專利名稱：新型血吸蟲疫苗肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機化合物。
血吸蟲病是目前世界上廣為流行的一種寄生蟲傳染病。其主要的病原體是日本血吸蟲和曼氏血吸蟲。它是目前最有希望用疫苗的方法加以控制的傳染病之一。
結(jié)構(gòu)精確的亞單位疫苗是現(xiàn)代疫苗發(fā)展的一個主要方向，在使用的安全性和便捷性上，它都優(yōu)于經(jīng)典的減弱活疫苗。本發(fā)明的目的即在于利用血吸蟲蛋白質(zhì)的多肽片斷構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)的血吸蟲亞單位疫苗。此種疫苗的重要意義在于可以采用人工大量合成，經(jīng)人工合成的疫苗接種量小，可以減少異種蛋白的過敏反應(yīng)，并可大量制備，且無滅活不完全造成的致病危險，有實際應(yīng)用前景。
日本血吸蟲(Schistosoma Japonicum,Sj)是流行于我國的唯一蟲種，曼氏(Schistosoma Mansoni,Sm)血吸蟲則流行于非洲及南美地區(qū)。曼氏血吸蟲28KD谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Sm 28GST)具有較好的免疫原性，可以在實驗動物中誘導(dǎo)保護性，但Sj中相應(yīng)蛋白的免疫原性卻較弱。而另一方面，Sm28GST和Sj28GST的氨基酸序列卻具有高度同源性，且兩者之間有強烈的血清學(xué)交叉反應(yīng)。因此本發(fā)明利用曼氏血吸蟲的多肽序列構(gòu)建抗日本血吸蟲病疫苗，取得了較好的生物活性。
小分子多肽的免疫原性通常較弱，近年來發(fā)展的多抗原肽方法(multiple antigen peptide,MAP)為解決這一難題帶來了希望。該方法是以寡聚賴氨酸為母核，然后在賴氨酸的氨基上合成并聯(lián)的多條抗原肽鏈，以提高抗原的分子量，延長它在體內(nèi)的停留時間，增加抗原性。當(dāng)所連接的賴氨酸級數(shù)為n時，母核中含有2n-1個賴氨酸，肽段的數(shù)目2n。
本發(fā)明所涉及的有機化合物-多抗原肽，是結(jié)構(gòu)精確的血吸蟲可溶性亞單位疫苗，其通式是
在上式中，n為賴氨酸母核中所接賴氨酸的級數(shù)，(n=1,2,4,5)，2n-1為母核中賴氨酸的數(shù)目，2n-1為多抗原肽分子中所含該肽段的數(shù)目。
A可以是天然氨基酸殘基，也可以是對應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基，還可以是β-丙氨酸。
B可以是ⅰ)NHR,R為H或C1-5烷基。
或 ⅱ)OR,R為H或C1-5烷基。
C可以為氫，或RCO形式的基團，這里，R為H或C1-5烷基。
肽段1的序列為Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(稱為P1)肽段2的序列可以與肽段1的序列相同，也可以是ⅰ)Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly(稱為P2)或ⅱ)Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys(稱為P3)本發(fā)明實施例中即利用MAP方法分別合成了含有一種和兩種多肽片段的四聚體，并以小鼠為模型進行了抗日本血吸蟲(大陸株)的生物活性試驗，取得了令人滿意的結(jié)果，其中一種多肽的四聚體免疫BALB/C種小鼠，減蟲率和減卵率可分別達到62.5％和54％，按照國際公認標(biāo)準(zhǔn)，如果抗原的減蟲率、減卵率達到50％以上，即有進一步開發(fā)為疫苗的可能性。
本發(fā)明涉及的多肽可以以其自由的形式存在，也可以以藥物上可以接受的鹽的形式或復(fù)合物的形式存在。
本發(fā)明涉及的多肽可以用已知的多肽化學(xué)方法進行合成，以下的實施例中給出了用固相多肽合成法進行合成的過程。
實施例1.含有同種肽段的多抗原肽四聚體的合成合成中，以接合甘氨酸的PAM樹脂作為起始物(0.34mmol/g)，所有氨基酸的α-氨基均采用Boc保護(叔丁氧羰?；?，Lys側(cè)鏈氨基用Z(芐氧羰酰基)保護。Thr,Ser,Glu,Asp的側(cè)鏈官能團分別用芐醚和芐酯進行保護。每步縮合中，用50％TFA(三氟乙酸)/DCM(二氯甲烷)、溶液脫除Boc保護基，用10％TEa(三乙胺)/DCM中和，接肽縮合劑采用DCC/HoBt，以DMF作為接肽反應(yīng)的溶劑。每步接肽反應(yīng)中，所用氨基酸、縮合試劑與樹脂氨基的摩爾數(shù)之比為2.5∶1。合成結(jié)束后，先用50％TFA/DCM脫去末端氨基酸的Boc基團，整個肽段最后用HF從樹脂上裂解下來。所得粗肽用Sephadex G-50柱純化后，冷凍干燥得到目標(biāo)物。合成的流程如下
2．含有兩種多抗原肽的四聚體的合成兩種肽鏈的α-氨基分別用Fmoc(芴甲氧羰?；?和Boc進行保護，在Fmoc保護的氨基酸中，Asp,Glu,Ser,Thr,Tyr的側(cè)鏈官能團分別以叔丁酯和叔丁醚的形式進行保護。Boc氨基酸的保護法同上。在合成中，F(xiàn)moc官能團以50％哌啶/DCM溶液進行脫除。Boc基團的脫除仍使用50％TFA/DCM，中和過程則采用10％DIPEA/DCM溶液。合成的簡要流程如下所示
縮略語簡表Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Boc叔丁氧羰基Bopbenzotriazolyl-N-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluoropho sphateDCC二環(huán)己基碳二亞胺DCM二氯甲烷DIPEA 二異丙基乙基胺Fmoc 9-芴甲氧羰?；鵊ly甘氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺HOBt 1-羥基苯并三氮唑Leu亮氨酸Ile異氨酸Lys賴氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Si 日本血吸蟲Sm 曼氏血吸蟲TFA三氟乙酸TEA三乙胺Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸
權(quán)利要求
1．一種有機化合物-多抗原肽，還包括該類化合物的鹽以及藥物組合物，該類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下
在上式中，n為賴氨酸母核中所接賴氨酸的級數(shù)，(n=1,2,4,5)，2n-1為母核中賴氨酸的數(shù)目，2n-1為多抗原肽分子中所含該肽段的數(shù)目。A可以是天然氨基酸殘基，也可以是對應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸殘基，還可以是β-丙氨酸。B可以是ⅰ)NHR,R為H或C1-5烷基。或 ⅱ)OR,R為H或C1-5烷基。C可以為氫，或RCO形式的基團，這里，R為H或C1-5烷基。肽段1的序列為Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(稱為P1)肽段2的序列可以與肽段1的序列相同，也可以是ⅰ)Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly(稱為P2)或ⅱ)Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys(稱為P3)
2．如權(quán)利要l中所述的化合物，其特征在于n=2，肽段2的序列與肽段1的序列相同，為P1,A為Gly,B為-OH,C為H時，多抗原肽的結(jié)構(gòu)為
3．如權(quán)利要求l中所述的化合物，其特征在于n=2，肽段1的序列為P1，肽段2的序列為P2,A為Gly,B為-OH,C為H時，多抗原肽的結(jié)構(gòu)為
4．如權(quán)利要求1中所述的化合物，其特征在于n=2，肽段1的序列為P1，肽段2的序列為P3,A為Gly,B為-OH,C為H時，多抗原肽的結(jié)構(gòu)為
5．本權(quán)利要求1中要求保護的多肽，或其藥物可以接受的鹽的形式或復(fù)合物的形式及其與藥物可以接受的稀釋劑和載體一起使用所形成的復(fù)合物，以及對治療和預(yù)防血吸蟲病有作用的藥物，和用其制成的抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機化合物。具有下列基本結(jié)構(gòu)的多肽:n=1,2,4,5該結(jié)構(gòu)對血吸蟲病有保護性免疫作用,可用于制備抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
文檔編號A61P33/12GK1235163SQ98101838
公開日1999年11月17日 申請日期1998年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者蔡孟深, 秦致輝, 曹勝利, 石佑恩, 易有云 申請人:北京醫(yī)科大學(xué)