專利名稱：新構(gòu)建的l－天門冬酰胺酶工程菌及其發(fā)酵培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于新構(gòu)建的L-天門冬酰胺酶工程菌及其發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明是利用現(xiàn)代生物技術(shù)、基因工程方法來構(gòu)建工程菌，并選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法使得到的酶活力達(dá)到最高水平。
L-天門冬酰胺酶[E.C3.5.1.1]，也稱L-天門冬酰胺基水解酶，能專一地催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨。
1953年，Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清有抗腫瘤作用，到了六十年代，Broome證實(shí)了豚鼠血清的抗腫瘤因子是血清中的L-天門冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感腫瘤細(xì)胞氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸代謝的紊亂，從而抑制腫瘤生長。1964年，Mashburn從大腸桿菌分離得到該酶，從此開始了從微生物中提取L-天門冬酰胺酶，進(jìn)行生產(chǎn)及臨床的研究。許多臨床資料表明L-大門冬酰胺酶對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病、急性變慢性白血病以及若干實(shí)質(zhì)性腫瘤有肯定的治療作用，特別對(duì)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病有很好的療效。
我們實(shí)驗(yàn)室于1970年開始L-天門冬酰胺酶研究，篩選出一株高產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的大腸桿菌菌株，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)條件試驗(yàn)，酶活力達(dá)到4.6iu/ml，以后進(jìn)行純化、工廠中試、純化酶制劑的動(dòng)物試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)，在1973年通過了鑒定，并開始在天津生化制藥廠進(jìn)行生產(chǎn)，在醫(yī)院里得到了應(yīng)用。
此后，我們用甲基戊二醇方法獲得了該酶的結(jié)晶，并對(duì)該酶作了一系列的性質(zhì)試驗(yàn)，酶的分子量是144000，由四個(gè)相同的亞基組成，單獨(dú)的亞基不具備酶活性，酶的等電點(diǎn)是pI4.6，酪氨酸殘基是該酶活性的必需基團(tuán)，處于該酶分子的活性部位，對(duì)酶分子的N-端氨基酸組成進(jìn)行了分析。雖然，L-天門冬酰胺酶已使用多年，但在治療白血病方面，該酶仍被認(rèn)為是一個(gè)有效的藥物，只是在應(yīng)用中產(chǎn)生了一些問題，如作為異體蛋白的酶的長期使用會(huì)刺激免疫系統(tǒng)，對(duì)人體產(chǎn)生有害的免疫排斥反應(yīng)，酶在人體中不穩(wěn)定性，半衰期短；更為重要的是，菌種產(chǎn)酶活性低而引起酶制劑成本太高，一般病人根本承受不起，這些問題不解決，就會(huì)大大限制了酶的廣泛使用。
提高菌種產(chǎn)酶能力，可以用多種方法，包括重新篩選優(yōu)良菌種、通過傳統(tǒng)的物理化學(xué)的方法進(jìn)行菌種誘變以及用現(xiàn)代遺傳育種技術(shù)、基因工程方法來提高菌種的產(chǎn)酶能力等。但是通過國內(nèi)外專利及文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)的基因工程方面的報(bào)道很少，還沒有用工程菌來生產(chǎn)該酶。英國的PublicHealth Laboratory Service Board的Atkinson博士從歐文氏菌(Erwinia chrsyanthemi)的DNA基因庫中篩選出L-天門冬酰胺酶基因，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pASN30，在大腸桿菌和歐文氏菌中進(jìn)行表達(dá)。酶的表達(dá)量僅為可溶性蛋白的5-6％，酶活力最高只有20iu/ml.該酶的亞基分子量為32000，等電點(diǎn)pI8.5(EP211639)。美國Purdue大學(xué)的Harms博士也構(gòu)建了產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的大腸桿菌工程菌(Protein ExpressionPurification,1991 2(2-3),44-50).所分泌出的酶占細(xì)胞可溶性蛋白的10-15％。每立升發(fā)酵液能得到10-15mg酶。在國內(nèi)，中國藥科大學(xué)的劉景晶等人先后構(gòu)建了二個(gè)產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的工程菌。在第一個(gè)工程菌中，產(chǎn)酶量僅為6.2-31.8iu/ml，酶蛋白占28.3-35.7％(藥物生物技術(shù)1995,2(4)8-15)。而在第二個(gè)工程菌中，使用了同一個(gè)酶的基因來源，但構(gòu)建在不同的表達(dá)載體里，使表達(dá)水平有了很大提高，在LB培養(yǎng)基里，能達(dá)到106iu/ml。只是在1.5L的生物反應(yīng)器，酶活力高達(dá)400iu/ml。酶蛋白占菌體可溶性蛋白48.3％。酶的分子量為140000。(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996,27(11)696-700)。但這些工作離酶的生產(chǎn)應(yīng)用仍有很大一段距離，因?yàn)樗捎玫谋磉_(dá)質(zhì)粒含Tac啟動(dòng)子，需要有價(jià)格昂貴的IPTG誘導(dǎo)及氨芐青霉素作為選擇標(biāo)記，而在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，加上IPTG和氨芐青霉素顯然是不合適的。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一株高產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的工程菌，其發(fā)酵培養(yǎng)基易得，培養(yǎng)方法簡單可行，不需化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)及氨芐青霉素作為選擇標(biāo)記，易于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)酶能力強(qiáng)，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的L-天門冬酰胺酶工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下一些工藝步驟從產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的菌株中分離染色體DNA、引物設(shè)計(jì)和用PCR方法釣取酶的基因、基因序列測(cè)定及重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒在幾種宿主菌中表達(dá)、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建及工程菌的培養(yǎng)方法的上述各步詳細(xì)內(nèi)容如下1．從產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的菌株中分離染色體DNA產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的原始菌株，是由本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)室篩選而得。是幾年前篩選出的一株高產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的大腸桿菌菌株，后由天津生化制藥廠試生產(chǎn)。該菌種名叫IM-602，在7.5％玉米漿，37℃培養(yǎng)8小時(shí)，其產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的酶活力每毫升培養(yǎng)液最高能達(dá)到4.6單位。
從上述菌種中分離提取染色體DNA的方法，是采用已知技術(shù)，詳見“DNA探針技術(shù)”(美國G.H.凱勒和M.M.馬納克著，孫士勇等人譯，科學(xué)出版社，1992年出版)。該方法主要是將37℃培養(yǎng)過夜的IM-602培養(yǎng)液離心收集菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml,0℃作用15min，加RNase至終濃度100μg/ml,37℃ 30min，加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，37℃ 2小時(shí)后用苯酚∶氯仿(1∶1)將蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸鈉至終濃度為0.2mol/L，加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇，界面形成云霧狀沉淀，即沉淀的DNA，用玻棒順時(shí)針纏繞，放至4℃ TE緩沖液中逆時(shí)針解旋下DNA，即得到提取的染色體DNA。2．引物設(shè)計(jì)和用PCR方法釣取酶的基因制備重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的L-天門冬酰胺酶的基因是通過已知PCR方法從上述染色體DNA中擴(kuò)增而得到。兩個(gè)引物是根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌L-天門冬酰胺酶的基因序列及表達(dá)質(zhì)粒的多酶切點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，EcoRⅠ在酶基因的5’端，并在其后設(shè)置起始密碼子ATG,SalⅠ在酶基因的3’端。其中primer-1:5’-TAGAATTCATGGAGTTTTTCAAGAAGACG-3’primer-2:5’-AAGTCGACATTAGTACTGATTGAAGATC-3’兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)質(zhì)粒PBV220的EcoRⅠ和SalⅠ相匹配，適合于在大腸桿菌中高表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒pBV220經(jīng)過用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)膠電泳，切下所需的帶，進(jìn)行純化。
純化的經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA連接酶作用下，連接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ，轉(zhuǎn)化在JM105中，從菌落中提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ,SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定。挑出二個(gè)含L-天門冬酰胺酶基因的重組質(zhì)粒，并命名為pASN(見附

圖1)。附圖1是本發(fā)明工程菌重組質(zhì)粒pASN的構(gòu)建圖。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切為大小二個(gè)片段，其大小分別與酶基因和pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ的片段大小相一致。
PCR反應(yīng)染色體DNA模板1.5μg,2.5單位Taq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mM dATPdCTPdGTP和dTTP各1μl，終體積25μl，每循環(huán)中94℃變性45s,45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最后一次循環(huán)延至10min,共36個(gè)循環(huán)。
所得PCR產(chǎn)物在1％agarose中電泳，產(chǎn)物大小約為1kb。
所采用的表達(dá)質(zhì)粒pBV220是由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所構(gòu)建的，具有以下特點(diǎn)1)整個(gè)質(zhì)粒為3.66kb2)含有PRPL啟動(dòng)子和cI調(diào)控基因3)SD序列后面緊跟多酶切點(diǎn)，便于插入外源基因。
4)含有抗氨芐青霉素基因(Ampr)對(duì)重組質(zhì)粒的L-天門冬酰胺酶基因進(jìn)行DNA序列分析(見圖2)。圖2是本發(fā)明L-天門冬酰胺酶基因系列，其中一指信號(hào)肽序列，口是與E.coliK-12不同的堿基和氨基酸。L-天門冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因全長為1044bp，與已發(fā)表的大腸桿菌K-12的L-天門冬酰胺酶基因序列相比較(David T.Bonthron,Gene91(1990)101-105)。全部核苷酸序列中，有33個(gè)堿基不同。在編碼的氨基酸序列中，有2個(gè)氨基酸改變即27位氨基酸，大腸桿菌K-12為Val27，而大腸桿菌IM-602為Ala27,263位氨基酸，大腸桿菌K-12為Thr263，而大腸桿菌IM-602為Asn263。3．重組質(zhì)粒在宿主菌中表達(dá)重組質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化在大腸桿菌TGl、JM105、IM602等宿主菌中，得到可高效表達(dá)L-天門冬酰胺酶的工程菌。其轉(zhuǎn)化的方法和條件如下用CaCl2法分別制備各宿主菌感受態(tài)細(xì)胞(“分子克隆”)。將1μl重組質(zhì)粒與200μl感受態(tài)細(xì)胞混合，于冰上放置30min,42℃90s，后放冰上2min，加入800μlLB培養(yǎng)基，于37℃ 100rpm振蕩培養(yǎng)1hr，后取100μl鋪于LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置過夜，即得到含重組質(zhì)粒的工程菌pASN-T,pASN-J,pASN-I。
上述三種不同工程菌均可高效表達(dá)L-天門冬酰胺酶。其酶活力可達(dá)到120-228iu/ml發(fā)酵液。4．工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)工程菌的培養(yǎng)基是5％-10％玉米漿，尤以7.5％玉米漿最好，0.1-0.5％酵母膏，0.1-0.5％蛋白胨，PH7.0-7.5,15磅壓力30分鐘滅菌。
用過夜培養(yǎng)的工程菌作為種子液，接種量為0.5-3.0％，尤以1.5％較好，在28-30℃培養(yǎng)4-10小時(shí)，使培養(yǎng)物的生長濁度在A600達(dá)到2.0-4.0，以3.0為最好，然后在42℃開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為2-6小時(shí)，以3-4小時(shí)為最好。
上述所得的發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶酶活力為每毫升120-228單位。
酶活力測(cè)定方法取1ml發(fā)酵液，6000rpm離心10min，棄上清，用1ml PH8.4、0.1mol/L的硼酸-硼酸鈉緩沖液懸浮菌體。測(cè)定步驟1ml0.04mol/L L-天門冬酰胺，0.5ml 0.1mol/L硼酸-硼酸鈉緩沖液，0.5ml合適的細(xì)胞稀釋懸浮液，在37℃保溫15min，加入0.5ml 15％三氯乙酸終止反應(yīng)。離心取上清液1ml，加入在2ml奈斯勒試劑和7ml蒸餾水溶液中，15min后，用1cm比色皿在500nm處比色。
酶活力定義在上述條件下，每分鐘催化L-天門冬酰胺釋放1微克分子氨所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。
通過以上的技術(shù)實(shí)施，本發(fā)明得到了一個(gè)含L-天門冬酰胺酶基因的重組質(zhì)粒pASN，該重組質(zhì)粒在不同宿主菌，包括TG1、JM105、IM602進(jìn)行轉(zhuǎn)化，特別是在原生產(chǎn)菌株IM602轉(zhuǎn)化所得工程菌，在發(fā)酵培養(yǎng)誘導(dǎo)以后，酶活力高達(dá)159-228單位/毫升，是原生產(chǎn)菌株的35-50倍。該工程菌產(chǎn)生的酶特征是分子量為144000，它有四個(gè)相同的亞基組成，酶的亞基的氨基酸組成及基因序列與已公開發(fā)表的有差別。在全長1044bp中，有33個(gè)堿基不同，在編碼的氨基酸序列中，有兩個(gè)氨基酸有差異(27位Ala,263位Asn)。
實(shí)施例1按照上述四步工藝方法構(gòu)建L-天門冬酰胺酶工程菌和培養(yǎng)產(chǎn)生該工程菌，一具體實(shí)施例如下首先取已知菌種IM-602利用“DNA探針技術(shù)”分離提取染色體DNA。主要是將37℃培養(yǎng)過夜的IM-602培養(yǎng)液離心收集菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml，0℃作用15min，加RNase至終濃度100ug/ml,37℃ 30min,加蛋白酶K至終濃度100ug/ml,37℃ 2小時(shí)后用苯酚∶氯仿(1∶1)將蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸鈉至終濃度為0.2mol/L，加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇，界面形成云霧狀沉淀，即沉淀的DNA，用玻棒順時(shí)針纏繞，放全4℃ TE緩沖液中逆時(shí)針解旋下DNA，即得到提取的染色體DNA。
然后用PCR方法釣取酶基因并制備重組質(zhì)粒。方法如下染色體DNA模板1.5ug,2.5單位Taq聚合酶，100pmol/L DNA引物，2.5mmol/LdATP,dCTP,dGTP和dTTP各1ul，終體積25ul，每循環(huán)中94℃變性45s，45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最后一次循環(huán)延至10min，共36個(gè)循環(huán)。
所得PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)膠純化。經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA連接酶作用下，連接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ大片段上，得到重組質(zhì)粒。
將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在大腸桿菌JM105中，方法如下用CaCl2法分別制備大腸桿菌JM105感受態(tài)細(xì)胞(“分子克隆”)。將1μl重組質(zhì)粒與200μl感受態(tài)細(xì)胞混合，于冰上放置30min,42℃ 90s，后放冰上2min，加入800ul LB培養(yǎng)基，于37℃ 100rpm振蕩培養(yǎng)1hr，后取100μl鋪于LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置過夜，即得到含重組質(zhì)粒的工程菌。
最后發(fā)酵培養(yǎng)工程菌1個(gè)裝有2ml玉米漿培養(yǎng)基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.5)的10ml小試管，經(jīng)15磅30分滅菌后，接上工程菌斜面，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養(yǎng)基，15磅30分滅菌，接入0.5ml上述過夜培養(yǎng)液，28℃振蕩培養(yǎng)5.5hr，使A600達(dá)到3左右，42℃誘導(dǎo)3hr，最后發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶活力達(dá)到153IU/ml。實(shí)施例2本實(shí)施例中，方法和條件與實(shí)施例1相同，不同之處僅在于工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)在50立升發(fā)酵罐中。
將工程菌斜面接入已滅好菌的8個(gè)分別裝入50ml培養(yǎng)基250ml三角瓶中，(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.5)37℃，培養(yǎng)過夜。
在50L小罐中，裝上25L同種培養(yǎng)基，15磅30分滅菌，接上375ml上述過夜培養(yǎng)液。28℃，培養(yǎng)6.5h，使A600達(dá)到3.2,42℃，誘導(dǎo)3.5h，最后所得發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶活力達(dá)到123iu/ml。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，染色體提取，PCR方法和轉(zhuǎn)化方法與實(shí)施例1相同，不同之處僅在于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在大腸桿菌IM-602中，發(fā)酵培養(yǎng)工程菌的方法是1個(gè)裝有2ml玉米漿培養(yǎng)基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的10ml小試管，經(jīng)15磅30分滅菌后，用滅菌牙簽從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 230rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養(yǎng)基，15磅30分滅菌，接入0.75ml上述過夜培養(yǎng)液，30℃ 230rpm振蕩培養(yǎng)4hr，使A600達(dá)到3左右，42℃誘導(dǎo)4hr，最后發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶活力達(dá)到228IU/ml。實(shí)施例4本實(shí)施例中，基本方法和條件與實(shí)施例3相同，不同之處僅在于工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)在50立升發(fā)酵罐中。
1個(gè)裝有20ml玉米漿培養(yǎng)基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的250ml三角瓶，15磅30分滅菌后，用滅菌牙簽從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
8個(gè)分別裝入50ml培養(yǎng)基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨PH7.4)250ml三角瓶，15磅30分滅菌后，接入2ml上述培養(yǎng)液，30℃ 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
在50L小罐中，裝上25L 同種培養(yǎng)基，15磅30分滅菌，接上300ml上述過夜培養(yǎng)液。30℃，培養(yǎng)5h，使A600達(dá)到3.1,42℃，誘導(dǎo)4.5h,最后所得發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶活力達(dá)到159iu/ml。實(shí)施例5本實(shí)施例中，基本方法和條件與實(shí)施例1相同，不同之處僅在于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在大腸桿菌TG1中。發(fā)酵培養(yǎng)工程菌的方法是1個(gè)裝有2ml玉米漿培養(yǎng)基(7.5％玉米漿，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的10ml小試管，經(jīng)15磅30分滅菌后，用滅菌牙簽從工程菌平板上挑入一單菌落，30℃ 230rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
在250ml三角瓶中，裝入50ml同種培養(yǎng)基，15磅30分滅菌，接入0.75ml上述過夜培養(yǎng)液，30℃ 230rpm振蕩培養(yǎng)5hr，使A600達(dá)到3左右，42℃誘導(dǎo)3hr，最后發(fā)酵液的L-天門冬酰胺酶活力達(dá)到203IU/ml。
權(quán)利要求
1．一種產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的工程菌，其特征在于1)該工程菌是由重組質(zhì)粒pASN在三種宿主菌TG1、JM105、IM602分別轉(zhuǎn)化而得，2)該工程菌在合適的培養(yǎng)基、合適的培養(yǎng)條件下，具有強(qiáng)的產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的能力，其酶活力為120-228國際單位/毫升發(fā)酵液，3)該工程菌產(chǎn)生的酶不同于已有的大腸桿菌K-12，酶的分子量為144000，由四個(gè)相同亞基組成，亞基基因全長為1044bp，其中有33個(gè)堿基不同于大腸桿菌K-12，所編碼的氨基酸中二個(gè)有差別(Ala27和Asn263)。
2．如權(quán)利要求1所述的工程菌重組質(zhì)粒pASN，其特征在于是由以下方法構(gòu)建的1)從產(chǎn)L-天門冬酰胺酶的原始菌株E.coliIM-602分離提取染色體DNA，2)用PCR方法從上述染色體DNA中釣取酶的基因。3)將酶基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pBV220上。
3．如權(quán)利要求2所述的酶基因與表達(dá)質(zhì)粒連接的方法，其特征在于1)PCR所采用二個(gè)引物是根據(jù)與表達(dá)質(zhì)粒pBV220中EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)相匹配而設(shè)計(jì)的，并在EcoRⅠ位點(diǎn)后設(shè)置起始密碼子ATG，2)酶基因的5’端連在表達(dá)質(zhì)粒EcoRⅠ位點(diǎn)上，3’端連在SalⅠ位點(diǎn)上，從而構(gòu)成重組質(zhì)粒pASN。
4．如權(quán)利要求1所述的工程菌合適培養(yǎng)基是指含5-10％(W/V)的玉米漿，最佳為7.5％,0.1-2.0％(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白胨，pH6.5-8.0.
5．如權(quán)利要求1所述的工程菌合適培養(yǎng)條件方法，其特征在于接種量0.3-4.0％，起始培養(yǎng)溫度28℃-32℃，培養(yǎng)3-10小時(shí)，生物量達(dá)到A6001.0-6.0，最佳3.0時(shí)，然后42℃熱誘導(dǎo)2-8小時(shí)，最佳4.5小時(shí)，可得到L-天門冬酰胺酶酶活力為120-228單位/毫升的發(fā)酵液。
6．一種用權(quán)利要求1所述工程菌所生產(chǎn)的酶，其特征在于該酶的分子量為144000，由四個(gè)相同亞基組成，亞基基因全長為1044bp，其中有33中堿基不同于大腸桿菌K-12，所編碼的氨基酸中二個(gè)有差別(Ala27和Asn263)。
7．一種如權(quán)利要求1或6所述工程菌生產(chǎn)的酶在制備白血病醫(yī)藥方面的使用，其特征在于在含5-10％(W/V)玉米漿、0.1-2.0(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白胨及pH6.5-8.0的基質(zhì)中，接種0.3-4.0％(V/V)的工程菌，在28-32℃培養(yǎng)3-10小時(shí)，然后42℃熱誘導(dǎo)2-8小時(shí)，得到L-天門冬酰胺酶酶活力為120-228單位/毫升的發(fā)酵液，繼而純化所得制劑用于治療白血病。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于新構(gòu)建的產(chǎn)L－天門冬酰胺酶重組菌及其發(fā)酵培養(yǎng)的方法。其中包括從產(chǎn)L－天門冬酰胺酶的菌株中分離染色體DNA，引物的設(shè)計(jì)，用PCR方法釣取酶的基因，酶基因的序列測(cè)定，重組質(zhì)粒的構(gòu)建，在幾種宿主菌的表達(dá)，工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。本方法中，所得到的酶基因區(qū)別于已報(bào)道的該酶基因序列，并在個(gè)別氨基酸組成上也有差異；工程菌所采用的培養(yǎng)基便宜易得，發(fā)酵方法簡單可行，每毫升發(fā)酵液可達(dá)120—228單位。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1237633SQ9810204
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1998年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月1日
發(fā)明者錢世鈞, 王穎達(dá), 孟廣震, 葉軍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所