專利名稱:性能改善的抑肽酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及具有改善的酶抑制活性、免疫學(xué)性質(zhì)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的抑肽酶變異體及其制備。
抑肽酶也稱為牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI),屬于Kunitz類型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族??梢种频慕z氨酸蛋白酶的范圍包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纖維蛋白溶酶和血漿血管舒緩素(W.Gebhard,H.Tschesche and H.Fritz,Proteinase Inhibitors,Barrett and Salvesen(eds.),Elsevier Science Publ.BV 375-387,1986)。
抑肽酶由58個(gè)氨基酸組成。借助于X-射線結(jié)構(gòu)分析和NMR光譜分析,闡明了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(Wlodawer et al.,J.Mol.Biol.198(3),469-480,1987;Wager et al.,J.Mol.Biol.196(1),227-231,1987;Berndtet al.,Biochemistry 32(17),4564-4570,1993)。
商品名為Trasylol的天然抑肽酶最初用于胰腺炎的治療。今天Trasylol用于心臟外科,因?yàn)榕R床研究表明,用抑肽酶進(jìn)行治療顯著降低該類型手術(shù)中輸血的需要,并減少術(shù)后出血(D.Royston,J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.676-100,1992)。
有跡象表明,在決定抑制特異性的15位氨基酸的置換可產(chǎn)生具有改善的抑制性質(zhì)的有用的抑肽酶變異體(德國(guó)專利說(shuō)明書3339693)。這樣,根據(jù)導(dǎo)入的氨基酸不同,可以產(chǎn)生例如可抑制胰腺或白細(xì)胞彈性蛋白酶的各種有效抑制劑。
還有跡象表明,抑肽酶抑制活性以及在第15位置換產(chǎn)生的變異體們的抑制活性還由被抑制的靶蛋白酶與抑制劑分子之間接觸區(qū)中的氨基酸殘基所決定。這些氨基酸尤其包括在第14、16、17、18、19、34、38和39位上的其它氨基酸殘基。在以下專利申請(qǐng)例如WO89/01968、WO89/10374、EP 0307592、EP 683229中描述了其中包括由于在接觸區(qū)中置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生的性能改善的抑肽酶變異體。
有趣的是,通過置換確定物質(zhì)物化性質(zhì)的氨基酸,可能改進(jìn)抑肽酶及其變異體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。因此通過降低分子的凈正電荷可能顯著降低腎臟的結(jié)合。專利申請(qǐng)WO92/06111中描述了該類型的變異體。
為了提高工業(yè)的制備性,在某些情況下最好進(jìn)行抑制分子的N-末端修飾。這類修飾可以是N-末端收縮或延伸,或是缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。EP 419878中描述了N-末端修飾的抑肽酶變異體。
本發(fā)明的抑肽酶變異體本專利申請(qǐng)中描述的抑肽酶變異體的區(qū)別在于以下特征1.置換分子活性中心的一個(gè)或多個(gè)氨基酸,以改進(jìn)活性性質(zhì)。
2.置換氨基酸降低凈正電荷,以改進(jìn)免疫學(xué)性質(zhì)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
3.修飾N-末端氨基酸序列,以改進(jìn)工業(yè)制備性。
上述專利申請(qǐng)中描述的每個(gè)抑肽酶變異體只含有其中一個(gè)上述特征。現(xiàn)在,本發(fā)明的抑肽酶變異體在其分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合了兩個(gè)或三個(gè)上述特征。圖中舉例顯示了某些變異體的氨基酸序列。
然后,本發(fā)明的抑肽酶變異體不限于
圖1所示的實(shí)例。本發(fā)明抑肽酶變異體也包括具有N-末端延伸Ala(-2)-Gln(-1)的變異體、在2位具有中性氨基酸殘基脯氨酸的變異體、由中性或帶負(fù)電荷的氨基酸殘基置換帶正電荷的氨基酸的變異體、或由帶負(fù)電荷的氨基酸殘基置換中性氨基酸的變異體。這里氨基酸殘基置換的選擇按照以下原則進(jìn)行產(chǎn)生的物質(zhì)在生理pH下凈正電荷降低,最好為+2至-2。上述氨基酸序列的改變(包括N-末端收縮或延伸或缺失)可以根據(jù)需要相互結(jié)合來(lái)加以利用。因此,本發(fā)明的抑肽酶變異體包括含有上述特征組合、并在生理pH下凈正電荷降低的所有化合物。
令人驚訝的是,兩個(gè)或三個(gè)上述特征的組合似乎不僅使得我們獲得各個(gè)特征的表達(dá),而且在某些情況下甚至增強(qiáng)各個(gè)特征的表達(dá)。此外,也可能產(chǎn)生涉及例如免疫學(xué)性質(zhì)、藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和表面結(jié)合性質(zhì)的明顯新的物質(zhì)性質(zhì)。這些新變異體表現(xiàn)出與多克隆人抗血清和多克隆兔抗血清(使用抑肽酶所產(chǎn)生)的反應(yīng)減小。我們還發(fā)現(xiàn),與抑肽酶相比,新變異體顯著地降低了其免疫原行為,即它們誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱。還有跡象表明,本發(fā)明的變異體與抑肽酶相比,誘導(dǎo)血細(xì)胞釋放的組胺數(shù)量降低。此外,與抑肽酶相比,新變異體還表現(xiàn)出明顯較少腎臟蓄積量。與該分子的早期變異體相比,盡管在該分子中存在大量變化,其酶動(dòng)力學(xué)抑制常數(shù)(Ki值)都令人驚訝地提高了。
因此,本發(fā)明涉及在pH7下凈電荷為+3至-3、具有氨基酸Arg 15或Arg 15-Ala 17的抑肽酶變異體。優(yōu)選變異體的凈電荷為+2至-2,特別優(yōu)選為+1至-1。
這些抑肽酶變異體適用于血漿血管舒緩素、組織血管舒緩素和纖維蛋白溶酶的抑制。
另外,這些抑肽酶變異體具有修飾的N-末端序列。
因此,本發(fā)明的目的是提供具有N-末端延伸或收縮或具有缺失的氨基酸的抑肽酶變異體。
推薦的抑肽酶變異體是DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶。
這些抑肽酶變異體在第2位也攜帶氨基酸脯氨酸。
本發(fā)明也涉及包含一個(gè)或多個(gè)這些抑肽酶變異體的藥物。
描述的新蛋白酶抑制劑適于治療多種疾病,在這些疾病中(也由于相對(duì)復(fù)雜的手術(shù)方法,諸如在心臟外科或在移植術(shù)中的異常關(guān)節(jié)成形的關(guān)節(jié)置換中的方法等),由于血液廣泛的或增強(qiáng)的外源表面接觸,使血漿中酶系統(tǒng)的活性發(fā)生而造成。
抑制劑能降低那些具有高度出血危險(xiǎn)的手術(shù)中血液的損失(例如心臟手術(shù)、骨外科和關(guān)節(jié)外科)。它們適于治療休克、多處創(chuàng)傷和顱腦創(chuàng)傷、敗血癥、散播性血管內(nèi)凝血(DIC)、多器官衰竭、涉及血管舒緩素系統(tǒng)的炎癥(諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘等)。通過抑制血纖維蛋白溶酶,阻止惡性腫瘤的生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移。由于抑制舒緩激肽的合成,它們也適用于疼痛和水腫的治療。它們也適用于透析療法和預(yù)防人造器官炎癥、血凝固和出血風(fēng)險(xiǎn)的增加。
本發(fā)明抑肽酶變異體的制備為了制備本發(fā)明抑肽酶變異體,最好使用基因工程方法。為此,使用常規(guī)分子生物學(xué)方法,將在各種情況下考慮用于抑肽酶變異體合成的基因工程信息引入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)微生物體內(nèi)。重組微生物進(jìn)行發(fā)酵;通過選擇適宜的條件,表達(dá)異源遺傳信息。隨后從培養(yǎng)肉湯中獲得表達(dá)的抑肽酶變異體。
用于生產(chǎn)本發(fā)明抑肽酶變異體的適宜的宿主微生物可以是細(xì)菌、酵母菌或真菌。表達(dá)可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,或用適當(dāng)?shù)姆置谙到y(tǒng)在細(xì)胞外進(jìn)行。抑肽酶變異體可以正確地加工或融合為多肽或蛋白質(zhì)。
專利申請(qǐng)EP 683229、WO89/02463、WO90/10075以及上述各種其它專利申請(qǐng)中描述了用于表達(dá)抑肽酶變異體的適宜系統(tǒng)。
實(shí)施本發(fā)明的方法酶所用的酶(限制性內(nèi)切酶、來(lái)自牛腸的堿性磷酸酶、T4多核苷酸激酶和T4 DNA連接酶)得自Boeringer Mannheim和GIBCO/BRL,按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用。
分子生物學(xué)技術(shù)諸如從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA(所謂的微制備)和用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌等的常規(guī)克隆工作按照Sambrook等人的方法進(jìn)行(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,1989)。用于轉(zhuǎn)化的宿主生物是大腸桿菌菌株DH5α(GIBCO/BRL)。為了分離大量的質(zhì)粒DNA,使用Qiagen牌取液器槍頭(Qiagen)。按照生產(chǎn)商(Genomed)的詳細(xì)說(shuō)明,借助于Jetsorb從瓊脂糖凝膠中提取DNA片斷。
用于“定點(diǎn)誘變”實(shí)驗(yàn)的寡核苷酸和用于PCR和測(cè)序反應(yīng)的引物用Applied Biosystems的“380 A DNA合成儀”進(jìn)行制備。誘變實(shí)驗(yàn)按照Deng和Nickoloff的方法(Deng et a.,Anal.Biochem.200,81-88,1992),用Pharmacia Biotech的試劑盒(“Unique Site EliminationMutagenesis”)進(jìn)行。所有構(gòu)建的載體和誘變實(shí)驗(yàn),在“ABI 373 A測(cè)序儀”(Applied Biosystems)上通過使用熒光標(biāo)記終止子的Taq循環(huán)DNA序列分析法進(jìn)行證實(shí)。
釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞例如菌株JC34.4D(MATα,ura3-52,suc2)在10mlYEPD(2%葡萄糖;2%蛋白胨;1%Difco酵母抽提液)中進(jìn)行培養(yǎng),在O.D.600nm為0.16-0.8時(shí)收獲。細(xì)胞用5ml溶液A(1M山梨醇;10mM N-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35;3%乙二醇)洗滌,再懸浮于0.2ml溶液A中,并于-70℃保藏。
將質(zhì)粒DNA(5μg)和載體DNA(50μg,來(lái)自青魚的精液)加入冷凍細(xì)胞中。細(xì)胞于37℃振蕩5分鐘進(jìn)行復(fù)蘇。加入1.5ml溶液B(40%PEG 1000,200mM N-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35)后,細(xì)胞于30℃保溫60分鐘,然后用1.5ml溶液C(0.15M NaCl;10mM N-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35)洗滌,再懸浮于100μl溶液C中。在具有2%瓊脂的選擇培養(yǎng)基上涂平板。于30℃培養(yǎng)3天后獲得轉(zhuǎn)化子。用于發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1.SD2培養(yǎng)基Bacto酵母含氮培養(yǎng)基 6.7g/l葡萄糖*20g/lKH2PO46.7g/lpH6.02.SC5培養(yǎng)基葡萄糖*20g/lDifco酵母抽提液 20g/lKH2PO46.7g/l(NH4)2SO42.0g/lMgSO4×7H2O 1.0g/l微量元素溶液SL4 1.0ml/lpH6.0微量元素溶液SL4Titriplex III 5g/lFeSO4×7H2O 2g/lZnSO4×7H2O 0.1g/lMnCl2×4H2O 0.03g/lH3BO30.3g/lCoCl2×6H2O 0.2g/lCuCl2×2H2O 0.01g/lNiCl2×6H2O 0.02g/lNa2MoO4×2H2O0.03g/l*=單獨(dú)高壓滅菌3.發(fā)酵罐培養(yǎng)基葡萄糖*2.0g/l大豆蛋白胨 25.0g/lKH2PO41.4g/lMgSO4×7H2O1.0g/l鹽酸硫胺 5.1mg/l肌醇 20mg/l微量元素溶液SL4 3ml/l維生素溶液 3ml/l(NH4)2SO43.8g/lpH5.5進(jìn)料溶液葡萄糖*530g/l(NH4)2SO45.0g/lKH2PO42.9g/lMgSO4×7H2O3.8g/l鹽酸硫胺 13mg/l肌醇 70mg/l微量元素溶液SL4 6.8ml/l維生素溶液 6.8ml/l*=單獨(dú)高壓滅菌微量元素溶液FeCl3×6H2O13.5g/lZnCl2×4H2O2.0g/lH3BO30.5g/l
CoCl2×6H2O2.0g/lCuSO4×5H2O1.9g/lNa2MoO4×2H2O 2.0g/lCaCl2×2H2O1.0g/l濃鹽酸 100ml/l維生素溶液核黃素 0.42g/l泛酸鈣 5.9g/l煙酸 6.1g/l鹽酸吡哆醇 1.7g/l生物素 0.06g/l葉酸 0.04g/l接種液的制備于1L錐形瓶中,在200ml SD2培養(yǎng)基中接種保藏原種至濃度為1%。培養(yǎng)物在搖床上(260rpm)于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。然后以每份2ml裝入保藏容器中并在液氮中冷凍。
在搖床上的燒瓶中進(jìn)行的發(fā)酵作為預(yù)培養(yǎng),于1L錐形瓶中,將200ml SD2培養(yǎng)基用接種液接種至濃度為1%,然后在搖床上(260rpm)于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。用預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物(在1L燒瓶中的200ml SC5培養(yǎng)基)至濃度為1%,然后在搖床上(260rpm)于28℃培養(yǎng)72-96小時(shí)。
在10L生物反應(yīng)器中的發(fā)酵作為預(yù)培養(yǎng),于11錐形瓶中,將200ml SD2培養(yǎng)基用接種液接種至濃度為1%,然后在搖床上(260rpm)于28℃培養(yǎng)72小時(shí)。10L發(fā)酵罐中的主培養(yǎng)在96小時(shí)的過程中分批進(jìn)料進(jìn)行發(fā)酵。所用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為發(fā)酵罐培養(yǎng)基,起始體積為7L。發(fā)酵罐用200ml預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行接種。
發(fā)酵條件溫度28℃攪拌器的旋轉(zhuǎn)速度500rpm通氣10l/minpH5.5head space壓力200mbar發(fā)酵7小時(shí)后,開始進(jìn)料。進(jìn)料速率由呼吸商(RQ)(RQ=產(chǎn)生的CO2/消耗的氧氣)控制。如果RQ升至>1.15,那么降低進(jìn)料速率,如果RQ降至<1.05,那么增加進(jìn)料速率。
按一定的時(shí)間間隔,從發(fā)酵罐中取出樣品,通過測(cè)定700nm的光密度檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外,通過活性測(cè)量測(cè)定上清液中Bay 19-8757的濃度。
發(fā)酵結(jié)束時(shí),通過加入50%(w/v)檸檬酸將pH降至pH3,發(fā)酵罐于70℃加熱10分鐘。然后以7,500×g離心分離出細(xì)胞,上清液用于蛋白質(zhì)純化。
用于蛋白質(zhì)化學(xué)分析的材料序列分析用Applied Biosystems(Forster City,USA)的473型蛋白質(zhì)測(cè)序儀進(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序程序。在操作手冊(cè)中詳細(xì)描述了測(cè)序儀、各種測(cè)序程序和PTH檢測(cè)系統(tǒng)(用戶手冊(cè),473 A型蛋白質(zhì)測(cè)序系統(tǒng)(1989)Applied Biosystems Forster City,CA 94404,USA)。
用于測(cè)序儀操作的試劑和用于PTH檢測(cè)的HPLC柱得自AppliedBiosystems。
HPLC分析用Hewlett Packard(D-Waldbronn)的HP 1090 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行。將Bakerbond(D-Groβ Gerau)的RP-18 HPLC柱(250mm×4.6mm,5μ材料,孔徑為300)用于分離。
270A-HT型毛細(xì)電泳儀來(lái)自Applied Biosystems(Forster City,CA94404,USA)。通常按不同的時(shí)間間隔流體動(dòng)力學(xué)地注射樣品。所用的毛細(xì)管柱(50μm×72cm)來(lái)自Applied Biosystems。
氨基酸分析用Eppendorf Biotronik(D-Maintal)的LC 3000氨基酸分析儀進(jìn)行。使用稍微修改的Biotronik的標(biāo)準(zhǔn)分離程序。儀器手冊(cè)中詳細(xì)描述了分離程序和分析儀的功能。
分子量用Kratos/Shimadzu(D-Duisburg)的MALDI I系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。SDS電泳用Pharmacia(D-Freiburg)的電泳系統(tǒng)進(jìn)行。
動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)用SLT(D-Crailsheim)的微量滴定板讀板儀進(jìn)行測(cè)定。微量滴定板用Dynatec(D-Denkendorf)的洗滌儀進(jìn)行洗滌。
酶和底物來(lái)自Calbiochem(D-Bad Soden)。所有其它化學(xué)品和試劑都來(lái)自Merck(D-Darmstadt)或Sigma(D-Deisenhofen)。96孔板購(gòu)自Greiner。
多克隆兔抗抑肽酶抗體通過用抑肽酶免疫兔來(lái)獲得。人多克隆抗抑肽酶抗體來(lái)自用抑肽酶治療的病人。
蛋白質(zhì)的化學(xué)分析N-末端序列分析將溶于水中的1-3nmol蛋白酶抑制劑加到用Polybrene預(yù)保溫的測(cè)序紙上。用快速正常的測(cè)序儀周期進(jìn)行序列分析。PTH氨基酸用聯(lián)機(jī)的PHLC,借助于50pmol PTH標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行識(shí)別。
氨基酸分析將200μg蛋白質(zhì)溶于200μl 6N HCl中,于166℃水解1小時(shí)。將大約1nmol樣品加入氨基酸分析儀中。用5nmol標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定氨基酸的量。
SDS凝膠電泳按照Laemmli的條件進(jìn)行SDS凝膠電泳。用10-20%強(qiáng)度的SDS凝膠分析10μg蛋白酶抑制劑,并用銀染法進(jìn)行目測(cè)檢驗(yàn)(Merril等人)。
U.K.Laemmli,Nature 227,680-685(1970)。
C.R.Merril,M.L.Dunau,D.Goldman,Anal.Biochem.100201-207(1981)。
毛細(xì)電泳在玻璃柱(長(zhǎng)度為72cm,內(nèi)徑為50μm)上進(jìn)行毛細(xì)電泳,研究8ng蛋白酶抑制劑。條件電流密度為90μA,柱溫為25℃,100nM磷酸鹽緩沖液pH3.0,測(cè)定210nm,在3秒內(nèi)在壓力下加樣。
反相色譜法將5nmol蛋白酶抑制劑在Bakerbond RP-18 HPLC柱(5μ材料,4.6nm×250mm,孔徑為300)上進(jìn)行色譜分離。所用的洗脫液為乙腈/TFA梯度。條件流速為0.7ml/min,柱溫為40℃,測(cè)定溫度為40℃,溶劑A為0.1%TFA,溶劑B為0.1%TFA/60%乙腈;梯度0min 0%B,10min 0%B,70min 100%B,80min 0%B。
分子量的測(cè)定1μg蛋白酶抑制劑用MALDI技術(shù)進(jìn)行分析。所用的基質(zhì)為芥子酸。用于質(zhì)量校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)為牛胰島素、細(xì)胞色素C和蜂毒肽。
蛋白含量蛋白含量按照BCA法進(jìn)行測(cè)定。在該方法中,Cu2+離子借助于存在的蛋白質(zhì)反應(yīng)為Cu1+離子,后者與bicinchoninic acid形成絡(luò)合物,在560nm處有吸收峰。
凍干的蛋白質(zhì)在濃度為1mg/ml時(shí)達(dá)到平衡含濕量,并溶于0.9%NaCl。制備稀釋系列。將1000μl BCA試驗(yàn)試劑(Pierce)加入50μl樣品溶液中,用塞子緊緊塞住試管,并于60℃恰好保溫30分鐘。在冰浴中將樣品冷卻5分鐘后,于25℃、波長(zhǎng)為560mm進(jìn)行測(cè)定。
活性(胰蛋白酶抑制試驗(yàn),滴定分析)活性按照修改的F.I.P.胰蛋白酶抑制試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。Bay 19-8757抑制胰蛋白酶催化的Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解。通過堿滴定測(cè)定反應(yīng)中釋放的羧基基團(tuán)。胰蛋白酶的殘留活性是活性化合物抑制活性的度量標(biāo)準(zhǔn)。
凍干的蛋白質(zhì)在濃度為1mg/ml時(shí)達(dá)到平衡含濕量,并溶于0.9%NaCl,制備稀釋系列。將2ml緩沖液(15mM硼酸鹽緩沖液,pH8.0,含有200mM CaCl2)和0.8ml胰蛋白酶溶液(2mg/ml)加入1ml樣品中,混合物于25℃保溫5分鐘。然后加入0.2ml BAEE溶液(6.8mg/ml),在5分鐘內(nèi)測(cè)定KOH的消耗量。
蛋白酶抑制劑與多克隆兔或人抗抑肽酶抗體交叉反應(yīng)的測(cè)定將溶于偶聯(lián)緩沖液的0.5-10ng蛋白酶抑制劑或抑肽酶于4℃過夜結(jié)合到微量滴定板上。每個(gè)孔用洗滌緩沖液洗滌4次,每次200μl,然后加入100μl封閉溶液。蓋上微量滴定板,于37℃保溫1小時(shí)。按上述方法洗滌后,加入多克隆兔抗抑肽酶抗體(在含有1%BSA的PBS緩沖液中0.2μg/ml)或人抗體(在含有1%HSA的PBS緩沖液中20μg/ml)。蓋上微量滴定板,于37℃保溫1小時(shí),然后按上述方法洗滌。然后加入100μl生物素化的抗兔或抗人抗體(25μl+10ml含有1%BSA的PBS緩沖液或含有1%HSA的PBS緩沖液),混合物于37℃保溫1小時(shí)。按上述方法洗滌微量滴定板,然后每孔加入100μl抗生蛋白鏈霉素-過氧化物酶復(fù)合物(50μl+10ml含有1%BSA的PBS緩沖液或含有1%HSA的PBS緩沖液)。蓋上微量滴定板,于37℃保溫1小時(shí),然后按上述方法洗滌。
底物反應(yīng)用TMB底物+過氧化物酶溶液(1+1;每孔100μl)進(jìn)行。10分鐘后每孔用100μl 2M磷酸終止反應(yīng),然后于450nm(參考為570nm)進(jìn)行測(cè)定。
溶液1.保溫緩沖液15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH9.62.樣品緩沖液將樣品以適當(dāng)?shù)臐舛热苡诒鼐彌_液。
3.洗滌緩沖液含有0.1%(v/v)Tween 20的PBS4.封閉緩沖液含有3%(w/v)BSA或HSA的PBS實(shí)施例實(shí)施例1
用于分泌重組DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表達(dá)載體的制備用于制備DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶基因的起始材料為DesPro2-Arg15-Ala17基因,用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI將后者克隆到載體pUC18中。產(chǎn)生的載體(pEM6.6.L)按照U.S.E.法(Pharmacia Biotech),用誘變引物A和Scal/MlulU.S.E.選擇引物進(jìn)行雙鏈誘變反應(yīng)。誘變引物A具有以下序列引物A5’GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTTGCGGTGGTGCTTAG3’。該引物在DesPro2-Arg15-Ala17抑肽酶基因中產(chǎn)生突變Asn41和Glu53。用酶SacI和SphI進(jìn)行限制性降解來(lái)進(jìn)行該克隆的分析。所需的序列再通過克隆pEM31.8.L的DNA序列分析加以證實(shí)。由pEM31.8.L質(zhì)粒DNA開始,用引物B和‘反24-mer M13’引物借助于PCR技術(shù)在基因的5’區(qū)產(chǎn)生進(jìn)一步的置換(Ser10-Asp24-Thr26-Glu31)。引物B具有以下序列引物B5’TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCTACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3’。橫線上為XhoI酶的識(shí)別序列。
總體積為100μl的PCR混合物中含有20ng pEM31.8.L質(zhì)粒DNA、20pmol‘反24-mer M13’引物、60pmol引物B、200μMdNTPs、1×PCR反應(yīng)緩沖液II(Perkin Elmer)、4mM MgCl2和2.5UTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)?!h(huán)’條件為94℃3分鐘,然后以94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán),隨后于72℃保溫5分鐘。將PCR混合物按1∶5稀釋,與載體pCRII(Invitrogen)連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。用酶XhoI和BamHI進(jìn)行限制性降解后識(shí)別陽(yáng)性克隆,并對(duì)幾個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。克隆pES9.10.L含有所需的序列,將其用于進(jìn)一步的研究。
大腸桿菌/酵母菌穿梭載體(例如pA202)用于酵母菌分泌載體的構(gòu)建,其中將DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶序列連接到酵母α-因子的pre-pro序列上。
載體pA202攜帶的氨芐青霉素抗性基因(bla)和URA3基因作為大腸桿菌和酵母菌的選擇性標(biāo)記基因。載體的另一基本要素為Co1 E1和2μ復(fù)制原點(diǎn)(ori)。REP3位點(diǎn)也位于該區(qū)內(nèi)。1200bp EcoRI-HindIII片斷攜帶MFα1啟動(dòng)子和酵母α-因子蛋白前體的N-末端pre-pro序列(Kujan and Herskowitz,Cell 30,933-943,1982)。通過導(dǎo)入作為HindIII-BamHI片斷的已修飾DesPro2-Arg15-抑肽酶cDNA,酵母α-因子pre-pro序列內(nèi)KexII蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)(‘Lys-Arg’)得已制備(EP 0419878)。
在DesPro2-Arg15-抑肽酶序列的3’末端,載體攜帶酵母URA3基因的BamHI-SalI片斷,后者在該位置作為轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)(Yarger et al.,Mol.Cell.Biol.6,1095-1101,1986)。
用XhoI和BamHI從載體pES9.10.L切下180bp DNA片斷,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化,然后克隆到也用XhoI和BamHI切割并去磷酸化的載體pA202中。通過該克隆,載體pA202中的DesPro2-Arg15-抑肽酶被DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶置換。用該克隆產(chǎn)生的載體pES13.10.L克隆酵母菌細(xì)胞(JC34.4D)。
具有不同啟動(dòng)子(諸如組成型GAPDH啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)型GAL 10啟動(dòng)子等)的其它大腸桿菌/酵母菌穿梭載體可以以相似的方式進(jìn)行制備,也導(dǎo)致DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的分泌。
另外,當(dāng)然也可以使用具有其它酵母復(fù)制原點(diǎn)(諸如自主復(fù)制染色體的片斷(ars)等)的穿梭載體。
除USA3基因外,適合的選擇性標(biāo)記基因是那些幫助酵母恢復(fù)原養(yǎng)型的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體基因,諸如LEU2、HIS3或TRP1基因。此外,當(dāng)然也可以使用那些其產(chǎn)物賦予各種抗生素(諸如氨基葡糖苷G418等)抗性的基因。
其它酵母菌(諸如甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌Pichia pastoris或Hansenulapolymorpha等)在用適當(dāng)?shù)妮d體轉(zhuǎn)化后,也能夠生產(chǎn)DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。
實(shí)施例2用于分泌具有天然N-末端序列‘Arg-Pro-Asp’的重組DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表達(dá)載體的制備為了制備能夠分泌具有天然N-末端序列‘Arg-Pro-Asp’的DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的酵母表達(dá)載體,首先通過PCR擴(kuò)增和克隆具有α-因子pre-序列和抑肽酶基因5’末端(直到限制性內(nèi)切酶XhoI的識(shí)別位點(diǎn))的MFα1啟動(dòng)子。所用的引物具有以下序列引物C5’GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG3’。橫線上為EcoRV酶的識(shí)別序列。引物D5’GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT3’。橫線上為XhoI酶的識(shí)別序列。
總體積為50μl的PCR混合物中含有200ng pA202質(zhì)粒DNA、0.2μM引物C、0.2μM引物D、200μM dNTPs、1×PCR反應(yīng)緩沖液11(Stratagene,Opti-PrimeTM)和2.5U Taq DNA聚合酶(PerkinElmer)?!h(huán)’條件為94℃1分鐘,然后以94℃1分鐘、50℃1分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán),隨后于72℃保溫5分鐘。將PCR混合物按1∶5稀釋,與載體pCRII(Invitrogen)連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。用酶EcoRI進(jìn)行限制性降解后識(shí)別陽(yáng)性克隆,并對(duì)幾個(gè)克隆進(jìn)行序列分析??寺IU20.11.L用于進(jìn)一步的研究。
大腸桿菌/酵母菌穿梭載體pYES2(Invitrogen)用于酵母分泌載體的構(gòu)建,其中將DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶序列直接連接到酵母α-因子的pre-序列上。載體pYES2首先用限制性內(nèi)切酶SspI和BamHI進(jìn)行酶切、去磷酸化,然后進(jìn)行凝膠純化。以這種方式取出存在于載體pYES2上的GAL1啟動(dòng)子和flori。用EcoRV和XhoI從載體pIU20.11.L切下大約1030bp DNA片斷,通過瓊脂糖凝膠電泳純化,然后與載體pES9.10.L的大約180bpXhoI和bamHI片斷一起克隆到用SspI和BamHI酶切的載體pYES2中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。用酶XhoI進(jìn)行限制性降解后識(shí)別陽(yáng)性克隆并進(jìn)行序列分析。用產(chǎn)生該克隆的載體pIU28.11.L轉(zhuǎn)化酵母菌細(xì)胞(JC34.4D)。表達(dá)載體不再含有α-因子的pro-序列,因此,只能通過信號(hào)肽酶進(jìn)行DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的加工,而不受KexII蛋白酶酶切的影響。
實(shí)施例3釀酒酵母的發(fā)酵釀酒酵母表達(dá)菌株按上述方法進(jìn)行發(fā)酵。
實(shí)施例4在中性pH不帶凈電荷的抑肽酶衍生物的純化1.適宜純化方法的調(diào)查發(fā)酵后,通過離心分離出細(xì)胞,過濾留下的上清液,以除去留下的細(xì)胞。
加入濃檸檬酸,將無(wú)細(xì)胞的上清液調(diào)至pH3。溶液必須用純水進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂?,以建立低?mS/cm的電導(dǎo)率。隨后,將溶液裝到預(yù)先用酸性緩沖液平衡的陰離子交換柱上。用起始緩沖液進(jìn)行大量地洗滌,除去未結(jié)合的物質(zhì)。借助于鹽梯度洗脫產(chǎn)物。獲得的部分借助于反相高壓液相色譜(RP-HPLC)以及測(cè)定蛋白酶抑制的生物學(xué)活性試驗(yàn)進(jìn)一步調(diào)查產(chǎn)物內(nèi)含物。合并獲得的部分,直接裝到制備型RP-HPLC柱上。柱子預(yù)先用起始緩沖液進(jìn)行平衡。用有機(jī)溶劑梯度洗脫產(chǎn)物。獲得的部分再按上述方法調(diào)查產(chǎn)物內(nèi)含物,合并含有產(chǎn)物的部分。根據(jù)達(dá)到的產(chǎn)物純度,可能必須在第二個(gè)RP-HPLC柱上純化合并的部分。條件基本上與上述條件相同。獲得的產(chǎn)物溶液用水稀釋,以用于注射,以適當(dāng)?shù)姆輸?shù)進(jìn)行調(diào)制并冷凍干燥。
可以與上述方法一起使用的、在中性pH不帶凈電荷的抑肽酶衍生物的其它純化方法是瓊脂糖-固定化胰蛋白酶親和層析法以及凝膠滲透色譜法。
2.DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的純化來(lái)自101發(fā)酵的材料按照以下方法進(jìn)行純化。在發(fā)酵完成后,將發(fā)酵罐內(nèi)含物用濃檸檬酸調(diào)至pH3,并于70℃加熱10分鐘。然后通過離心除去細(xì)胞(Heraeus離心機(jī),7500×g,15分鐘),過濾獲得的上清液(8-0.2μm,Millipore,Germany)。上清液可以從該階段開始,于-18℃冷凍儲(chǔ)藏直至下一次使用。然后加入純水,將溶液稀釋為電導(dǎo)率低于8mS/cm,裝到SP-瓊脂糖FF柱上(Pharmacia,Sweden)。柱子預(yù)先用50nM檸檬酸鹽-NaOH緩沖液pH3平衡。用相同的緩沖液進(jìn)行充分洗滌,除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后借助于鹽梯度(1M NaCl)洗脫產(chǎn)物。獲得的部分借助于反相高壓液相色譜(RP-HPLC,C4)以及蛋白酶抑制活性試驗(yàn)調(diào)查產(chǎn)物內(nèi)含物。合并那些含有所需產(chǎn)物的部分。
然后將產(chǎn)物溶液直接裝到預(yù)先用0.1%三氟乙酸/水平衡的第一RP-HPLC柱上(Source 15 RPC,Pharmacia,Sweden)。用相同的緩沖液進(jìn)行充分洗滌,除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。借助于線性乙腈梯度(0-70%)洗脫產(chǎn)物。獲得的部分再用上述方法調(diào)查產(chǎn)物內(nèi)含物,然后合并那些含有產(chǎn)物的部分。
對(duì)于最后的純化,含有產(chǎn)物的溶液用水稀釋,以用于注射,然后裝到預(yù)先用0.1%三氟乙酸/水平衡的第二RP-HPLC柱上(Vyadc C8,Vydac,USA)。用相同的緩沖液進(jìn)行充分洗滌,除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后借助于線性乙腈梯度(0-70%)洗脫產(chǎn)物。獲得的部分用上述方法調(diào)查產(chǎn)物內(nèi)含物,然后合并那些含有產(chǎn)物的部分。
獲得的產(chǎn)物溶液用水稀釋,以用于注射,以適當(dāng)?shù)姆輸?shù)進(jìn)行調(diào)制(20、10、1和0.2mg),凍干并進(jìn)行分析。
實(shí)施例5使用DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶進(jìn)行的人血漿血管舒緩素的Ki的測(cè)定實(shí)施例將1單位的人血漿血管舒緩素用緩沖液(0.05M Tris/0.1M NaCl,0.05%Treen 20;pH8.2)稀釋至16ml。在200μl該酶溶液加入體積逐級(jí)減少的試驗(yàn)緩沖液(250μl、240μl、230μl、220μl、200μl、180μl、170μl、150μl、100μl和50μl)混合,然后增加加入在分析緩沖液中的抑制劑量(10μl、20μl、30μl、50μl、70μl、80μl、100μl、150μl、200μl和250μl;濃度為0.7μg/μl)。
將酶/抑制劑溶液于室溫預(yù)保溫4小時(shí)。然后將180μl的每種溶液加入微量滴定板的孔中,與20μl底物溶液混合。于450nm測(cè)定10分鐘的吸收變化。測(cè)定酶的反應(yīng)速率,由此按照Bieth的方法計(jì)算Ki值(Biochemical Medicine 32387-397(1984)。
底物儲(chǔ)液 含0.1M底物的DMSO(二甲亞砜)底物溶液 含1×10-3MS-2302的分析緩沖液分析緩沖液0.05M三(羥甲基)-氨基甲烷,0.1M NaCl,0.05%Treen 20;pH8.2;1ml苯甲醇/l用同樣的步驟測(cè)定與酶纖維蛋白溶酶因子XIa、牛胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶絡(luò)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。纖維蛋白溶酶的底物為ChromozymPL,因子XI的底物為HD-Pro-Phe-Arg-pNA,胰蛋白酶的底物為S-2444,而胰凝乳蛋白酶的底物為Suc-Phe-Leu-Phe-pNA。
實(shí)施例6DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶蛋白質(zhì)化學(xué)表征的結(jié)果蛋白酶抑制劑DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶通過基因工程修飾的酵母有機(jī)體的分泌進(jìn)行制備。由酵母上清液用各種色譜法純化為同質(zhì)。用克隆的序列進(jìn)行的抑制劑的識(shí)別用以下蛋白質(zhì)分析研究來(lái)表明。
N-末端序列分析蛋白酶抑制劑完全的序列分析超過57步。以下序列顯示出測(cè)定的蛋白質(zhì)序列,與克隆的序列相同。
1Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-21Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-40Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-AlaDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的序列分析超過57步。
氨基酸分析氨基酸分析是蛋白質(zhì)表征的重要的定量參數(shù)。除蛋白質(zhì)含量外,在已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下,測(cè)定各個(gè)氨基酸的數(shù)。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的氨基酸分析與來(lái)自一級(jí)結(jié)構(gòu)的理論值(表1)很好地吻合。
表1DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的氨基酸分析。殘基數(shù)基于Ala=7。
氨基酸殘基數(shù) 理論數(shù)CysSO3H 5.286Asp6.276Thr3.494Ser1.582Glu4.254Gly6.166Ala7.007Val0.981Met1.101Ile1.662Leu1.892Tyr2.493Phe4.114Lys1.051Arg4.735Pro3.233*) 半胱氨酸和甲硫氨酸用過甲酸氧化進(jìn)行測(cè)定(Met表示甲硫氨酸磺基)。
反相色譜法在化學(xué)結(jié)合的反相蛋白質(zhì)HPLC色譜中,通過蛋白質(zhì)的疏水作用結(jié)合到所用的相上。隨結(jié)合到固定相的強(qiáng)度的不同,蛋白質(zhì)被有機(jī)溶劑(流動(dòng)相)取代。因此,該方法是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)純度的很好的判別準(zhǔn)則。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶從RP-18相中作為單獨(dú)的峰洗脫出來(lái)。表明分離的蛋白酶抑制劑是純凈的。
CE色譜法毛細(xì)電泳允許根據(jù)在電場(chǎng)中的電荷分離多肽和蛋白質(zhì)。在這種情況下分離的質(zhì)量取決于緩沖液、pH、溫度以及所用的添加劑。所用的毛細(xì)管是所謂的“熔凝硅石”柱,內(nèi)徑為50-100μm。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶在電場(chǎng)中的“熔凝硅石”柱上分離。電泳圖譜顯示出一個(gè)窄峰。
分子量的測(cè)定DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的分子量用MALDI技術(shù)測(cè)定為6223道爾頓。這樣,測(cè)定的分子量在測(cè)定方法精確度的范圍內(nèi)與理論值6215道爾頓很好地吻合。芥子酸用作基質(zhì)。
SDS凝膠電泳在還原和非還條件下用SDS電泳分析DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。顯示的帶大約為6.5kD。
實(shí)施例7DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶與酶絡(luò)合的Ki值的測(cè)定測(cè)定各種酶的DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶的抑制常數(shù)。表2顯示Ki值。
表2DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶與酶血漿血管舒緩素、因子XIa、牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶絡(luò)合的抑制常數(shù)。
實(shí)施例8蛋白酶抑制劑與多克隆兔或人抗抑肽酶抗體的相互作用用重組方法制備的蛋白酶抑制劑用多克隆兔或人抗抑肽酶抗體進(jìn)一步研究其交叉反應(yīng)?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)各種蛋白酶抑制劑變異體與抑肽酶抗血清只顯示非常弱的相互作用。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)者(A)姓名Bayer AG(B)街道Bayerwerk(C)城市Leverkusen(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼51368(G)電話0214-3061455(H)電傳0214-303482(ii)發(fā)明的題目性能改善的抑肽酶變異體(iii)序列數(shù)目5(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30B(EPA)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度69個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反向否(vi)來(lái)源(A)有機(jī)體引物A(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO1GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAGACTGCATGGA AACTTGCGGT 60GGTGCTTAG 69(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度93個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反向否(vi)來(lái)源(A)有機(jī)體引物B(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO2GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAGACTGCATGGA AACTTGCGGT 60GGTGCTTAG 69(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(v)片斷類型線性(vi)來(lái)源(A)有機(jī)體引物C(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO3GGGATATCTA TTGATAAGTA TTAAAGGTAT TTGACAAG38(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度99個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反向否(vi)來(lái)源(A)有機(jī)體引物D(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO4GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAAGCAGCGAACA AGACAGCAGT 60GAAA TAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAATC GTTTATATT99(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度57個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型多肽(v)片斷類型線性(vi)來(lái)源(A)有機(jī)體抑肽酶變異體(xi)序列說(shuō)明SEQ ID NO5Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala1 5 10 15Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe20 25 30Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu35 40 45Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala50 5權(quán)利要求
1.pH7時(shí)凈電荷為+3至-3、在結(jié)合區(qū)內(nèi)具有氨基酸Arg15或Arg15-Ala17的抑肽酶變異體。
2.按照權(quán)利要求1的抑肽酶變異體用于抑制絲氨酸蛋白酶。
3.按照權(quán)利要求1或2的抑肽酶變異體,它具有修飾的N-末端序列。
4.按照權(quán)利要求1或2的抑肽酶變異體,它具有N-末端延伸或收縮或在N-末端具有缺失的氨基酸。
5.包括以下蛋白質(zhì)的抑肽酶變異體DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶。
6.包含一種或多種權(quán)利要求1-5的抑肽酶變異體的藥物。
7.按照權(quán)利要求1-5的抑肽酶變異體在外科中用來(lái)減少血液損失的藥物生產(chǎn)以及在治療嚴(yán)重?fù)p傷、休克和炎癥的藥物生產(chǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的酰-抑制性質(zhì)、 免疫學(xué)性質(zhì)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的抑肽酶變異體及其制品。
文檔編號(hào)A61K38/04GK1172116SQ97115348
公開日1998年2月4日 申請(qǐng)日期1997年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月25日
發(fā)明者W·施羅伊德爾, S·比約恩, K·諾里斯, V·迪尼斯, L·諾爾斯科夫-勞里特森, N·D·克里斯滕森 申請(qǐng)人:拜爾公司