專利名稱：與層粘連蛋白的巢蛋白結合域結合的抗體及其制備和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與層粘連蛋白的巢蛋白結合域特異性結合的單克隆和多克隆抗體及其部分，還涉及所述抗體及其部分的制備方法，以及它們作為藥物、作為檢測層粘連蛋白同種型的診斷試劑、作為研究和評價影響巢蛋白/層粘連蛋白相互作用之物質的模型物質的用途。本發(fā)明的抗體或其部分優(yōu)選與層粘連蛋白的γ1 III4區(qū)域結合，特別是與環(huán)a或環(huán)-a和c之高度保守區(qū)域中的必不可少的巢蛋白結合位點結合，并且能抑制層粘連蛋白和巢蛋白的結合。
層粘連蛋白(一種800kDa的糖蛋白)和巢蛋白(一種160kDa的糖蛋白)的結合被看成是基底膜合成和穩(wěn)定化中一種關鍵性的生物分子機制[Mayer，U.& Timpl，R.(1994)胞外基質裝配和結構(P.D.Yurchenco等人編)p389-416，Academic Press，Orlando，FL]。由于巢蛋白能與基底膜所有主要成分，如含有γ1的層粘連蛋白同種型[有關其命名，見Burgeson，R.E.等(1994)，基質生物學，14209-211]、膠原蛋白IV、基底膜聚糖和fibulin以及它們的各個結合結構形成三元復合體，因此巢蛋白可行使連接成員功能，互連、空間識別并穩(wěn)定相互不同的宏觀結構(Fox，J.W等(1991)EMBOJ.103137-3146；Aumailley，M.等(1993)Kidney Int.437-12)。
使用多克隆的抗層粘連蛋白抗體的實驗提供了明顯的證據表明層粘連蛋白/巢蛋白之相互作用在功能性基底膜合成中起主要作用。通過用層粘連蛋白P1或重組產生的層粘連蛋白片段γ1 III 3-5免疫兔，得到了這些抗體，并通過在層粘連蛋白P1或層粘連蛋白γ1III 3-5基質上進行親和層析濃縮了所述抗體。在抑制試驗中，所述抗體完全抑制了層粘連蛋白/巢蛋白之結合，然而，這種抑制是以抗體為基礎的，抗體的結合區(qū)域只是位于層粘連蛋白之巢蛋白結合序列的附近，在空間上阻隔了巢蛋白接近層粘連蛋白(Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885)。在胚胎器官培養(yǎng)中，這些抗體能抑制腎小管發(fā)生，也能抑制肺泡形成。這兩個過程都是依賴于基底膜不受阻撓的新合成的個體發(fā)育程序(Ekblom，P等(1994)發(fā)育1202003-2014；Ekblom，P(1993)基底膜的分子和細胞領域(Rohrbach，D.H. & Timpl，R.編)p359-383；Academic Press，SanDiego，CA.)。
已清楚地鑒定和表述了層粘連蛋白之巢蛋白結合域的位置和序列及其空間結構(X-射線晶體結構和NMR結構)(Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885；Baumgartner，R等(1996)分子生物學雜志，257658-668；Stetefeld，J等(1996)分子生物學雜志，257644-657)。所述結合域位于層粘連蛋白γ1鏈短臂之γ1 III 4區(qū)域中的“LE組件”(層粘連蛋白型，表皮生長因子樣)內?！癓E組件”是由50-60個氨基酸組成的結構基元，所述基元表現出類似于表皮生長因子的、具有4個二硫鍵的復合折疊模式(Bairoch，A.(1995)胞外域的命名，SWISS-PROT蛋白質序列數據庫，Release 310；Engel，J.(1989)FEBS Letters 2511-7)。
已經闡明，對于小鼠EHS腫瘤層粘連蛋白P1、人胎盤層粘連蛋白2和層粘連蛋白4以及果蠅層粘連蛋白而言，巢蛋白以高親合力與互補的層粘連蛋白區(qū)域結合。這種種間重疊的結合特異性出現的原因是在所研究的諸種內層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域存在異常高水平的氨基酸序列同一性。當考慮到整個組件時，人和小鼠之間的上述序列同一性達到97％，人和果蠅之間的上述同一性竟然達到61％。如果將比較局限于含有必需的巢蛋白結合位點的a至c環(huán)區(qū)域，上述值分別增加至100％和75％(Pikkarinen，T等(1987)生物化學雜志，2636751-6758；Chi，H-C. & Hui，C.F.(1989)生物化學雜志，2641543-1550)。
除闡明了巢蛋白的結合依賴于完整的三維結構之外，也有可能鑒定出位于層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域之S-S穩(wěn)定化的a和c環(huán)內十分確定的序列區(qū)域。鑒定出了5個必需的氨基酸4個位于a環(huán)中7個氨基酸的區(qū)段內，一個酪氨酸位于c環(huán)側鏈中(Poschl，E等(1994)EMBO J，133741-3747；Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885；Poschl，E等(1996)EMBO J，155154-5159)。
在特殊結合試驗中，可得自層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域之相應區(qū)域的合成肽能完全抑制層粘連蛋白/巢蛋白的結合(US5,493,008)。然而，這種合成肽在抑制試驗中表現出的活性比完整的層粘連蛋白P1或層粘連蛋白γ1 III 3-5的活性約低400-10,000倍(Poschl，E等(1994)EMBO J，133741-3747；US 5,493,008)。層粘連蛋白/巢蛋白間相互作用受強大的構象成分影響(Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885)。在水溶液中，肽能采取無數不同的構象，結果是僅有一部分肽以具有生物活性的構象存在，據此可解釋合成肽抑制作用較弱的原因。
由于這些肽構型的靈活性，以及在蛋白酶存在下的不穩(wěn)定性和弱的生物利用率和藥效，使其作為藥物的用途受到很大的限制(Milner-White，E.J.(1989)Trends Pharmacol.Sci.1070-74；Hruby，V.J.(1994)Peptides，Proc.Thirteenth AmericanPeptide Symposium；(Hodges，R.S. & Smith，J.A編)p 3-17；ESCOMLeiden，Netherlands)。
與層粘連蛋白之巢蛋白結合域特異性結合、且在低濃度下能競爭性抑制層粘連蛋白和巢蛋白之間的結合的抗體更適于用作治療疾病的治療劑，因為它們具有較高的親和力，較高程度的穩(wěn)定性和令人滿意的藥物動力學。另外，它們也可用作診斷試劑，或用作研究和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白間相互作用之物質的生物學和藥學模型中的輔助物。
盡管以前生產的一些抗層粘連蛋白P1或抗層粘連蛋白γ1 III3-5抗體能抑制巢蛋白/層粘連蛋白結合，但它們不是直接識別層粘連蛋白γ1鏈的巢蛋白結合位點；反倒是空間相互作用的結果抑制了巢蛋白/層粘連蛋白結合(Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885)。層粘連蛋白γ1鏈的巢蛋白結合域以種間重疊的方式超乎尋常地高度保守。除此之外，層粘連蛋白是一種胞外蛋白，它既可作為基底膜的整合組分，也可以循環(huán)血清組分的形式，持續(xù)地與免疫系統(tǒng)接觸(EP 0696 597 A2)。由于免疫系統(tǒng)能區(qū)分“我”與“非我”，可以斷定，每個經免疫的種均將高度保守的免疫抗原識別為其自體組分，為此不會產生任何針對此組分的抗體，因此，預期不能產生特異性的抗體滴度。迄今為止，通過用層粘連蛋白P1和層粘連蛋白γ1 III 3-5免疫兔，均未能產生任何針對層粘連蛋白巢蛋白結合域的抗體，這一事實進一步證實了上述被普遍認可的學說(Mayer，U等(1993)EMBO J.121879-1885)。然而，與層粘連蛋白之巢蛋白結合域外部非確切限定的表位結合的上述多克隆抗體不太適于或完全不適于用作治療劑、診斷試劑，或用作研究和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白相互作用之物質的模型物質因為空間抑制作用取決于抑制劑的空間范圍，因此將這些抗體的部分用作治療劑(在藥物學上以此為佳)幾乎是不太可能的。另外，與并不打算檢測的分析物之間可能的交叉反應限制了這些抗體在診斷試驗中的應用。
本發(fā)明的目的是產生這樣一類抗體，它們能與層粘連蛋白的巢蛋白結合域特異性結合，即能直接識別層粘連蛋白γ1鏈的巢蛋白結合域，并適于用作藥物、用作檢測層粘連蛋白同種型的診斷試劑，以及用作開發(fā)和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白間相互作用之物質的模型物質。
通過下文描述的抗體以及制備和使用這些抗體的方法，可達到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的抗體或其部分特征性地與層粘連蛋白的巢蛋白結合域(即層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域)結合，優(yōu)選與層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域的a環(huán)或a和c環(huán)之高度保守的區(qū)域結合。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以與表位有關的依賴于構象的方式(即識別層粘連蛋白之巢蛋白結合位點的天然構象；參見實施例6)，直接或以重疊的方式與a環(huán)或a環(huán)和c環(huán)之高度保守的區(qū)域結合。具體地說，本發(fā)明包括至少與表1所示的一種肽結合的抗體或其部分。本發(fā)明提供了多克隆和單克隆抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗體是嵌合的、人源化的、雙特異性或寡特異性抗體。特別優(yōu)選本發(fā)明的抗體競爭性地或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白間的結合(參見實施例7)。表1用于免疫的肽的氨基酸序列(1) DNIDPNAVGNL
通過用層粘連蛋白、層粘連蛋白P1、層粘連蛋白γ1 III 3-5或層粘連蛋白γ1 III 4，特別是用含有層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域的必需的巢蛋白結合位點但非其整個氨基酸序列的肽，特別優(yōu)選用表1所示的一種或兩種肽作為免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎動物，如兔、小鼠、綿羊、山羊、豚鼠、大鼠和雞，可得到本發(fā)明的抗體。
當用層粘連蛋白或層粘連蛋白P1進行免疫時，使用層粘連蛋白γ1 III-3-5和/或層粘連蛋白γ1 III-4鑒定抗體，并最終檢測其競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的能力。
當用層粘連蛋白γ1 III 3-5進行免疫時，使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定抗體，并最終檢測其競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的能力。
特別優(yōu)選使用層粘連蛋白γ1 III 4或表1所示的一種或多種肽作為免疫抗原。用這些免疫抗原免疫可得到的抗體優(yōu)選使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1進行鑒定。檢測鑒定出的抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白結合位點的能力是有利的。
除了多克隆抗體之外，在下文的實例中，用起先產生的可生產單克隆抗體Mab的雜交瘤細胞也可得到單克隆抗體(Mab)。也可使用親和層析，優(yōu)選使用以層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1作為親和基質的親和層析，從含有抗體的材料(如經免疫動物的抗血清、雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液、腹水或細胞)中純化本發(fā)明的抗體，得到純化形式的抗體。
本發(fā)明的抗體或其部分能抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用，作為一個總稱說來，它們也包含相應的嵌合的、人源化的、雙特異性或寡特異性抗體，和抗體類似物，在別處詳細描述了這些抗體和抗體類似物。
本發(fā)明也包括產生本發(fā)明抗體和抗體部分的動物、植物和原核生物的細胞以及細胞系，優(yōu)選雜交瘤DSMACC2327，根據布達佩斯條約的規(guī)定，于1997年10月27日將該雜交瘤保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心)(DSMZ，Marscheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德國)。本發(fā)明也涉及由保藏號為DSMACC2327的雜交瘤產生的單克隆抗體。
本發(fā)明另外還包括上述抗體的制備方法，其中，使用具有免疫活性的脊椎動物，如兔、小鼠、綿羊、山羊、豚鼠、大鼠和雞，用層粘連蛋白、層粘連蛋白P1、層粘連蛋白γ1 III 3-5和層粘連蛋白γ1 III 4，特別優(yōu)選用不含有層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域完整的氨基酸序列的肽，更特別優(yōu)選用表1所示的一種或兩種肽來制備上述抗體。應理解術語“肽”包括寡肽、多肽，也包括蛋白質和蛋白質片段。當用作免疫抗原時，優(yōu)選使用與載體偶聯(lián)的肽，所述載體如蛋白質(如卵白蛋白、白蛋白或血藍蛋白)，或聚合物(如聚乙二醇，聚丙烯酰胺或聚-d-谷氨酰胺-d-賴氨酸)。
當用層粘連蛋白或層粘連蛋白P1進行免疫時，使用層粘連蛋白γ1 III 3-5和/或層粘連蛋白γ1 III 4鑒定抗體，并檢測其競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的能力。
當用層粘連蛋白γ1 III 3-5進行免疫時，使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定抗體，并檢測其競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的能力。
優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中使用層粘連蛋白γ1 III 4，或必要時使用表1所示的一種或兩種肽，優(yōu)選使用與載體偶聯(lián)的上述物質。
優(yōu)選使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1，對用層粘連蛋白γ1III 4或用表1所示的一種或兩種肽免疫產生的抗體進行鑒定，檢測所述抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的能力是有利的。
該方法也任選地包括產生可生產MAb的雜交瘤細胞。業(yè)已證實，借助于例如親和層析，優(yōu)選使用以層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1作為親和基質的親和層析，從含有抗體的材料(如經免疫動物的抗血清、雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液、腹水或細胞)中純化本發(fā)明的抗體或其部分是有利的。
可以多種不同的方式使用本發(fā)明的抗體或其部分，例如作為藥物，作為診斷試劑，作為開發(fā)和評價能影響巢蛋白/層粘連蛋白相互作用之物質的生物學和藥學模型中的輔助物，例如作為模型物質，用于評估與層粘連蛋白之巢蛋白結合位點互補的接觸區(qū)帶的空間結構，及此接觸區(qū)帶潛在的結合效價，和用于研究基底膜的生物合成和在不同生理學進程(如器官發(fā)育、血管發(fā)生或胚胎發(fā)生)中基底膜的影響。本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的一種或多種抗體或抗體部分的藥物和診斷試劑。
本發(fā)明也包括本發(fā)明的一種或多種抗體或抗體部分用于下述的用途*用于制備藥物以治療一些疾病，這些疾病有，基底膜、具體為纖維膜過量或不必要合成的疾病，尤其是酒精肝纖維變性和肺纖維變性，以及伴隨著基底膜增厚(尤其是在腎臟，眼和血管系統(tǒng)中)的所有形式的糖尿病晚期并發(fā)癥，還有動脈硬化以及因血管發(fā)生而使臨床癥狀惡化的所有疾病，如癌癥、糖尿病性視網膜病，和具有強炎性因子的疾病，如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、血管炎、血管瘤和銀屑?。?用于制備診斷試劑以檢測生物樣品、例如體液(如血液、血清、血漿、尿液、唾液或腦脊髓液)和組織中含有γ1的層粘連蛋白同種型。術語診斷試劑包括例如異種和同種免疫測定、免疫組化檢測系統(tǒng)和如免疫閃爍掃描術的體內檢測方法中所用試劑的不同實施方案。含有本發(fā)明抗體或抗體部分的制品也可以診斷試劑盒的形式或單獨或與其它輔助試劑(如緩沖液、洗滌溶液、發(fā)射信號檢測溶液)和/或其它輔助物(如小池)一起聯(lián)合使用。
下文中，將借助于多個實施例更詳細地描述和闡明本發(fā)明令人驚奇的是使用表1所列的、不能形成如LE組件中所見的任何折疊模式的肽可以產生針對層粘連蛋白之巢蛋白結合域高度保守的氨基酸序列的抗體。為此，使用碳二亞胺，將表1所示的肽與卵白蛋白偶聯(lián)，然后使用這些偶聯(lián)物免疫兔。借助于酶免疫測定法分析針對層粘連蛋白P1和層粘連蛋白γ1 III 3-5的特異性抗體滴度的產生情況。
通過使具有所需特異性的多克隆抗體穿過結合有人胎盤層粘連蛋白P1的基質以進行親和層析，然后再進行分子篩層析，濃縮所述抗體。EP 0696 597 A2中描述了純化和鑒定人胎盤層粘連蛋白的方法，以及人胎盤層粘連蛋白用于免疫小鼠和分離能合成抗層粘連蛋白P1之抗體的雜交瘤的用途。
對抗血清進行層粘連蛋白P1親和層析后得以濃縮的抗體顯示出對人胎盤層粘連蛋白P1/小鼠層粘連蛋白P1(EHS腫瘤)和大鼠層粘連蛋白(卵黃囊)的結合特異性。除了能識別該特異性序列外，抗體也能識別層粘連蛋白之巢蛋白結合域的生物活性構象。它們能完全抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合。
然而，優(yōu)選地，用層粘連蛋白γ1 III 4，特別是用含有層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域的重要的巢蛋白結合位點但并不含有其完整的氨基酸序列的肽，特別優(yōu)選用表1所示的肽免疫具有免疫活性的其它脊椎動物，如小鼠、綿羊、山羊、豚鼠、大鼠和雞，也可得到本發(fā)明的抗體?？蓮慕浢庖邉游锏目寡逯屑兓景l(fā)明的多克隆抗體。為了產生相應的單克隆抗體，可使用眾所周知的方法(例見Harlow，E. & Lane，D.(1988)抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港)，將經免疫動物(如小鼠)的免疫細胞與骨髓瘤細胞融合，以產生可生產Mab的雜交瘤細胞，然后分離適當的克隆。使用特異的篩選方法選擇所需的可生產Mab的克隆。本文優(yōu)選使用酶免疫測定法或放射性免疫測定法，以及Western印跡，來檢查釋放至培養(yǎng)物上清液中的抗體結合例如免疫抗原、免疫抗原載體以及天然和重組層粘連蛋白和/或其片段的特異性。另一個可能的選擇標準是抗體阻止巢蛋白/層粘連蛋白結合的能力。使用例如實施例中詳細描述的抑制試驗可評價這種能力。已克隆出了能產生特異性地結合層粘連蛋白之巢蛋白結合域的Mab的雜交瘤，然后可將所述雜交瘤長期用于產生Mab。根據所需的目的，僅使用抗體的一部分，如F(ab)2、Fab’或Fab片段可能更為有利的。使用例如本領域技術人員已知的酶裂解法可產生這些片段(例見Harlow，E. & Lane，D.(1988)抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港)。
抗體的抗原結合位點位于所謂的可變區(qū)，該可變區(qū)由相應的V基因編碼。假如通過氨基酸測序的結果仍不知道該序列，也可使用已知的基因操作方法(例見Sambrook，J等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，第2版；McCafferty，J等(1990)自然，348552-554)測定與層粘連蛋白之巢蛋白結合域結合的抗體的相應核酸序列，從而推定其相應的氨基酸序列。雜交瘤細胞或經免疫哺乳動物之產生抗體的免疫細胞被用作分析的起始材料。
當已知核酸和氨基酸序列時，即可使用常規(guī)的基因操作和分子生物學方法(也參見Johnson，K.S. & Chiswell，D.J.(1993)結構生物學最新見解，3564-571)制備與層粘連蛋白之巢蛋白結合域特異性結合的人源化的或嵌合的、雙特異性的或寡特異性的抗體和抗體類似物，如得自互補決定區(qū)的肽(“最小識別單位”)、單鏈片段和功能性融合產物，具體如重組制備的抗體/酶或抗體/補體構建體。得自本發(fā)明抗體或抗體基因的這些分子包括在本文所用的總術語“抗體或其部分”中。這些分子可作如下應用例如，當將它們作為藥物施用時，可用來達到免疫原性降低和/或效力增加的目的，和/或當將它們用作診斷試劑或作為研究和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白相互作用之物質的輔助物時，也可帶來好處?？稍谥参?如酵母)、動物和原核細胞中制備諸抗體或其部分。
當用于體內診斷時，可通過例如用放射性同位素或順磁化合物標記來修飾本發(fā)明的抗體及其部分，或者，可通過將藥學活性物質與之結合來修飾本發(fā)明的抗體及其部分以產生甚至更有效的藥物。
下文所述實施例通過舉例方式闡明本發(fā)明的各個方面。實施例根據標準方法或生產商說明進行SDS凝膠電泳，Western印跡和BCA蛋白質測定。除非特別說明，所用化合物得自Merck(Darmstadt)，Sigma(Munich)或Riedel de Haen(Seelze)。實施例1肽的合成使用148mg(0.1mmol)FMOC-酰胺錨-PAM樹脂以固相合成(ABI433肽合成儀)肽。完成合成之后，觀察到樹脂重量增加到513mg。室溫下，用由10ml三氟乙酸和365μl三乙基硅烷組成的溶液將樹脂處理2小時。樹脂被濾去之后，通過在真空中旋轉蒸發(fā)以濃縮溶液，將殘留物溶解于50ml 10％乙酸(AcOH)中，然后將此溶液凍干，得到145mg(得率為54％)粗肽。然后將粗肽溶解于3ml 80％AcOH中，將此溶液滴加至快速攪拌的溶液(0.006mmol碘和0.006mmol乙酸鈉于55ml 80％AcOH)中。5分鐘后，加入0.1N抗壞血酸溶液以終止反應。將溶液濃縮至體積為2ml，并上樣于SephadexG25柱中，用0.1MAcOH展開。然后使用反相HPLC層析得到高度純化形式的分離肽。得率36mg DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2(理論值的13.5％)通過質譜分析法(分子量2673Da)和氨基酸分析證實結構。
按類似的方式制備肽DNIDPNAVGNL-NH2。得率268mg(理論值的67％)；分子量1140Da實施例2將肽與卵白蛋白偶聯(lián)將30mg卵白蛋白(Sigma A 2512)溶解于1ml磷酸鈉緩沖液，pH7.4中，然后向此卵白蛋白溶液中加入200μl含7mg N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉鹽(Fluka 56485)的水溶液和300μl含100mg 1-乙基-3-(3-diaminaminopropyl)碳二亞胺，HCl(Sigma E 6383)的水溶液。5分鐘后，加入肽溶液(30mg適當的肽溶于1ml 10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4中)。室溫下，在黑暗中進行偶聯(lián)反應16小時。反應期結束時，離心溶液以除去可能已出現的任何濁物。然后通過NAP 25柱(Pharmacia)層析除去未反應的化合物和鹽。這樣即將卵白蛋白/肽偶聯(lián)物轉移至PBS+0.04％吐溫20中，得率為50-55mg偶聯(lián)物。偶聯(lián)物1卵白蛋白-DNIDPNAVGNL偶聯(lián)物2
實施例3免疫兔用卵白蛋白/肽偶聯(lián)物免疫體重約為3kg的雜種兔。為此，將1mg各種適當的偶聯(lián)物溶解于0.5ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，然后將此溶液與相同體積的完全弗氏佐劑混合，小心乳化全部混合物。將1ml所得乳劑皮內注射給兔；在此操作過程中，每次將1/5體積施用于局部淋巴結附近5個不同位點中的1處。21天和53天后，用半濃縮的抗原乳劑進行加強免疫注射(為此，用不完全弗氏佐劑乳化抗原)。實施例44只經免疫兔體內滴度的發(fā)展通過使用經層粘連蛋白P1包被或經層粘連蛋白γ1 III 3-5包被的塑料托盤進行酶免疫測定，以詳細研究4只動物體內特異性抗體滴度的發(fā)展情況。以R2，R3，R4和R905表示相應的動物血清。用偶聯(lián)物1免疫得到血清R3和R4，而用偶聯(lián)物2免疫得到血清R2和R905。在所有兔中，均非?？斓丶ぐl(fā)了免疫反應，此免疫反應在21天后(第一次加強免疫)保持恒定，或緩慢但連續(xù)地降低。未觀察到第二次加強免疫注射可重新刺激免疫應答。形成的抗體既可與層粘連蛋白P1反應，也可與層粘連蛋白γ1 III 3-5區(qū)域反應。然而，抗體與層粘連蛋白P1的結合在某種程度上不如與層粘連蛋白γ1 III3-5的結合那么顯著，且在免疫反應的過程中似乎較不穩(wěn)定。這可能表明在多克隆的血清中存在幾個以不同親合力與層粘連蛋白P1和層粘連蛋白γ1 III 3-5中的巢蛋白結合基元或其構象結合的抗體群。實施例5抗體的親和純化為了進一步鑒定抗體，將特異性的抗體與動物血清中剩余的免疫球蛋白、其它血清組分和針對卵白蛋白的抗體分開。為此，在層粘連蛋白P1親和基質上進行親和層析，將FractogelEMDazlactone 650(S)(Merck，Darmstadt)用作支持物(凝膠基質)。偶聯(lián)之前，于6ml PBS、1M Na2SO3，pH7.4中將0.3g材料保溫15分鐘，然后倒掉液體上清液。保溫過程中，材料的體積溶脹至1ml，可直接使用基質以與所需配體共價偶聯(lián)。
將3.4mg人層粘連蛋白P1溶解于2ml 0.2M碳酸氫銨，pH8.0中，于4℃，將此溶液與1ml被激活(見上文)的支持材料一起保溫過夜(＞16小時)。然后用0.2M碳酸氫銨，pH8.0洗滌凝膠材料。通過在4℃，于5ml 0.2M甘氨酸，pH8.0中保溫24小時，以封閉支持材料上的殘留活性基團。通過在PBS、1M Na2SO3(pH7.4)，0.1M乙酸鈉(pH4.0)和0.2M甘氨酸(pH8.0)中輪換保溫，進行3次洗滌循環(huán)，最終制得親和結合所用的凝膠基質。用基質填充PharmaciaHR5/5柱，然后用PBS/0.04％吐溫20平衡柱。
為了從動物血清中純化與層粘連蛋白P1結合的抗體，用PBS/0.04％吐溫20按1∶2稀釋相關血清，并以2ml/min的流速使稀釋后的血清流過柱。隨后，用緩沖液洗滌柱，直至流過監(jiān)測儀的UV信號(220nm)再次達到基線。通過將過柱緩沖液變換為0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7，最終洗脫結合的抗體。
使用固定化的層粘連蛋白γ1 III 3-5進行酶免疫測定，分析柱流過液和柱洗脫液。
上述親和純化被成功地用于從4種動物血清中純化抗體，平均得率是每50ml血清0.3mg(血清R2的得率僅為0.1mg)。然而，所有血清中的大多數抗體(＞80％)均不與層粘連蛋白P1結合，推測這或者是由于結合動力學太低，或者是由于只對用于免疫的肽的序列具有親合力。
在層粘連蛋白P1柱上進行親和層析使得可以從血清中選擇性地富集快速而穩(wěn)定結合的抗體變體(尋找抗體)。實施例6經親和純化的抗體的結合特異性Western印跡結果證實，經親和純化的抗體保持了對層粘連蛋白P1的結合特異性，相對于與通過還原二硫鍵可分離的線性層粘連蛋白P1部分(Gerl，M.等(1991)歐洲生物化學雜志，202167-174)的反應而言，不同制品與未經還原的層粘連蛋白P1的反應更加強烈。這是抗體的結合特異性中依賴于構象的組分的間接證據。另外還發(fā)現，4種抗體制品的結合偏向性不同。用偶聯(lián)物1免疫得到的兩種抗體制品R3和R4識別相同的層粘連蛋白P1帶，所述帶是通過對未經還原的樣品進行SDS(十二烷基硫酸鈉)凝膠電泳之后得到的。而兩種抗體制品R2和R905(抗偶聯(lián)物2)也表現出彼此相同的反應模式，與抗偶聯(lián)物1的兩種抗體制品相比，它們識別較少的層粘連蛋白P1帶。
在免疫化學檢測通過還原和SDS凝膠電泳分離的層粘連蛋白P1帶時，我們驚奇地發(fā)現所有4種抗體制品對含有層粘連蛋白γ1 III 4的部分具有不同的結合偏向性。實施例7抑制試驗-用經親和純化的抗體抑制層粘連蛋白/巢蛋白的結合利用包被管試驗可以鑒定經親和純化的抗體的抑制活性，所述包被管試驗是在抗體存在下測定經放射性標記的巢蛋白與被(人胎盤)層粘連蛋白P1包被的管的結合情況。用125I放射性標記巢蛋白將重組產生的人巢蛋白(35μg，有關克隆的描述和培養(yǎng)及純化條件可參見Mayer，U等(1995)，歐洲生物化學雜志，227681-686)溶解于250μl PBS中，向溶液中加入0.405mCi(＝15Mbq)碘化鈉(125I)溶液(＝1.55μl，Nordion Europe)，10μl 0.5M磷酸鈉(pH7.4)和溶于100μl 0.05M磷酸鈉(pH7.4)中的40μg氯胺T(N-氯-4-甲苯磺酰胺鈉鹽，Merck)。室溫下將反應進行60秒，加入溶于100μl 0.05M磷酸鈉(pH7.4)中的40μg偏亞硫酸氫鈉(Riedel-de-Haen)溶液以終止反應。此加入過程至多持續(xù)30秒，然后向混合物中加入900μl溶于PBS中的1％BSA(Sigma)。通過使用PD 10柱(Pharmacia)的分子篩層析，分離出游離的放射性和過量的鹽。收集洗脫至PBS中的被碘標記的巢蛋白，用1％BSA/0.05M磷酸鈉/0.01％疊氮化鈉，pH7.4進行稀釋，使其濃度為50ng/ml。包被反應管于4℃，用4μg/ml溶于碳酸鹽緩沖液(0.159g碳酸鈉；0.293g碳酸氫鈉；0.02g NaN3于1升蒸餾水中)、20μg/ml BSA(牛血清白蛋白，Serva)，pH9.2中的層粘連蛋白P1溶液將反應管(Greiner，75×12，No.115061)包被過夜。通過與0.5ml溶于PBS/0.04％吐溫20中的0.5％BSA一起保溫2小時以封閉游離的結合位點。使用“層粘連蛋白模擬”結構的抑制試驗(有順序的抑制)室溫下，在反應容器中搖晃200μl經碘標記的巢蛋白(約10ng，約40,000cpm)和200μl抑制劑(如可得自層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域的肽)或標準品(層粘連蛋白γ1 III 3-5)。抑制劑和標準品皆溶于PBS/0.04％吐溫20中。保溫3小時之后，將150μl此混合物轉移至經包被的管中，室溫下再保溫2小時。最后，移出溶液，用1mlPBS/0.04％吐溫20將管洗滌2次，然后在γ計數儀上測定結合的放射性(巢蛋白)。含有抑制劑的溶液中結合的巢蛋白的量與未加入抑制劑時巢蛋白的量相關。使用“巢蛋白模擬”結構的抑制試驗(有順序的抑制)在經層粘連蛋白P1包被的反應容器中，將150μl抑制劑(如可與層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域結合的抗體或可得自巢蛋白序列的肽)或標準品(重組的巢蛋白)搖晃3小時。抑制劑和標準品皆溶于PBS/0.04％吐溫20中。樣品被吸收之后，加入150μl經碘標記的巢蛋白(約10ng，約40,000cpm)，維持2小時，以置換已結合的抑制劑。最后，移出溶液，用1ml PBS/0.04％吐溫20將容器洗滌2次，然后在γ計數儀上測定結合的放射性(巢蛋白)。結合的放射性巢蛋白的量與抑制劑濃度或標準品的濃度有關。抑制試驗(同時抑制)在此試驗變型中，未預先進行保溫，而是將75μl經碘標記的巢蛋白(10ng)與75μl抑制劑或標準品一起直接移入經包被的管中，然后于室溫下保溫2小時；除此不同之外，本方案類似于有順序的抑制試驗變型。結果從10次獨立的試驗中得出層粘連蛋白γ1 III 3-5標準品的IC50％為0.22nM，標準偏差為+/-15％。IC50％的定義為將巢蛋白與層粘連蛋白P1的結合抑制50％所需物質的濃度。為了進行比較，使用US5,493,008中所述的(平衡)抑制試驗得到IC50％為0.05nM，標準偏差為+/-52％。
表2顯示出抗體制品R3，R905，R1.2，R2.2和R3.2及不同的游離肽的IC50％值?？贵w制品R1.2，R2.2和R3.2是用新的偶聯(lián)物II進行第二輪兔免疫并經過類似的純化步驟得到的。這些結果表明該方法具有再現性。表2本發(fā)明抗體對層粘連蛋白/巢蛋白結合的抑制作用
*氨基酸序列見表1**試驗類型US 5,493,008中指出可得自巢蛋白結合域的抑制肽的IC50％值為22nM至1000nM。由于保溫時間顯著縮短，用選定的試驗不可能得到這些值；例如，在本文所述試驗中，肽DNIDPNAVGNL的IC50％值僅為60000nM。實施例8使用BIAcore系統(tǒng)鑒定結合動力學可使用Pharmacia Biosensor的BIAcore系統(tǒng)聯(lián)機監(jiān)測生物特異性的相互作用。檢測原理是基于一種光學現象(表面胞質基因組共振)，這種現象受結合于金膠片上的物質的影響。簡單地說，該系統(tǒng)是金傳感器表面的小型化親和層析?？梢怨舱裥盘柕男问饺庋塾^察特異性結合的配體的量(Chaiken，I等(1992)分析生物化學，201197-201；Karlsson，R等(1992)抗原結構；(van Regenmortel編).p127-148；CRC出版社，Boca Raton，FI.)。
根據使用手冊中的指示，將溶于10mM乙酸鈉(pH4.0)中濃度為200μg/ml的層粘連蛋白P1固定于傳感器片上，得到含有4000RU結合的層粘連蛋白P1的基質。進行雙脈沖，每次均用4μl 100mMHCl，以再生親和基質。
在HBS緩沖液(10mM HEPES，3.4mM EDTA，150mM NaCl，0.005％BIAsurfactant P20；pH＝7.4)中，流速為2μl/min時，巢蛋白(20μg/ml)以拋物線式飽和動力學與層粘連蛋白P1結合，經親和純化的抗體制品R905和R3以線性依賴于抗原的方式與層粘連蛋白P1結合。1400秒后仍未能觀察到任何向平衡態(tài)轉換的跡象，這一事實可能是負責結合巢蛋白的層粘連蛋白P1特異性肽序列易于被抗體所用的反映。不論此序列是生物活性構象還是不同的構象，諸抗體都與此序列結合。這一觀點的證據在于以下觀察結果，即僅結合600RU后，巢蛋白就明顯轉換至飽和相。因此，很顯然，不是所有固定化的層粘連蛋白P1分子都以巢蛋白可識別的結構存在，因為未達到層理論最大飽和值2500RU。然而，長時間接觸后，兩種抗體即可達到這種飽和。令人驚奇的是，不得不以高10倍的濃度(320μg/ml)使用R905樣品，以達到和R3(33μg/ml)差不多的結合速率。另一方面，與R3相比，R905與層粘連蛋白P1的結合更加穩(wěn)定，因為R905解離的速率(由變化至HBS緩沖液的時間1500秒即可看出)比R3制品解離的速率明顯慢一些。
這些發(fā)現解釋了在抑制試驗中觀察到的R3和R905之間的差異●抗體制品R3抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的效果比R905更好，因為R3結合的特征在于具有更快速的結合動力學?！癞斣诮泴诱尺B蛋白P1包被的管中與巢蛋白同時保溫時，抗體制品R3也能抑制層粘連蛋白/巢蛋白的結合，因為當其濃度與巢蛋白差不多時，R3具有良好的結合動力學?！窨贵w制品R905僅能在“有順序的抑制”試驗變型中抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合，因為其特征在于解離速率較慢，因此后來加入的巢蛋白不再能輕易地從抗原上取代R905。當R905和巢蛋白同時競爭結合位點時，R905因其很慢的結合動力學而遜于巢蛋白。實施例9通過Western印跡檢測親和純化的抗體制品R3和R905的結合特異性在Western印跡分析中研究抗體制品R3和R905與偶聯(lián)物2和卵白蛋白的相互作用。為此，根據NOVEXTM說明書，使用4-12％NuPAGETM凝膠(NOVEXTM，San Diego，CA)和MOPS緩沖液分級分離抗原，然后使用NuPAGETM轉移緩沖液(NOVEXTM)將抗原轉移至硝酸纖維素膜上。用1μg/ml聚乙烯醇封閉膜上的游離結合位點(1min)之后，將抗原與檢測抗體一起保溫。然后用共價鍵合了堿性磷酸酶的抗兔IgG抗體檢測已結合的抗體。
我們發(fā)現，親和純化的抗體只與肽結合，因為未能檢測到其與載體蛋白卵白蛋白的任何相互作用。也未能觀察到其與藍色的“SeeBlue”標準標記物(NOVEXTM)有任何反應。
還已證明，R3和R905都能與層粘連蛋白和得自不同種的層粘連蛋白衍生物(人胎盤層粘連蛋白和大鼠卵黃囊層粘連蛋白(Calbiochem)，人胎盤層粘連蛋白P1和小鼠EHS腫瘤層粘連蛋白P1，以及重組制備的小鼠層粘連蛋白γ1 III 3-5)反應。這為抗體與巢蛋白結合域內保守序列的結合提供了支持證據。兩種抗體制品均未表現出與人巢蛋白或人IV型膠原蛋白具有任何交叉反應性。這是明確使用上述抗體作為巢蛋白拮抗劑的先決條件。實施例10制備單克隆抗體為了得到單克隆抗體，使用標準方法，用例如層粘連蛋白、層粘連蛋白P1、層粘連蛋白γ1 III 3-5或層粘連蛋白γ1 III 4，或用實施例2中提及的偶聯(lián)物免疫適當的脊椎動物，優(yōu)選為小鼠或大鼠。當抗血清表現出特異性的免疫反應時，使用標準方法分離可產生Mab的雜交瘤。
使用結合試驗(如應用層粘連蛋白γ1 III 3-5和/或層粘連蛋白γ1 III 4的點印跡或Western印跡)，特別是實施例7描述的抑制試驗，以及其它方法，篩選出所需的抗體或相應的雜交瘤克隆。選定的克隆構成了合成大量本發(fā)明抗體的來源。
可使用常規(guī)方法，如與G蛋白或A蛋白的結合來純化所需抗體。然而，優(yōu)選使用在層粘連蛋白P1柱上進行的親和層析。至于上述多克隆抗體，此純化步驟使得有可能挑選出并選擇性地濃縮具有最佳結合常數的單克隆抗體。
本發(fā)明抗體的例子是單克隆細胞克隆A6/2/4產生的單克隆抗體(MAb)，該細胞克隆已根據布達佩斯條約的規(guī)定，于1997年10月27 日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心)(DSMZ，Marscheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國)，保藏號為DSMACC2327。
用分離自人胎盤的層粘連蛋白P1免疫小鼠得到雜交瘤。EP 0696 597 A2中描述了抗原的純化和雜交瘤的產生方法。依據其與層粘連蛋白γ1 III 3-5和層粘連蛋白γ1 III 4的結合特征，鑒定出了抗體A6/2/4。該抗體是IgM亞型的單克隆抗體，它可以通過分子篩層析純化。部分由于該抗體是多價的，它與層粘連蛋白P1的結合特別強。由于此原因，且由于IgM抗體的大小，因而不能從層粘連蛋白P1親和柱上洗脫下該抗體(見上文)。(“同時抑制試驗變型”，見上文)抑制試驗已反映出該抗體與層粘連蛋白P1強烈結合。MabA6/2/4能抑制層粘連蛋白/巢蛋白的結合，IC50為30nM。
由于其結合明顯地依賴于構象，因此層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域內的結合表位(層粘連蛋白的巢蛋白結合域)不能明確定義。然而，可得自層粘連蛋白之巢蛋白結合序列的肽能部分(75-80％)抑制抗體與層粘連蛋白P1的相互作用，這一事實表明Mab A6/2/4的結合表位與巢蛋白的結合表位有重疊。
下文將描述類似于本發(fā)明的多克隆抗體、可使用肽/卵白蛋白偶聯(lián)物產生的抑制性單克隆抗體的制備。
在完全弗氏佐劑存在下，使用50μg肽2/卵白蛋白偶聯(lián)物(偶聯(lián)物2，見上文)皮下免疫SJL/J品系的小鼠。4和8周后，在不完全弗氏佐劑存在下，各用25μg偶聯(lián)物2皮下注射以加強免疫反應，再過7周。融合前3天，通過腹膜內注射25μg偶聯(lián)物2來加強免疫應答。
為了進行融合，處死動物并分離脾細胞。在聚乙二醇存在下，將脾細胞與骨髓瘤細胞系P3X63AG8.653融合。通過在次黃嘌呤/氨基喋呤/胸苷培養(yǎng)基中將融合混合物培養(yǎng)3周來選擇脾細胞×P3X63AG8.653雜合體。為了得到穩(wěn)定的細胞系，將所得細胞克隆亞克隆幾次。在多種免疫學結合試驗中檢測所得細胞集落的抗體生產情況。依據下文的篩選策略，篩選 得到細胞系E79/1/6和E82/1/10。表征和鑒定特異性單克隆抗體的實驗用偶聯(lián)物2免疫SJL/J小鼠可得到很多能產生抗體的雜交瘤克隆。培養(yǎng)物上清液中的抗體顯示出與層粘連蛋白γ1 III 3-5、層粘連蛋白P1和卵白蛋白具有強烈免疫反應。
現在，為了找到能產生針對具有天然結構的層粘連蛋白之巢蛋白結合域的單克隆抗體的克隆，必需運用適當的篩選方法。
在此篩選方法中，注意力主要集中于抗體與層粘連蛋白P1和層粘連蛋白γ1 III 3-5的結合。同時，在亞克隆過程中，也要注意抗體與載體蛋白卵白蛋白的反應應是可以忽略不計的，并選擇出專門識別卵白蛋白的抗體。
表3和4給出了以此方法鑒定出的兩個克隆(E79和E82)得到的結果。表3在ELISA中測定E79的結合
表4在ELISA中測定E82的結合
顯然可通過克隆分離出與卵白蛋白具有免疫反應的細胞。同時，在每種情況下都可以分離出產生能與層粘連蛋白γ1 III 3-5和層粘連蛋白P1結合之抗體的細胞克隆。這一事實和用得自層粘連蛋白之巢蛋白結合域的肽引起了免疫的事實表明，抗體與具有天然結構的層粘連蛋白之巢蛋白結合基元能夠結合。
抑制試驗的“同時結合”變型(見上文)提供了結合特異性的直接證據，其中抗體直接與被碘標記的巢蛋白競爭結合完整層粘連蛋白(得自小鼠EHS腫瘤的層粘連蛋白，Chemicon，No.CC095)的巢蛋白結合基元。
由細胞克隆E79/1/6產生的抗體(IgG2a亞型)以IC50為19nM的水平抑制層粘連蛋白-巢蛋白的結合，由細胞克隆E82/1/10產生的抗體(IgG1亞型)以IC50為190nM的水平抑制層粘連蛋白-巢蛋白的結合。
權利要求
1.一種與可結合巢蛋白的層粘連蛋白γ1 III-4區(qū)域能結合的抗體或其部分。
2.權利要求1所要求的抗體或其部分，其與可結合巢蛋白的層粘連蛋白γ1 III4區(qū)域的a環(huán)或a和c環(huán)、或這些環(huán)緊鄰部分的高度保守區(qū)域能結合。
3.權利要求2所要求的抗體或其部分，其可直接地以與表位有關的構象依賴性方式，或以重疊的方式與a環(huán)或a和c環(huán)之高度保守區(qū)域結合。
4.權利要求1至3中一項或多項所要求的抗體或其部分，其至少可與表1所示的一種肽結合。
5.權利要求1至4中一項或多項所要求的抗體，它是多克隆抗體。
6.權利要求1至4中一項或多項所要求的抗體，它是單克隆抗體。
7.權利要求6所要求的抗體，它是嵌合的、人源化的、雙特異性的或寡特異性的抗體。
8.權利要求1至7中一項或多項所要求的抗體，它可競爭性地或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白的結合。
9.一種抗體，所述抗體可通過用層粘連蛋白或層粘連蛋白P1作為免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎動物，隨后使用層粘連蛋白γ1 III 3-5和/或層粘連蛋白γ1 III 4鑒定抗體，并檢測所得抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力而得到。
10.一種抗體，所述抗體可通過用層粘連蛋白γ1 III 3-5作為免疫抗原免疫具有免疫活性的脊椎動物，隨后使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定抗體，并檢測所得抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力而得到。
11.一種抗體，所述抗體可通過用層粘連蛋白γ1 III 4和/或用不含有層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域完整的氨基酸序列但含有其巢蛋白結合位點的重要組分的肽作為免疫抗原，免疫具有免疫活性的脊椎動物而得到。
12.權利要求11所要求的抗體，其中層粘連蛋白γ1 III 4被用作免疫抗原。
13.權利要求11所要求的抗體，其中表1所示的一種或兩種肽被用作免疫抗原。
14.權利要求11至13中的一項或多項所要求的抗體，所述抗體是使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定出的。
15.權利要求11至14中的一項或多項所要求的抗體，其中檢測了所述抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力。
16.權利要求9至15中任一項所要求的抗體，其中得到了可生產單克隆抗體的雜交瘤細胞。
17.權利要求9至16中任一項所要求的抗體，它是通過親和層析從含有抗體的材料中純化得到的。
18.權利要求18所要求的抗體，其中以層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1作為親和基質進行該親和層析。
19.產生權利要求1至8中一項或多項所要求的抗體或其部分的細胞或細胞系。
20.雜交瘤DSMACC2327。
21.由雜交瘤DSMACC2327產生的抗體。
22.制備權利要求1至8中任一項所要求的抗體的方法，所述方法包括用層粘連蛋白或層粘連蛋白P1免疫具有免疫活性的脊椎動物，使用層粘連蛋白γ1 III 3-5和/或層粘連蛋白γ1 III 4鑒定抗體，和檢測此抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力。
23.制備權利要求1至8中任一項所要求的抗體的方法，所述方法包括用層粘連蛋白γ1 III 3-5免疫具有免疫活性的脊椎動物，使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定抗體，和檢測此抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力。
24.制備權利要求1至8中任一項所要求的抗體的方法，所述方法包括用層粘連蛋白γ1 III 4和/或用不含有層粘連蛋白γ1 III 4區(qū)域完整的氨基酸序列但含有其巢蛋白結合位點的重要組分的肽免疫具有免疫活性的脊椎動物。
25.權利要求24所要求的方法，其中層粘連蛋白γ1 III 4被用作免疫抗原。
26.權利要求24所要求的方法，其中表1所示的一種或兩種肽被用作免疫抗原。
27.權利要求26所要求的方法，其中免疫抗原偶聯(lián)在載體上。
28.權利要求24至27中一項或多項所要求的方法，其中使用層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1鑒定抗體。
29.權利要求24至28中一項或多項所要求的方法，其中對所述抗體競爭性或部分競爭性地抑制層粘連蛋白/巢蛋白之結合的能力進行了檢測。
30.權利要求22至29中一項或多項所要求的方法，其中產生了可生產單克隆抗體的雜交瘤細胞。
31.權利要求22至30中一項或多項所要求的方法，其中通過親和層析從含有抗體的材料中純化所述抗體。
32.權利要求31所要求的方法，其中以層粘連蛋白和/或層粘連蛋白P1作為親和基質進行該親和層析。
33.權利要求1至18或21中任一項所要求的抗體或其部分，其可用作藥物。
34.含有權利要求1至18和21中至少一項所要求的一種或多種抗體或抗體部分的藥物。
35.權利要求1至18和21中至少一項所要求的一種或多種抗體或抗體部分用于制備治療特征為基底膜合成過量或不必要之疾病的藥物的用途。
36.權利要求35所要求的用途，其中所述疾病為伴隨著基底膜增厚的糖尿病晚期并發(fā)癥形式，動脈硬化形式，纖維變性，或因血管發(fā)生而使臨床癥狀惡化的疾病。
37.權利要求35或36所要求的用途，所述用途是制備治療糖尿病性視網膜病、酒精肝性纖維變性、肺纖維變性、癌癥、糖尿病性腎病或具有強炎性因子的疾病，如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、血管炎、血管瘤和銀屑病的藥物。
38.權利要求1至18或21中任一項所要求的抗體或其部分用作診斷試劑。
39.含有權利要求1至18和21中至少一項所要求的一種或多種抗體或抗體部分的診斷試劑。
40.權利要求1至18和21中至少一項所要求的一種或多種抗體或抗體部分用于制備檢測生物樣品、體液或組織中含有γ1之層粘連蛋白同種型的診斷試劑的用途。
41.權利要求1至18或21中任一項所要求的抗體或其部分用作研究和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白間相互作用之物質的生物學和藥學模型中的輔助物的用途。
42.權利要求41所要求的用途，所述用途是在研究和評價影響層粘連蛋白/巢蛋白間相互作用之物質的生物學和藥學模型中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與層粘連蛋白的巢蛋白結合域特異性結合的單克隆和多克隆抗體及其部分,還涉及所述抗體及其部分的制備方法,以及它們作為藥物、作為檢測層粘連蛋白同種型的診斷試劑、作為研究和評價影響巢蛋白/層粘連蛋白相互作用之物質的模型物質的用途。本發(fā)明的抗體或其部分優(yōu)選與層粘連蛋白的γ1Ⅲ4區(qū)域結合,特別是與a和c環(huán)之高度保守區(qū)域結合,并能抑制層粘連蛋白和巢蛋白的結合。
文檔編號A61P19/00GK1244873SQ97181412
公開日2000年2月16日 申請日期1997年12月22日 優(yōu)先權日1997年1月17日
發(fā)明者M·杰爾 申請人:赫徹斯特股份公司