專利名稱：Exodus化學(xué)激活素物質(zhì)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及化學(xué)激活素、更具體地說(shuō)涉及純化的和分離的編碼命名為Exodus的人C-C化學(xué)激活素及其類似物的多聚核苷酸，涉及由所述多聚核苷酸編碼的純化的和分離的化學(xué)激活素多肽，涉及用于這些多肽之重組生產(chǎn)的材料和方法，涉及這些多肽的治療用途、特別是化療中的脊髓保護(hù)、治療骨髓組織增生性疾病和用于治療獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。
本發(fā)明
背景技術(shù)：
化學(xué)激活素(亦稱為“間分泌素”和“SIS細(xì)胞因子”)包括一個(gè)超家族的小分泌蛋白(約70-100氨基酸，大小約8-12千道爾頓)，它們主要調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移和激活，因此幫助刺激和調(diào)節(jié)該免疫系統(tǒng)。該“化學(xué)激活素”名稱來(lái)自名詞趨化細(xì)胞因子，指這些蛋白質(zhì)刺激白細(xì)胞趨化性的能力。確實(shí)，化學(xué)激活素可以包括炎癥細(xì)胞進(jìn)入病理組織的主要引誘劑。[一般參見(jiàn)Baggiolini等，Advances in Immunology,55:97-179(1994)；Oppenheim,The Chemokines,Lindley等編輯，第183-186頁(yè)，Plenum Press,NY(1993))]。盡管化學(xué)激活素一般由白細(xì)胞分泌，但有幾種化學(xué)激活素在眾多組織中表達(dá)。Baggiolini等，見(jiàn)上述，表Ⅱ。一些化學(xué)激活素亦激活或吸引除白細(xì)胞之外的多種細(xì)胞，例如內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
以前鑒定的化學(xué)激活素一般展示彼此之間有20-70％的氨基酸相同并含有四個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基。根據(jù)這些半胱氨酸殘基的前二個(gè)殘基的相對(duì)位置，已經(jīng)將化學(xué)激活素進(jìn)一步分類為二個(gè)亞家族。在“C-X-C”或“α”亞家族(由定位于第4條人染色體上的基因編碼)中，前二個(gè)半胱氨酸被一個(gè)氨基酸隔開(kāi)。在“C-C”或“β”亞家族(由基因定位于第17條人染色體上的基因編碼)中，前二個(gè)半胱氨酸相鄰。對(duì)幾種化學(xué)激活素的X-射線晶體學(xué)和NMR研究已經(jīng)表明在每個(gè)家族中，第一和第三個(gè)半胱氨酸形成第一個(gè)二硫橋，而第二個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸形成第二個(gè)二硫橋，強(qiáng)烈地影響所述蛋白的天然構(gòu)象。僅在人類中，對(duì)每個(gè)化學(xué)激活素亞家族已描述了將近十個(gè)不同的序列。這兩個(gè)亞家族的化學(xué)激活素都有20-25個(gè)氨基酸的特征前導(dǎo)序列。
當(dāng)比較任何二種氨基酸序列時(shí)，C-X-C化學(xué)激活素(包括IL-8、GROα/β/γ、血小板堿性蛋白、血小板因子4(PF4)、嗜中性粒細(xì)胞激活肽-2(NAP-2)、巨噬細(xì)胞趨化激活因子(MCAF)、IP-10和其它化學(xué)激活素)有25％-60％的相同性(除了GROα/β/γ成員，它們之間有84-88％相同性)。大多數(shù)的亞家族成員(不包括IP-10和血小板因子4)在前二個(gè)半胱氨酸殘基的上游都有一共同的E-L-R三肽基元。C-X-C化學(xué)激活素一般是嗜中性粒細(xì)胞的有效刺激劑，導(dǎo)致迅速的外形改變、趨化性、呼吸釋放和去顆粒。某些C-X-C化學(xué)激活素(包括IL-8)N末端氨基酸序列的特定截短與活性的顯著增加相聯(lián)系。
C-C化學(xué)激活素(包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-1α[Nakao等，Mol.Cell Biol.,10:3646(1990)]和MIP-1β[Brown等，J.Immunol.,142:679(1989)]、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1[Matsushima等，J.Exp.Med.,169:1485(1989)]、MCP-2[Van Danune等，J.Exp.Med.,176:59(1992)和Chang等，Int.Immunol.,1:388(1989)]和MCP-3[Van Damme等，見(jiàn)上述]、RANTES[Schall等，J.Immunol.141:1018(1988)]、Ⅰ-309[Miller等，J.Immunol,143:2907(1989)]、eotaxin[Rothenberg等，J.Exp.Med.,181:1211-1216(1995)]和其它，相互之間有25％-70％的氨基酸相同。C-C化學(xué)激活素一般激活單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，但不激活嗜中性粒細(xì)胞。大多數(shù)已報(bào)道的C-C化學(xué)激活素激活單核細(xì)胞，導(dǎo)致鈣流出和趨化性。在淋巴細(xì)胞例如對(duì)RANTES最強(qiáng)烈應(yīng)答的T-淋巴細(xì)胞上可以看到更加選擇性的效果。
根據(jù)結(jié)構(gòu)同源性和相似活性可以將C-C化學(xué)激活素進(jìn)一步亞分類。與該家族的其它成員相比，MIP-1α、MIP-1β和RANTES有更相近的同源性和生物學(xué)活性范圍。C-C化學(xué)激活素家族的另一亞家族是單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)，它們相互之間在結(jié)構(gòu)上比C-C化學(xué)激活素家族的其它成員更相似，并且優(yōu)先刺激單核細(xì)胞遷移和對(duì)炎癥刺激物應(yīng)答。
用缺失和置換類似物的研究已經(jīng)表明關(guān)鍵受體結(jié)合區(qū)似乎主要在所述化學(xué)激活素的氨基末端殘基，其后是在第二個(gè)半胱氨酸之后的環(huán)內(nèi)的第二個(gè)區(qū)。功能的這些一般要求看起來(lái)對(duì)所有的化學(xué)激活素都是相同的。[Clark-Lewis等，J.Leukocyte Bio.57:703(1995)]。
化學(xué)激活素受體是七個(gè)跨膜區(qū)類視紫質(zhì)G蛋白偶聯(lián)受體。Holmes等(Science,253:1278-83(1991))已克隆了IL-8的特異性受體，而Murphy和Tiffany(Science,253:1280-83(1991))已克隆了識(shí)別IL-8、GRO和NAP-2的相似受體(77％相同性)。迄今為止已克隆了5個(gè)C-C化學(xué)激活素受體:識(shí)別MIP-1α和RANTES的C-C化學(xué)激活素受體-1(CCR-1)[Neote等，Cell,72:415-425(1993)],MIP-1α、RANTES和MCP-1的受體(CCR-4)[Power等，J.Biol.Chem.,270:19495-19500(1995)]、MCP-1受體(CCR-2B)[Charo等，Proc.Nat.Acad Sci.,91:2752-56(1994)]和eotaxm受體(CCR-3)[Combadiere等，J.Biol Chem.27D:16491-16494(1995)]以及MIP-1α、MIP-1β和RANTES的受體(CCR-5)[Raport等，J.Biol.Chem.,271:7161-17166(1996)]。
這些受體趨向于多功能，可以結(jié)合多種不同的化學(xué)激活素。所述受體本身在人類疾病中可以起作用。例如，與包括IL-8、NAP-2、GROα、RANTES、MCP-1的化學(xué)激活素積極結(jié)合的人血紅細(xì)胞上的Duffy抗原(也稱為紅細(xì)胞化學(xué)激活素受體)是引起瘧疾的寄生蟲Plasmodium knowlesi的侵入受體。二種皰疹病毒科病毒松鼠猴皰疹病毒和人巨細(xì)胞病毒也似乎編碼功能性化學(xué)激活素受體同系物。[Ahuja等，Immunol.Today,15:281-(1994)；Murphy,Ann.Rev.Immnol.,12:593-633(1994)；Horuk,TIPS,15:159(1994).]因?yàn)榛瘜W(xué)激活素的前炎癥活性，據(jù)信化學(xué)激活素在廣泛的涉及炎癥組織破壞的多種疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞和成人呼吸窘迫綜合癥)中起作用。已有充分文字記錄多種化學(xué)激活素特別是C-X-C化學(xué)激活素IL-8在各種病理狀態(tài)下的作用。一般參見(jiàn)Baggiolini等，見(jiàn)上述，表Ⅶ。例如，幾項(xiàng)研究已觀察到在患風(fēng)濕性疾病、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)的病人發(fā)炎關(guān)節(jié)滑液中有高水平的IL-8。牛皮癬也與IL-8過(guò)量產(chǎn)生有聯(lián)系。
已有文件證明C-C化學(xué)激活素在病理狀態(tài)中的作用。例如，患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人滑液中的MCP-1濃度比患其它關(guān)節(jié)疾病的病人高。依賴于MCP-1的單核吞噬細(xì)胞的流入在特發(fā)性肺纖維變性的發(fā)展中可能是重要的事件。目前強(qiáng)烈關(guān)注的是C-C化學(xué)激活素在補(bǔ)充單核細(xì)胞到動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域的作用，在富有巨噬細(xì)胞的動(dòng)脈壁區(qū)域檢測(cè)到增強(qiáng)MCP-1表達(dá)，但在正常動(dòng)脈組織中未檢測(cè)到增強(qiáng)的MCP-1表達(dá)。MCP也可能參與誘導(dǎo)血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。MCP-1在惡性細(xì)胞中的表達(dá)已顯示抑制這類細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤的能力。(參見(jiàn)美國(guó)專利5,179,078號(hào)，該專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
其它化學(xué)激活素活性包括抑制骨髓祖細(xì)胞增殖的能力。重組MCP-1α而不是MCP-1β已顯示抑制干細(xì)胞和祖細(xì)胞的骨髓組織形成，并似乎在其抑制多能祖細(xì)胞(粒細(xì)胞-紅系-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞的集落形成單位，CFU-GEMM)和紅系爆增形成單位的亞群(BFU-E)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞的集落形成單位(CFU-GM)的生長(zhǎng)因子刺激的增殖的能力上有選擇性。[Broxmeyer等，Blood,76:1110-1116(1990)。]這些效應(yīng)不是細(xì)胞毒性效應(yīng)，而是細(xì)胞周期停滯。亦有報(bào)道MIP-2α、IL-8、PF4和MCAF是造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞增殖的抑制劑。[Broxmeyer等，J.Immunol.,150:3448-3458(1993)；Broxmeyer等，Ann.Hematol.,71:235-246(1995)]。這些化學(xué)激活素看來(lái)直接在骨髓祖細(xì)胞水平上作用。一些報(bào)道表明MIP-1α有保護(hù)多能造血細(xì)胞免受化療藥劑的細(xì)胞毒性作用的潛力。[Dunlop等，Blood,79:2221-2225(1992)和Lord等，Blood,79:2605-2609(1992).]。據(jù)報(bào)道正在進(jìn)行做為具有Cytoxan_(來(lái)自Bristol-Myers Squibb Oncology的環(huán)磷酰胺)的骨髓保護(hù)劑的MIP-1α類似物(命名為BB10010,British Biotechnology)的應(yīng)用的臨床試驗(yàn)。
最近，有幾個(gè)報(bào)道表明一些C-C化學(xué)激活素(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的產(chǎn)生。[Cocchi等，Science,270:1811(1996)；Fauci,Nature,378:561(1996).]。一項(xiàng)研究報(bào)道那些接觸HIV但卻保持HIV陰性的個(gè)體的CD4+淋巴細(xì)胞表達(dá)高水平的這些C-C化學(xué)激活素。[Paxton等，Nature Med.,2:412(1996).]。通過(guò)分離和鑒別做為該化學(xué)激活素受體家族成員的HIV輔受體(coreceptor)提出了這種抑制的潛在機(jī)制。結(jié)合RANTES、MIP-1α和MIP-1β的CCR-5受體已鑒定出是大多數(shù)親巨噬細(xì)胞HIV毒株的主要輔受體[Deng等，Nature,381:661(1996)；Dragic等，Nature,381:667(1996)；Alkhatib等，Science,272:1955(1996)]。已有報(bào)道特定原代HIV-1親巨噬細(xì)胞毒株于體外與CCR-3和CCR-2B受體相互作用[Choe等，Cell,85:1135(1996)；Doranz等，Cell,85:1149(1996)]。命名為“融合素(Fusin)”的化學(xué)激活素受體(現(xiàn)已知為C-X-C化學(xué)激活素受體CXCR-4)已被鑒定為HIV親T細(xì)胞毒株的受體[Feng等，Science,272:872(1996)]。這些HIV輔受體屬于化學(xué)激活素受體家族，看來(lái)是與CD4一起的、HIV病毒融合和進(jìn)入人靶細(xì)胞的輔因子。
因此有必要鑒別和表征其它的C-C化學(xué)激活素，以進(jìn)一步闡明該重要的分子家族在病理狀態(tài)下的作用，并開(kāi)發(fā)使用化學(xué)激活素衍生產(chǎn)物對(duì)這類疾病的改進(jìn)治療。
本發(fā)明感興趣的是于1996年2月29日公布的國(guó)際公開(kāi)WO96/05856，它報(bào)告了從分別得自人膽囊和9周齡人胎組織的cDNA文庫(kù)中鑒別了二種化學(xué)激活素，分別稱為人化學(xué)激活素β-4(Ckβ-4)和人化學(xué)激活素β-10(Ckβ-10)。Ckβ-4與此處描述的Exodus化學(xué)激活素在DNA和氨基酸序列方面非常相似(與Exodus前導(dǎo)序列的22個(gè)氨基酸相比，區(qū)別在于Ckβ-4在成熟Exodus化學(xué)激活素的殘基4后有一個(gè)額外的丙氨酸，并且報(bào)道的Ckβ-4的推測(cè)前導(dǎo)序列是24個(gè)氨基酸)。尚未確定化學(xué)激活素Ckβ-4或Ckβ-10的生物學(xué)活性。具體地說(shuō)，該公開(kāi)并未提及這些化學(xué)激活素在HIV感染的發(fā)病機(jī)制中的任何潛在作用，也未具體描述這些化學(xué)激活素治療骨髓組織增生性疾病的用途。
亦值得注意的是另一個(gè)命名為Exodus-2的C-C化學(xué)激活素的克隆，看來(lái)它與Exodus/MIP-3α-LARC緊密相關(guān)，有31％的氨基酸相同性和在頭二個(gè)半胱氨酸周圍有同一特有的Asp-Cys-Cys-Leu基元。[Hromas等，J.Immunol,159:2554-2558(1997).]。
已顯示C-C亞家族的化學(xué)激活素有在醫(yī)學(xué)成像(例如感染部位、炎癥部位和其它具有C-C化學(xué)激活素受體分子的部位的成像)方面的用途。參見(jiàn)例如Kunkel等，美國(guó)專利5,413,778號(hào)，該專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這類方法涉及用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將標(biāo)記劑(例如放射性同位素)化學(xué)連接至該化學(xué)激活素(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,965,392號(hào)和5,037,630號(hào)，這些專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)、將該標(biāo)記化學(xué)激活素在藥學(xué)上可接受的載體中給與受治療者、使該標(biāo)記化學(xué)激活素在目標(biāo)部位富集、并在該目標(biāo)部位使該標(biāo)記化學(xué)激活素成像。本領(lǐng)域需要其它的新C-C化學(xué)激活素以增加可用的醫(yī)學(xué)成像工具庫(kù)。
更普遍的是，由于化學(xué)激活素做為趨化性和炎癥的介質(zhì)的重要性，需要鑒定和分離該化學(xué)激活素家族的新成員以促進(jìn)炎癥和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。例如，促進(jìn)免疫應(yīng)答的物質(zhì)可以促進(jìn)傷口愈合或從提高傳染性疾病(例如肺炎)康復(fù)的速度。抑制化學(xué)激活素的前炎癥效果的物質(zhì)可以用于治療由炎癥介導(dǎo)的病理狀態(tài)，例如關(guān)節(jié)炎、Crohn病和其它自免疫疾病。
另外，已建立的化學(xué)激活素表達(dá)與炎癥性疾病和疾病狀態(tài)之間的相互關(guān)系提供了使用化學(xué)激活素和特異性地與化學(xué)激活素進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)的診斷和預(yù)后指標(biāo)；有必要鑒定和分離新的化學(xué)激活素以促進(jìn)這類診斷和預(yù)后指標(biāo)。
由于以上所有理由，需要新發(fā)現(xiàn)化學(xué)激活素生產(chǎn)的重組方法，該方法促進(jìn)涉及所述化學(xué)激活素和/或化學(xué)激活素抑制劑的臨床應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供純化的和分離的編碼命名為Exodus的人C-C化學(xué)激活素的多聚核苷酸及其片段或類似物；純化的和分離的Exodus多肽及其片段和類似物；重組生產(chǎn)這些多肽及其片段和類似物的材料和方法；抗這類Exodus多肽和類似物的抗體；包含這些多肽、片段、類似物或抗體的藥用組合物；和使用這些多肽、片段、類似物或抗體的治療(包括預(yù)防性和治療性治療)，滿足了一個(gè)或多個(gè)上述需要。
Exodus是C-C化學(xué)激活素家族的一員，它優(yōu)先在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)并由炎癥刺激物顯著增量調(diào)節(jié)。編碼Exodus的cDNA的推導(dǎo)氨基酸序列長(zhǎng)95個(gè)氨基酸，其中首22個(gè)N末端殘基包含一個(gè)信號(hào)序列。在本文中證明的其生物學(xué)活性預(yù)計(jì)使其在多種不同的臨床應(yīng)用中有用。與其它C-C化學(xué)激活素一樣，它刺激單核細(xì)胞的趨化性。Exodus顯著地抑制造血祖細(xì)胞增殖并且也抑制在受感染細(xì)胞中HIV的產(chǎn)生。
本發(fā)明具體提供純化的編碼SEQ IN NO:2的Exodus氨基酸序列的多聚核苷酸(即DNA和RNA，有義鏈和反義鏈)，特別是包含由SEQ ID NO:1的核苷酸序列的Exodus蛋白編碼部分(核苷酸43-327)組成的核苷酸序列的DNA；純化的編碼SEQ IN NO:2的第1-73個(gè)氨基酸的多聚核苷酸，特別是包含由SEQ ID NO:1的109-327核苷酸組成的核苷酸序列的DNA；和純化的編碼選自以下的全長(zhǎng)Exodus的多聚核苷酸(a)SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸；(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交或若不是該遺傳密碼的簡(jiǎn)并性就可在嚴(yán)格條件下與其雜交的多聚核苷酸；和(c)與SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸編碼的相同的Exodus多肽的多聚核苷酸。本發(fā)明亦提供包含這類多聚核苷酸的載體，特別是其中編碼Exodus的DNA可操作地與一表達(dá)控制DNA序列連接的表達(dá)載體，亦提供用這種多聚核苷酸DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞和通過(guò)培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞生產(chǎn)Exodus以及從所述宿主細(xì)胞或其營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離該Exodus的相應(yīng)方法。本發(fā)明另外亦提供純化的Exodus多肽，特別是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽、或包含SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的多肽。本發(fā)明的另一方面提供與Exodus特異性反應(yīng)的抗體，包括單克隆抗體和產(chǎn)生這類單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明的再一方面提供通過(guò)向受治療者(特別是該受治療者有接觸HIV的風(fēng)險(xiǎn)或曾經(jīng)接觸過(guò)HIV或已被HIV感染)給與一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物以增強(qiáng)對(duì)HIV感染抗性的方法。本發(fā)明的這一方面亦提供治療HIV感染的方法，包括向感染HIV的受治療者給與一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面提供保護(hù)骨髓祖細(xì)胞免受細(xì)胞毒性作用的方法，包括給與一定量的有效抑制骨髓祖細(xì)胞增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物，特別是其中該受治療者正接受化療或放療。本發(fā)明的再一方面提供治療骨髓組織增生性疾病的方法，包括給與一定量的有效抑制惡性骨髓祖細(xì)胞增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物。下面更完全地描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供純化的和分離的編碼Exodus的多聚核苷酸(即DNA和RNA，有義鏈和反義鏈)。本發(fā)明優(yōu)選的DNA序列包括基因組序列和cDNA序列和化學(xué)合成的DNA序列。
SEQ ID NO:1提出了編碼該Exodus化學(xué)激活素包括5’和3’非編碼序列的cDNA的核苷酸序列。第43-327核苷酸包含SEQ ID NO:1的DNA的Exodus蛋白編碼部分，本發(fā)明優(yōu)選的DNA包含SEQ ID NO:1的第109-327核苷酸，它包含該成熟的分泌Exodus蛋白的推斷編碼序列但無(wú)其信號(hào)序列。
化學(xué)激活素Exodus的氨基酸序列列于SEQ ID NO:2。本發(fā)明優(yōu)選的多聚核苷酸除上述多聚核苷酸之外，包括編碼列于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多聚核苷酸，并且僅因該遺傳密碼眾所周知的簡(jiǎn)并性而不同于前述段落中描述的多聚核苷酸。
同樣地，因?yàn)镾EQ ID NO:2的22個(gè)氨基酸(位置-22至-1)包含被切割而產(chǎn)生成熟Exodus化學(xué)激活素的信號(hào)肽，優(yōu)選的多聚核苷酸包括那些編碼SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的多聚核苷酸。因此，優(yōu)選的多聚核苷酸是一純化的多聚核苷酸，它編碼具有包括SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的氨基酸序列。
在本發(fā)明的多聚核苷酸的用途之中是做為雜交探針使用，以識(shí)別和分離編碼人Exodus的基因組DNA，該基因可能具有C-C化學(xué)激活素基因的三個(gè)外顯子/二個(gè)內(nèi)含子的特征性結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Baggiolini等，見(jiàn)上述)；以鑒別和分離編碼與Exodus同源的蛋白的非人類基因；以交鑒別具有與Exodus相似性的人類和非人類化學(xué)激活素；和以識(shí)別那些表達(dá)Exodus的細(xì)胞和表達(dá)該蛋白的條件。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的DNA的Exodus編碼部分的互補(bǔ)鏈雜交的純化多聚核苷酸。同樣地，本發(fā)明提供若不是該遺傳密碼的簡(jiǎn)并性就可在嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO:1的DNA的Exodus編碼部分的互補(bǔ)鏈雜交的純化的多聚核苷酸。典型的嚴(yán)格雜交條件如下述:于42℃在5X SSC、20mM NaPO4、pH6.8、50％甲酰胺中進(jìn)行雜交；于42℃在0.2X SSC中清洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解最好根據(jù)欲雜交的序列的長(zhǎng)度和GC核苷酸堿基的含量經(jīng)驗(yàn)性地變化這些條件，并有確定這種變化的準(zhǔn)則。[參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。第二版，冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989)。]在另一方面中，本發(fā)明包括加入本發(fā)明DNA(包括任何上述的DNA)的質(zhì)粒和病毒DNA載體。優(yōu)選的載體包括表達(dá)載體，其中加入的Exodus編碼cDNA可操作地與一內(nèi)源或異源表達(dá)控制序列連接。這類表達(dá)載體亦可以包括與該Exodus編碼DNA序列可操作地連接的多肽編碼DNA序列，該載體可以表達(dá)這些序列，產(chǎn)生包含該目的Exodus多肽的融合蛋白。
在另一方面中，本發(fā)明包括用本發(fā)明的DNA或載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的宿主細(xì)胞中，表達(dá)由本發(fā)明的DNA或載體編碼的該Exodus多肽。本發(fā)明的DNA、載體和宿主細(xì)胞可以用于例如重組生產(chǎn)大量的本發(fā)明Exodus多肽的方法中。這些方法本身也是本發(fā)明的方面。例如，本發(fā)明包括生產(chǎn)Exodus的方法，其中本發(fā)明的宿主細(xì)胞在合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并從該細(xì)胞或該培養(yǎng)基中分離Exodus蛋白。
在再一方面，本發(fā)明包括純化的和分離的Exodus多肽。優(yōu)選的多肽是具有包含SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的氨基酸序列的純化的化學(xué)激活素多肽?？梢詮奶烊粊?lái)源純化本發(fā)明的多肽，但最好使用本發(fā)明的DNA、載體和/或宿主細(xì)胞用重組方法生產(chǎn)或化學(xué)合成。本發(fā)明的純化多肽可以是糖基化(例如O-連接或N-連接)或非糖基化、水溶性或不溶性、氧化的、還原的等等，取決于選擇的宿主細(xì)胞、重組生產(chǎn)方法、分離方法、加工、儲(chǔ)存緩沖液之類?；蛘?，采用已成功地用于其它化學(xué)激活素例如IL-8[Clark-Lewis等，J.Biol Chem.,266:23128-34(1991)]和MIP-1生產(chǎn)的技術(shù)，通過(guò)化學(xué)肽合成制備Exodus多肽。
本發(fā)明亦考慮Exodus多肽片段，其中缺失一個(gè)或多個(gè)N末端或C末端氨基酸殘基，并且保持一個(gè)或多個(gè)C-C化學(xué)激活素的特征生物學(xué)活性。
本發(fā)明的另一方面包括Exodus多肽類似物，其中從本發(fā)明的Exodus上添加、缺失或置換了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并且保持一個(gè)或多個(gè)C-C化學(xué)激活素的特征生物學(xué)活性。這類類似物是有用的，例如上述的醫(yī)學(xué)成像方法或下述的治療方法。它們可以用本領(lǐng)域已知的任何重組或合成方法(包括在實(shí)施例7中描述的方法)制備。
典型的類似物包括在Exodus氨基酸序列中設(shè)計(jì)的置換以實(shí)現(xiàn)與它最緊密聯(lián)系的化學(xué)激活素的更大的同源性。設(shè)計(jì)以實(shí)現(xiàn)與C-C化學(xué)激活素家族更大同源性的置換包括在該成熟蛋白序列的第31位用蘇氨酸置換丙氨酸，或于第26位用酪氨酸置換苯丙氨酸。其它產(chǎn)生與MIP-1α、MIP-1β和RANTES更大同源性的置換包括用MIP-1α的第1-10殘基或RANTES的第1-9殘基置換Exodus的1-8殘基、用苯丙氨酸置換第11位的亮氨酸、用絲氨酸置換第12位的甘氨酸、用谷氨酸置換第25位的甘氨酸、用絲氨酸置換第36位的谷氨酸、用谷氨酰胺置換第46位的絲氨酸、用酪氨酸置換第60位的異亮氨酸、和用天冬氨酸置換第67位的絲氨酸?？梢詥蝹€(gè)或以所有組合進(jìn)行這些置換，并預(yù)期它們具有增強(qiáng)Exodus在骨髓抑制或抑制HIV產(chǎn)生方面的活性的潛力。
其它設(shè)計(jì)用來(lái)增強(qiáng)給定位置氨基酸特性的置換(例如，如果一氨基酸是疏水性的，則置換物的疏水性更強(qiáng))亦可以增強(qiáng)Exodus的活性用天冬氨酸置換第6位的天冬酰胺、用異亮氨酸置換第18位的亮氨酸、用谷氨酸置換第29位的谷氨酰胺、用天冬氨酸置換第38位的天冬酰胺、用異亮氨酸置換第50位的纈氨酸以及用谷氨酸置換第56位的谷氨酰胺?？梢詥蝹€(gè)或以所有的組合進(jìn)行這些置換。
本發(fā)明的相關(guān)方面包括不具有Exodus生物學(xué)活性的類似物，但它能夠競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制C-C化學(xué)激活素與其受體的結(jié)合。這類類似物可以用于例如抑制內(nèi)源性Exodus或宿主中其它C-C化學(xué)激活素的生物學(xué)活性的治療組合物或方法中。特別考慮這類Exodus多肽類似物調(diào)節(jié)Exodus與化學(xué)激活素受體和/或其它據(jù)認(rèn)為在把Exodus向其受體呈遞的過(guò)程中起重要作用的分子(例如，肝素、糖胺聚糖、紅細(xì)胞化學(xué)激活素受體)的結(jié)合特性。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供純化的和分離的編碼這類Exodus多肽類似物的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸可以用于例如重組生產(chǎn)所述Exodus多肽類似物；加入這類多聚核苷酸的質(zhì)粒和病毒載體；和用這類DNA或載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核和真核宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明包括與本發(fā)明Exodus多肽和多肽類似物特異地免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)(例如單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合或人化抗體的之類)。本發(fā)明亦包括生產(chǎn)本發(fā)明抗體物質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞系。這類抗體可以用于例如純化本發(fā)明的多肽、例如用眾所周知的ELISA技術(shù)檢測(cè)或定量測(cè)定流體或組織樣品中的Exodus、以及調(diào)節(jié)Exodus與其受體的結(jié)合。一些化學(xué)激活素抗體(例如抗IL-8抗體)已顯示顯著的抗炎作用。
本發(fā)明的重組Exodus多肽和多肽類似物可以用于在結(jié)合反應(yīng)中代替抗體，以鑒別表達(dá)Exodus受體的細(xì)胞和在標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)克隆技術(shù)中分離編碼所述受體的多聚核苷酸。分別參見(jiàn)例如以下之實(shí)施例16和Holmes等(見(jiàn)上述)和Charo等(見(jiàn)上述)的IL-8和MCP-1受體的克隆。這類Exodus多肽、Exodus多肽類似物和Exodus受體多肽可以用于調(diào)節(jié)Exodus化學(xué)激活素活性、鑒別多肽和化學(xué)(例如小分子)Exodus激動(dòng)劑和拮抗劑。
本文使用的“Exodus蛋白產(chǎn)物”包括Exodus多肽、片段或其類似物(包括Exodus的保持Exodus相關(guān)生物學(xué)活性的二者挑一的剪接變異體，例如國(guó)際公開(kāi)WO 96/05856號(hào)(見(jiàn)上述)描述的化學(xué)激活素Ckβ-4。我們已證明在Ckβ-4中發(fā)現(xiàn)的該多出的丙氨酸(在Exodus的第4殘基之后)位于內(nèi)含子-外顯子邊界?？缭皆搮^(qū)的測(cè)序提示這二種形式Exodus源于二者挑一的剪接。
本發(fā)明亦考慮用于增強(qiáng)受傷或患傳染性疾病的哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法中的包含Exodus蛋白產(chǎn)物的藥用組合物。亦考慮用于在炎癥介導(dǎo)病理狀態(tài)(例如關(guān)節(jié)炎、Crohn病或其它自身免疫疾病)中減輕炎癥的方法之中的包含Exodus蛋白產(chǎn)物或其抗體的藥用組合物。還考慮用于減輕動(dòng)脈粥樣硬化、血管發(fā)生或腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的藥用組合物。
特別考慮用于抑制造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞增殖的藥用組合物。這種骨髓抑制可以在化療或放療中保護(hù)干細(xì)胞/祖細(xì)胞免受細(xì)胞毒性作用。亦考慮使用Exodus蛋白產(chǎn)物制造抑制骨髓祖細(xì)胞增殖的藥物，所述藥物特別希望給與接受化療或放療的受治療者。
亦特別考慮用于治療骨髓組織增生性疾病的藥用組合物和使用Exodus蛋白產(chǎn)物制造治療骨髓組織增生性疾病的藥物。
另外特別考慮用于治療剛剛接觸HIV但尚未用標(biāo)準(zhǔn)診斷程序檢測(cè)或確認(rèn)HIV陽(yáng)性的病人(例如HIV陽(yáng)性母親的新生兒、接觸HIV陽(yáng)性血的醫(yī)務(wù)人員)、有接觸HIV風(fēng)險(xiǎn)的病人或已被HIV感染的病人(即HIV陽(yáng)性病人)的藥用組合物。亦考慮使用Exodus蛋白產(chǎn)物制造抑制HIV增殖的藥物，所述藥物特別希望給與有接觸HIV風(fēng)險(xiǎn)、或已接觸HIV或已感染HIV的受治療者。另外考慮使用Exodus蛋白產(chǎn)物制造治療HIV感染的藥物。
這種藥用組合物包含Exodus蛋白產(chǎn)物或其抗體以及生理上可接受的稀釋劑或載體，并且根據(jù)該臨床應(yīng)用可選地包括其它合適的治療劑，例如抗炎劑或抗HIV劑。Exodus蛋白產(chǎn)物的劑量將根據(jù)欲治療的病理狀態(tài)在約1μg至100mg/kg體重之間變化，優(yōu)選為5至100μg/kg體重?？梢愿鶕?jù)欲治療疾病通過(guò)各種途徑給與這種藥用組合物，包括通過(guò)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)、經(jīng)口或栓劑給藥。
可以由主治醫(yī)生決定增加或減少Exodus蛋白產(chǎn)物的劑量以及縮短或延長(zhǎng)治療時(shí)間。用藥頻率取決于該藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)和給藥途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)給藥途徑和所需劑量可以確定最佳藥物配方。參見(jiàn)例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990,MackPublishing Co.,Easton,PA18042)，第1435-1712頁(yè)，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這類配方可以影響物理狀況、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和所給與藥劑的體內(nèi)清除速率。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以根據(jù)良好醫(yī)療實(shí)踐和病人的臨床狀況容易地優(yōu)化有效劑量和同時(shí)的用藥制度。在不考慮用藥方式的情況下，可以根據(jù)體重、體表面積或器官大小計(jì)算具體劑量。為確定涉及上述每種配方的治療合適劑量所必需的進(jìn)一步的精確計(jì)算可以由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行而不需過(guò)度試驗(yàn)，特別是可以根據(jù)本文公開(kāi)的劑量信息和檢測(cè)以及上述討論的人體臨床試驗(yàn)觀察到的藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行。通過(guò)使用已建立的確定血液水平劑量的檢測(cè)給與適當(dāng)?shù)膭┝糠磻?yīng)數(shù)據(jù)可以確定合適的劑量。可以由主治醫(yī)生考慮修改藥物作用的各種因素決定最終劑量制度，這些因素例如藥物的具體活性、損傷的嚴(yán)重性和病人的反應(yīng)性、病人的年齡、狀況、體重、性別和飲食、感染的嚴(yán)重性、用藥時(shí)間和其它臨床因素。隨著研究的進(jìn)行，會(huì)出現(xiàn)其它有關(guān)治療各種疾病和狀況的適當(dāng)劑量水平的信息。
上述Exodus材料和方法可以應(yīng)用于幾種臨床應(yīng)用中。首先，由于化學(xué)激活素吸引并激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(Baggiolini等，見(jiàn)上述)，Exodus在致病炎癥環(huán)境下的表達(dá)通過(guò)補(bǔ)充額外的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞或其它白細(xì)胞到發(fā)病部位、通過(guò)激活已在該處的白細(xì)胞或通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞停留在該部位可以加重病情。因此，抑制Exodus的化學(xué)引誘劑活性預(yù)期可以減輕有害的炎癥過(guò)程。值得注意的是，這種方法的潛在益處已在涉及IL-8(一種吸引并激活嗜中性粒細(xì)胞的C-X-C化學(xué)激活素)的試驗(yàn)中直接證明?？笽L-8抗體具有抑制由嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病的極度能力[Haada等，J.Leukoc.Biol.,56:559(1994)]。抑制Exodus預(yù)期在假設(shè)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞起作用的疾病(例如Crohn病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞或急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS))中有類似效果。
另一方面，增強(qiáng)Exodus的作用可能在疾病中起有益作用，因?yàn)橐阎瘜W(xué)激活素在傷口愈合和血管發(fā)生中有正效應(yīng)。因此，外源Exodus蛋白產(chǎn)物或Exodus激動(dòng)劑可以在促進(jìn)這種疾病康復(fù)方面有益。
正如C-C化學(xué)激活素TCA3在小鼠中抑制腫瘤形成的能力(參見(jiàn)Laning等，見(jiàn)上述)所提示的，Exodus蛋白產(chǎn)物或Exodus激動(dòng)劑亦可以在治療腫瘤方面在臨床上是重要的。Exodus可以例如通過(guò)將各種非特異性效應(yīng)細(xì)胞吸引至腫瘤部位并將其激活，或通過(guò)刺激特異性抗腫瘤免疫，直接或間接作用抑制腫瘤形成。
另外，本文證明的Exodus的骨髓抑制效應(yīng)表明，Exodus蛋白產(chǎn)物或Exodus激動(dòng)劑可以通過(guò)減輕化療或放療對(duì)病人骨髓干細(xì)胞或祖細(xì)胞產(chǎn)生的有害影響而對(duì)接受化療或放療的病人產(chǎn)生相當(dāng)大的益處。例如，在給與細(xì)胞周期特異性化療藥劑之前或期間(例如一天前，用藥之前或同時(shí))用Exodux蛋白產(chǎn)物治療可以保護(hù)骨髓免受所述藥劑的細(xì)胞毒性作用。這類細(xì)胞周期特異性化療藥劑包括長(zhǎng)春花堿、依托泊甙、柔紅霉素、阿霉素、去甲氧柔紅霉素、氨甲蝶呤、羥基脲、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、噴司他丁、氟達(dá)拉濱和2-氯脫氧腺苷(2-CDA)。如上所述，目前將MIP-1α類似物(命名為BB10010,British Biotechnology)做為Cytoxan_治療法(來(lái)自Bristol-Myers SquibbOncology的環(huán)磷酰胺)的骨髓保護(hù)劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
正如本文所表明的，Exodus抑制細(xì)胞因子依賴性骨髓細(xì)胞系增殖的能力表明Exodus蛋白產(chǎn)物亦可用于治療骨髓組織增生性疾病，包括(但不限于)慢性髓細(xì)胞性白血病、特發(fā)性血小板增多、骨髓纖維化和真性紅細(xì)胞增多。為此目的給與Exodus蛋白產(chǎn)物可以與其它化療藥劑或其它細(xì)胞因子(例如干擾素)同時(shí)給與。
另外，C-C化學(xué)激活素RANTES、MIP-1α和MIP-1β已顯示抑制人免疫缺陷病毒HIV-1的復(fù)制[Cocchi等，Scienc,270:1811-1815(1995)]，提示它們可做為預(yù)防或治療AIDS的可能的治療劑。正如本文證明的，Exodus抑制HIV增殖的能力表明Exodus蛋白產(chǎn)物在預(yù)防AIDS發(fā)病或進(jìn)程或在促進(jìn)接觸HIV后對(duì)HIV感染抗性方面亦將有益于治療AIDS患者。感染HIV后不會(huì)立即出現(xiàn)AIDS完全發(fā)病；在可變時(shí)間范圍內(nèi)患者保持健康但表現(xiàn)出病毒血癥。這種病毒血癥由病毒復(fù)制和再感染血細(xì)胞的連續(xù)周期維持。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)測(cè)定血漿病毒載量(以及CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù))可以預(yù)測(cè)后續(xù)AIDS或死亡風(fēng)險(xiǎn)。[Ho,Science,272:1124-1125(1996).]。因此干擾病毒復(fù)制的連續(xù)周期可以導(dǎo)致改善的預(yù)后。
另外，已建立的化學(xué)激活素表達(dá)與炎性疾病和疾病狀態(tài)的相互關(guān)系提供了使用Exodus蛋白產(chǎn)物包括特異性與Exodus起免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)的診斷和預(yù)后指癥。這類Exodus材料可以用于診斷和評(píng)價(jià)炎癥性疾病條件和疾病狀態(tài)的預(yù)后以及涉及這種條件和疾病狀態(tài)區(qū)域的醫(yī)學(xué)成像方法中。
在考慮了下述描述本發(fā)明目前優(yōu)選實(shí)施例的對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的很多其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示各種濃度Exodus對(duì)單核細(xì)胞趨化性的影響。
圖2顯示未處理和CAN處理的Exodus對(duì)小鼠血細(xì)胞生成的影響。
圖3顯示Exodus單獨(dú)或與MCP-1或MIG一起對(duì)小鼠造血祖細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
圖4顯示Exodus對(duì)骨髓細(xì)胞系MO7E增殖的影響。
圖5顯示Exodus對(duì)骨髓細(xì)胞系TF-1增殖的影響。
圖6顯示純化的合成Exodus對(duì)骨髓細(xì)胞系MO7E增殖的影響。
圖7顯示Exodus對(duì)感染HIV后單核細(xì)胞釋放HIV p24蛋白的影響。
圖8顯示純化的合成Exodus蛋白產(chǎn)物對(duì)感染HIV后單核細(xì)胞釋放HIV p24蛋白的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于鑒別編碼Exodus的cDNA序列和Exodus活性的表征。
化學(xué)激活素Exodus的全cDNA的長(zhǎng)度是821個(gè)核苷酸。于第786位有一共有多聚腺苷酸化位點(diǎn)。3’不轉(zhuǎn)譯序列有一些在許多細(xì)胞因子基因中介導(dǎo)mRNA穩(wěn)定性的AAAU序列。這些序列促進(jìn)信息降解并是許多細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄物(包括化學(xué)激活素)半衰期短的原因之一。有一個(gè)短的43個(gè)核苷酸的5’不轉(zhuǎn)譯區(qū)。
在Exodus的推斷氨基酸序列中有95個(gè)氨基酸。這與C-C化學(xué)激活素家族一致，該家族成員的長(zhǎng)度范圍為91-99。Exodus的首22個(gè)氨基酸組成一個(gè)強(qiáng)疏水性信號(hào)肽。定義該家族的參與二硫鍵的四個(gè)半胱氨酸亦保存在Exodus中。在氨基酸水平上Exodus與MIP-1α和RANTES關(guān)系最密切(相同性為26-28％)，當(dāng)考慮保守變化時(shí)，約75％相似性。Exodus與RANTES在氨基酸24-46和58-75上特別相似，在這些位置中間僅有6個(gè)非保守變化。
雖然Exodus具有其它人類C-C化學(xué)激活素的最多保守氨基酸特征，但Exodus的幾個(gè)獨(dú)特的特征值得注意。Exodus有一個(gè)高度堿性的羧基末端，與RANTES相比與MCP亞家族更一致。另外，Exodus于第47和51位分別缺失一個(gè)保守酪氨酸和蘇氨酸，這二者在所有其它人類C-C化學(xué)激活素包括RANTES中都存在。不清楚這二個(gè)高度保守氨基酸是否在C-C化學(xué)激活素活性中的作用，因?yàn)轭A(yù)期它們不接觸該受體。
通過(guò)考慮下列描述性實(shí)施例，會(huì)理解本發(fā)明的各種方面和優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例1描述Exodus cDNA的鑒別。實(shí)施例2描述檢測(cè)Exodus基因在各種人類細(xì)胞系和組織中表達(dá)方式的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3描述該Exodus基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組表達(dá)。實(shí)施例4描述該Exodus基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組表達(dá)的另一方法和純化產(chǎn)生的蛋白。實(shí)施例5提供在原核細(xì)胞中表達(dá)該Exodus基因和純化產(chǎn)生蛋白的方法。實(shí)施例6提供在酵母或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)Exodus的方法。實(shí)施例7描述通過(guò)肽合成或重組生產(chǎn)方法生產(chǎn)Exodus和Exodus類似物。實(shí)施例8提供產(chǎn)生與Exodus特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體的方法。實(shí)施例9論述Exodus體外對(duì)單核細(xì)胞趨化性的影響。實(shí)施例10論述Exodus對(duì)骨髓祖細(xì)胞、骨髓細(xì)胞系和慢性髓細(xì)胞性白血病祖細(xì)胞增殖的影響。實(shí)施例11論述Exodus對(duì)HIV p24蛋白產(chǎn)生的影響。實(shí)施例12、13、14和15提供化學(xué)引誘劑和白細(xì)胞激活、腫瘤生長(zhǎng)抑制、腹膜內(nèi)或皮下注射后白細(xì)胞激活的體內(nèi)檢測(cè)。實(shí)施例16描述Exodus受體的克隆。
實(shí)施例1編碼Exodus的cDNA序列的鑒別如Takeda等(Human Mol.Genetics,2:1793-1798(1993))所述，從解剖的正常成人胰島細(xì)胞制備信使RNA，用含有一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)的引物通過(guò)寡聚(dT)引物法合成第一鏈cDNA。在第二鏈cDNA合成和鈍化后，將EcoRⅠ連接物連接至該cDNA，然后對(duì)后者進(jìn)行大小分級(jí)分離以除去大小小于1000個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。用XhoⅠ消化后，將產(chǎn)物克隆至λZAPⅡ，并在XL1-Blue MRF細(xì)胞(Stratagene,La Jolla,CA)中擴(kuò)增。按照制造商說(shuō)明書通過(guò)解救pBluescript SK將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒。通過(guò)單程自動(dòng)測(cè)序確定這些隨機(jī)分離的胰島細(xì)胞cDNA的1000的部分序列。這些序列保存于GenBank(Takeda等，見(jiàn)上述)并與國(guó)立生物技術(shù)情報(bào)中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)的其它序列比較。用于比較的cDNA序列的平均長(zhǎng)度約為200bp。該工作已發(fā)表于Takeda等，見(jiàn)上述。
緊接著Takeda等的工作，按下述從這些1000個(gè)胰島細(xì)胞表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)中鑒別出編碼Exodus的克隆。用NCBI的BLAST服務(wù)將一共有化學(xué)激活素序列與這些ESTs比較，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)克隆具有與C-C化學(xué)激活素家族的遠(yuǎn)緣同源性。在用手動(dòng)雙脫氧雙鏈測(cè)序鑒別出初始自動(dòng)通過(guò)的幾個(gè)測(cè)序錯(cuò)誤并正確地表征該編碼區(qū)和讀框后，這種與該化學(xué)激活素家族的同源性得以增加。這個(gè)最初由Takeda等命名為HBC2850的克隆與任何其它已知化學(xué)激活素都不相同。該克隆的cDNA由821個(gè)核苷酸組成，含有該化學(xué)激活素蛋白的完整開(kāi)放讀框。將此化學(xué)激活素命名為Exodus。
SEQ ID NO:1列出的該Exodus cDNA序列與Takeda等的EST序列之間的差異如下(以SEQ ID NO:1中的核苷酸號(hào)碼為參照)于核苷酸64(Exodus中為“C”)，該EST核苷酸為“N”；于核苷酸71(Exodus中為“C”)，該EST核苷酸為“N”；在核苷酸130和131之間，EST含有一個(gè)額外的“G”堿基，導(dǎo)致該讀框移位；在核苷酸150和151之間，該EST含有一個(gè)額外的“T”堿基，導(dǎo)致該讀框移位；于核苷酸193(Exodus中為“C”)，該EST核苷酸為“N”；于核苷酸196(Exodus中為“C”)，該EST核苷酸為“N”；于核苷酸271(Exodus中為“A”)，該EST核苷酸為“N”；和于核苷酸309(Exodus中為“T”)，該EST核苷酸為“GC”。
實(shí)施例2Exodus基因在細(xì)胞系和組織中的表達(dá)方式通過(guò)Northern印跡分析從各種人體組織和細(xì)胞系提取的mRNA，檢測(cè)Exodus mRNA表達(dá)方式。所用的探針為含有完整Exodus編碼區(qū)的cDNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離，按照制造商說(shuō)明書(BMB,Indianapolis,IN)用隨機(jī)引物法進(jìn)行32P-dCTP和32P-dTTP(DuPont-NEN,Boston,MA)標(biāo)記。A.Exodus基因在人體組織中的表達(dá)按照制造商說(shuō)明書用RNA STAT-60(Tel-Test B Inc.,Friendswood,TX)從細(xì)胞系和培養(yǎng)單核細(xì)胞中分離RNA。將總RNA(20μg)在0.8％甲醛瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素，在嚴(yán)格條件下雜交并清洗。將底片于-80℃用增感屏曝光一天。
按照制造商說(shuō)明書在嚴(yán)格條件下亦用該Exodus cDNA探針檢測(cè)人多種組織Northern印跡和人免疫系統(tǒng)多種組織Northem(Clontech,Palo Alto,CA)并清洗。將放射自顯影如上述曝光1-4天。
看來(lái)Exodus具有很有限的表達(dá)方式。它在很多受測(cè)試的細(xì)胞系(包括TMR323成神經(jīng)細(xì)胞瘤、MDA乳腺癌、K562紅白血病、JurkatT-細(xì)胞白血病、HL60前髓細(xì)胞白血病、用視黃酸分化為粒細(xì)胞的HL60細(xì)胞、3T3胚性成纖維細(xì)胞或293胚性腎細(xì)胞)中不表達(dá)。當(dāng)用多種正常人體組織的市售Northern印跡分析Exodus表達(dá)時(shí)，在肺中檢測(cè)到表達(dá)，而在心臟、大腦、胎盤、成人肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、脾臟或骨髓中未檢測(cè)到表達(dá)。轉(zhuǎn)錄物的大小約0.9kB，假如加上一polyA尾，則與本文報(bào)道的cDNA大小一致。
然而，當(dāng)用淋巴組織的市售Northern印跡檢測(cè)Exodus表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它在幾種不同的淋巴器官中高度表達(dá)。Exodus在外周淋巴結(jié)、闌尾、外周血單核細(xì)胞和胎肝中高度表達(dá)。它在胸腺中表達(dá)略低，而在脾臟和骨髓中未檢測(cè)到表達(dá)。
這是許多化學(xué)激活素的典型表達(dá)方式。Exodus主要在淋巴組織特別是淋巴結(jié)、闌尾和外周血中表達(dá)?？赡苡糜诖薔orthern印跡分析的該淋巴組織可以被一些免疫刺激物激活，由此導(dǎo)致比正常水平高的Exodus表達(dá)。與在外周血中相反，Exodus在骨髓中表達(dá)差可能是因?yàn)楣撬柚饕晌闯墒旃撬韬图t細(xì)胞前體組成，而在外周血中有多的多的成熟單核細(xì)胞。B.炎癥刺激后的Exodus基因表達(dá)因?yàn)樵S多化學(xué)激活素的表達(dá)是由炎癥刺激在單核細(xì)胞中誘導(dǎo)的，所以用Northern印跡分析法分析各種細(xì)胞系接觸LPS、TNF-α或PMA后Exodus的表達(dá)。
從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)獲得單核細(xì)胞系THP-1。將細(xì)胞保持于添加了10％胎牛血清(FCS,Hyclone Laboratories,Inc.,Logan,Utah)、25Mm HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(組織培養(yǎng)抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的RPMI1640培養(yǎng)基(Biowhitaker,Walkersville,MD)。為進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在有佛波醇酯(PMA,Signa,St.Louis,MO)存在的條件下于一百萬(wàn)細(xì)胞每毫升的密度下培養(yǎng)。
從俄勒岡州大學(xué)的Jay Nelson博士獲得無(wú)限增殖化人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系1-HUVEC，并培養(yǎng)于添加了10％FCS(Hyclone)、400μg/mlG418(Life Technologies,Grand Island,NY)、1u/ml肝素(Sigma)和30μg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)RPMI 1640上至?xí)?0-80％，然后在有或無(wú)10ng/ml腫瘤壞死因子-α(TNF-α,Peprotech,NJ)的情況下培養(yǎng)不同時(shí)間。
在Histopaque梯度(Signa)上純化外周血單核細(xì)胞，并通過(guò)塑料吸附分離單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞培養(yǎng)6天，每2天更換培養(yǎng)基一次，以使之分化成巨噬細(xì)胞。用100ng/nl脂多糖(LPS,Sigma)刺激細(xì)胞不同的時(shí)間。
當(dāng)外周血單核細(xì)胞接觸LPS 8或12小時(shí)后，高度誘導(dǎo)Exodus表達(dá)。當(dāng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接觸TNF-α僅3小時(shí)后，又高度誘導(dǎo)Exodus表達(dá)。值得注意的是，只要有炎癥刺激物存在，就保持Exodus高度表達(dá)。當(dāng)用PMA處理單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1時(shí)，亦誘導(dǎo)Exodus表達(dá)，并在接觸48小時(shí)后達(dá)到表達(dá)峰值，然后略微下降。
這些結(jié)果表明除非炎癥刺激存在，否則Exodus表達(dá)很差。然而，一旦存在這種刺激物，則Exodus立即和穩(wěn)定地被增量調(diào)節(jié)。該刺激物本身的性質(zhì)亦不受限制，LPS、TNF-α和PMA均增量調(diào)節(jié)Exodus。Exodus的產(chǎn)生看來(lái)是成熟淋巴吞噬細(xì)胞(特別是在炎癥刺激后)的功能，而不是未成熟骨髓細(xì)胞的功能。
實(shí)施例3在COS細(xì)胞中生產(chǎn)重組Exodus通過(guò)將該Exodus cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞生產(chǎn)重組Exodus。用常規(guī)限制位點(diǎn)將全長(zhǎng)Exodus cDNA以有義定位亞克隆入SV-40驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體pECE[Ellis等，Cell,45:721(1986)]的多接頭位點(diǎn)。將對(duì)數(shù)期的COS細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)CRL 1651號(hào))以每個(gè)100mm培養(yǎng)皿100萬(wàn)細(xì)胞的密度接種于含有10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素(組織培養(yǎng)抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的DMEM并培養(yǎng)過(guò)夜。按照制造商的說(shuō)明書用Lipofectin(Life Techologies,Bethesda,MD)，用每平皿20μg純化的pECE-Exodus質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染所述COS細(xì)胞。做為對(duì)照，將純化的pECE質(zhì)粒(無(wú)Exodus DNA)同樣轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞。將具有報(bào)道基因β-半乳糖苷酶的表達(dá)載體(SV40/β-Gal,Pharmacia,Piscataway,NJ)共轉(zhuǎn)染以控制轉(zhuǎn)染效率。72小時(shí)后，用0.2μm濾器過(guò)濾該COS細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液并將其儲(chǔ)存于-70℃。除去上清液后，制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物并按Rosenthal先前所述(Meth.Enzymol.,152:704(1987))檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。當(dāng)進(jìn)行pECE和pECE-Exodus轉(zhuǎn)染時(shí)，用β-半乳糖苷酶活性測(cè)定的同時(shí)轉(zhuǎn)染效率在各自的10％之內(nèi)。
實(shí)施例4在CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組Exodus及其純化用PCR擴(kuò)增該Exodus cDNA(示于SEQ ID NO:1)的第30-330堿基，該cDNA包括13bp的5’非編碼序列和3bp的3’非編碼序列。所述PCR引物的序列是5’-GGCGAAGCTTTGAGCTAAAAACCATG(SEQ ID NO:3)和5’-GCGGGAATTCTTACATGTTCTTGACT(SEQID NO:4)。為便于克隆，這些引物分別包含HindⅢ和EcoRⅠ限制位點(diǎn)(用斜體表示)。將該片段克隆入載體pDC1(描述于于1995年11月16日申請(qǐng)的共同擁有、共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)08/558,658號(hào)，該專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，該載體是pBR322衍生物，它含有與該克隆位點(diǎn)相鄰的CMV立即早啟動(dòng)子以便于表達(dá)該插入物，并且含有細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶基因和鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因以分別在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒的篩選(Sambrook等，見(jiàn)上述)。將含有該Exodus插入物的該構(gòu)建物用在該載體序列內(nèi)切割的PvuI(BMB,Indianapolis,IN)限制消化而線性化。該線性化質(zhì)粒用乙醇沉淀并重新溶于HBS(20mM HEPES-NaOH,pH7.0；137mM NaCl,5mM KCl；0.7mM Na2HPO4；6mM右旋糖)。為進(jìn)行電穿孔，將107該CHO細(xì)胞系DG44[Urlab等，Cell,33:405(1983)]在細(xì)胞清洗，再懸浮在1ml PBS中，與10微克的線性化質(zhì)?；旌喜⑥D(zhuǎn)移至0.4cm的電穿孔杯中。用Biorad基因脈沖發(fā)生器(Gene Pulser)(Richmond,CA)于290伏、960微法蘭第對(duì)該懸浮液進(jìn)行電穿孔。在含有10％透析FCS(Hyclone,Logan,UT)并缺乏次黃嘌呤和胸苷的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)上培養(yǎng)以挑選轉(zhuǎn)化體。將來(lái)自幾百個(gè)轉(zhuǎn)化集落的細(xì)胞混合并再接種于含有20nM氨甲蝶呤(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM/F12培養(yǎng)基。分離該輪選擇生存的集落并擴(kuò)增以得到單個(gè)克隆。如下測(cè)定Exodus表達(dá)水平。
將克隆在組織培養(yǎng)平板上于含有10％透析FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)至約90％會(huì)合時(shí)，更換該培養(yǎng)基。使所述細(xì)胞在含有1％透析FCS的EMEM/F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4天。將上清液上HeparinSepharose CL-6B(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱。該柱用含有0.2M NaCl的20mM Tris,pH7.5清洗，并用含有0.6M NaCl的20mM Tris,pH7.5洗脫該化學(xué)激活素。將該洗脫的Exodus用SDS-PAGE通過(guò)18％Tris甘氨酸凝膠(NOVEX,San Diego,CA)分級(jí)分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore,Bedford,MA)上。通過(guò)用Exodus特異性兔多克隆抗血清(按以下實(shí)施例8所述制備)檢測(cè)而確認(rèn)遷移至約7kD的該Exodus條帶。
可以將Exodus化學(xué)激活素表達(dá)水平最高的克隆擴(kuò)增以進(jìn)行大規(guī)模蛋白生產(chǎn)。按下述從該上清液生產(chǎn)和純化得到的重組Exodus。將遷移至約7kD的該Exodus條帶切下并在自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems,473A型，F(xiàn)oster City,CA)上對(duì)N末端測(cè)序。
做為進(jìn)一步的純化步驟，將從該Heparin-Sepharose柱洗脫的Exodus加至1.6M NaCl并上HI-Propyl 40微米樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)柱。用含有1.6M NaCl的20mM Tris,pH7.5清洗該柱，用20mM Tris,pH7.5洗脫該Exodus。
通過(guò)氨基酸分析以確認(rèn)蛋白測(cè)序預(yù)測(cè)的氨基酸比例并通過(guò)質(zhì)譜法(mass spectrophotometry)確認(rèn)預(yù)測(cè)的大小而確證該洗脫Exodus的完整性。
實(shí)施例5在細(xì)菌中生產(chǎn)重組Exodus以下是在細(xì)菌中重組表達(dá)Exodus并純化得到的產(chǎn)物的典型方法。
用PCR擴(kuò)增編碼該蛋白成熟形式的DNA序列并克隆入載體pGEX-3X(Pharmacia,Piscataway,NJ)。設(shè)計(jì)該pGEX載體使產(chǎn)生融合蛋白，該融合蛋白包含由該載體編碼的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和由插入該載體克隆位點(diǎn)的DNA片段編碼的蛋白。該P(yáng)CR的引物是SEQ IDNO:4和5’-TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT GAA TCA GAA GCAAGC AAC T-3’，它含有一個(gè)BamHi限制位點(diǎn)、一個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)[Chang,Eur.J,Biochem.,151:217(1985)]和SEQ ID NO:1的第109-127核苷酸。用BamHⅠ和EcoRⅠ消化得到的PCR產(chǎn)物并插入用BglⅡ和EcoRⅠ消化的質(zhì)粒pGEX-3X。
用凝血酶或因子X(jué)a(Pharmacia,Piscataway,NJ)處理該重組融合蛋白預(yù)期切割該融合蛋白，從該GST蛋白釋放該化學(xué)激活素。將該pGEX-3X/Exodus構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-1藍(lán)細(xì)胞(Stratagene,LaJolla CA)，分離各個(gè)轉(zhuǎn)化體并使之生長(zhǎng)。從各個(gè)轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA并用自動(dòng)測(cè)序儀部分測(cè)序以確認(rèn)所需Exodus基因插入物以正確定位存在。
將該轉(zhuǎn)化XL-1藍(lán)培養(yǎng)物于37℃在LB培養(yǎng)基(添加了羧芐青霉素)上生長(zhǎng)至600nm波長(zhǎng)的光密度為0.4，接著在有0.5mM異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖(Sigma Chemical Co.,St Louis MO)的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)以達(dá)到誘導(dǎo)該GST/Exodus融合蛋白。
可以如下述純化預(yù)期做為細(xì)菌內(nèi)不溶性包涵體產(chǎn)生的該融合蛋白。離心收獲細(xì)胞；在0.15M NaCl、10mM Tris、pH8、1mM EDTA中清洗；用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于室溫處理15分鐘。通過(guò)超聲處理澄清該裂解液，于12,000Xg離心10分鐘使細(xì)胞碎片沉淀。將含有融合蛋白的沉淀再懸浮于50mM Tris,pH8和10mM EDTA中，鋪于50％甘油上，于6000Xg離心30分鐘。將該沉淀再懸浮于不含Mg++和Ca++的標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中。通過(guò)將該再懸浮沉淀于變性SDS聚丙烯酰胺凝膠(Sambrook等，見(jiàn)上述)中分級(jí)分離進(jìn)一步純化該融合蛋白。將該凝膠浸泡于0.4M KCl以顯現(xiàn)該蛋白，將該蛋白切下在缺乏SDS的凝膠電泳緩沖液中電洗脫。如果該GST/Exodus融合蛋白在細(xì)菌中以可溶蛋白產(chǎn)生，則可以用GST純化組件(Purification Module)(Pharmacia Biotech)純化。
可以將該融合蛋白進(jìn)行凝血酶消化，以將該GST從該成熟Exodus蛋白切割出來(lái)。將消化反應(yīng)物(20-40μg融合蛋白，在0.5ml PBS中有20-30單位人凝血酶(4000 U/mg(Sigma))于室溫培育16-48小時(shí)并上變性SDS-PAGE凝膠以分級(jí)分離該反應(yīng)蛋白。將該凝膠浸泡于0.4M KCl以顯現(xiàn)該蛋白條帶?？梢酝ㄟ^(guò)用自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems 473A型，F(xiàn)oster City,CA)進(jìn)行部分氨基酸序列分析，確認(rèn)對(duì)應(yīng)于預(yù)期Exodus分子量的蛋白條帶的身分。
另一方面，可以將編碼預(yù)期成熟Exodus蛋白的該DNA序列克隆入含有所需啟動(dòng)子和可選地前導(dǎo)序列[參見(jiàn)例如Better等，Science,240:1041-43(1988)]的質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^(guò)自動(dòng)測(cè)序確認(rèn)該構(gòu)建物的序列。然后采用標(biāo)準(zhǔn)方法使用CaCl2培育和對(duì)細(xì)菌進(jìn)行熱震處理(Sambrook等，見(jiàn)上述)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株MC1061。將該轉(zhuǎn)化細(xì)菌在添加了羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)誘導(dǎo)該表達(dá)蛋白的產(chǎn)生。如果存在，則該前導(dǎo)序列將導(dǎo)致該成熟Exodus蛋白分泌并在分泌后被切割。
通過(guò)上述實(shí)施例4描述的方法或例如采用以前描述的純化重組產(chǎn)生的RANTES化學(xué)激活素[Kuna等，J.Immunol.,149:636-642(1992)]、MGSA化學(xué)激活素[Horuk等，J.Biol.Chem.268:541-46(1993)]和IP-10化學(xué)激活素(在昆蟲細(xì)胞中表達(dá))[Sarris等，J.Exp.Med.,178:1127-1132(1993)]的方法，從該細(xì)菌培養(yǎng)基中純化該分泌的重組蛋白。
實(shí)施例6在酵母或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)Exodus以下是在酵母或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中重組表達(dá)Exodus并純化得到的產(chǎn)物的典型方法。
用PCR擴(kuò)增該Exodus cDNA的編碼區(qū)。用含有α接合因子基因第1-20核苷酸的引物和與該基因的255-235核苷酸互補(bǔ)的另一引物[Kurjan和Herskowitz,Cell,30:933-943(1982)]，在PCR反應(yīng)中從酵母基因組DNA擴(kuò)增編碼酵母前原α前導(dǎo)序列的DNA。將該前原α前導(dǎo)編碼序列和Exodus編碼序列片段連接入含有酵母乙醇脫氫酶(ADH2)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，使得該啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)由融合到該成熟Exodus多肽的該前原α因子組成的融合蛋白。如Rose和Broach(Meth.Enz.185:234-279,D.Goeddel編輯，Academic Press,Inc.,San Diego,CA(1990))所指出的，該載體另外含有在克隆位點(diǎn)下游的ADH2轉(zhuǎn)錄終止子、酵母“2微米”復(fù)制起點(diǎn)、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。β-內(nèi)酰胺酶和leu-2d基因分別提供在酵母和大腸桿菌中的篩選。該leu-2d基因亦促進(jìn)增加質(zhì)粒在酵母中的拷貝數(shù)以誘導(dǎo)高水平的表達(dá)。REP1和REP2基因編碼參與調(diào)節(jié)該質(zhì)?？截悢?shù)的蛋白。
用已知方法例如乙酸鋰處理[Stearns等，Meth.Enz.，見(jiàn)上述，第280-297頁(yè)]將前段描述的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中葡萄糖耗竭時(shí)誘導(dǎo)該ADH2啟動(dòng)子[Price等，Gene,55:287(1987)]。該前原α序列導(dǎo)致該融合蛋白從細(xì)胞分泌。酵母KEX2蛋白將相伴地該前原序列從該成熟Exodus化學(xué)激活素切割出來(lái)[Bitter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5330-5334(1984)]。
另一方面，用市售表達(dá)系統(tǒng)例如Pichia表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen,SanDiego,CA)，按照制造商說(shuō)明書在酵母中重組表達(dá)Exodus。該系統(tǒng)亦依賴該前原α序列指導(dǎo)分泌，但由甲醇誘導(dǎo)時(shí)由乙醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該插入物的轉(zhuǎn)錄。
用例如用于從細(xì)菌核哺乳動(dòng)物上清液純化Exodus的方法(參見(jiàn)上述實(shí)施例4和5)，從該酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化分泌的重組Exodus。
或者，將編碼Exodus的cDNA克隆入桿狀病毒表達(dá)載體pVL1393(PharMingen,San Diego,CA)。然后按照制造商說(shuō)明書(PharMingen)用該含有Exodus的載體感染sF9無(wú)蛋白培養(yǎng)基中的草地貪夜蛾細(xì)胞并產(chǎn)生重組蛋白。用肝素-Sepharose柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)和連續(xù)分子篩分柱(Amicon,Beverly,MA)從該培養(yǎng)基中純化和濃縮該蛋白并再懸浮于PBS中。SDS-PAGE分析顯示一個(gè)單一條帶并確認(rèn)該蛋白的分子量，在Porton 2090肽測(cè)序儀上的Edman測(cè)序確認(rèn)了其N末端序列。
實(shí)施例7生產(chǎn)Exodus類似物可以用諸如先前實(shí)施例中描述的重組技術(shù)制備Exodus多肽類似物。更詳細(xì)地說(shuō)，使用已知技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)修飾編碼Exodus的多聚核苷酸，以編碼目的多肽類似物。一般參見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上述，第15章。重組表達(dá)該修飾多聚核苷酸，用先前實(shí)施例所述方法純化該重組多肽類似物。
例如通過(guò)與其它C-C化學(xué)激活素的同源性和通過(guò)用丙氨酸替代天然Exodus氨基酸殘基，鑒別Exodus活性的關(guān)鍵殘基。半胱氨酸通常對(duì)蛋白功能完整性很關(guān)鍵，因?yàn)樗鼈兙哂行纬啥蜴I的能力。為確定Exodus中的四個(gè)半胱氨酸的任一個(gè)對(duì)酶活性是否重要，將每個(gè)半胱氨酸單獨(dú)突變?yōu)榻z氨酸。
其它典型的類似物包括設(shè)計(jì)用來(lái)造成與其最緊密相關(guān)的化學(xué)激活素同源性更高的Exodus氨基酸序列中的置換。設(shè)計(jì)用于造成與C-C化學(xué)激活素家族同源性更高的置換包括將成熟蛋白序列中第31位的丙氨酸替換為蘇氨酸、或?qū)⒌?6位的苯丙氨酸用酪氨酸替換。其它產(chǎn)生與MIP-1α、MIP-1β和RANTES更高同源性的置換包括用MIP-1α的第1-10殘基或RANTES的第1-9殘基置換Exodus的第1-8殘基、用苯丙氨酸取代第11位的亮氨酸、用絲氨酸取代第12位的甘氨酸、用谷氨酸取代第25位的甘氨酸、用絲氨酸取代第36位的谷氨酸、用谷氨酰胺取代第46位的絲氨酸、用酪氨酸取代第60位的異亮氨酸、和用天冬氨酸取代第67位的絲氨酸?？梢詥蝹€(gè)或以所有組合進(jìn)行這些取代，并預(yù)期它們具有增強(qiáng)Exodus在骨髓抑制或抑制HIV產(chǎn)生方面的活性的潛力。
設(shè)計(jì)用來(lái)增強(qiáng)給定位置氨基酸特性的其它取代(例如，如果一氨基酸是疏水性的，則取代物的疏水性更強(qiáng))亦可以增強(qiáng)Exodus的活性用天冬氨酸取代第6位的天冬酰胺、用異亮氨酸取代第18位的亮氨酸、用谷氨酸取代第29位的谷氨酰胺、用天冬氨酸取代第38位的天冬酰胺、用異亮氨酸取代第50位的纈氨酸和用谷氨酸取代第56位的谷氨酰胺?？梢詥蝹€(gè)或以所有的組合進(jìn)行這些取代。
可以通過(guò)例如用核酸外切酶Ⅲ消化Exodus編碼序列的3’末端不同的時(shí)間、然后將該縮短的編碼序列連接至編碼所有三個(gè)讀框中的終止密碼子的質(zhì)粒DNA而制備C末端缺失。用類似方法通過(guò)消化該編碼序列的5’末端，并然后將該消化片段連接至包含啟動(dòng)子序列和恰好在該啟動(dòng)子上游的起始甲硫氨酸的質(zhì)粒而制備N末端缺失。亦可以將這些N末端缺失做為融合蛋白表達(dá)。
或者，亦可以用已成功地用于生產(chǎn)其它化學(xué)激活素例如IL-8[Clark-Lewis等，J.Biol Chem.,266:23128-34(1991)]和MCP-1的技術(shù)，通過(guò)化學(xué)肽合成制備Exodus多肽類似物。這類方法是優(yōu)越的，因?yàn)樗鼈兛焖?、?duì)例如化學(xué)激活素的短序列可靠，并允許選擇性第導(dǎo)入新的、非天然氨基酸和其它化學(xué)修飾。
Exodus類似物對(duì)涉及炎癥過(guò)程的一種或多種類型的細(xì)胞(例如，T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞或其它細(xì)胞)的性質(zhì)通過(guò)本領(lǐng)域認(rèn)可的、已用于檢測(cè)許多其它化學(xué)激活素的性質(zhì)的技術(shù)檢測(cè)。也按照下述實(shí)施例10和11檢測(cè)Exodus類似物抑制骨髓增生和HIV產(chǎn)生的性質(zhì)。
實(shí)施例8制備Exodus的抗體基本上按照實(shí)施例7所述化學(xué)合成Exodus化學(xué)激活素。為儲(chǔ)存，將Exodus稀釋于含有1％牛血清白蛋白(Sigrna,St.Louis,MO)的RPMI培養(yǎng)基中。接著通過(guò)肝素Sepharose CL-6B柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)，從該培養(yǎng)基純化Exodus。用0.2M NaCl和20mM Tris,pH7.5的溶液清洗該柱，用0.6M NaCl和20mM Tris,pH7.5洗脫該化學(xué)激活素。
為產(chǎn)生多克隆抗血清，將50μgExodus在弗氏完全佐劑中乳化以免疫兔子。以21天的間隔，將50μgExodus在弗氏不完全佐劑中乳化以加強(qiáng)免疫。這些抗血清在Western印跡上識(shí)別該化學(xué)合成Exodus和CHO細(xì)胞來(lái)源的Exodus(按照實(shí)施例4所述制備)。
為產(chǎn)生Exodus的單克隆抗體，用實(shí)施例3-7的任一項(xiàng)得到的重組Exodus(例如在弗氏完全佐劑中乳化的10-20μg)周期性地注射小鼠。用PBS中的Exodus對(duì)該鼠進(jìn)行最后融合前加強(qiáng)注射，四天后，殺死該小鼠并取出其脾臟。將該脾臟置于10ml無(wú)血清RPMI 1640中，將脾臟在浸泡于無(wú)血清RPMI 1640中的二片冷凍的玻璃顯微鏡載玻片的末端之間研磨制得單細(xì)胞懸浮液，該RPMI 1640添加了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco,Canada)的。將該細(xì)胞懸液通過(guò)無(wú)菌的70目Nitex細(xì)胞濾過(guò)器(BectonDickinson,Parsippany,New Jersey)過(guò)濾，并通過(guò)于200g離心5分鐘清洗二次，并將沉淀再懸浮于20ml無(wú)血清RPMI。用類似方法制備從三只首次用于實(shí)驗(yàn)的Balb/c小鼠取出的脾細(xì)胞并用做對(duì)照。將在融合前在含有11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories,Inc.,Logan,Utah)的RPMI中以對(duì)數(shù)期保存的NS-1骨髓瘤細(xì)胞于200g離心5分鐘，按照上述段落將沉淀清洗二次。
將1×108脾細(xì)胞與2.0×107NS-1細(xì)胞混合并離心，吸去上清液。輕敲試管使細(xì)胞沉淀移動(dòng)，在1分鐘加入1ml 37℃ PEG 1500(在75mM Hepes,pH 8.0中50％)并攪拌，接著用7分鐘加入7ml無(wú)血清RPMI。另外加入8ml RPMI并將細(xì)胞于200g離心10分鐘。除去上清液后，將沉淀再懸浮于200ml含有15％FBS、100μM次黃嘌呤鈉、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106脾細(xì)胞/ml的RPMI，并接種于10個(gè)Cornmg平底96孔組織培養(yǎng)板(Commg,Cornmg New York)。
融合后第2、4和6天，從所述融合平板的孔中取出100μl培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。第8天，用ELISA篩選融合，按下述檢測(cè)與Exodus結(jié)合的鼠IgG的存在。用100ng/孔在25 mM Tris,pH7.5中稀釋的Exodus將Immulon 4板(Dynatech,Cambridge,MA)于37℃包被2小時(shí)。吸出包被溶液并加入200μl/孔封閉溶液[稀釋于CMF-PBS的0.5％魚皮膠(fish skin gelatm)(Sigma)]并于37℃培育30分鐘。用含有0.05％吐溫20(PBST)的PBS將板清洗三次，并加入50μl培養(yǎng)上清液。于37℃培育30分鐘后，如上述進(jìn)行清洗，加入在PBST中稀釋至1∶3500的50μl結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗鼠IgG(fc)(JacksonImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania)。如上述培育板，用PBST清洗四次，加入由100mM檸檬酸，pH4.5中的1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2組成的100μl底物。5分鐘后加入50μl 15％H2SO4終止顏色反應(yīng)。在讀板儀(Dynatech)上測(cè)定A490。
將選擇的融合孔通過(guò)稀釋至96孔板并于5天后目視計(jì)數(shù)每孔的集落數(shù)而克隆二次。用Isostrip系統(tǒng)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)將雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體同種型化。
實(shí)施例9Exodus對(duì)單核細(xì)胞趨化性的作用按照先前Martinet等(J.Immunol.Meth.,174:209,1994)和Keller等(J.Immunol.Meth.,1:165,1972)所述，進(jìn)行趨化性檢測(cè)以評(píng)價(jià)Exodus的活性。在10ml肝素化的試管中從健康志愿者收集20ml外周血。用PBS 1∶1稀釋血液，然后用10ml Histopaque(Sigma)鋪墊。于400g離心25分鐘后，收集在界面處的細(xì)胞并在用PBS中清洗二次。將細(xì)胞以106/ml再懸浮于含有100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(組織培養(yǎng)抗生素，Life Technologies)的DMEM(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。加入無(wú)菌的牛血清白蛋白(Sigma)至最終濃度為0.2mg/ml。
向每個(gè)轉(zhuǎn)孔插入物(transwell insert)(Costar)加入100μl的該細(xì)胞懸浮液。將含有抗生素和0.2％BSA和含或不含純合成Exodus的DMEM加入該24孔板的下部孔。所有的Exodus濃度都做三份檢測(cè)。將轉(zhuǎn)孔插入物置于所述下部孔中，并于37℃培育90分鐘。培育結(jié)束后，取出插入物并用橡膠淀帚擦該濾器的頂部以除去附著的細(xì)胞。然后用Wright-Giemsa將整個(gè)插入物染色。在三個(gè)高功率場(chǎng)下計(jì)數(shù)附著在該插入物下表面和遷移至下部孔的細(xì)胞，求和得出遷移細(xì)胞的總數(shù)。
以5、50和500ng/ml的濃度測(cè)試純化的合成Exodus。為比較，以833ng/ml的濃度測(cè)試MIP-α。對(duì)照不含化學(xué)激活素。結(jié)果示于圖1。數(shù)值代表以三份進(jìn)行的二個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值并加上或減去標(biāo)準(zhǔn)差。星號(hào)代表在p＜0.05下用未配對(duì)“學(xué)生”t檢驗(yàn)與對(duì)照在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。
這些結(jié)果表，如以轉(zhuǎn)移孔遷移測(cè)試的，Exodus刺激正常人外周血單核細(xì)胞的趨化活性。最高濃度的Exodus比最有效濃度的MIP-1α更有效地刺激趨化性。
用Exodus蛋白產(chǎn)物(在殘基4后有一額外的丙氨酸的Exodus)得到了類似的結(jié)果。
實(shí)施例10Exodus對(duì)骨髓細(xì)胞增殖的作用A．對(duì)骨髓祖細(xì)胞的作用基本上按照先前在例如Broxmeyer等(Blood,76:1110(1990))中所述，檢測(cè)Exodus蛋白產(chǎn)物對(duì)造血集落形成的影響。在得到許可后，從獻(xiàn)血者采集骨髓細(xì)胞。將低密度的5×104/ml的人骨髓細(xì)胞接種于含有1％甲基纖維素的Iscove改良基本培養(yǎng)基(Biowhitaker,Walkersville,MD)，該培養(yǎng)基添加了30％FCS(Hyclone)、重組人紅細(xì)胞生成素(EPO,1U/ml,Amgen,Thousand Oaks,CA)、重組人白介素-3(IL-3,100U/ml,Immunex,Seattle,WA)和重組人干細(xì)胞因子(SCF,50ng/ml,Amgen)，所述重組人干細(xì)胞因子用于粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的集落形成單位(CFU-GM)、粒細(xì)胞/紅細(xì)胞/巨噬細(xì)胞/巨核細(xì)胞的集落形成單位(CFU-GEMM)或紅細(xì)胞爆增形成單位(BFU-E)的分析。在5％CO2和低氧壓(5％)下培養(yǎng)培養(yǎng)物14天，以盲法用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)集落形成。至少以三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)二次。
在該檢測(cè)中測(cè)試含有按照上述實(shí)施例3制備的Exodus的不同量的COS細(xì)胞上清液和50ng/ml的MIP-1α(R&D Systems,Minmeapolis,MN)。結(jié)果示于下表1，該表展示了每個(gè)平板的造血祖細(xì)胞集落的平均計(jì)數(shù)加上或減去標(biāo)準(zhǔn)差。
表1

>*p＜0.005(其它數(shù)值與對(duì)照無(wú)顯著差異或pECE是在p＜0.05)在COS細(xì)胞上清液中的Exodus以劑量依賴性方式抑制造血祖細(xì)胞集落形成，比最大劑量的MIP-1α效率略高。在單獨(dú)的COS細(xì)胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染了空白pECE表達(dá)載體的COS細(xì)胞培養(yǎng)基之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)重組人MIP-1α為50ng/ml時(shí)(在該劑量時(shí)該生物學(xué)效應(yīng)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài))，CFU-GM(培養(yǎng)基對(duì)照的43％)、BFU-E(對(duì)照的66％)和CFU-GEMM(對(duì)照的50％)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的重組Exodus的最高濃度下，CFU-GM(培養(yǎng)基對(duì)照的42％)、BFU-E(對(duì)照的48％)和CFU-GEMM(對(duì)照的48％)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低。
Exodus的該抑制是劑量依賴性的，在于通過(guò)集落形成檢測(cè)測(cè)定的該三個(gè)最高水平的Exodus顯示抑制造血祖細(xì)胞的增殖。然而，使用的最低濃度的Exodus未顯示此種抑制。與MIP-1α一樣，Exodus以多譜系方式抑制祖細(xì)胞。
在該檢測(cè)中亦測(cè)試了純化的合成Exodus。結(jié)果示于下表2，該表展示了每個(gè)平板的造血祖細(xì)胞集落的平均計(jì)數(shù)加上或減去標(biāo)準(zhǔn)差。
表2

在Exodus濃度低至25ng/ml的情況下，所有三種類型的集落形成都有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(“學(xué)生”T檢驗(yàn))減少(p＜0.005)。該純化的合成Exodux與COS細(xì)胞上清液中的Exodus表現(xiàn)一致。這二種來(lái)源的Exodus都有效地抑制造血骨髓祖細(xì)胞增殖，如果不比MIP-1α好，至少與它一樣有效。
用純化的合成Exodus蛋白產(chǎn)物(在殘基4后有一額外的丙氨酸的Exodus)，通過(guò)集落形成檢測(cè)測(cè)定，得到了顯示抑制造血祖細(xì)胞增殖的類似結(jié)果。
這些結(jié)果顯示Exodus蛋白產(chǎn)物抑制造血祖細(xì)胞的增殖。確實(shí)，Exodus蛋白產(chǎn)物與MIP-1α一樣有效。這表明Exodus蛋白產(chǎn)物可以做為周期特異性化學(xué)保護(hù)劑使用。
另外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Exodus蛋白產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)對(duì)造血的影響?；旧习凑誃roxmeyer等(Ann.Hematol.,71:235-246(1995))所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用了未處理的純合成Exodus和按照Mantel等(Proc.Natl.Acad,Sci,USA,90:2232-2236(1993))所述用30％乙腈/1％三氟乙酸(ACN)溶液處理的Exodus。對(duì)于以多體在溶液中存在的化學(xué)激活素，用ACN處理刺激形成單體，單體是體內(nèi)活性形式，因此增強(qiáng)化學(xué)激活素活性。用ACN處理的化學(xué)激活素可以在比未處理的化學(xué)激活素濃度低200倍的情況下有活性。
簡(jiǎn)言之，制備濃度范圍為0.001-50ng/ml Exodus的未處理Exodus和ACN處理的Exodus的溶液。將ACN處理或未處理的稀釋劑做為對(duì)照以顯示CAN無(wú)毒性。向正常C3H/HeJ小鼠靜脈注射0.2ml劑量的每種溶液，并在24小時(shí)后殺死小鼠。從其股骨得到未分離的骨髓細(xì)胞并接種于或者評(píng)價(jià)CFU-GM)瓊脂的含有10％(v/v)美洲商陸促細(xì)胞分裂劑的小鼠脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基(PWMSCM)、或者評(píng)價(jià)BFU-E/CFU-GEMM的含有人紅細(xì)胞生成素(Epogen_,Amgen,Thousand Oaks,CA)、PWMSCAM和氯高鐵血紅素(Eastman Kodak Co.,Rochester,NY)的甲基纖維素。在ESPEC N2-O2-CO2培養(yǎng)箱BNP-210(Taboi ESPECCorp.,South Plainfield,NJ)于5％CO2和5％O2下，在濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)7天后測(cè)定集落計(jì)數(shù)。結(jié)果示于圖2。
結(jié)果顯示當(dāng)注射單劑量0.2ml 25ng/ml Exodus時(shí)，未處理Exodus將CFU-GM集落形成降低至平均對(duì)照的56％。當(dāng)注射單劑量0.2ml 0.1ng/ml Exodus時(shí)，ACN處理的Exodus將CFU-GM集落形成平均降低至對(duì)照的53％。當(dāng)p＜0.05時(shí)，由ACN處理和未處理Exodus誘導(dǎo)的體內(nèi)CFU-GM形成抑制在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。
在另一實(shí)驗(yàn)中，基本按照Broxmeyer等(Ann.Hematol.，見(jiàn)上述)和Mantel等(Proc.Natl.Acad.Sci，見(jiàn)上述)所述，用氚標(biāo)記胸苷殺傷實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)未處理Exodus對(duì)造血祖細(xì)胞體內(nèi)周期的影響。簡(jiǎn)言之，用不同濃度的單獨(dú)的未處理Exodus(0.5、1或10ng/ml)或與其它未處理化學(xué)激活素結(jié)合(Exodus濃度為0.01或0.1ng/ml與或者0.01或0.1ng/ml的MCP-1或MIG)處理小鼠。然后，24小時(shí)后殺死所述動(dòng)物，采集骨髓以進(jìn)行氚標(biāo)記胸苷殺傷實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樘幱诩?xì)胞周期的S期的細(xì)胞優(yōu)先摻入胸苷，它們由于摻入氚標(biāo)記胸苷而殺傷，不處于S期的細(xì)胞未受傷害?；谖从秒皹?biāo)記胸苷處理的細(xì)胞的對(duì)照集落數(shù)，通過(guò)計(jì)算殺傷細(xì)胞數(shù)估計(jì)處于S期的細(xì)胞數(shù)。所述值做為處于S期祖細(xì)胞的百分比報(bào)告，并按照每個(gè)股骨的祖細(xì)胞總數(shù)歸一化。CFU-GM的結(jié)果示于圖3。
結(jié)果顯示，與處于S期CFU-GM的平均對(duì)照值的56％相比，單次注射10ng/小鼠的Exodus將處于細(xì)胞周期S期的CFU-GM祖細(xì)胞的百分比顯著降至平均4％(p＜0.001)。另外，Exodus誘導(dǎo)的CFU-GM細(xì)胞周期進(jìn)程抑制與MCP-1和MIG處理是協(xié)同的。當(dāng)很低濃度的Exodus與MIG或MCP-1一起注射時(shí)，處于S期的CFU-GM降低得更多。因此，化學(xué)激活素的組合可以更有效地抑制造血。
這些結(jié)果表明Exodus可以暫停骨髓祖細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)程，因此可以用于保護(hù)正常骨髓細(xì)胞免受S期細(xì)胞毒性化療的影響。B．對(duì)骨髓細(xì)胞系的作用亦檢測(cè)了Exodus蛋白產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞因子依賴性骨髓細(xì)胞系的作用。人骨髓細(xì)胞系TF-1和MO7E[Avanzi等，Brit.J.Haematol.,69:359(1988)]的最大增殖需要GM-CSF和SCF。將細(xì)胞因子依賴性原發(fā)性急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系TF-1和MO7E(均受贈(zèng)于Hal Broxmeyer博士，印地安那大學(xué)，Indiana)培養(yǎng)于添加了10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(組織培養(yǎng)抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的RPMI 1640(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。該培養(yǎng)基添加了正常對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)所需的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF,100U/ml,Immunex,Seattle,WA)和干細(xì)胞因子(SCF,50ng/ml,Amgen,Thousand Oaks,CA)。
以最終稀釋度為1/10檢測(cè)按照實(shí)施例3所述制備的COS細(xì)胞上清液中的Exodus。結(jié)果示于圖4(MO7E細(xì)胞)和圖5(TF-1細(xì)胞)。當(dāng)將COS細(xì)胞上清液加入對(duì)數(shù)期MO7細(xì)胞時(shí)，在GM-CSF和SCF的存在下，后續(xù)72小時(shí)的增殖被降低至對(duì)照的10.4％。當(dāng)將COS細(xì)胞上清液加入亦連續(xù)接觸GM-CSF和SCF的對(duì)數(shù)期TF-1細(xì)胞時(shí)，增殖被完全抑制。Exodus沒(méi)有細(xì)胞毒性作用，因?yàn)橥ㄟ^(guò)臺(tái)盼藍(lán)排染所評(píng)價(jià)的，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Exodus處理的細(xì)胞具有超過(guò)95％的存活率，這與對(duì)照細(xì)胞的存活率相等。
如圖6所示，純化的合成Exodus亦完全抑制所述MO7E細(xì)胞增殖。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。星號(hào)表示用配對(duì)t-檢驗(yàn)在p＜0.05時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。加入Exodus亦未改變存活率。
這些結(jié)果表明Exodus亦可以用于治療諸如慢性骨髓性白血病的骨髓組織增生性疾病。C．對(duì)慢性骨髓性白血病祖細(xì)胞的作用按照Hromas等(Blood,89:3315-3322(1997))所述，用集落形成檢測(cè)評(píng)價(jià)Exodus(亦稱為“Exodus-1”)對(duì)慢性骨髓性白血病(CML)的祖細(xì)胞增殖的影響。簡(jiǎn)言之，從處于慢性期的6個(gè)CML患者采集骨髓細(xì)胞。將低密度的5×104細(xì)胞/ml骨髓細(xì)胞接種于含有1％甲基纖維素的Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加了30％胎牛血清、1U/ml人紅細(xì)胞生成素(Epogen_,Amgen)、100U/ml人白介素-3(GeneticsInstitute)和50ng/ml人干細(xì)胞因子(Amgen)、含或不含100ng/mlExodus、含或不含100ng/ml MIP-1α。培養(yǎng)物于5％CO2和低氧壓(5％)培養(yǎng)14天，然后用倒置顯微鏡對(duì)CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E計(jì)數(shù)。將用Exodus或MIP-1α處理的培養(yǎng)物集落計(jì)數(shù)與所述對(duì)照培養(yǎng)物的集落計(jì)數(shù)比較，并以對(duì)照CFU或BFU的百分比表示。數(shù)據(jù)示于下表3。
表3

*用未配對(duì)“學(xué)生”t檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)這些數(shù)據(jù)證明在這6名處于CML慢性期的患者中，Exodus顯著地抑制祖細(xì)胞集落形成。Exodus在抑制增殖方面比MIP-1α有效得多，提示Exodus的所述作用系通過(guò)一MIP-1α不能激活的受體介導(dǎo)。
CML祖細(xì)胞過(guò)量表達(dá)BCR-ABL融合癌蛋白，該蛋白是刺激增殖的組成型激活細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶。事實(shí)上，細(xì)胞培養(yǎng)中BCR-ABL的強(qiáng)制過(guò)量表達(dá)在許多細(xì)胞類型包括NIH 3T3細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)化。按照上述用氚標(biāo)記胸苷殺傷試驗(yàn)再探索Exodus對(duì)來(lái)自三名慢性CML患者的祖細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影向。Exodus對(duì)所述CML祖細(xì)胞的處理使細(xì)胞周期暫停的平均比例，CFU-GM為55±5％、BFU-E為45±13％和CFU-GEMM為50±10％。因此，Exodus抑制信號(hào)能夠克服CML祖細(xì)胞中BCR-ABL的過(guò)分增殖信號(hào)。
這些結(jié)果表明Exodus抑制造血并可能有效治療慢性期CML。
實(shí)施例11Exodus對(duì)HIV增殖的影響按照先前Cocchi等(Science,270:1811(1996))所述，用標(biāo)準(zhǔn)p24ELISA檢測(cè)測(cè)試Exodus蛋白產(chǎn)物抑制以HIV p24蛋白產(chǎn)生為衡量的HIV增殖的能力。在Ficoll梯度上分離正常志愿者人外周血單核細(xì)胞。用含有1ng/ml PHA(Sigma,St.Louis,MO)的添加了10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(組織培養(yǎng)抗生素，LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的RPMI 1640(Life Technologies,Gaithersburg,MD)將這些細(xì)胞于37℃激活48小時(shí)，在完全培養(yǎng)基中清洗，然后于37℃在完全培養(yǎng)基中用TCID50=5000的HIV毒株BAL(得自ATCC)或A018-H112-2(得自ATCC)感染1小時(shí)。然后將細(xì)胞在培養(yǎng)基中清洗三次以除去多余的病毒，然后以每個(gè)試驗(yàn)5×105細(xì)胞/0.3ml再懸浮于完全培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加了重組人IL-2(10ng/ml,Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)和重組Exodus或者做為對(duì)照的轉(zhuǎn)染pECE的COS細(xì)胞上清液。培養(yǎng)6天后，用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA,Abbott Laboratories,Chicago,IL)檢測(cè)無(wú)細(xì)胞上清液的HIVp24含量。進(jìn)行試驗(yàn)三次。
感染6天后，測(cè)定最終稀釋度為1∶2(即在每個(gè)孔中的0.3ml總體積中有0.15ml COS細(xì)胞上清液)的含有Exodus的COS細(xì)胞上清液、最終稀釋度為1∶4的含有Exodus的COS細(xì)胞上清液、濃度為625ng/ml和1250ng/ml的MIP-1α(分別是圖7中的條帶1和條帶2)和pECE COS細(xì)胞上清液(無(wú)Exodus)。結(jié)果示于圖7。當(dāng)用PMA刺激的正常人外周血單核細(xì)胞用HIV的二個(gè)毒株高度多重感染時(shí)，Exodus能夠顯著抑制這二個(gè)毒株的HIV增殖。在使用最高濃度的重組Exodus時(shí)，HIV毒株BAL的增殖被降低至對(duì)照的39％，而HIV毒株A018的增殖被降低至對(duì)照的27％。當(dāng)降低Exodus濃度時(shí)，這種抑制的顯著降低。另外，這種抑制與使用MIP-1α?xí)r觀察到的一致，MIP-1α被用做這些試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。Exodus的抑制作用不是因?yàn)榧?xì)胞毒性，因?yàn)橛肊xodus處理的細(xì)胞的存活率與對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有差異。
濃度為1μg/ml純化的合成Exodus蛋白產(chǎn)物(在殘基4后有一額外的丙氨酸的Exodus)和濃度為1μg/ml的MIP-1α的類似結(jié)果示于圖8。顯示了感染后第3、6和9天的結(jié)果。感染后第9天，Exodus的抑制作用與同一濃度的MIP-1α觀察到的類似。在這個(gè)初步實(shí)驗(yàn)中，未觀察到濃度低于1μg/ml的該Exodus蛋白產(chǎn)物具有任何作用。
這些結(jié)果表明Exodus蛋白產(chǎn)物抑制HIV增殖，因此可以用于增強(qiáng)抗HIV感染的方法和治療HIV感染的方法。
實(shí)施例12檢測(cè)Exodus對(duì)人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和人嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘劑和細(xì)胞激活性質(zhì)通過(guò)Devi等(J.Immunol.,153:5376-5383(1995))描述的用于評(píng)價(jià)鼠TCA3誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活的方法，評(píng)價(jià)Exodus對(duì)人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞或人嗜中性粒細(xì)胞的作用。在這類研究中測(cè)定的激活指標(biāo)包括由于整合蛋白激活引起的對(duì)血纖維蛋白原的增強(qiáng)附著、趨化性、反應(yīng)性氮中間體的誘導(dǎo)、呼吸爆增(respiratory burst)(產(chǎn)生超氧化物和過(guò)氧化氫)和在有細(xì)胞松弛素B的情況下溶菌酶和彈性蛋白酶的胞吐作用。如Devi等所討論的，這些活動(dòng)與白細(xì)胞對(duì)炎癥應(yīng)答的幾個(gè)步驟相關(guān)。由Springer(Cell,76:301-314(1994))綜述的這種白細(xì)胞應(yīng)答包括白細(xì)胞附著于血管內(nèi)皮細(xì)胞、穿越該內(nèi)皮層遷移、趨向化學(xué)激活素源的趨化性和定點(diǎn)釋放炎癥介質(zhì)。這些步驟的任一步驟中Exodus的涉及都提供了通過(guò)調(diào)節(jié)該炎癥應(yīng)答進(jìn)行臨床干涉的重要的靶。
實(shí)施例13Exodus體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制檢測(cè)例如通過(guò)修改Laning等(J.Immunol.,153:4625-4635(1994))所述的檢測(cè)鼠TCA3的腫瘤生長(zhǎng)抑制性質(zhì)的方法，檢測(cè)Exodus的腫瘤生長(zhǎng)抑制性質(zhì)。用電穿孔將Exodus編碼cDNA轉(zhuǎn)染入骨髓瘤來(lái)源細(xì)胞系J558(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MD)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè))，用制備的抗實(shí)施例8的Exodus的單克隆抗體篩選產(chǎn)生Exodus的轉(zhuǎn)染體。將得自產(chǎn)生Exodus的克隆的一團(tuán)1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞皮下注射至BALB/c小鼠的下右四分體(quadrant)。做為比較，將1000萬(wàn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射至對(duì)照小鼠。比較這二組的腫瘤形成的速率和頻率，以確定Exodus抑制腫瘤生長(zhǎng)的效力。通過(guò)組織學(xué)方法鑒別隨后與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞浸潤(rùn)物的性質(zhì)。另外，將重組Exodus(20ng)與未轉(zhuǎn)染J558細(xì)胞混合，并注射(20ng/天)入來(lái)自這種細(xì)胞的腫瘤，以檢測(cè)外源給與的Exodus對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。
實(shí)施例14腹膜內(nèi)注射檢測(cè)按照Luo等(J.Immunol.,153:4616-4624(1994))所述，將1-100ng純化的Exodus注射入小鼠腹膜內(nèi)腔，以確定體內(nèi)應(yīng)答Exodus的細(xì)胞。注射后，從外周血和腹膜腔分離白細(xì)胞，并通過(guò)Diff Quick藥盒(Baxter,McGraw,IL)染色進(jìn)行鑒定。在不同時(shí)間測(cè)定白細(xì)胞的外形以評(píng)價(jià)不同細(xì)胞類型外觀的動(dòng)力學(xué)。在減單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將針對(duì)Exodus(實(shí)施例8)的中和抗體與Exodus一起注射，以確認(rèn)白細(xì)胞浸潤(rùn)是由Exodus的活性引起。
實(shí)施例15體內(nèi)活性檢測(cè)-皮下注射通過(guò)采用Meurer等(J.Exp.Med.,178:1913-1921(1993))描述的方案，體內(nèi)檢測(cè)Exodus的化學(xué)引誘劑特性。將重組Exodus(10-500 pmol/部位)皮內(nèi)注射至適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物例如狗或兔子。在4-24小時(shí)，用組織學(xué)方法評(píng)價(jià)注射部位的細(xì)胞浸潤(rùn)。用針對(duì)Exodus的抗體通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)Exodus的存在。通過(guò)用Baxter的DiffQuick藥盒染色鑒別該細(xì)胞浸潤(rùn)物的性質(zhì)。
實(shí)施例16克隆Exodus受體采用先前Holmes等(見(jiàn)上述)描述的分離IL-8受體基因的方法和Charo等(見(jiàn)上述)描述的分離MCP-1受體基因的方法克隆編碼Exodus受體的DNA。
最好從通過(guò)趨化性和激活對(duì)Exodus應(yīng)答的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)。亦可以使用放射性標(biāo)記的Exodus以鑒別表達(dá)高水平Exodus受體的細(xì)胞類型。值得特別注意的是不應(yīng)答MIP-1α或RANTES的細(xì)胞、或?qū)@些配體應(yīng)答時(shí)表現(xiàn)出不同方式受體脫敏的細(xì)胞。通過(guò)放射自顯影從該cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)染克隆庫(kù)中篩選放射性標(biāo)記的Exodus的結(jié)合。對(duì)陽(yáng)性庫(kù)進(jìn)行連續(xù)次分級(jí)分離并再篩選，直至得到單個(gè)陽(yáng)性克隆。
另一方面，可以使用簡(jiǎn)并PCR策略，其中所述PCR引物的序列基于已知化學(xué)激活素受體序列的保守區(qū)。為增加分離Exodus受體的機(jī)會(huì)，用于該反應(yīng)中的模板DNA可以是得自對(duì)Exodus應(yīng)答的細(xì)胞類型的cDNA。
雖然已用具體實(shí)施例描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明的變化和修改。因此，只有所附權(quán)利要求書中出現(xiàn)的這種限制適用于本發(fā)明。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人印地安那大學(xué)基金會(huì)(ⅱ)發(fā)明名稱Exodus化學(xué)激活素物質(zhì)及方法(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通信地址(A)收信人Marshall,O’Toole,Gerstein,Murray & Borun(B)街道233 South Wacker Drive/6300 Sears Tower(C)城市芝加哥(D)州伊利諾州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼60606-6402(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOC/MSDOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/749,513(B)提交日期1996年11月15日(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名Rin-Laures,Li-Hsien(B)注冊(cè)號(hào)33,547(C)參考/檔案號(hào)27866/34328 PCT(ⅸ)電訊資料(A)電話(312)474-6300
(B)傳真(312)474-0448(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度821個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置43…327(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置109…327(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:GGTACTCAAC ACTGAGCAGA TCTGTTCTTT GAGCTAAAAA CC ATG TGC TGT ACC 54Met Cys Cys Thr-22 -20AAG AGT TTG CTC CTG GCT GCT TTG ATG TCA GTG CTG CTA CTC CAC CTC 102Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu Leu Leu His Leu-15 -10 -5TGC GGC GAA TCA GAA GCA AGC AAC TTT GAC TGC TGT CTT GGA TAC ACA 150Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr1 5 10GAC CGT ATT-CTT CAT CCT AAA TTT ATT GTG GGC TTC ACA CGG CAG CTG 198Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu15 20 25 30GCC AAT GAA GGC TGT GAC ATC AAT GCT ATC ATC TTT CAC ACA AAG AAA 246Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys35 40 45AAG TTG TCT GTG TGC GCA AAT CCA AAA CAG ACT TGG GTG AAA TAT ATT 294Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile50 55 60GTG CGT CTC CTC AGT AAA AAA GTC AAG AAC ATG TAAAAACTGT GCCTTTTCTG 347Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met65 70GAATGGAATT GGACATAGCC CAAGAACAGA AAGAACCTTG CTGGGGTTGG AGGTTTCACT 407TGCACATCAT GGAGGGTTTA GTGCTTATCT AATTTGTGCC TCACCTGGAC TTGTCCAATT 467AATGAAGTTG ATTCATATTG CATCATAGTT TGCTTTGTTT AAGCATCACA TTAAAGTTAA 527ACTGTATTTT ATGTTATTTA TAGCTGTAGG TTTTCTGTGT TTAGCTATTT AATACTAATT 587TTCCATAAGC TATTTTGGTT TAGTGCAAAG TATAAAATTA TATTTGGGGG GGAATAAGAT 647TATATGGACT TTCTTGCAAG CAACAAGCTA TTTTTTAAAA AAAACTATTT AACATTCTTT 707TGTTTATATT GTTTTGTACT CCTAAATTGT TGTAATTGCA TTATAAAATA AGAAAAATAT 767TAATAAGACA AATATTGAAA ATAAAGAAAC AAAAAGTTCT TCTGTTAAAA AAAA 821(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度95個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu-22 -20 -15 -10Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys-5 1 5 10Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe15 20 25Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe30 35 40His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp45 50 55Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met60 65 70(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3:GGCGAAGCTT TGAGCTAAAA ACCATG 26(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)順序描述SEQ D NO:4:GCGGGAATTC TTACATGTTC TTGACT 2權(quán)利要求
1．編碼SEQ ID NO:2的Exodus氨基酸序列的純化的多聚核苷酸。
2．權(quán)利要求1的多聚核苷酸，它是DNA。
3．權(quán)利要求2的DNA，它包含由SEQ ID NO:1的第43-327核苷酸組成的核苷酸序列。
4．編碼SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的純化多聚核苷酸。
5．權(quán)利要求4的多聚核苷酸，它是DNA。
6．權(quán)利要求5的DNA，它包含由SEQ ID NO:1的第109-327核苷酸組成的核苷酸序列。
7．包含權(quán)利要求2、3、5或6的DNA的載體。
8．為表達(dá)載體的權(quán)利要求7的載體，其中該DNA可操作地連接至一個(gè)表達(dá)控制DNA序列。
9．用權(quán)利要求2、3、5或6的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方式使得允許在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)Exodus。
10．生產(chǎn)Exodus的方法，包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，并從所述宿主細(xì)胞或所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中分離Exodus。
11．用權(quán)利要求10的方法制備的純化多肽。
12．包含SEQ ID NO:2的Exodus氨基酸序列的純化多肽。
13．包含SEQ ID NO:2的Exodus的第1-73氨基酸的純化多肽。
14．產(chǎn)生與權(quán)利要求15的多肽特異性反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
15．由權(quán)利要求14的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
16．增強(qiáng)對(duì)人免疫缺陷病毒(HIV)感染抗性的方法，包括向受治療者給與一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物。
17．權(quán)利要求16的方法，其中該受治療者有接觸HIV的風(fēng)險(xiǎn)、已接觸HIV或已感染HIV。
18．治療人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，包括向已感染HIV的受治療者給與一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物。
19．Exodus蛋白產(chǎn)物的用途，即用于制備預(yù)防性或治療性治療HIV感染的藥物。
20．按照權(quán)利要求19的用途，其中該藥物抑制HIV增殖。
21．保護(hù)骨髓祖細(xì)胞免受細(xì)胞毒性作用的方法，包括向受治療者給與一定量的有效抑制骨髓祖細(xì)胞增殖的Exodus蛋白產(chǎn)物。
22．權(quán)利要求21的方法，其中該受治療者正進(jìn)行化療或放療。
23．Exodus蛋白產(chǎn)物的用途，即用于制備抑制骨髓祖細(xì)胞增殖的藥物。
24．權(quán)利要求23的方法，其中將該藥物給與接受化療或放療的受治療者。
25．治療骨髓組織增生性疾病的方法，包括向患骨髓組織增生性疾病的受治療者給與一定量的有效抑制惡性骨髓祖細(xì)胞增生的Exodus蛋白產(chǎn)物。
26．權(quán)利要求25的方法，其中該骨髓組織增生性疾病是慢性髓細(xì)胞性白血病、原發(fā)性血小板增生、骨髓纖維化或真性紅細(xì)胞增多。
25．Exodus蛋白產(chǎn)物的用途，即用于制備治療骨髓組織增生性疾病的藥物。
26．按照權(quán)利要求26的用途，其中該骨髓組織增生性疾病是慢性髓細(xì)胞性白血病、原發(fā)性血小板增生、骨髓纖維化或真性紅細(xì)胞增多。
全文摘要
本發(fā)明提供純化的和分離的編碼人巨噬細(xì)胞來(lái)源的命名為Exodus的C－C化學(xué)激活素的多聚核苷酸序列。亦提供純化的和分離的化學(xué)激活素蛋白、其片段及多肽類似物、其抗體和其重組生產(chǎn)的材料和方法。這些產(chǎn)物可以用于治療、診斷和醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1213401SQ97192980
公開(kāi)日1999年4月7日 申請(qǐng)日期1997年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月15日
發(fā)明者R·羅馬斯 申請(qǐng)人:先進(jìn)研究及技術(shù)學(xué)會(huì)