專利名稱：通過種間核移植制備胚胎細胞或干細胞樣細胞系的制作方法
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及通過將來源于動物或人細胞的細胞核移植入不同于供體核種類的其它動物之去核卵母細胞以制備胚胎細胞或干細胞樣細胞。本發(fā)明更特別地涉及通過將人細胞核移植入一種去核動物卵母細胞，優(yōu)選地為一種有蹄動物卵母細胞，最優(yōu)選地為一種牛去核卵母細胞以制備人類胚胎細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明還涉及所得胚胎細胞或干細胞樣細胞，優(yōu)選為人胚胎細胞或干細胞樣細胞的治療和診斷用途，以及同樣用于治療和診斷的分化細胞的制備，轉基因胚胎細胞或轉基因分化細胞、細胞系、組織或器官的制備。另外，根據(jù)本發(fā)明獲得的胚胎細胞或干細胞樣細胞本身可以作為核移植或核轉移方法中的核供體。
2.發(fā)明背景從早期前移植鼠胚胎體外衍生胚胎干細胞(ES)系的方法是公知技術。(參見例如，Evans等，自然29154-156(1981)；Martin，美國國家科學院學報787634-7638(1981))。假設存在成纖維細胞飼喂層(Evans等，同前)或分化抑制源(Smith等，發(fā)育生物學1211-9(1987))，ES細胞可以未分化狀態(tài)傳代。
先前報導過ES細胞具有多種用途。例如，據(jù)報導ES細胞可用作體外分化模型，特別是用于參與早期發(fā)育調(diào)控基因的研究。鼠ES細胞導入前移植鼠產(chǎn)生種系嵌合體，從而表現(xiàn)它們的多能性。(Bradley等，自然309255-256(1984))。
就其向下一代轉移基因組的能力而言，通過使用帶有或不帶有期望的遺傳修飾的ES細胞，ES細胞可用于對牲畜進行種系改良。另外，對牲畜而言，例如有蹄動物，來源于如前移植牲畜胚胎的細胞核支持去核卵母細胞發(fā)育至足月(Smith等，生物繁殖401027-1035(1989)；Keefer等，生物繁殖50935-939(1994))。這與來源于超過八細胞期的鼠胚胎的細胞核據(jù)報導轉移后不能支持去核卵母細胞的發(fā)育相反(Cheong等，生物繁殖48958(1993))。因此，由于來源于牲畜的ES細胞頗受歡迎，因為它們可以提供潛在的全能供體細胞核的來源，在進行遺傳操縱或其它處理后以用于核轉移過程。
一些研究小組已經(jīng)報導分離所謂多能胚胎細胞系。例如，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.43255-260(1991)，報導由豬和綿羊胚泡建立穩(wěn)定、多能細胞系，該豬和綿羊胚泡顯示與從綿羊胚泡由免疫切除法分離到的內(nèi)細胞群(ICM)的原代培養(yǎng)物細胞相似的某些形態(tài)和生長特性(同前)。Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.4151-56(1990)也公開了從豬胚泡得到的推測為多能胚胎細胞系培養(yǎng)物的維持和分化。另外，Gerfen等，動物生物技術，6(1)1-14(1995)公開了來自豬胚泡的胚胎細胞系的分離。這些細胞穩(wěn)定地維持在鼠胚胎成纖維細胞飼喂層，無須條件培養(yǎng)基的使用。據(jù)報導這些細胞在培養(yǎng)過程中分化形成幾種不同細胞類型(Gerfen等，同前)。
還有Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.201134-141(1992)報導培養(yǎng)的牛胚胎干細胞樣細胞系經(jīng)三次傳代仍存活，但第四次傳代后死亡。同時還有，Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)公開了免疫切除法分離的綿羊胚胎內(nèi)細胞群在允許來源于鼠ICM的鼠ES細胞系得以分離的條件下的培養(yǎng)。Handyside等(1987)(同前)報導該條件下，綿羊ICM附著、擴散和增殖了ES細胞樣細胞和內(nèi)胚層樣細胞，但之后延長培養(yǎng)僅可見內(nèi)胚層樣細胞。(同前)最近，Cherny等，動物生殖學，41175(1994)報導多能牛原生殖細胞來源的細胞系以長期培養(yǎng)方式維持。這些細胞培養(yǎng)約七天后，產(chǎn)生ES樣集落，其對堿性磷酸酶(AP)染色呈陽性，表明形成胚狀體的能力，并且自發(fā)分化形成至少兩種不同的細胞類型。據(jù)報導這些細胞也表達轉錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，一種認為由ES細胞專門表達的同源框基因模式。
同樣是最近，Campbell等，自然，38064-68(1996)報導在促進鼠中ES細胞系分離的條件下，培養(yǎng)的來自第九天羊胚胎的胚盤(ED)細胞進行核轉移后產(chǎn)生活的小羊。作者斷定基于他們的結果來自第九天羊胚胎的ED細胞進行核轉移具有全能性，并在培養(yǎng)中保持全能性。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)報導來源于牛成纖維細胞內(nèi)細胞群細胞的永久細胞系的分離和表征。作者分離并在不同條件下培養(yǎng)了來自八天或九天牛成纖維細胞的ICM以確定哪種飼喂細胞和培養(yǎng)基對維持牛ICM細胞附著和生長最有效。他們斷定基于他們的結果，通過使用STO(鼠成纖維細胞)飼喂細胞(代替牛子宮上皮細胞)并使用添加活性炭脫色血清(而不是正常血清)的培養(yǎng)基可以增強培養(yǎng)的ICM細胞的附著和生長。然而VanStekelenburg等報導他們的細胞系類似上皮細胞而不是多能ICM細胞。(同前)另外，Smith等，WO94/24274，1994年10月27日公開，Evans等，WO90/03432，1990年4月5日公開，和Wheeler等，WO94/26889，1994年11月24日公開的專利，報導了動物干細胞的分離、選擇和增殖，該干細胞據(jù)稱可以用于獲得轉基因動物。Evans等，WO90/03432，1990年4月5日公開，也報導了認為對生產(chǎn)轉基因動物有用的來源于豬和牛的所謂多能胚胎干細胞的誘導。另外，Wheeler等，WO94/26884，1994年11月24日公開，披露了認為對生產(chǎn)嵌合有蹄動物和轉基因有蹄動物有用的胚胎干細胞。因此，基于上述，很明顯許多課題組試圖制備ES細胞系，例如，因為它們在制備克隆胚或轉基因胚以及核移植過程中的應用潛能。
有蹄動物ICM細胞在核移植中的應用也有報導。例如，Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)公開了通過將裂解的供體細胞顯微注射到去核成熟卵母細胞中實現(xiàn)牛ICM核移植的方法。參考文獻公開了體外培養(yǎng)胚七天產(chǎn)生十五個成纖維細胞，其經(jīng)轉移到牛受體中后，導致四次懷孕和兩次分娩。同樣，Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)也公開了牛ICM細胞作為核轉移過程供體細胞核的應用，以產(chǎn)生成纖維細胞，其經(jīng)移植入牛受體后，得到幾個活的后代。另外，Sims等，美國國家科學院學報，906143-6147(1993)公開了通過來自一體外短期培養(yǎng)的牛ICM細胞的細胞核轉移到去核成熟卵母細胞生產(chǎn)小牛的方法。
同樣報導了培養(yǎng)的胚盤細胞核轉移后生產(chǎn)活的小羊的方法(Campbell等，自然，38064-68(1996))。同樣也報導了牛多能胚胎細胞在核轉移和生產(chǎn)嵌合胎牛中的用途(Stice等，生物繁殖，54100-101(1996))；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)。
以前也曾試圖制備種間核轉移(NT)單元(Wolfe等，動物生殖學，33350(1990))。尤其是牛胚胎細胞與野牛卵母細胞融合產(chǎn)生一些可能具有內(nèi)細胞群的種間NT單元。然而核轉移過程中使用了胚胎細胞而不是成體細胞作為供體細胞核。普遍認為胚胎細胞比成體細胞易于重新調(diào)控。這要追溯于對蛙的早期NT研究(DiBerardino綜述，分化，1717-30(1980))。該研究也涉及系統(tǒng)發(fā)生上非常相似的動物(牛細胞核和野牛卵母細胞)。相比較而言，以前NT過程中融合十分不同的動物(牛細胞核轉移到倉鼠卵母細胞中)，不能得到內(nèi)細胞群結構。而且，以前從未報導過來源于NT單元的內(nèi)細胞群細胞可以用于形成可增殖的ES細胞樣集落。
Collas等(同前)也指明了粒細胞(成體體細胞)在制備牛核轉移胚中的應用。然而，與本發(fā)明不同，這些實驗沒有涉及種間核轉移。并且與本發(fā)明不同，沒有獲得ES細胞樣集落。
因此，雖然以前文獻已經(jīng)報導過此類研究，仍然有必要改進制備胚胎細胞或干細胞樣細胞的方法。特別是有必要制備具有明顯治療和診斷作用的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
關于這方面，已確定可以通過細胞移植治療很多人類疾病。例如，帕金森病是由黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的退化導致。帕金森病的一般治療方法是服用L-DOPA，它能暫時改善多巴胺的缺失，但產(chǎn)生嚴重的副作用，最終不能逆轉疾病的進程。認為對治療一些腦疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有廣闊應用前景的治療帕金森病的另一種方法，是將胎兒或初生動物的細胞或組織移植入成人腦中。來自不同腦區(qū)的胎神經(jīng)元可以被摻入成人腦。這種移植在實驗室動物中顯示緩解了實驗誘導性行為缺陷，包括復雜的認知功能。來自人類臨床實驗的初步結果也令人鼓舞。然而，獲自流產(chǎn)胎兒的人胎兒細胞或組織十分有限。而且，自流產(chǎn)胎兒得到細胞或組織存在很大爭議。
目前沒有制備來自病人的“胎樣”細胞的方法。而且，不容易得到同種移植組織，并且同種異體移植組織和異種移植組織都易于產(chǎn)生移植排斥。另外，在一些情況下，移植前進行細胞或組織的遺傳修飾是有益的。然而，一些需要進行這種修飾的細胞或組織在培養(yǎng)中不能良好分裂，而遺傳轉化的大多數(shù)細胞需要快速分裂的細胞類型。
因此，本領域的確需要提供用于移植以及細胞和基因治療的未分化的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
發(fā)明目的本發(fā)明目的在于提供制備胚胎細胞或干細胞樣細胞的新的改進的方法。
本發(fā)明目的特別在于提供制備胚胎細胞或干細胞樣細胞的新方法，包括將哺乳動物或人細胞的細胞核移植入不同種的去核卵母細胞。
本發(fā)明的另一個特別目的在于提供制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞的新方法，包括將人細胞核移植入去核動物卵母細胞，優(yōu)選為有蹄去核動物卵母細胞。
本發(fā)明的又一目的在于提供制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞的新方法，包括將人細胞例如，人成體細胞的細胞核移植入人去核卵母細胞。
本發(fā)明的又一目的在于通過將動物或人細胞的細胞核移植入不同種的去核卵母細胞制備胚胎細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明的另一個特別目的在于通過將人細胞的細胞核移植入去核動物卵母細胞，優(yōu)選為有蹄去核動物卵母細胞，制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明的另一個目的在于使用這種胚胎細胞或干細胞樣細胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的一個特別目的在于使用這種人胚胎細胞或干細胞樣細胞治療或診斷一些通過細胞、組織或器官移植能有效治療或診斷的疾病。
本發(fā)明的另一個特別目的在于使用按照本發(fā)明制備的胚胎細胞或干細胞樣細胞制備分化的細胞、組織或器官。
本發(fā)明的一個特別目的在于使用按照本發(fā)明制備的人胚胎細胞或干細胞樣細胞制備分化的人細胞、組織或器官。
本發(fā)明的另一個特別目的在于使用按照本發(fā)明制備的胚胎細胞或干細胞樣細胞制備基因工程胚胎細胞或干細胞樣細胞，其中該細胞可以用于制備例如，在基因治療中使用的基因工程的或轉基因分化的人細胞、組織或器官。
本發(fā)明的另一個特別目的在于體外使用按照本發(fā)明制備的胚胎細胞或干細胞樣細胞，例如，用于細胞分化研究和檢測目的(例如藥物研究)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供移植治療的改進方法，包括從按照本發(fā)明制備的胚胎細胞或干細胞樣細胞產(chǎn)生的等基因的或同源細胞、組織或器官的使用。該治療包括(以舉例的方式)疾病和損傷的治療，包括帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌萎縮、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨置換、灼傷、血管疾病、泌尿道疾病、以及免疫缺陷、骨髓移植、癌癥和其它疾病的治療。
本發(fā)明的另一個目的在于使用按照本發(fā)明制備的轉基因或基因工程胚胎細胞或干細胞樣細胞用于基因治療，特別用于治療和/或防止上述疾病和損傷。
本發(fā)明的另一個目的在于使用按照本發(fā)明制備的胚胎細胞或干細胞樣細胞或者按照本發(fā)明制備的轉基因或基因工程胚胎細胞或干細胞樣細胞作為核移植中的核供體。
對于本發(fā)明上述以及其它目的之優(yōu)點和特征將在下文描述，本發(fā)明的特征通過參考下面對本發(fā)明優(yōu)選實施例和所附權利要求的詳細敘述而更易于理解。
附圖簡介

圖1是通過成體人細胞轉移到去核牛卵母細胞產(chǎn)生的核轉移(NT)單元的照片。
圖2-5是來源于(例如圖1描述的)NT單元的胚胎干細胞樣細胞的照片。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供制備胚胎細胞或干細胞樣細胞的新方法，特別是通過核轉移或核移植制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞。本申請中，核轉移或核移植或NT可替換使用。
如上所述，通過核轉移或核移植分離胚胎細胞或干細胞樣細胞尚未曾報導。然而，以前報導過從受精胚胎分離ES樣細胞。涉及遺傳上不同種屬的細胞或DNA，或者更特別的涉及一種生物成體細胞或DNA和另一種生物卵母細胞的成功的核轉移也從未曾報導。基于申請人的認識，也從未曾報導過用于在組織培養(yǎng)中制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞的方法。然而，目前可用的有限的人胎兒細胞和組織必須通過自然流產(chǎn)組織和墮胎兒獲得。
在本發(fā)明以前，也沒有人通過種間核移植獲得胚胎細胞或干細胞樣細胞。
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)可以通過將人細胞(例如成體分化的人細胞)的細胞核移植入用于制備核轉移(NT)單元的去核動物卵母細胞獲得人胚胎細胞或干細胞樣細胞以及細胞集落，這種細胞培養(yǎng)后產(chǎn)生了人胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。這一結果非常令人驚訝，因為它首次證明了有效的種間核移植，即，自動物或人細胞(例如，成體細胞)的細胞核移植入不同種動物的去核卵，以制備核轉移單元，其包含在合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)產(chǎn)生胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落的細胞。
優(yōu)選地，用于制備ES樣細胞的NT單元培養(yǎng)到至少2-400個細胞，優(yōu)選地4-128個細胞，且最優(yōu)選地至少約50個細胞的大小。
本發(fā)明中，胚胎細胞或干細胞樣細胞指按照本發(fā)明制備的細胞。本發(fā)明指的這種細胞是干細胞樣細胞而不是干細胞，因為其是通過種間核轉移方式制備的。雖然期望這些細胞擁有同正常干細胞一樣的分化能力，但由于其制備方式它們可能具有一些不明顯的差異。例如，這些干細胞樣細胞可能具有用于核轉移的卵母細胞的線粒體。
本發(fā)明基于成體人細胞特別是獲自人供體口腔的人上皮細胞的細胞核進行核移植的觀察，當該細胞核轉移到去核牛卵母細胞，導致核轉移單元的形成，這些細胞經(jīng)培養(yǎng)會產(chǎn)生人干細胞樣細胞或胚胎細胞和人胚胎細胞或干細胞樣細胞集落。本發(fā)明人推測牛卵母細胞和人卵母細胞必須經(jīng)歷熟化過程，以使它們足夠相似從而允許牛卵母細胞作為人卵母細胞的有效取代或替代物行使功能。
基于人細胞核可被有效移植入牛卵母細胞的事實，可以預期人細胞可移植入其它物種例如其它有蹄動物以及其它動物的卵母細胞。其它有蹄動物的卵母細胞尤其合適，例如，豬、綿羊、馬、山羊等。其它來源的卵母細胞也適用，例如，來源于其它靈長類動物、兩棲動物、嚙齒動物、兔類等的卵母細胞。而且，使用類似的方法，可以將人細胞或細胞核轉移到人卵母細胞中。
因此，在最廣泛的實施例中，本發(fā)明涉及通過注射或融合，將動物或人細胞核或是動物或人細胞移植入與供體核不同種動物的去核卵母細胞，產(chǎn)生包含可以用于獲得胚胎細胞或干細胞樣細胞和/或細胞培養(yǎng)物的細胞的NT單元。例如，本發(fā)明可以涉及通過注射或融合將有蹄動物細胞核或有蹄動物細胞移植入其它物種例如另一種有蹄動物或非有蹄動物的去核卵母細胞中，所述細胞和/或細胞核被混合以產(chǎn)生NT單元，且在適于獲得多細胞NT單元，優(yōu)選地含至少約2-400個細胞，更優(yōu)選為4-128個細胞，最優(yōu)選為至少約50個細胞的條件下培養(yǎng)。該NT單元的細胞經(jīng)培養(yǎng)后可以用于制備胚胎細胞或干細胞樣細胞或細胞集落。
本發(fā)明的優(yōu)選實施例包括通過將供體人細胞核或人細胞移植入去核動物卵母細胞，優(yōu)選為有蹄動物卵母細胞，最優(yōu)選為牛去核卵母細胞中，制備人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
通常，胚胎細胞或干細胞樣細胞通過以下步驟的核轉移程序制備
(i)獲得所需的用作核供體來源的人或動物細胞；(ii)從合適來源例如哺乳動物和最優(yōu)選的有蹄動物(例如牛)獲得卵母細胞；(iii)將所述卵母細胞去核；(iv)將人或動物細胞或細胞核通過例如融合或注射轉移到不同于供體細胞或細胞核的其它動物的去核卵母細胞中；(v)培養(yǎng)所得的NT產(chǎn)物或NT單元以制備多細胞結構；且(vi)培養(yǎng)獲自所述胚的細胞以制備胚胎細胞或干細胞樣細胞和干細胞樣細胞集落。
核轉移技術或核移植技術在文獻中已有描述，本發(fā)明背景引用的一些參考文獻也有描述。特別參見，Campbell等，動物生殖學，43181(1995)；Collas等，Mol.Report.Dev.，38264-267(1994)；Keefer等，生物繁殖，50935-939(1994)；Sims等，美國國家科學院學報，906143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274；和WO 90/03432，此處全文引入作為參考文獻。美國專利4944384和5057420也描述了牛核移植的方法。
通過公知的方法可以獲得人或動物細胞。用于本發(fā)明的人和動物細胞包括(通過舉例的方式)上皮細胞、神經(jīng)細胞、表皮細胞、角質(zhì)化細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T淋巴細胞)、紅細胞、巨噬細胞、單細胞、單核細胞、成纖維細胞、心肌細胞和其它肌細胞等。而且，用于核轉移的人細胞可以從不同器官獲得，例如，皮膚、肺、胰、肝、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎、尿道和其它泌尿器官等。它們僅是合適供體細胞的例子。合適的供體細胞，即本發(fā)明中有用的細胞可以從軀體的任何細胞和器官獲得。包括所有體細胞和生殖細胞。
下面的實施例中，用作核轉移供體的細胞是來源于人供體口腔的上皮細胞。然而，如上所述，公開的方法適用于其它人細胞或細胞核。而且，細胞核可以從人體細胞和生殖細胞獲得。
用于核轉移的卵母細胞可以獲自動物包括哺乳動物和兩棲動物。卵母細胞的合適哺乳動物細胞源包括綿羊、牛、羊、豬、馬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類動物等。在優(yōu)選實施例中，卵母細胞獲自有蹄動物，最優(yōu)選為牛。
分離卵母細胞的方法為本領域公知技術。該方法基本上是從哺乳動物或兩棲動物(例如牛)的卵巢或生殖道分離卵母細胞。屠宰場的材料是獲得牛卵母細胞方便來源。
為成功使用例如基因工程技術、核轉移和克隆技術，卵母細胞在用作核轉移的受體細胞和被精子細胞受精形成胚之前通常需要體外熟化。這一過程通常需要從動物卵巢例如于屠宰場獲得的牛卵巢中收集非成熟(分裂前期I)卵母細胞，受精或去核之前在熟化培養(yǎng)基中熟化卵母細胞，直到卵母細胞到達分裂中期II期，其對于牛卵母細胞通常發(fā)生在抽出后約18-24小時。用于本發(fā)明中，這一時間稱為“熟化期”。本文為計算時間使用的“抽出”指從卵巢的卵泡中抽出非成熟卵母細胞。
另外，已在體內(nèi)成熟的分裂中期II期的卵母細胞也已成功地用于核轉移技術?；旧?，從非超排卵或超排卵母牛或開始發(fā)情35到48小時的年輕母?；蜃⑸淙私q膜促性腺激素(hCG)或類似激素后的年輕母牛分離收集成熟的分裂中期II期的卵母細胞。
曾報導去核和核轉移過程中卵母細胞的成熟期是NT方法是否成功的關鍵(參見，例如，Prather等，分化，481-8，1991)。通常，成功的哺乳動物胚胎克隆方法使用分裂中期II期的卵母細胞作為受體卵母細胞，因為認為處于該期的卵母細胞可以被有效活化以至于能夠以接受類似受精精子的方式對待導入的細胞核。家養(yǎng)動物尤其是牛中，卵母細胞的活化期通常約為16-52小時，優(yōu)選地是抽出后約28-42小時。
例如，可以如Seshagine等，生物生殖，40，544-606，1989描述的，用HEPES緩沖的倉鼠胚培養(yǎng)基(HECM)沖洗非成熟卵母細胞，然后置于含10％胎牛血清并含適量促性腺激素例如黃體生成素(LH)和卵泡刺激激素(FSH)和雌二醇的50微升組織培養(yǎng)基(TCM)199中，上封一層輕質(zhì)石蠟或硅油，39℃保溫。
熟化一定時間后(該成熟期范圍約10-40小時，優(yōu)選地約16-18小時)卵母細胞去核。去核之前卵母細胞最好在細胞丘去除之前移至每毫升含1毫克透明質(zhì)酸酶的HECM中。這可以通過極細內(nèi)徑吸管反復抽吸或簡單地旋渦振蕩實現(xiàn)。然后篩選分離到的卵母細胞的極性體，由存在極性體確定的分裂中期II期卵母細胞用于核轉移。接著去核。
去核可以通過已知方法進行，例如美國專利No.4994384的描述，此處引入本文作為參考。例如，分裂中期II期卵母細胞既可以置于任選地每毫升含7.5毫克松胞菌素B的HECM中用于立即去核，也可以置于合適培養(yǎng)基，例如添加10％發(fā)情母牛血清的CR1aa中，然后去核，優(yōu)選地不超過24小時后，更優(yōu)選地不超過16-18小時。
去核可以通過顯微手術用微吸管除去極性體和周圍的胞漿實現(xiàn)。然后篩選卵母細胞確定其中已被成功去核的細胞。這種篩選可以通過用每毫升含1微克33342 Hoechst染料的HECM染色，然后紫外線下觀察卵母細胞少于10秒來完成。已成功去核的卵母細胞可被置于合適培養(yǎng)基中，例如，添加10％血清的CR1aa。
本發(fā)明中，受體卵母細胞優(yōu)選地在體外熟化開始后約10到約40小時之間，更優(yōu)選約16到約24小時，最優(yōu)選約16到約18小時去核。
然后將與去核卵母細胞異源的單動物細胞或人細胞轉移到用于制備NT單元的去核卵母細胞的卵周隙。動物或人細胞和去核卵母細胞將用于按照本領域已知方法制備NT單元。例如，可以用電融合方法融合細胞。由提供足以使得細胞質(zhì)膜短暫崩解的電脈沖實現(xiàn)電融合。因為膜迅速重新形成，細胞質(zhì)膜的崩解非常短暫。實質(zhì)上，如果誘導兩個鄰近膜崩解并重新形成互相摻和的脂質(zhì)雙分子層，兩個細胞之間的小通道將打開。由于該小通道的熱力學不穩(wěn)定性，它將擴大直到兩個細胞融合成一個。參見Prather等的美國專利4997384(此處全文引入作為參考)進一步討論了該方法?？梢允褂煤芏嚯娙诤辖橘|(zhì)，包括例如，蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸鹽緩沖液。也可以使用仙臺病毒作為融合劑實現(xiàn)融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。
一些條件下(例如，用小供體核)，優(yōu)選的直接將核注射到卵母細胞而不是用電穿孔融合。Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)公開了這種技術(此處全文引入作為參考)。
優(yōu)選的，人或動物細胞和卵母細胞在開始熟化約24小時后在500μm的小室中使用90-120V的電脈沖約15微秒進行電融合。融合后，產(chǎn)生的融合NT單元置于合適培養(yǎng)基例如CR1aa培養(yǎng)基直到活化。典型的活化將在其后較短時間內(nèi)完成，一般不超過24小時，優(yōu)選的約為之后4-9小時。
可以用已知方法活化NT單元。該方法包括，例如，在亞生理溫度培養(yǎng)NT單元，實際上使用冷或者低溫刺激NT單元。通過室溫培養(yǎng)NT單元可最為方便地操作，其相對于胚正常的生理溫度條件而言屬于低溫。
另外，可以使用已知的活化劑實現(xiàn)活化。例如，已表明受精過程精子穿透卵母細胞可以活化預融合的卵母細胞，以在核轉移后產(chǎn)生更大量的有效受孕和多個遺傳上相同的小牛。融合后的處理例如電休克和化學休克也可以用于活化NT胚。美國專利No.5496720(Susko-Parrish等)的目的即為提供合適的卵母細胞活化方法。
另外，可以同時也可以順次完成活化(i)增加卵母細胞中二價陽離子的水平，且(ii)降低卵母細胞中細胞蛋白質(zhì)的磷酸化。
這通常由將二價陽離子(例如，鎂、鍶、鋇或鈣，例如，以離子載體的形式)導入卵母細胞細胞質(zhì)完成。其它增加二價陽離子水平的方法包括使用電休克、用乙醇處理和用籠狀螯合劑處理。
可以用已知方法降低磷酸化，例如，添加激酶抑制劑，例如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，例如，6-二甲基-氨基-嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
另外，通過向卵母細胞導入磷酸酶例如磷酸酶2A和磷酸酶2B也可以抑制細胞蛋白質(zhì)的磷酸化。
優(yōu)選實施例中，融合后24小時內(nèi)，優(yōu)選融合后約4-9小時內(nèi)將融合的NT單元短暫接觸含5μM離子霉素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培養(yǎng)基，隨后用含30mg/ml BSA的TL-HEPES沖洗，實現(xiàn)NT的活化。
然后，活化的NT單元可以培養(yǎng)在合適的體外培養(yǎng)基中直到產(chǎn)生胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。培養(yǎng)和熟化胚胎的合適培養(yǎng)基是本領域已知的?？梢杂糜谂Ｅ咛ヅ囵B(yǎng)和維持的已知培養(yǎng)基的例子包括，Ham′sF-10+10％胎牛血清(FCS)、組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽液(PBS)、Eagle′s和Whitten′s培養(yǎng)基。用于收集和熟化卵母細胞的最常用的培養(yǎng)基之一是TCM-199，且添加1％-20％的血清，包括胎牛血清、新生兒血清、發(fā)情母牛血清、小羊血清或閹牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含帶有Earl鹽、10％胎牛血清、0.2MM Ma丙酮酸鹽和50μg/ml硫酸艮他霉素的TCM-199。上述的任一種也可以包括與不同細胞類型的共培養(yǎng)，例如粒細胞、輸卵管細胞、BRL細胞和子宮細胞和STO細胞。
Rosenkrans，Jr.等的美國專利5096822(此處引入作為參考)描述了另一種維持培養(yǎng)基。該稱為CR1的胚胎培養(yǎng)基包含支持胚胎所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。
CR1含有量為1.0mM到10mM的L-乳酸半鈣，優(yōu)選為1.0-5.0mM。L-乳酸半鈣是半鈣鹽與L-乳酸鹽組合形成。L-乳酸半鈣是滿足培養(yǎng)基兩個重要需要的典型單組分(i)滿足壓緊和細胞骨架排列的鈣需要(ii)滿足代謝和電子運輸?shù)娜樗猁}需要。L-乳酸半鈣也作為胚胎存活必需培養(yǎng)基的重要的礦質(zhì)和能量源。
CR1培養(yǎng)基的優(yōu)點是不含血清，例如胎牛血清，不需要使用動物細胞共培養(yǎng)物或其它生物培養(yǎng)基，即，含動物細胞例如輸卵管細胞的培養(yǎng)基。生物培養(yǎng)基有時也有缺點，它們也許含有可能對胚胎有害的難以檢測、定性和消除的微生物或痕量因子。
CR1培養(yǎng)基中主要成分的例子包括L-乳酸半鈣、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉和少量無脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma A-6003)。另外，可以加入培養(yǎng)基一定量必需和非必需氨基酸。加入氨基酸的CR1簡稱為″CR1aa″。
CR1培養(yǎng)基優(yōu)選的包含下述量的下述成分氯化鈉 --114.7mM氯化鉀 --3.1mM碳酸氫鈉 --26.2mML-乳酸半鈣--5mM無脂肪酸的BSA --3mg/ml優(yōu)選實施例中，活化的NT胚胎單元置于含1.9mM DMAP的CR1aa培養(yǎng)基約4小時，隨后在HECM中漂洗，然后在含BSA的CR1aa中培養(yǎng)。
例如，活化的NT單元可以轉移到含2.0mM DMAP(Sigma)的CR1aa培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境條件為，例如，約38.5℃，5％CO2培養(yǎng)一定時間，例如，約4-5小時。
之后，優(yōu)選地清洗培養(yǎng)的NT單元，然后置于合適培養(yǎng)基，例如，放置在含10％FCS和6mg/ml的CR1aa培養(yǎng)基，優(yōu)選地含合適生長程度的飼喂層的孔板中。合適飼喂層包括(以舉例的方式)，成纖維細胞和上皮細胞，例如，來源于有蹄動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞、雞成纖維細胞、鼠(如小鼠或大鼠)成纖維細胞、STO和SIm220飼喂細胞系和BRL細胞。
優(yōu)選實施例中，飼喂細胞包括鼠胚胎成纖維細胞。合適成纖維細胞飼喂層的制備方法在下面的實施例中描述，并且它已為普通技術人員公知。
NT單元培養(yǎng)在飼喂層上直到其達到可以用于制備胚胎干細胞樣細胞或細胞集落的合適的大小。優(yōu)選地，這些NT單元培養(yǎng)至至少約2-400個細胞，更優(yōu)選為約4-128個細胞，最優(yōu)選至少約50個細胞。在合適條件下進行培養(yǎng)，即約38.5℃，5％CO2，為最適于生長最好約每2-5天更換一次培養(yǎng)基，優(yōu)選地約每3天更換一次。
對于人細胞/去核牛卵母細胞形成的NT單元，在卵母細胞開始活化后約12天得到制備ES細胞集落的足夠細胞，一般約為50個細胞。然而，這可能依用作細胞核供體的特定細胞、特定物種的卵母細胞和培養(yǎng)條件而變化。基于培養(yǎng)的NT單元的形態(tài)，本領域技術人員可以容易地觀察確定是否已經(jīng)得到所需的足夠數(shù)量的細胞。
得到所需足夠數(shù)量NT單元后，從該區(qū)機械性地轉移細胞，用于制備胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞系。該操作優(yōu)選地取含NT單元(一般含至少約50個細胞)的細胞簇，清洗這些細胞，將這些細胞在飼喂層例如，輻照過的成纖維細胞上鋪板。典型地，用于制備干細胞樣細胞或細胞集落的細胞從培養(yǎng)的NT單元(優(yōu)選地至少約50個細胞)的最中間部分獲得。然而，較小或較大的NT單元以及NT單元的其它部分的細胞也可用于獲得ES樣細胞和細胞集落。細胞在飼喂層和合適生長培養(yǎng)基(例如，添加10％FCS、0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM)上維持生長。以最適于生長的需要更換生長培養(yǎng)基，例如，約每2-3天更換一次。
此培養(yǎng)過程導致胚胎細胞或干細胞樣細胞或細胞系的形成。對于人細胞/牛卵母細胞衍生的胚胎，在αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)約第二天觀察到集落。然而，這一時間可依特定的核供體細胞、特定的卵母細胞和培養(yǎng)條件而變化。本領域技術人員可以按照適于特定胚胎細胞或干細胞樣細胞生長的需要改變培養(yǎng)條件。
獲得的胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落一般呈現(xiàn)與用作核供體細胞的物種而不是提供卵母細胞的物種的胚胎細胞或干細胞樣細胞相似的外觀。例如，對于由轉移人供體細胞核到去核牛卵母細胞獲得的胚胎細胞或干細胞樣細胞，細胞表現(xiàn)的形態(tài)更類似鼠胚胎干細胞而不是牛ES樣細胞。
更特別的是，人ES系細胞集落的單獨細胞無明顯界限，僅發(fā)現(xiàn)集落周邊折光且表面光滑。而且細胞集落的倍增時間較長，約為鼠ES細胞倍增時間的兩倍。另外，與來自牛和豬的ES細胞不同，該集落不具有上皮樣外觀。
產(chǎn)生的胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞系，優(yōu)選為人胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞系，具有很多治療和診斷應用。更特別的，這種胚胎細胞或干細胞樣細胞可以用于細胞移植治療。人胚胎細胞或干細胞樣細胞可應用在很多病況的治療中。
在這點上，公知鼠胚胎干(ES)細胞能夠分化成幾乎任一類型的細胞型，例如，造血干細胞。因此，按照本發(fā)明制備的人胚胎細胞或干細胞樣細胞應該具有相似的分化能力。本發(fā)明的胚胎細胞或干細胞樣細胞將按照已知方法被誘導分化以便獲得希望的細胞類型。例如，在分化培養(yǎng)基中以及提供細胞分化的條件下培養(yǎng)目標人胚胎細胞或干細胞樣細胞，其可以被誘導分化形成造血干細胞、肌細胞、心肌細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿道細胞等。導致胚胎干細胞分化的合適的培養(yǎng)基和方法及合適的培養(yǎng)條件已為本領域公知。
例如，Palacios等，美國國家科學院學報，927530-7537(1995)講述了使用誘導程序處理干細胞從胚胎細胞系制備造血干細胞，該誘導程序包括在不含視黃酸的懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細胞的聚集體，隨后在含視黃酸的同樣培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將細胞聚集體轉移到能使細胞附著的基質(zhì)上。
另外，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6543-552(1994)的綜述參考了大量介紹用于胚胎干細胞體外分化以制備多種不同的細胞類型包括造血細胞、肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞等方法的文獻。
Bain等，Dev.Biol.，168342-357(1995)講述了胚胎干細胞體外分化以制備具有神經(jīng)元性質(zhì)的神經(jīng)細胞。這些參考文獻是從胚胎細胞或干細胞樣細胞獲得分化細胞的已報導的方法的例子。此處引入這些參考文獻，特別是此處公開的其中涉及分化胚胎干細胞方法的文獻作為參考。
因此，使用已知的方法和培養(yǎng)基，本領域的技術人員可以培養(yǎng)目標的胚胎細胞或干細胞樣細胞以獲得希望的分化細胞類型，例如，神經(jīng)細胞、肌細胞、造血細胞等。
目標胚胎細胞或干細胞樣細胞可以用于獲得任何希望的細胞類型。該分化人細胞的治療用途無可比擬。例如，人造血干細胞可以用于需要骨髓移植的治療中。該方法可被用于治療很多疾病，例如晚期癌癥例如卵巢癌和白血病，以及包括免疫系統(tǒng)疾病例如AIDS的疾病。可通過例如，癌癥或AIDS病人的成體體細胞例如上皮細胞或淋巴細胞與去核卵母細胞例如牛卵母細胞融合，以獲得上述的胚胎細胞或干細胞樣細胞，并在利于分化的條件下培養(yǎng)該細胞，直到獲得造血干細胞。這種造血細胞可以用于治療包括癌癥和AIDS等疾病。
或者，神經(jīng)性紊亂的病人的成體體細胞與去核動物卵母細胞例如牛卵母細胞融合，獲得人胚胎細胞或干細胞樣細胞，該細胞在分化條件下培養(yǎng)以制備神經(jīng)細胞系。用所述人神經(jīng)細胞移植可以治療的特定疾病包括(以舉例的方式)，帕金森病、阿爾茨海默病、ALS和大腦性麻痹等。帕金森病的特殊病例中，已經(jīng)證明了移植的胎兒腦神經(jīng)細胞促成與周圍細胞的正確聯(lián)系并產(chǎn)生多巴胺。這會導致帕金森病癥狀的長期逆轉。
本發(fā)明最大的優(yōu)點在于其可以基本上無限地提供適于移植的同基因的或同源的人細胞。因此，可以避免與目前移植方法有關的重大問題，即，由于宿主對移植體或移植體對宿主的排斥可能導致的移植組織的排斥問題。通常，由使用抗排斥藥物例如環(huán)胞菌素以防止或減小排斥。然而，這類藥物有顯著的不良副作用，例如，免疫抑制、致癌作用，并且也非常昂貴。本發(fā)明可以避免或者至少大大減少對抗排斥藥物的需求。
可以用同基因的細胞治療的其它疾病和病理癥狀包括(以舉例的方式)，脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌萎縮、糖尿病、肝病(即高膽固醇血癥)、心臟病、軟骨置換、灼傷、足潰瘍、胃腸道疾病、血管疾病、腎病、泌尿道疾病以及衰老相關的疾病和癥狀。
按照本發(fā)明制備的人胚胎細胞或干細胞樣細胞也可以用于制備基因工程或轉基因人分化細胞?；旧峡梢赃@樣實現(xiàn)，即導入希望的一種或多種基因(可以是異源的)，或者除去按照本發(fā)明制備的人胚胎細胞或干細胞樣細胞中其全部或部分內(nèi)源基因，使這種細胞分化成希望的細胞類型。實現(xiàn)這種修飾的優(yōu)選方法是同源重組，因為該技術可以在干細胞樣細胞基因組的一個或一些特定位點插入、缺失或修飾一種或多種基因。
這種方法可以用于替換缺陷基因，例如，缺陷免疫系統(tǒng)基因、囊性纖維化基因，或?qū)肽軌虮磉_治療有效蛋白質(zhì)的基因，例如生長因子、淋巴因子、細胞因子、酶等。例如，編碼腦生長因子的基因可以被導入人胚胎細胞或干細胞樣細胞，該細胞分化成神經(jīng)細胞，分化后的細胞移植給帕金森病病人以延遲該病過程中神經(jīng)細胞的丟失。
以前曾發(fā)現(xiàn)用BDNF轉染的細胞類型從原代細胞變?yōu)椴凰兰毎?，無論來源于神經(jīng)細胞還是非神經(jīng)細胞(成肌細胞和成纖維細胞)。例如，用逆轉錄病毒載體以BDNF基因轉染的星形細胞，且該細胞移植入帕金森疾病的大鼠模型(Yoshimoto等，腦研究，69125-36，(1995))。
在轉移后32天，這種離體治療在多達45％的大鼠中減少了帕金森樣癥狀。酪氨酸羥化酶基因也被導入星形細胞并產(chǎn)生類似的結果(Lundberg等，神經(jīng)發(fā)育，13939-53(1996)和其中引用的參考文獻)。
然而，該離體系統(tǒng)還存在問題。尤其是，目前使用的逆轉錄病毒載體在體內(nèi)被下調(diào)，轉基因僅得到瞬時表達(Mulligan綜述，科學，260926-932(1993))。這種研究中也使用了原代細胞，星形細胞，其生命周期有限且復制緩慢。這種性質(zhì)對轉染率不利，并妨礙穩(wěn)定轉染的細胞的篩選。而且，大量增殖用于同源重組技術中的基因靶向的原代細胞幾乎是不可能的。
相反，與逆轉錄病毒系統(tǒng)有關的困難通過使用人胚胎細胞或干細胞樣細胞可以消除。該項目代理人以前曾論證牛和豬胚胎細胞系可以被轉染并可以用于篩選異源DNA的穩(wěn)定整合體。1996年4月1日提交的申請?zhí)枮閁.S.No.08/626054的專利描述了該方法，全文引入作為參考。因此，使用該方法或其它已知方法，可以將所需基因?qū)肽繕巳伺咛ゼ毎蚋杉毎麡蛹毎?，使細胞分化成希望的細胞類型，例如，造血細胞、神?jīng)細胞、胰細胞、軟骨細胞等。
可被導入目標胚胎細胞或干細胞樣細胞的基因包括(以舉例的方式)，表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、源于膠質(zhì)的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、胰島素樣生長因子(I和II)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、AFT-1、細胞因子基因(白介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子(α和β)等)、編碼治療酶的基因等。
目標胚胎細胞或干細胞樣細胞，優(yōu)選地人細胞，也可以用作體外分化模型，特別是用于涉及早期發(fā)育調(diào)節(jié)的基因研究。
利用目標胚胎細胞或干細胞樣細胞的分化細胞組織和器官也可用于藥物研究。
另外，目標胚胎細胞或干細胞樣細胞可以用作制備其它胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落的核供體。
提供下列實施例以更清楚地描述本發(fā)明。
實施例1材料和方法用于核轉移的供體細胞用標準載玻片輕輕刮下志愿成人口腔內(nèi)部的上皮細胞。用不含Ca或Mg的磷酸緩沖鹽液將細胞從載玻片上沖入培養(yǎng)皿。用小內(nèi)徑吸液管抽吸細胞以便打散細胞團形成單細胞懸液。然后將細胞轉移到含10％胎牛血清(FCS)的TL-HEPES培養(yǎng)基微滴中，表面油封用以細胞核轉移到去核牛卵母細胞中。核轉移程序前面曾描述過基本核轉移程序。簡單的說，即屠宰場的卵母細胞體外熟化后，去除卵母細胞的細胞丘，熟化后約18小時(hpm)用斜面微吸液管去核。在添加雙芐亞胺(Hoechst 33342，3μg/ml；Sigma)的TL-HEPES培養(yǎng)基中證實去核。然后將各個供體細胞置入受體卵母細胞的卵周隙空間。牛卵母細胞細胞質(zhì)和供體核(NT單元)用電融合技術融合。應用90V，15微秒的融合脈沖作用于NT單元。該操作在卵母細胞開始熟化后24小時(hpm)進行。NT單元置于CR1aa培養(yǎng)基直到28 hpm。
其它文章曾描述過人工活化卵母細胞的方法。NT單元的活化在28hpm。活化方法簡單描述如下NT單元在添加1mg/ml BSA的TL-HEPES中與離子霉素(5μM；CalBiochem，La Jolla，CA)接觸四分鐘，然后，在添加30mg/ml BSA的TL-HEPES中漂洗5分鐘。隨后，NT單元轉移到含0.2mM DMAP(Sigma)的CR1aa培養(yǎng)基微滴中，于38.5℃、5％CO2培養(yǎng)四到五小時。清洗NT單元，然后置于添加10％FCS和6mg/ml BSA的CR1aa培養(yǎng)基，放入含鼠胚胎成纖維細胞(如下述)生長至鋪滿的飼喂層的四個孔板。NT單元于38.5℃和5％CO2下再培養(yǎng)三天。培養(yǎng)基每三天更換一次直到活化后第十二天。此時將達到所需細胞數(shù)，即約50個細胞的NT單元機械性地移出該區(qū)，用于制備胚胎細胞系。如上述獲得的NT單元的照片如圖1所示。成纖維細胞飼喂層胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)物來源于14-16天齡的鼠胎。無菌除去頭、肝、心臟和食道后切碎鼠胚胎，在預熱的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中37℃保溫30分鐘。成纖維細胞在組織培養(yǎng)瓶中接種，在添加10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。傳代后三到四天，胚胎成纖維細胞置于35×10Nunc的培養(yǎng)皿(Baxter Scientific，McGaw Park，IL)輻照。輻照后的成纖維細胞在潮濕并含5％CO2的大氣中37℃生長和維持。然后具有一致的細胞單層的培養(yǎng)板用于培養(yǎng)胚胎細胞系。胚胎細胞系的制備清洗如上述獲得的NT單元細胞，直接鋪在輻照過的飼喂成纖維細胞平板上。這些細胞包括NT單元的內(nèi)部細胞。細胞在添加10％FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)的生長培養(yǎng)基αMEM中維持。生長培養(yǎng)基每兩到三天更換一次。至培養(yǎng)第二天觀察到初始集落。增殖該集落，其表現(xiàn)與以前公開的鼠胚胎干(ES)細胞相似的形態(tài)。集落中的個體細胞界限不明顯，克隆的周界折光且表觀光滑。細胞集落表現(xiàn)比鼠ES細胞慢的細胞倍增時間。與牛和豬形成的ES細胞不同，迄今為止集落沒有發(fā)現(xiàn)上皮樣外觀。圖2-圖5是如上述獲得的ES樣細胞集落的照片。分化人細胞的制備獲得的人胚胎細胞轉移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到獲得分化的人細胞類型。
結果表1.人細胞作為NT單元制備和擴增的供體細胞核表1
將形成超過16個細胞結構一種的NT單元在成纖維細胞飼喂層上鋪板。該結構附著于飼喂層并開始增殖形成ES細胞樣形態(tài)的集落(參見，例如，圖2)。而且，雖然4-16細胞期的結構未曾試過制備ES細胞集落，但以前曾表明該期細胞可以制備ES或ES樣細胞系(鼠Eistetter等人，生長、發(fā)育和分化，31275-282(1989)；牛Stice等人，1996)。因此，認為4-16細胞期的NT單元也可以增殖成胚胎細胞或干細胞樣細胞和細胞集落。
雖然已參考各種特定材料、方法和實施例描述和說明本發(fā)明，應該理解本發(fā)明不限于該特定材料、材料的組合和實現(xiàn)該目的的方法。本領域技術人員可以知曉和利用這些細節(jié)的許多變化。
權利要求
1.一種制備胚胎細胞或干細胞樣細胞的方法，包括下列步驟(i)在適于形成核轉移(NT)單元的條件下，在去核動物卵母細胞中插入希望的人或哺乳動物細胞或細胞核，其中該卵母細胞來源于與人或哺乳動物細胞不同的動物種類；(ii)活化所得的核轉移單元；(iii)培養(yǎng)所述活化的核轉移單元直到超過2細胞發(fā)育期；且(iv)培養(yǎng)獲自所述培養(yǎng)的NT單元的細胞，以獲得胚胎細胞或干細胞樣細胞。
2.權利要求1的方法，其中插入去核動物卵母細胞的細胞是人細胞。
3.權利要求2的方法，其中所述人細胞是成體細胞。
4.權利要求2的方法，其中所述人細胞是上皮細胞或淋巴細胞。
5.權利要求2的方法，其中卵母細胞獲自哺乳動物。
6.權利要求5的方法，其中該動物卵母細胞來自有蹄動物。
7.權利要求6的方法，其中所述有蹄動物選自牛、羊、豬、馬、capine和水牛。
8.權利要求1的方法，其中去核卵母細胞在去核前被熟化。
9.權利要求1的方法，其中融合的核轉移單元通過接觸離子霉素和DMAP而活化。
10.權利要求1的方法，其中活化的核轉移單元在飼喂層培養(yǎng)物上培養(yǎng)。
11.權利要求10的方法，其中飼喂層包括成纖維細胞。
12.權利要求1的方法，其中第IV步中來自具有16細胞或更多細胞的NT單元的細胞在飼喂細胞層上培養(yǎng)。
13.權利要求12的方法，其中所述飼喂細胞層包括成纖維細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述成纖維細胞包括鼠胚胎成纖維細胞。
15.權利要求1的方法，其中所得的胚胎細胞或干細胞樣細胞被誘導分化。
16.權利要求2的方法，其中所得的胚胎細胞或干細胞樣細胞被誘導分化。
17.權利要求1的方法，其中融合通過電融合實現(xiàn)。
18.按照權利要求1的方法獲得的胚胎細胞或干細胞樣細胞。
19.按照權利要求2的方法獲得的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
20.按照權利要求3的方法獲得的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
21.按照權利要求4的方法獲得的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
22.按照權利要求6的方法獲得的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
23.按照權利要求7的方法獲得的人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
24.按照權利要求16的方法獲得的分化的人細胞。
25.權利要求24的分化的人細胞，其選自神經(jīng)細胞、造血細胞、胰細胞、肌細胞、軟骨細胞、泌尿道細胞、肝細胞、脾細胞、生殖細胞、皮膚細胞、腸細胞和胃細胞。
26.一種治療方法，包括對需要細胞移植治療的病人施用按照權利要求24的等基因的分化的人細胞。
27.權利要求26的方法，其中所述細胞移植治療對治療下述疾病或病理狀況有效帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、灼傷、足潰瘍、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS和癌癥。
28.權利要求26的方法，其中分化的人細胞是造血細胞或神經(jīng)細胞。
29.權利要求26的方法，其中治療是治療帕金森病，分化的細胞是神經(jīng)細胞。
30.權利要求26的方法，其中治療是治療癌癥，分化的細胞是造血細胞。
31.權利要求24的分化的人細胞，其包含并表達一種插入的基因。
32.權利要求1的方法，其中在所述胚胎細胞或干細胞樣細胞中一種希望的基因被插入、除去或修飾。
33.權利要求32的方法，其中希望的基因編碼治療酶、生長因子或細胞因子。
34.權利要求32的方法，其中所述胚胎細胞或干細胞樣細胞是人胚胎細胞或干細胞樣細胞。
35.權利要求32的方法，其中通過同源重組除去、修飾或刪除希望的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將供體細胞核移植入不同于供體細胞物種的去核卵母細胞的核轉移的改進方法。產(chǎn)生的細胞核轉移單元用于制備等基因的胚胎干細胞,特別是人類等基因的胚胎或干細胞。這些胚胎或干細胞樣細胞可用于制備希望的分化細胞和導入、去除或修飾希望的基因,例如在這些細胞基因組的特定位點通過同源重組。這些可能含有異源基因的細胞在細胞移植治療和體外細胞分化研究中尤其有用。
文檔編號A61K35/12GK1230989SQ97198083
公開日1999年10月6日 申請日期1997年7月28日 優(yōu)先權日1996年8月19日
發(fā)明者J·羅伯, J·希貝利, S·L·斯提思 申請人:馬薩諸塞大學