專利名稱：抗人肝癌單克隆抗體HAb18放射免疫診斷劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術及細胞工程。
肝癌是我國及東南亞常見的惡性腫瘤，尤其在中國每年有11.2萬肝癌患者死亡，占全世界肝癌死亡人數的43％，九十年代以來肝癌已上升為第二癌癥殺手。肝癌發(fā)病兇險，進展迅速，影響極大，加上肝癌與乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染關系密切，因此進行肝癌的二級預防(早診、早治)具有重要意義。以往肝癌的手術切除率較低，其主要原因是肝癌的診斷，尤其是早期診斷比較困難，甲胎蛋白(AFP)臨床應用后，雖然檢出率有所提高，但在我國還有30％左右的AFP陰性的肝癌病例漏檢。80年代以來，由于醫(yī)學影像學的發(fā)展，肝癌的診斷方法日臻完善。國內范楨等報導用131I標記抗人肝癌鐵蛋白抗體對16例肝細胞癌作放射免疫顯像，陽性率達81.3％，其中經肝動脈導管注射的8例全部獲得陽性顯像。國外有關放免顯像的研究也有報道Dunk等用抗肝癌細胞PLC/PRF/5單克隆抗體標記125I進行荷瘤裸鼠體內定位獲得成功，瘤/肝比值為4.4±0.05(1987，J Hepatol 452)，Markham等用結腸癌單克隆抗體(因與肝細胞癌有交叉反應)在人體無肝硬化的肝癌中部分顯像，陽性率為50％(8/16)。美國FDA自1992年以來已陸續(xù)批準了10多項由單克隆抗體標記放射性核素的體內放免顯像劑，如ImmuRAID-IL2用于淋巴瘤診斷的II期臨床等，而國內外尚未有肝癌特異性的定性診斷試劑形成產品。
本發(fā)明的目的是研制準確性和敏感性高的肝癌體內導向診斷劑，以提高肝癌早診水平。
為達到此目的，本發(fā)明實施的技術方案為以外科手術切除的新鮮人體肝癌細胞為免疫原，免疫小鼠，融合獲得高分泌雜交瘤細胞株HAb18，其染色體在81-106間，眾數為93-99，其分泌高親和性抗人肝癌單克隆的抗體亞型為小鼠IgG1，其相應抗原為61KD的單位膜蛋白抗原，與甲胎蛋白、鐵蛋白元競爭抑制，親和常數為8.17×109L/mol，其抗原譜較為特異，主要針對肝癌，和部分胃癌、腸癌有交叉，但和正常組織無交叉反應。
用酶切法將HAb18 IgG分割為F(ab′)2和Fab，分子量減小，更易穿透到達腫瘤部位。
本發(fā)明中采用的放射性核素為131I或99mTc。131I半衰期為8.04天，主要發(fā)射β-及γ射線，用溴代琥珀酰亞胺法，將131I標記到HAb18單抗及其F(ab′)2上，組成抗人肝癌單抗介導的放免顯像劑131I-HAb18和131I-HAb18 F(ab′)2。99mTc半衰期為6小時，可從鉬锝發(fā)生器中淋洗制備，其主要帶電粒子為γ射線，采用還原抗體法或修飾抗體法可將99mTc標記于肝癌單抗HAb18 F(ab′)2和Fab上，組成肝癌放免顯像劑99mTc-HAb18 F(ab′)2和99mTc-HAb18 Fab。
臨床應用方式靜脈給藥患者服用盧戈氏碘液2-3天，3滴，每日3次，先靜脈注射地塞米松5mg，然后緩慢注入碘標記抗體92.5-111MBq/1.8-2.0ml。
臨床前及臨床研究1.體外免疫活性檢測標記抗體與肝癌細胞的免疫結合率，131I-HAb18 IgG為70％，131I-HAb18 F(ab′)2為55％，131I-C4IgG(無關抗體)為4.5％。
2.體內放免顯像及生物學分布注入碘標記抗體后，裸鼠左臀部位腫瘤區(qū)明確顯像。腫瘤直徑在0.5cm以上即能定位，顯像率100％。最佳顯像時間，全抗體120-168小時，F(ab′)248-72小時，無關對照抗體C4在腫瘤部位無放射性聚集。
HAb18及其F(ab′)2片斷在48小時時每克腫瘤組織的攝取，分別占其注入總劑量的2.56％和2.03％，兩者均高于對照抗體的1.2％。在不同時間點上處死荷瘤鼠，取全身各組織器官稱重，測cpm/mg組織，觀察T/NT比值，結果見表1。表1內3種抗體最佳顯像時間點上T/NT比值，其中最重要的為瘤/肝、瘤/血比值。注入標記單抗后，在不同時間點上分別取樣、測試、計算。瘤/肝比值全抗體在48、120、168小時分別為1.53、3.95、5.15。而F(ab′)2在48小時達14.47，遠高于全抗體；瘤/血比值，全抗體在以上時間點上分別為0.42、0.58、1.35。而F(ab′)2在48小時即為4.55比值也明顯大于全抗體。無關抗體C4T/NT比值均較小，無集中趨勢。
表1 標記抗體注入后在荷人肝癌裸鼠體內分布(T/NT比值X±S)標記物131I-HAb18 F(ab′)2131I-HAb18 IgG131I-C4IgG48h 168h 168h血 4.55±0.07 1.35±0.21 0.44±0.17心18.60±2.05 4.79±1.31 1.62±0.45肺 8.05±0.46 2.30±0.41 0.97±0.12肝14.47±2.35 5.15±0.64 0.93±0.16脾10.88±2.70 5.90±0.59 1.72±0.40胰18.40±1.08 9.58±1.12 1.48±0.23腎 4.46±0.86 3.84±0.62 2.75±0.37胃 2.51±0.69 4.87±1.14 0.92±0.08腸15.83±1.24 7.08±1.10 2.20±0.26肌肉 13.82±3.52 9.51±2.53 3.31±1.42腦81.91±12.13 31.63±1.0211.27±0.73
表2 碘標抗體注入人體內的分布(T/NT比值X±S)標記物131I-HAb18 IgG131I-HAb18 F(ab′)2血2.01±0.162.45±0.22腦4.70±0.305.95±0.32心3.13±0.183.0±0.25肝2.15±0.152.63±0.21脾2.82±0.213.22±0.34肺3.02±0.343.55±0.28腹腔 4.46±0.555.20±0.47注n＝15(IgG 12例，F(ab′)23例)。器官比值為ECT感興趣區(qū)(ROI)單位面積外測量的數據。131I-HAb18對正常人體的器官輻射吸收劑量根據醫(yī)學內照射劑量委員會綱要(Medical Internal Radiation Dose CommitteSchema，MIRD)，131I-HAb18對正常人體的器官輻射吸收劑量如下①各器官放射性藥物有效半衰期[T1]eff在相同顯像條件下，從全身顯像圖像上用感興趣區(qū)(ROI)技術計算出各器官不同時間的計數，擬合時間-放射性曲線，求出[T1]eff(h)肝 肺 心 甲狀腺 腸 腎 脾 睪丸 全身48 72 88120 68 24 120 9648②各器官累積放射性強度
肝 肺 心 腎 脾腸 睪丸全身骨皮質 骨髓8338 6822 12583 4370 8895 2202 2308288519440 19440
全身343917③各器官輻射吸收劑量(mGy/MBq)，如下肝 肺心腎脾 腸 睪丸甲狀腺 骨皮質 骨髓0.36 0.26 0.022 0.396 1.46 0.164 1.813.570.252 0.252全身0.184有效劑量當量(effective dose equivalent，EDE)為各器官吸收劑量與器官權重因子乘積代數和，經計數為0.958mSv/MBq，按每次顯像給藥185MBq計算，EDE為177.23mSv/每次檢查，乘以現行的危險度系數1.65×10-5/mSv，每次檢查因癌致死危險度為2.92×10-3。
本發(fā)明有敏感性強，組織特異性高的優(yōu)點。以“肝占位性病變待查”定位20例，其中13例經CT、B型超聲和血清AFP診斷為肝癌。經本發(fā)明顯像劑診斷陽性顯像11例，其中2例小肝癌，最小腫瘤直徑僅為0.5cm，血清AFP＜20ng/ml，B型超聲診斷為“血管瘤”，但本診斷劑定位發(fā)現陽性顯像區(qū)，手術后病理診斷證實為肝細胞癌。因此，本抗體對血清低值AFP的早期小肝癌的診斷也具有一定的可靠性。而5例肝占位病變，4例術前診斷為肝癌，1例疑為血管瘤，經本診斷劑檢查全部為陰性，最后由手術探查或胃鏡病理診斷證實3例是血管瘤，2例為來源于胃和賁門的肝轉移癌，陰性診斷符合率為100％。
權利要求
1.抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑。其特征在于以外科手術的新鮮人體肝癌細胞為免疫原，免疫小鼠，融合后獲得HAb18雜交瘤，其分泌高特異性抗人肝癌單克隆抗體HAb18，用放射性核素131I或99mTc標記HAb18單抗，組成抗人肝癌單抗HAb18交聯物。
2.根據權利要求1所述的抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑，其特征在于HAb18雜交瘤細胞株染色體在81-106間，眾數為93-99，其分泌特異性抗人肝癌單抗HAb18。
3.根據權利要求1或2所述的抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑，其特征在于HAb18單抗的亞型為小鼠IgG1，其相應抗原為61KD的單位膜蛋白抗原，與甲胎蛋白，鐵蛋白無競爭抑制，親和常數為8.17×109L/mol，其抗原譜較為特異，主要針對肝癌，和部分胃癌、腸癌有交叉，但和正常組織無交叉反應。
4.根據權利要求3所述的抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑，其持征在于還可用酶切法將HAb18 IgG分割為F(ab′)2和Fab片斷，使抗體分子量減小，而更易穿透到達腫瘤部位。
5.根據權利要求4所述的抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑，其特征在于所述的抗人肝癌單抗HAb18交聯物具體為以下四種制劑[131I]-HAb18 IgG； [131I]-HAb18 F(ab′)2；[99mTc]-HAb18 F(ab′)2； [99mTc]-HAb18 Fab。
全文摘要
抗人肝癌單抗HAb18放射免疫診斷劑，涉及生物技術及細胞工程領域，其主要技術特征為以外科手術切除的新鮮人體肝癌細胞為免疫原，免疫小鼠，融合后獲得HAb18雜交瘤，其分泌高特異性抗人肝癌單抗HAb18，用酶切法將HAb18分割為F(ab′)
文檔編號A61K39/395GK1166988SQ97108618
公開日1997年12月10日 申請日期1997年7月11日 優(yōu)先權日1997年7月11日
發(fā)明者陳志南, 劉彥仿, 隋延仿, 米力, 仇凱, 陳敏, 邊惠潔, 劉成剛 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學