wohnsland等人，J Med Chem 44923-930，2000Woodle等人，Pharm Res 9260-265，1992Zhang，Nat Rev Drug Discov 1101-102，2002
<110>The Walter and Eliza Hall Institute of Medical ResearchHUANG，David C.S(US Only)COLMAN，Peter M(US Only)DAY，Catherine L(US Only)ADAMS，Jerry M(US Only)CHEN，Lin(US Only)WILLIS，Simon N(US Only)WEI，Andrew(US Only)SMITH，Brian J(US Only)HINDS，Mark G(US Only)<120>治療性分子和用于產(chǎn)生和/或選擇所述分子的方法<130>12563560/EJH<150>Australian Provisional Patent Application No.20049000562<151>2004-02-06<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>肽<400>1Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>肽<400>2Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5
<210>3<211>9<212>PRT<213>肽<400>3Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生促生存Bc1-2家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋之殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；選擇一或多個(gè)與BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型結(jié)合表型相關(guān)的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合模式的氨基酸或其化學(xué)類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導(dǎo)更為限制的Bc1-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的能力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗劑特異于Bc1-2、XBc1-xL、Bc1-w、Mc1或A1中的一種或多種。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中Bc1-2拮抗劑基于選自Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid的分子的結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗劑抑制癌細(xì)胞上的促生存蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中癌細(xì)胞選自ABL1原癌基因、AIDS相關(guān)癌癥、聽神經(jīng)瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺樣癌、腎上腺皮質(zhì)癌、起因不明的骨髓化生、脫發(fā)、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星細(xì)胞瘤、共濟(jì)失調(diào)-毛血管擴(kuò)張、基底細(xì)胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、類癌瘤、宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、皮膚纖維肉瘤-隆凸、促結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤、導(dǎo)管細(xì)胞癌、內(nèi)分泌腺癌、子宮內(nèi)膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、惡性骨髓瘤、肝外膽小管癌、眼癌、眼黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、輸卵管癌、先天性骨髓發(fā)育不全、纖維肉瘤、膽汁膀胱癌、胃癌、胃腸道癌、胃腸道類癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)層疾病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、婦科癌、血液惡性腫瘤、毛細(xì)胞性白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細(xì)胞增多病、霍奇金氏病、人視神經(jīng)乳頭水腫病毒、水泡狀胎塊、血鈣過多、咽喉癌、眼內(nèi)黑素瘤、島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、郎格罕氏細(xì)胞-組織細(xì)胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni綜合癥、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、惡性棒狀腎腫瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、Merkel細(xì)胞癌、間皮瘤、遷移癌、口癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤、蕈樣霉菌病、骨髓異常增生綜合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失調(diào)、鼻癌、鼻咽癌、腎母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤病遺傳性疾病、Nijmegen Breakage綜合征、非黑素瘤皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘺術(shù)卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周神經(jīng)外胚層腫瘤、垂體癌、紅血球增多癥、前列腺癌、罕見癌及其相關(guān)病癥、腎細(xì)胞肉瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、白內(nèi)障-毛細(xì)血管擴(kuò)張-色素沉著綜合征、唾液腺癌、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、惡性皮膚網(wǎng)狀細(xì)胞增多綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊索腫瘤、鱗片細(xì)胞肉瘤(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、遷移性細(xì)胞癌(膀胱)、遷移性細(xì)胞癌(腎-骨盆-/-輸尿管)、胚胎滋養(yǎng)層癌、尿道癌、泌尿系統(tǒng)癌、Uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、陰戶癌、瓦爾登斯特倫病(股骨小頭的骨軟骨病)巨球蛋白血癥、腎母細(xì)胞瘤。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中Bc1-2拮抗劑抑制哺乳動(dòng)物中的促生存蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
8.一種產(chǎn)生或選擇促生存Bc1-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇限制型BH3-only蛋白質(zhì)作為支架蛋白質(zhì)，確定賦予該支架限制型表型的構(gòu)象，和產(chǎn)生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bc1-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的構(gòu)象部分的化合物。
9.混雜型BH3-only蛋白質(zhì)作為氨基酸殘基替換基質(zhì)在產(chǎn)生或選擇替換變體中的用途，所述變體賦予所述BH3-only蛋白質(zhì)或其化學(xué)或構(gòu)象等價(jià)物以限制型結(jié)合表型。
10.一種基于帶有賦予其限制型表型的殘基位置之支架BH3-only蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)促生存Bc1-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑的計(jì)算方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質(zhì)；對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對，將這些蛋白質(zhì)與限制型BH3-only蛋白質(zhì)比較；根據(jù)所述比對得到各氨基酸在一或多個(gè)帶來與Bc1-2蛋白質(zhì)結(jié)合的混雜特性或限制特性的位置上的出現(xiàn)頻率；利用所述頻率產(chǎn)生選自電荷、大小、構(gòu)象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)的計(jì)分函數(shù)；用所述計(jì)分函數(shù)和至少一種另外的計(jì)分函數(shù)來產(chǎn)生一套優(yōu)化蛋白質(zhì)序列或其構(gòu)象等價(jià)物，和產(chǎn)生或選擇具有與Bc1-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合表型的化合物或蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述計(jì)分函數(shù)選自(a)酸性殘基的數(shù)量和位置；或(b)堿性殘基的數(shù)量和位置；或(c)極性殘基的數(shù)量和位置；或(d)非極性殘基的數(shù)量和位置；或(e)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；或(f)不帶電荷殘基的數(shù)量和位置；或(g)親水殘基的數(shù)量和位置；或(h)疏水殘基的數(shù)量和位置；或(i)殘基的水平；或(j)殘基的溶解度水平；或(k)殘基的大?。换?1)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中作出的對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。
12.一種用于確定在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的試劑之結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括(1)被接收為輸入計(jì)分函數(shù)(SF)的至少兩種與所述BH3-only或Bc1-2蛋白質(zhì)相關(guān)的特征的代碼，其中所述特征尤其選自(m)酸性殘基的數(shù)量和位置；(n)堿性殘基的數(shù)量和位置；(o)極性殘基的數(shù)量和位置；(p)非極性殘基的數(shù)量和位置；(q)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(r)不帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(s)親水殘基的數(shù)量和位置；(t)疏水殘基的數(shù)量和位置；(u)殘基的水平；(v)殘基的溶解度水平；(w)殘基的大?。?x)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中作出的對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)(2)累加所述SF以提供相應(yīng)于BH3-only蛋白質(zhì)的PV的總和的代碼；和(3)儲(chǔ)存代碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
13.一種用于評估BH3-only蛋白質(zhì)或化學(xué)等價(jià)物在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的可能用途的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)包括(1)機(jī)器可讀數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)，該介質(zhì)包括編碼有機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)材料，其中所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)包含至少兩種與所述BH3-only或Bc1-2蛋白質(zhì)相關(guān)的特征的Iv，其中所述特征尤其選自(m)酸性殘基的數(shù)量和位置；(n)堿性殘基的數(shù)量和位置；(o)極性殘基的數(shù)量和位置；(p)非極性殘基的數(shù)量和位置；(q)帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(r)不帶電荷殘基的數(shù)量和位置；(s)親水殘基的數(shù)量和位置；(t)疏水殘基的數(shù)量和位置；(u)殘基的水平；(v)殘基的溶解度水平；(w)殘基的大小；(x)該殘基在BH3-only蛋白質(zhì)中作出的對三級結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)(2)用于存儲(chǔ)處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的指令的工作存儲(chǔ)器；(3)與所述工作存儲(chǔ)器以及所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)相耦連的中央處理單元，用于處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)以提供相應(yīng)于所述化合物PV的所述SF的總和；和(4)與所述中央處理單元相耦連的輸出硬件，用于接收所述PV。
14.一種預(yù)防或減輕受試者的癌癥的方法，所述方法包括在足以預(yù)防或減輕癌癥的條件下向所述受試者施用有效量的Bc1-2蛋白質(zhì)拮抗劑一定時(shí)間。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述拮抗劑與一種或多種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑相結(jié)合形成藥物組合物。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中拮抗劑的施用經(jīng)呼吸道、氣管內(nèi)、鼻咽、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、顱內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、鞘內(nèi)、小腦內(nèi)、鼻內(nèi)、灌注、口服、直腸、貼片和植入途徑給藥。
17.一種包含促生存Bc1-2蛋白質(zhì)家族拮抗劑的組合物，所述拮抗劑通過以下方法產(chǎn)生選擇帶有定義由BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；選擇一或多個(gè)與BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型結(jié)合表型相關(guān)的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合模式的氨基酸或其化學(xué)類似物；分析各次替換后的相互作用其誘導(dǎo)更為限制的Bc1-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的能力，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑。
18.促生存Bc1-2蛋白質(zhì)家族的拮抗劑在生產(chǎn)癌癥治療藥物中的用途，所述拮抗劑通過以下方法產(chǎn)生選擇帶有定義由BH3結(jié)構(gòu)域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；選擇一或多個(gè)與BH3-only蛋白質(zhì)的混雜型結(jié)合表型相關(guān)的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質(zhì)的限制型結(jié)合模式的氨基酸或其化學(xué)類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導(dǎo)更為限制的Bc1-2蛋白質(zhì)結(jié)合譜的能力。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及可用于誘導(dǎo)例如但不限于癌細(xì)胞這樣的特定細(xì)胞凋亡的治療性分子，以及產(chǎn)生和/或選擇治療性分子的方法。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)例如癌細(xì)胞這樣的細(xì)胞發(fā)生凋亡的方法以及可用于此的藥物組合物。本發(fā)明還提供通過選擇性抑制促生存蛋白質(zhì)來產(chǎn)生或選擇能夠誘導(dǎo)特定細(xì)胞凋亡的治療劑的方法。本發(fā)明還提供基于結(jié)構(gòu)結(jié)合特征進(jìn)行治療性分子設(shè)計(jì)的計(jì)算方法。
文檔編號C07K14/435GK1973041SQ200580010491
公開日2007年5月30日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月6日
發(fā)明者D·C·S·黃, P·M·科爾曼, C·L·戴, J·M·亞當(dāng)斯, L·陳, S·N·威利斯, A·魏, B·J·史密斯, M·G·海因茲 申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院