專利名稱：一種羊胎素針劑的制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使用哺乳動物的胚胎提取針劑制品的方法，更具體地說是一種羊胎素針劑的制造方法。
羊胚胎為母羊在分娩前成形或半成形胚胎，附帶組織羊胎盤為胎兒母體營養(yǎng)物質(zhì)交換的重要組織結構，兩者均含有豐富的營養(yǎng)成份及生物活性物質(zhì)，并且營養(yǎng)成份比例與人體極為相似，含有多種氨基酸和蛋白質(zhì)、生物活性多肽、核酸、激素、酶與輔酶及粘多糖等。而將其經(jīng)提取后制作的羊胎素針劑具有極易為人體所吸收、生物利用度高的特點，在現(xiàn)有技術中，羊胎素針劑的制造工藝是將羊胚胎、羊胎盤一起經(jīng)提取后得羊胎素，將羊胎素再進行制劑、分裝即得羊胎素針劑。例如，一種經(jīng)常使用的提取工藝是首先將羊胚胎、羊胎盤一起經(jīng)鹽解提取，加熱去雜蛋白后經(jīng)樹脂吸附，然后用鹽水洗脫，再用乙醇洗滌得到粗制羊胎素，將粗品用鹽水溶液溶解，除去酸性蛋白等雜質(zhì)后澄清過濾，進行超濾，再用乙醇沉淀，然后脫水干燥即得成品羊胎素，將成品羊胎素進行制劑、分裝即得羊胎素針劑。但這些傳統(tǒng)工藝所存在的缺點是①將整個羊胚胎、羊胎盤一起提取，沒有根據(jù)羊胚胎、羊胎盤不同部分中主要有效成份的區(qū)別，采用不同的分級提取，使許多有效組份分離不完全、損失較多、收率低，并會使羊胚胎的原有效成份比例發(fā)生變化，使配比不盡合理；②來自胚胎臟器中的超氧化物歧化酶，因多次注入人體?？烧T發(fā)免疫反應，從而降低功效，甚至發(fā)生過敏。
本發(fā)明的目的在于提供一種羊胎素針劑的制造方法，使用該方法能夠使羊胚胎、羊胎盤中主要有效組份分離提取比較完全、損失少、收率高；本發(fā)明的另外一個目的是使用該方法所制造的羊胎素針劑，在注入人體后不易發(fā)生過敏反應。
為完成上述目的，本發(fā)明所提供的技術解決方案是，一種羊胎素針劑的制造方法，其特殊之處在于
(一)將羊胚胎、羊胎盤進行分級提取，它包括(1)將去除眼球、臍帶、皮、肝臟后的羊胚胎部分進行活性組份提取，得組合提取物；(2)將眼球、臍帶、皮進行進透明質(zhì)酸的活性組份提取，得透明質(zhì)酸提取物；(3)將肝臟進行超氧化物歧化酶活性組份提取，得超氧化物歧化酶提取物；(4)將胎盤進行胎盤組織液提取，得胎盤組織提取物；(二)混合配制、分裝將所述組合提取物、透明質(zhì)酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盤組織提取物進行混合制劑、分裝，即得羊胎素針劑。
上述技術解決方案內(nèi)分級提取中的各級提取，可以采用適于提取其有效組份的已知提取工藝，如組合提取物的提取，可以采用已知的中性提取工藝或酸性提取工藝；透明質(zhì)酸提取物的提取，可以采用適于提取透明質(zhì)酸活性組份的已知提取工藝；超氧化物歧化酶提取物的提取，可以采用適于提取超氧化物歧化酶活性組份的已知提取工藝；胎盤組織提取物的提取，也可采用適于提取其組份的各種提取工藝。
上述技術解決方案在混合配制、分裝之前，可以對所述超氧化物歧化酶進行無過敏化學修飾，其修飾方法可采用目前已知的多種傳統(tǒng)工藝，如修飾酶LAAH(IOA)-SOD修飾法。
以下將給出本發(fā)明經(jīng)多次試驗而得到的一個優(yōu)選實施例。
(一)將羊胚胎、羊胎盤進行分級提取，它包括(1)組合提取物的提取，其工藝過程如下a.提取將-20℃冷凍羊胚胎解凍除去皮、脂肪、肝、眼球后切成醉塊，每公斤加3升生理鹽水，用組織搗碎機5分鐘勻漿2分鐘，離心機離心3000r/min、10min得提取液。
b.加熱去雜蛋白將提取液于水浴中迅速加熱至80℃，保持15min，放冰柜中，迅速冷卻至10℃以下，離心除去沉淀，收集清液。
c.丙酮沉淀清液冷至4℃，加入5倍體積的-10℃丙酮，于-10℃放置4h過濾收集沉淀，真空干燥得丙酮粉。
d.鹽析將丙酮粉溶于PH＝7.0的磷酸鹽緩沖液，使每ml蛋白質(zhì)25mg，加入PH7.0的飽和硫酸銨溶液使達25％飽和度，離心除去沉淀。上清液調(diào)至PH4.0加硫酸銨使飽和度達50％，離心收集鹽析物。
e.脫鹽、干燥鹽析物用冷含水丙酮反復結晶脫鹽，至檢查無硫酸鹽后，冷丙酮洗2次，冷乙醚洗2次，抽干、真空干燥。
f.超濾將脫鹽干粉溶于生理鹽水并調(diào)PH為7.0-7.5超濾，得組合提取物。
(2)透明質(zhì)酸提取物的提取，其工藝過程如下a.提取將原料眼球、臍帶、皮膚在-20℃解凍后切碎加入1倍無熱原蒸餾水搗碎、勻漿3min，離心10min，上層液加入4倍體積的-10℃冷丙酮沉淀，沉淀物中加入2倍生理鹽水提取，經(jīng)離心10min得提取液。
b.去雜蛋白往提取液中加入冷5％三氯醋酸溶液除去雜蛋白。
c.粗品沉淀、洗滌加乙醇沉淀得粗品，粗品溶于生理鹽水中，加入漂白土吸附雜質(zhì)，上清液用1％溴化十六烷基吡啶(CPB)沉淀，沉淀經(jīng)洗滌得凈料。
d.脫水、精制往凈料中加入生理鹽水解離、過濾，清液用三倍量的95％乙醇沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮脫水，以五氧化二磷真空干燥得HA精品，即透明質(zhì)酸提取物。
(3)超氧化物歧化酶提取物的提取，其工藝過程如下a.勻漿、過濾將-20℃解凍后的羊胚胎肝臟洗凈、切碎，加入3倍的生理鹽水在搗碎機內(nèi)勻漿3min，調(diào)PH5.7，離心10min，上層液加熱到70℃ 30min后冷卻、過濾，再加熱68℃ 30min，冷卻，離心10min。
b.沉淀、溶解上清液用0.7倍和1.4倍丙酮分級，收集末次沉淀，以少量蒸餾水溶解。
c.透析、沉淀用PH7.6的磷酸納緩沖液透析，透析內(nèi)液經(jīng)DEAE-Sephadex A-50層析(柱床體積2.5×50cm)，用PH7.6的磷酸納緩沖溶液梯度洗脫，合并具有SOD活性的組分，調(diào)PH5.6，加1.3倍體積丙酮，收集沉淀。
d.溶解、凍干將沉淀加蒸餾水至完全溶解，然后放至凍干機內(nèi)凍干成超氧化物歧化酶(SOD)精品，即超氧化物歧化酶提取物。
e.超氧化物歧化酶無過敏化學修飾制取修飾液稱取修飾酶LAAH，溶于10-12倍重量的12％高碘酸納溶液中，室溫下攪拌30min，溶解后置24h，滴加5％亞硫酸氫納溶液至變色，透析濃縮，加入SOD以37℃攪拌能完全溶解為至，反應4b，反應液加到Sephadex G-75柱上，4℃層析分離，檢測器于254nm下跟蹤洗脫，收集第一峰，凍干，得修飾超氧化物歧化酶即修飾酶LAAH(104)-SOD。
(4)胎盤組織提取物的提取，其工藝過程如下a.將-20℃解凍的原料切碎后洗凈，加2倍的無熱原蒸餾水用搗碎機勻漿3min。
b.將勻漿加熱至85℃ 15min迅速冷至10℃以下，離心10min取上清液。
c.用2mol/L鹽酸調(diào)PH2.6-3.4，加入苯酚，使溶液為0.3％，加熱85℃水解，冷卻室溫過濾，過濾時可加入2％活性炭。
d.收集濾液，用2mol/L NaOH調(diào)PH6.8-8.0，補加NaCl至0.85％高壓滅菌后過濾。
e.調(diào)PH6.6-7.2后除菌過濾得胎盤組織提取物，分裝500ml瓶中后高壓滅菌。
(二)混合配制、分裝將上述分級提取所得的組合提取物、透明質(zhì)酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盤組織提取物成品混合，作含量檢定，按5mg/ml濃度計算注射用水量，除菌過濾灌裝于2ml西林瓶。即得羊胎素針劑。
采用上述方法所得羊胎素針劑PH值6.5-7.5，經(jīng)無菌試驗、安全試驗、過敏試驗、熱原質(zhì)試驗，測定產(chǎn)品合格。
結合上述實施例可以看出，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點1.根據(jù)羊胚胎、羊胎盤不同部分中主要活性組份的不同，采用不同的分級提取方法，幾乎提取出了羊胚胎、羊胎盤中全部有益于人體的成份，使有效組份損失少、收率高，使所得產(chǎn)品成份完全、生物利用度高。
2.修飾了超氧化物歧化酶的抗原性，使所得產(chǎn)品不易發(fā)生過敏反應。由于蛋白質(zhì)的表面抗原決定簇大多由親水氨基酸組成，大多數(shù)情況下，親水性較強的LYS殘基是其中重要組分。用免疫惰性物質(zhì)對蛋白質(zhì)進行不同程度的化學修飾時，蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇將部分或全部被掩蓋，因而可以達到降低以至消除蛋白質(zhì)的免疫抗原性，并保留相當程度的生物活性的目的。經(jīng)修飾后，修飾酶已不能誘發(fā)機體產(chǎn)生LAAH(104)-SOD抗體，而清除了自身的抗原性。它們雖仍能與SOD抗體產(chǎn)生交叉抗原--抗體免疫反應，但這種能力已很弱，分別會降低至原來的1/16和1/8，應用時極少出現(xiàn)過敏反應。
3.修飾了超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性。經(jīng)修飾后，其耐溫、耐酸、耐堿、耐酶解的耐受性均可明顯提高，大大提高了生物利用度，作為口服液添加原料在胃內(nèi)也不易破壞、分解、失活、失效，其穩(wěn)定性可明顯提高。
權利要求
1.一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于(1)將去除眼球、臍帶、皮、肝臟后的羊胚胎部分進行活性組份提取，得組合提取物；(2)將眼球、臍帶、皮進行進透明質(zhì)酸的活性組份提取，得透明質(zhì)酸提取物；(3)將肝臟進行超氧化物歧化酶活性組份提取，得超氧化物歧化酶提取物；(4)將胎盤進行胎盤組織液提取，得胎盤組織提取物；(二)混合配制、分裝將所述組合提取物、透明質(zhì)酸提取物、超氧化物歧化酶提取物、胎盤組織提取物進行混合、制劑、分裝，得羊胎素針劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于在混合配制、分裝之前，對所述超氧化物歧化酶進行了無過敏化學修飾。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于所述無過敏化學修飾的工藝是，稱取修飾酶LAAH，溶于10～12倍重量的12％高碘酸納溶液中，室溫下攪拌30分鐘，溶解后置24小時，滴加5％亞硫酸氫納溶液至變色，透析濃縮，加入超氧化物歧化酶溶液以37℃攪拌能完全溶解為至，反應4小時，反應液加到Sephadex G-75柱上，4℃層析分離，檢測器于254nm下跟蹤洗脫，收集第一峰，凍干即得修飾超氧化物歧化酶。
4.根據(jù)權要求書1或2或3所述的一種羊胎素針劑制造方法，其特征在于，所述組合提取物的提取工藝過程如下a.提取將-20℃冷凍羊胚胎解凍除去皮、脂肪、肝、眼球切成碎塊，每公斤加3升生理鹽水，用組織搗碎機5分鐘勻漿2分鐘，離心機離心3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘得提取液。b.加熱去雜蛋白將提取液于水浴中迅速加熱至80℃，保持15分鐘，放冰柜中，迅速冷卻至10℃以下，離心除去沉淀，收集清液。c.丙酮沉淀清液冷至4℃，加入5倍體積的-10℃丙酮，于-10℃放置4小時過濾收集沉淀，真空干燥得丙酮粉。d.鹽析將丙酮粉溶于PH＝7.0的磷酸鹽緩沖液，使每毫升蛋白質(zhì)25毫克，加入PH7.0的飽和硫酸銨溶液使達25％飽和度，離心除去沉淀。上清液調(diào)至PH4.0加硫酸銨使飽和度達50％，離心收集鹽析物。e.脫鹽、干燥鹽析物用冷含水丙酮反復結晶脫鹽，至檢查無硫酸鹽后，冷丙酮洗2次，冷乙醚洗2次，抽干、真空干燥。f.超濾將脫鹽干粉溶于生理鹽水并調(diào)PH為7.0-7.5超濾，得組合提取物。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸提取物的提取工藝過程如下a.提取將原料眼球、臍帶、皮膚在-20℃解凍后切碎加入1倍無熱原蒸餾水搗碎、勻漿3分鐘，離心10分鐘，上層液加入4倍體積的-10℃冷丙酮沉淀，沉淀物中加入2倍生理鹽水提取，經(jīng)離心10分鐘得提取液。b.去雜蛋白往提取液中加入冷5％三氯醋酸溶液除去雜蛋白。c.粗品沉淀、洗滌加乙醇沉淀得粗品，粗品溶于生理鹽水中，加入漂白土吸附雜質(zhì)，上清液用1％溴化十六烷基吡啶(CPB)沉淀，沉淀經(jīng)洗滌得凈料。d.脫水、精制往凈料中加入生理鹽水解離、過濾，清液用三倍量的95％乙醇沉淀，沉淀經(jīng)乙醇、丙酮脫水，以五氧化二磷真空干燥，即得透明質(zhì)酸提取物。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于，所述超氧化物歧化酶提取物的提取工藝過程如下a.勻漿、過濾將-20℃解凍后的羊胚胎肝臟洗凈、切碎，加入3倍的生理鹽水在搗碎機內(nèi)勻漿3分鐘，調(diào)PH5.7，離心10分鐘，上層液加熱到70℃ 30分鐘后冷卻、過濾，再加熱68℃ 30分鐘，冷卻，離心10分鐘。b.沉淀、溶解上清液用0.7倍和1.4倍丙酮分級，收集末次沉淀，以少量蒸餾水溶解。c.透析、沉淀用PH7.6的磷酸納緩沖液透析，透析內(nèi)液經(jīng)DEAE-Sephadex A-50層析，用PH7.6的磷酸納緩沖溶液梯度洗脫，合并具有超氧化物歧化酶活性的組分，調(diào)PH5.6，加1.3倍體積丙酮，收集沉淀。d.溶解、凍干將沉淀加蒸餾水至完全溶解，然后放至凍干機內(nèi)凍干成超氧化物歧化酶精品，即超氧化物歧化酶提取物。
7.根據(jù)權利要求6所述一種羊胎素針劑的制造方法，其特征在于，所述胎盤組織提物的提取工藝過程如下a.將-20℃解凍的原料切碎后洗凈，加2倍的無熱原蒸餾水用搗碎機勻漿3分鐘。b.將勻漿加熱至85℃ 15分鐘迅速冷至10℃以下，離心10分鐘取上清液。c.用2mol/L鹽酸調(diào)PH2.6-3.4，加入苯酚，使溶液為0.3％，加熱85℃水解，冷卻室溫過濾，過濾時可加入2％活性炭。d.收集濾液，用2mol/L NaOH調(diào)PH6.8-8.0，補加NaCl至0.85％高壓滅菌后過濾。e.調(diào)PH6.6-7.2除菌過濾后得胎盤組織提取物，分裝500ml瓶中后高壓滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用哺乳動物的胚胎提取針劑制品的方法,具體說是一種羊胎素針劑的制造方法。主要解決已有技術對有效組分的提取不完全、損失多、收率少以及使用后易產(chǎn)生過敏反應等缺點。該方法根據(jù)羊胚胎、羊胎盤中不同部分主要有效組分的區(qū)別,采用分級提取,包括對組合提取物、透明質(zhì)酸、超氧化物歧化酶、胎盤組織液的分別提取,該方法還可對超氧化物歧化酶進行無過敏化學修飾。其所得羊胎素針劑有效組份齊全、不易產(chǎn)生過敏反應。
文檔編號A61K35/48GK1242196SQ98112918
公開日2000年1月26日 申請日期1998年7月17日 優(yōu)先權日1998年7月17日
發(fā)明者于連發(fā), 張前進 申請人:西安陽光保健品開發(fā)有限責任公司