專利名稱：重組白細(xì)胞介素－2腺病毒載體及產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于治癌藥物及其制備方法。
基因治療法治癌研究已在先進(jìn)國家全面展開，其主要方法從治療途徑劃分有①體外法(ex vivo)，②體內(nèi)法(in vivo)。體內(nèi)法主要是把載有治療基因的生物藥品輸入病人體內(nèi)，而達(dá)到治癌效果，體內(nèi)法治療癌癥的關(guān)鍵是使治療基因能專一地在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
體內(nèi)法治癌可采用三種基因，一是采用激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的基因，白細(xì)胞介素-2(IL-2)是最廣泛使用的基因，二是采用能殺死細(xì)胞的基因(自殺基因)，三是腫瘤抑制基因，如P53和Rb基因等。這三種基因雖然都被廣泛地研究，但從安全性和有效性而言，采用能激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的基因是較為成熟又較有把握的方法，因?yàn)榘┑纳稍蛑皇前┘?xì)胞能有效地避開免疫系統(tǒng)的攻擊，二是細(xì)胞能分泌一些特別的蛋白質(zhì)，抑制周圍T-細(xì)胞的活力或是在癌細(xì)胞內(nèi)某些蛋白(如HLA蛋白)的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制而使癌細(xì)胞特有的蛋白無法被免疫系統(tǒng)識(shí)別。
IL-2能有效激活已失活的T-細(xì)胞，同時(shí)也能大大提高癌細(xì)胞內(nèi)的HLA蛋白的表達(dá)。因此IL-2產(chǎn)品被廣泛使用在癌癥的治療上并顯示了療效。但直接用IL-2治療也有缺點(diǎn)一是IL-2的劑量受到限制，高劑量治療導(dǎo)致頭暈、惡心，病人難以忍受，甚至?xí)?dǎo)致病人死亡，低劑量往往又不能達(dá)到顯著療效，同時(shí)IL-2產(chǎn)品價(jià)格昂貴，普通病人難以承擔(dān)。
白細(xì)胞介素2(IL-2)已廣泛進(jìn)入治療癌癥的臨床試驗(yàn)，IL-2是當(dāng)前利用細(xì)胞激動(dòng)素治療腫瘤和癌的主要方向。
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分顯示IL-2的重要性，在IL-2的參與下，休眠失活的淋巴細(xì)胞被激活，IL-2在一些腎癌病人的臨床試驗(yàn)中也顯示了類似的結(jié)果，在原發(fā)處的腫瘤被切除后IL-2的注射使10％左右的病人顯示出抑制癌生長(zhǎng)和消除擴(kuò)散了的癌細(xì)胞的功能。
然而尚無充分證據(jù)顯示IL-2的施用能消除大面積的腫瘤，一般認(rèn)為這是由于受到IL-2劑量的限制以及腫瘤細(xì)胞本身能分泌出抑制物對(duì)抗IL-2對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激。切除大的腫瘤組織可以減少免疫抑制物的分泌，利于IL-2的治療，但共存在腫瘤組織中的侵入性淋巴細(xì)胞(TIL)也被一并拋棄了，TIL在腎細(xì)胞癌(RCC)中與腫瘤細(xì)胞的比例約為1∶1，在病人體內(nèi)處于休眠狀態(tài)。有人試圖利用這些TIL，手術(shù)切除的腫瘤酶解后，加入IL-2做細(xì)胞培養(yǎng)，TIL可在體外增殖幾百～上萬倍，增殖后的淋巴細(xì)胞被輸回病人體內(nèi)，配合IL-2的注射，可提高療效，這一治療方法即為體外法，它最明顯的缺點(diǎn)是步驟太多，稍不小心會(huì)造成細(xì)胞或其它微生物的污染，同時(shí)，體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞處于與人體內(nèi)很不同的環(huán)境中，其生存與分泌得不到免疫系統(tǒng)及其它細(xì)胞的支持，抗癌特異性從中削弱，不能顯示生物學(xué)上顯著的療效。
在這一情況下，IL-2基因治療作為新的嘗試有理論支持，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生一種攜帶白細(xì)胞介素2(IL-2)的重組腺病毒載體。IL-2基因輸入癌細(xì)胞后，每個(gè)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞變成一個(gè)IL-2產(chǎn)生器不斷產(chǎn)生IL-2，與全身注射IL-2不同的是，載體可以集中地注射到癌腫塊中，體積大的腫瘤恰恰有利于載體的準(zhǔn)確注射和高效表達(dá)，使大量IL-2產(chǎn)生于癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞及周緣的IL-2濃度大大增加，癌細(xì)胞內(nèi)人白細(xì)胞抗原(HLA)表達(dá)增強(qiáng)，大大激活體內(nèi)免疫細(xì)胞，從而殺死腫瘤細(xì)胞，與逆病毒相比，其感染力和基因表達(dá)力提高十倍至上千倍，而且更安全，易于制備。
本發(fā)明的目的是通過下述方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組腺病毒(如IL-2腺病毒)的有效方法，公開了重組腺病毒載體組成，以及使用這樣的載體激活腫瘤細(xì)胞中免疫細(xì)胞的方法，還公開了Ca2+介導(dǎo)的二種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后同源重組產(chǎn)生重組腺病毒的方法，以及用PCR技術(shù)分析重組腺病毒的方法。
本發(fā)明所涉及重組腺病毒載體的構(gòu)建，包括使用腺病毒來攜帶細(xì)胞激動(dòng)素基因如IL-2，包括了產(chǎn)生可包裝的重組腺病毒的二種質(zhì)粒。重組載體插入序列一般包括巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子區(qū)，IL-2基因序列，以及位于啟動(dòng)子和IL-2之間的一段來自SV-40的小DNA序列，多聚腺苷酸化信號(hào)。
按照本發(fā)明的簡(jiǎn)化方法，將IL-2編碼序列插入缺乏E1區(qū)的腺病毒基因組中，但優(yōu)選的腺病毒是復(fù)制缺陷病毒，其中復(fù)制所必需的病毒基因已從腺病毒載體中被刪除，再在其位置上導(dǎo)入IL-2表達(dá)區(qū)域。
本發(fā)明在重組腺病毒的構(gòu)建中，是采用pJM17和CMVpLpA在Ca2+介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，從而讓二種質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，產(chǎn)生IL-2腺病毒。IL-2腺病毒因其缺失E1區(qū)，也是一種復(fù)制缺陷型的腺病毒。
制備復(fù)制缺陷型腺病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如包括Ghoch-Chaudlumy和Graham(1987),McGrory(1988)以及Ghezmam等人(1982)所描述的方法，各種已知的細(xì)胞系只要它們補(bǔ)償任何可能存在的復(fù)制缺陷，均可用于制備重組腺病毒，優(yōu)選的細(xì)胞系是人293細(xì)胞系。此外，為了得到病毒原種貯存液，也可以在塑料平皿上或懸浮液培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞。
腺病毒可以是42個(gè)不同的已知血清型式亞類Adv中的任何一個(gè)，為了得到用于本發(fā)明復(fù)制缺陷型腺病毒載體，優(yōu)選亞類C的5型腺病毒作為起始材料。這是因?yàn)?型腺病毒是人類腺病毒，并且該病毒亞型的許多生物化學(xué)和遺傳學(xué)信息都是已知的，并且歷史上在利用腺病毒作載體的大多數(shù)構(gòu)建工作都使用該亞型。
本發(fā)明的DNA片段在轉(zhuǎn)錄的5′～3′方向上一般包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，來自SV-40的一段小DNA序列，人的IL-2基因序列，以及SV-40多聚腺苷酸化信號(hào)。含有重組腺病毒的宿主細(xì)胞一般是真核式哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，如293細(xì)胞，或是人的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的重組腺病毒載體分散于藥理學(xué)中可接受的溶液或緩沖液中，包括磷酸鹽、乳酸鹽、Tris等中性鹽。當(dāng)然，也可純化腺病毒以使其基本上沒有不需要的污染物，從而避免該重組載體在動(dòng)物或病人體內(nèi)引起任何不適宜的反應(yīng)。純化載體的優(yōu)選手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化銫梯度離心法，以及層析等方法。
在這一實(shí)施方案中，通過比較用E1缺失的帶有光化基因(Luc)的基因載體和E1缺失的不帶外源基因的載體以及帶IL-2的基因載體，處理動(dòng)物腫瘤，可以清楚地表明帶有IL-2的腺病毒更有治療效力。
通過IL-2腺病毒載體的構(gòu)建以及腫瘤治療舉例已說明了本發(fā)明的各個(gè)方面，同時(shí)本發(fā)明可適用于期望通過使用重組腺病毒實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)細(xì)胞激動(dòng)素的任何情況。例如，在腫瘤治序程式方面，除了IL-2取代外，本發(fā)明人涉及的特定例子是其它白細(xì)胞介素(IL1-IL15)，干擾素(IFN-α,IFN-β和IFN-γ)，各種胞落刺激素(CSFS包括GM-CSGF，GCSF等)以及α-腫瘤壞死因子(TNF-α)，轉(zhuǎn)型生長(zhǎng)因子及其系列(TGF-β)等，以及其它用于人腫瘤治療的相關(guān)基因。
應(yīng)指出的是，所利用的腺病毒載體是復(fù)制缺陷的，所以不能在最終被感染的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。因此，在某些病人需要連續(xù)治療的情況下，有必要在一定時(shí)間如(7-35日)后再次導(dǎo)入病毒。
本發(fā)明的IL-2表達(dá)框架(expression cassettee)，有可能放入其它病毒載體以表達(dá)和輸送IL-2如單純皰疹病毒，(HSV)，E-P病毒(EBV1)，巨細(xì)胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)將是適用的。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)任何一類重組腺病毒的簡(jiǎn)化方法，不僅涉及Ca2+轉(zhuǎn)染法和噬班檢測(cè)法，而且還通過分析培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，了解其是否存在同源重組病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，CPE可直接使用倒置顯微鏡觀察。
重組病毒的產(chǎn)生還可用PCR法證明。即從表現(xiàn)出細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞上清中得到DNA，并使用兩對(duì)引物-一對(duì)表達(dá)載體特異性DNA(IL-2)引物和一對(duì)腺病毒基因組特異性DNA引物，以PCR法分析DNA。


圖1顯示得到重組IL-2腺病毒流程。將IL-2表達(dá)序列插入pLpA的BamHⅠ位點(diǎn)，形成pLpA-IL2質(zhì)粒。將IL-2表達(dá)載體(pL1A-IL2)和重組質(zhì)粒pJM17由Ca2+介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞維持在培養(yǎng)基中7～10天，觀察噬斑，以及細(xì)胞病變效應(yīng)，然后提取噬斑中的DNA模板，對(duì)DNA進(jìn)行PCR。分析以鑒定新產(chǎn)生的IL-2重組腺病毒(pAC-CMV-IL-2)。
圖2，顯示對(duì)pAC-CMV-IL-2基因組DNA進(jìn)行細(xì)胞分析的酶切圖。該基因組大約為37kb。
圖3顯示重組腺病毒-IL-2載體。由圖中可見，在腺病毒的E1區(qū)，依次插入了巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，來自SV-40小DNA，白細(xì)胞介素2的cDNA和SV-40的多腺苷化信號(hào)序列。
圖4顯示HS-IL2cDNA5′末端DNA序列。一段約100個(gè)堿基對(duì)DNA序列被插入白細(xì)胞介素2蛋白質(zhì)翻譯起始點(diǎn)(130位的ATG)之前。成熟的IL2蛋白是從190位的GCA開始。
圖5顯示HS-IL2 cDNA5′未端DNA序列與火雞皰疹病毒U32基因序列高度相似。
圖6顯示HS-IL2 cDNA5′未端DNA序列與SV-40病毒VP-1基因序列高度一致性，說明所插入的一小段DNA序列來源于SV-40。
圖7插入的IL-2 cDNA序列及其5′未端序列，蛋白質(zhì)翻譯起始于130位的ATG，終止于861位TGA。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述A．基因治療技術(shù)迄今已提出了幾種基因治療的實(shí)驗(yàn)方法，但每種方法都有其特定的缺點(diǎn)(Muiligan,1993)。如上文所述，已有幾種基本轉(zhuǎn)染方法，例如通過物理或化學(xué)方法加大細(xì)胞膜通透性以將含有感興趣基因的DNA非生物學(xué)地導(dǎo)入細(xì)胞中。當(dāng)然，這種方法只限于能暫時(shí)從體內(nèi)除去的并能耐受這種處理的細(xì)胞毒性的細(xì)胞，即淋巴細(xì)胞。也可以使用與某些脂質(zhì)和兩親性肽形成的脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)結(jié)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但基因整合的效率仍很低，一般每1,000到100,000個(gè)細(xì)胞才有一個(gè)發(fā)生整合，并且已轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)常常限于幾天(增殖細(xì)胞)或幾周(非增殖細(xì)胞)。因此DNA轉(zhuǎn)染顯然不是一種腫瘤治療的適宜方法。
第二種方法是利用病毒進(jìn)入細(xì)胞的天然能力。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒能將其基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，可轉(zhuǎn)移大量外來遺傳材料，并可被包裝到特定細(xì)胞系內(nèi)，所以有希望作為基因運(yùn)輸載體。但仍有不足之處，第一，逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染性取決于靶細(xì)胞表面上病毒受體的可利用性。第二，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能有效地整合到復(fù)制中的細(xì)胞內(nèi)。最后，逆轉(zhuǎn)錄病毒難于濃縮和純化。B．IL-2基因治療法對(duì)癌癥的治療效應(yīng)IL2基因治療法治癌的主要爭(zhēng)議是如果IL2蛋白本身能達(dá)到治療效果，用病毒載體將IL2基因輸入癌細(xì)胞而后讓其表達(dá)，是否繞了彎路。從醫(yī)療原理分析，用IL2蛋白直接注射與用載體輸入IL2基因，兩者解決問題的途徑是很不一樣的。IL2蛋白是一種自刺激和旁刺激(autocrine and paracrine)生長(zhǎng)激素而不是一種內(nèi)分泌(endocrine)生長(zhǎng)激素。在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中IL2蛋白濃度是極低的。給病人注射IL2一般都會(huì)產(chǎn)生副作用，引起病人發(fā)燒，嚴(yán)重的甚至?xí)斐伤劳?。把IL2基因輸入癌細(xì)胞則有不同的效果。一方面可以使IL2基因在癌細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生IL2蛋白，在其周圍形成IL2的梯度靠近癌細(xì)胞處的IL2濃度高而遠(yuǎn)離癌細(xì)胞處則濃度低，從而不僅能有效地刺激癌細(xì)胞周圍的特異性的淋巴細(xì)胞，還能有效地避免全身性的副作用。另一方面IL2基因的輸入能增強(qiáng)癌細(xì)胞的免疫原性(immunogenicity)。使得這些細(xì)胞能更有效地激活具有殺癌特異性功能的淋巴細(xì)胞。C．載體的選擇以E1切除的腺病毒(Adenovirus)為基礎(chǔ)，經(jīng)改造過的腺病毒載體具有安全，高效，制備成本低的優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)镋1區(qū)的基因已被切除，產(chǎn)生的病毒載體不能在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，大大提高其安全性。本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品效價(jià)為每毫升1011pfu(病毒班形成單位)，與其他白細(xì)胞介素2腺病毒載體相比，本發(fā)明載體具有高產(chǎn)額的優(yōu)點(diǎn)。活體實(shí)驗(yàn)證明研制出的IL-2腺病毒載體能極有效地提高免疫細(xì)胞的抗癌效果。以小鼠肉瘤為例的動(dòng)物試驗(yàn)顯示IL-2腺病毒載體能極有效地治療腫瘤。對(duì)于一立方厘米的大小的腫瘤，僅需0.01毫升。
此制劑可保存在零下20℃三個(gè)月以上。用前室溫化凍即可使用。因此比較傳統(tǒng)的逆病毒載體，具有活力高，易保存的特點(diǎn)。D．用于基因治療的腺病毒載體的構(gòu)建人腺病毒是基因組大小約36kb的雙股DNA病毒(Tooza,1981)。作為真核基因表達(dá)的模型系統(tǒng)，已對(duì)腺病毒進(jìn)行了廣泛的研究并充分鑒定了其性質(zhì)，使腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)成為有吸引力的系統(tǒng)。該病毒很容易生長(zhǎng)和操作，并且在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出很寬的宿主范圍。在溶胞感染的細(xì)胞中，腺病毒能夠切斷宿主蛋白質(zhì)合成途徑，引導(dǎo)細(xì)胞合成大量的病毒蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生大量病毒。
基因組的E1區(qū)域包括E1A和E1B及少數(shù)細(xì)胞基因，其中E1A和E1B編碼負(fù)責(zé)病毒基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。包括E2A和E2B在內(nèi)的E2的表達(dá)得以合成病毒復(fù)制功能蛋白質(zhì)，如DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶及引發(fā)復(fù)制的末端蛋白質(zhì)。E3基因產(chǎn)物防止由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和腫瘤壞死因子引起的細(xì)胞溶解作用并且似乎對(duì)病毒增殖有著重要作用。與E4蛋白質(zhì)相關(guān)的功能包括DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)及宿主細(xì)胞關(guān)閉。晚期基因產(chǎn)物包括大部分病毒顆粒衣殼蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)只在從主要晚期啟動(dòng)子開始的單一初級(jí)轉(zhuǎn)錄本發(fā)生大部分加工后被表達(dá)。在感染的晚期，主要晚期啟動(dòng)子(MLP)表現(xiàn)出高的效率(3tratford-Perricaudet and Perricaudet,1991a)。
由于只有一小部分病毒基因組似乎需要為順式(Tooza,1981)，腺病毒衍生的載體當(dāng)與細(xì)胞系如293細(xì)胞聯(lián)用時(shí)對(duì)于大DNA片段的取代具有極大的潛力。為了提供反式的病毒必需蛋白質(zhì)，已建立了Ad5轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系(Graham,et al.,1977)。因此本發(fā)明人推論腺病毒的特點(diǎn)使之成為用于導(dǎo)向體內(nèi)癌細(xì)胞的良好候選者。
使用腺病毒系統(tǒng)向細(xì)胞遞送外來蛋白質(zhì)的特殊優(yōu)點(diǎn)包括(ⅰ)能夠由外來DNA取代相對(duì)大的病毒DNA片段；(ⅱ)重組腺病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(ⅲ)給人投用腺病毒的安全性；(ⅳ)腺病毒感染與腫瘤或癌沒有任何已知的聯(lián)系；(ⅴ)能夠得到高滴度重組病毒；以及(ⅵ)腺病毒有高感染力。E．IL-2腺病毒載體與腫瘤治療本發(fā)明提供了用新的腫瘤治療載體進(jìn)行腫瘤的基因治療的方法，該重組腺病毒保留了腺病毒的優(yōu)點(diǎn)，如高滴度，宿主范圍廣泛，高效轉(zhuǎn)導(dǎo)及不整合入靶細(xì)胞等。
圖1顯示了優(yōu)選的IL-2腺病毒的設(shè)計(jì)和增殖。與之相應(yīng)，建立了增殖和鑒定重組腺病毒的方法-噬斑檢測(cè)法。然后如圖2所示，用PCR法從結(jié)構(gòu)上證實(shí)IL2-重組腺病毒。證實(shí)其結(jié)構(gòu)后，用IL2腺病毒感染293細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)其增殖。
比較三種載體1．E1缺失的不帶外源基因的載體。2．E1缺失的帶光化基因(luc)的載體。3．E1缺失帶白細(xì)胞介素2的基因載體，三者對(duì)體內(nèi)實(shí)體瘤的治療作用可以清楚地看到，只有注射了IL2-腺病毒載體的腫瘤塊明顯減少。組建的IL2腺病毒載體能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)各種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株，當(dāng)感染系數(shù)為5時(shí)，在感染的頭24小時(shí)內(nèi)，每一百萬個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生約18納克的IL2，因?yàn)橄俨《据d體在細(xì)胞中的表達(dá)峰期是在感染后的第3日～第8日的范圍內(nèi)，可以肯定在表達(dá)峰期每百萬個(gè)細(xì)胞24小時(shí)能產(chǎn)生100納克以上的IL2。由這一結(jié)果可見，在腫瘤細(xì)胞中，我們構(gòu)建的IL2-腺病毒載體中的IL-2得到了高效表達(dá)，其原因可能在于以下幾個(gè)方面①高效基因轉(zhuǎn)移；②強(qiáng)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人IL-2cDNA表達(dá)；③來自SV40的小DNA增強(qiáng)IL2 cDNA表達(dá)。
本文公開的研究工作表明IL2重組腺病毒具有腫瘤治療效應(yīng)，所說的治療作用是通過激活免疫T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，這些結(jié)果支持使用IL2腺病毒顆粒作為腫瘤的治療劑。F．患者和治療程序發(fā)明人提議向?qū)嶓w癌患者的腫瘤細(xì)胞區(qū)域性輸送腺病毒-IL2載體是一種很有效的對(duì)抗臨床疾病的方法，該方法是對(duì)目前腫瘤療法的重大改進(jìn)，其主要途徑是通過直接向腫瘤細(xì)胞注入IL2腺病毒，以產(chǎn)生大量的IL2基因產(chǎn)物，激活腫瘤附近的T細(xì)胞，即讓體內(nèi)的免疫細(xì)胞直接被激活以承擔(dān)清除癌的功能。
當(dāng)然，對(duì)于較大體積的腫瘤，由于受到IL-2劑量及腫瘤細(xì)胞分泌的抑制物的影響，使療效不明顯，此時(shí)可以通過切除大的腫瘤組織以減少免疫抑制物的分泌，再結(jié)合IL2腺病毒的注入，以清除癌細(xì)胞。
下列實(shí)施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。實(shí)施方案中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明過程中的改進(jìn)技術(shù)，可以看作是實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選方式。
實(shí)施例1IL-2表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例描述IL-2表達(dá)載體的構(gòu)建。按所指出的方法構(gòu)建該載體并用于取代腺病毒Ad5的E1區(qū)域。
如圖3所示。
將含有來自SV-40的小DNA(100 bp)和IL-2 cDNA的片段插入了pAC-CMV-pLpA的E1區(qū)的BamcHⅠ位點(diǎn)，該插入片段的基因組大小為700bp，形成pAC-CMV-pLpA-SV-IL2，將其與質(zhì)粒pJM17由Ca2+介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)7-10天后，用病毒斑法篩選，并提取病毒斑中DNA，進(jìn)行PCR分析，以鑒定IL-2重組腺病毒的產(chǎn)生。
實(shí)施例2重組IL2-腺病毒的產(chǎn)生及增殖本實(shí)施例描述一種適于產(chǎn)生表達(dá)IL2的腺病毒載體的方法。由于腺病毒的包裝限制，所以pJM17不能以其自身形成病毒，而pAC-CMV-pLpA-SV-IL2僅含有3.2kbAd5基因，不能形成有活性的病毒顆粒，因此，在IL2表達(dá)載體質(zhì)粒pAC-CMV-pLpA-SV-IL2和pJM17質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組以產(chǎn)生能夠包裝在必要的腺病毒包裝蛋白中的活病毒。
本實(shí)施例的方法利用293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)pAC-CMV-pLpA-SV-IL2和pJM17之間的同源重組。這一過程需要由Ca2+介導(dǎo)，將該二質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，并用噬斑檢測(cè)法篩選出重組腺病毒。
293細(xì)胞是培養(yǎng)在含5％胎牛血清的MEM中，并在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將293細(xì)胞(15～20代)接種在60mm平皿上，用2ug pJM17,10ugpAC-CMV-pLpA-SV-IL2轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后1～2天，在平皿上覆蓋一層海藻糖以防止重組病毒的游移。
重組IL-2腺病毒(pAC-CMV-SV-m2)的增殖是以重組IL-2腺病毒直接感染293細(xì)胞株實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)以反復(fù)凍融法實(shí)現(xiàn)成熟重組病毒粒子從293細(xì)胞中釋放。
實(shí)施例3證實(shí)重組腺病毒的同一性本實(shí)施例舉例說明用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)一步證明共轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞系后所得的重組腺病毒的同一性。
使用兩對(duì)引物一對(duì)表達(dá)載體特異性DNA(IL-2)引物和一對(duì)腺病毒基因組特異性DNA引物。
實(shí)施例4在小鼠纖維肉瘤細(xì)胞及乳癌細(xì)胞中IL2腺病毒載體指導(dǎo)的IL2基因表達(dá)分為2-3次瘤內(nèi)注射重組病毒2-6×109pfu，能顯著地延緩癌的生長(zhǎng)及排斥癌細(xì)胞。
小鼠纖維肉瘤(直徑為0.4-0.6cm)分別在皮下注射癌細(xì)胞后第14天，19天于形成的纖維肉瘤內(nèi)注射20μL AdvIL-2，病毒滴度為2×109pfu，結(jié)果使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，有些甚至完全消失。將體內(nèi)注射了2×109pfu病毒的0.8cm直徑大小的腫瘤取出，體外培養(yǎng)3天后，IL-2產(chǎn)量為490pg/24h。
小鼠乳腺癌(直徑為0.3-0.5cm)分別在皮下注射癌細(xì)胞后第12天，15天，17天瘤內(nèi)注射2×109pfu病毒，也發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)減慢甚至完全消失。
實(shí)施例5在人腎癌細(xì)胞中IL-2腺病毒載體指導(dǎo)的IL-2基因表達(dá)。
將來自病人的腎癌組織，酶解后所得的細(xì)胞懸浮液分為三份，培養(yǎng)在含5％牛血清的MEM培養(yǎng)基中，每份含有5×107細(xì)胞。其中一份以每毫升24納克的比例加入了IL2，一份細(xì)胞加入了5×108腺病毒白細(xì)胞介素2載體。而第三份則不加IL2或腺病毒白細(xì)胞介素2載體。經(jīng)一星期細(xì)胞培養(yǎng)，可以觀察到淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況在前兩份細(xì)胞培養(yǎng)中是基本相同的。淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著增加，從細(xì)胞的形狀可明確證實(shí)淋巴細(xì)胞被激活而附著并進(jìn)一步殺死癌細(xì)胞。在那份既不加腺病毒白細(xì)胞介素2載體，也不加白細(xì)胞介素2蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)照，癌細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)而淋巴細(xì)胞仍處休眠狀。
實(shí)施例6含有SV-40片段與不含SV-40片段的IL-2重組腺病毒載體(pAC-CMV-SV-IL2和pAC-CMV-IL2)在腎癌細(xì)胞中表達(dá)的比較結(jié)果見表1表1含有SV40片段與不含SV40的腺病毒IL2在腎癌細(xì)胞中表達(dá)

由表1可見當(dāng)重組腺病毒載體中不含來自SV40的小DMA片段時(shí)，只在感染后第3天表現(xiàn)出3.2ng/106細(xì)胞的IL2產(chǎn)量，而在感染后的第1天和第五天，都不能檢測(cè)出白細(xì)胞介素2。當(dāng)一段來自SV40的小DNA插入CMV啟動(dòng)子和IL2表達(dá)基因之間時(shí)，白細(xì)胞介素2的表達(dá)明顯增加，在第1、3、7天都檢出分別高達(dá)10.5、11.4、3.8ng/106細(xì)胞的產(chǎn)量。由此可見，來自SV40的這一小段DNA具有能明顯增加IL2的表達(dá)的功能。
實(shí)施例7加入IL-2重組腺病毒的多少對(duì)IL-2表達(dá)的影響在用重組腺病毒IL2處理腫癌細(xì)胞的過程中，我們發(fā)現(xiàn)感染倍數(shù)(MOI)不同，IL2在腫瘤細(xì)胞中的產(chǎn)量也就不相同，其結(jié)果見表2。
表2IL-2重組腺病毒的劑量對(duì)IL-2表達(dá)的影響

由表2，我們可以看出，感染倍數(shù)分別為50、5、2.5、0.5倍時(shí)，產(chǎn)生的白細(xì)胞介素2的產(chǎn)額(ng/106細(xì)胞)并不是成倍地減少，并且，由此表的結(jié)果我們也可以確定，有效感染為MOI=5的感染。同時(shí)，由此表我們也可以看出，乳癌細(xì)胞MCF-7與腎癌細(xì)胞2的結(jié)果基本一致，只是腎癌細(xì)胞隨MOI的減少，IL2產(chǎn)額減少更小，其原因可能是因?yàn)棰僭谀I癌細(xì)胞中，利于IL-2高效表達(dá)；②重組腺病毒更易感染進(jìn)入腎癌細(xì)胞；③腎癌細(xì)胞分裂速度較乳癌細(xì)胞慢。
實(shí)施例8感染倍數(shù)為10(病毒/細(xì)胞=10)時(shí)感染時(shí)間對(duì)IL-2表達(dá)的影響。
我們進(jìn)行了固定感染倍數(shù)，測(cè)定不同感染時(shí)間，在不同腫瘤細(xì)胞中IL2的產(chǎn)額的試驗(yàn)，其結(jié)果見表3。
表3感染時(shí)間對(duì)IL-2表達(dá)的影響

由表3可見，對(duì)腎癌細(xì)胞3而言，在感染后的第16小時(shí)至第3天都為IL2的表達(dá)高峰期，其產(chǎn)額都大于34ng/106細(xì)胞(高過測(cè)定范圍)，而對(duì)病人4腎腫瘤細(xì)胞而言，在感染后第5天至第7天為其IL2表達(dá)的高峰期，產(chǎn)額為9ng/106細(xì)胞。由此可見，對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞，IL2重組腺病毒感染后，出現(xiàn)IL2表達(dá)峰值的時(shí)間是很不相同的。
實(shí)施例9重組IL2腺病毒治療程式動(dòng)物模式應(yīng)用可作為臨床前試驗(yàn)的一部份，因此，可以檢測(cè)已確定進(jìn)行腺病毒基因治療的病人體內(nèi)是否存在抗腺病毒的抗體，如果存在，并且，病人有對(duì)藥理學(xué)式天然物質(zhì)發(fā)生過敏反應(yīng)的歷史，則在密切臨床觀察下給予一定劑量的重組腺病毒。
為了應(yīng)用IL-2重組腺病毒治療腫瘤，應(yīng)制備在適當(dāng)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子控制下表達(dá)IL-2的重組腺病毒，并按照符合藥物與食品管理局(FDA)規(guī)定的生產(chǎn)人用藥品的方法純化，目前的純化方法主要是氯化銫梯度超離心，柱層折法也正在試驗(yàn)中。
目前適用于IL-2腺病毒治療的方法主要是直接或局部給藥，即讓病毒分散在藥理學(xué)上可接受的溶液中，通過直接注射入腫瘤中，以使重組IL-2腺病毒更接近腫瘤細(xì)胞，投放劑量一般是5×109個(gè)病毒/cm3癌組織。
對(duì)于較大腫瘤組織，采用切除配合注射重組IL-2腺病毒更為有效。同時(shí)，不僅要注意使用重組缺陷腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體的安全性，更應(yīng)監(jiān)測(cè)其使用劑量以進(jìn)一步減少不期望的副作用。
確定是否有效或是否有毒性，在療程開始前應(yīng)測(cè)量腫瘤的大小，包括最大直徑和垂直徑，以二者的乘積作為腫瘤大小的記錄。測(cè)定腫瘤需測(cè)指標(biāo)，從進(jìn)入程序開始測(cè)病人的存活期。
追蹤檢查應(yīng)包括所有用于腫瘤診斷的常規(guī)檢查與腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)、酶、抗原的檢驗(yàn)，X線診斷，CT診斷，MRI檢查，超聲檢查，放射性藥物顯象，放射性免疫顯象等方法。
本說明已借助優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以在不背離本發(fā)明的概念、范圍前提下對(duì)本文所述的載體、方法、步驟或各步驟的順序作出改動(dòng)。具體說，顯然可以用與白細(xì)胞介素2，在生物學(xué)上相關(guān)的基因，如其它細(xì)胞激動(dòng)素其它白細(xì)胞介素干擾素，胞落刺激素，α-腫瘤壞死因子，轉(zhuǎn)型生長(zhǎng)因子系列等，取代本發(fā)明構(gòu)建的IL-2腺病毒載體中的白細(xì)胞介素2基因，以及用類似本載體構(gòu)建時(shí)缺失E1插入表達(dá)序列盒的方法改造腺病毒的E2A、E2B、E3、E4等區(qū)域，以達(dá)到生產(chǎn)表達(dá)基因產(chǎn)物，以及用其它化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的制劑取代本文描述的制劑并獲得相同或相似結(jié)果。所有這些相似的取代或修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的，并屬于本發(fā)明權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍和概念之內(nèi)。所有權(quán)利要求的材料和方法均可重現(xiàn)。
本發(fā)明發(fā)明人已證明了本發(fā)明在治療癌療中的顯著作用，特別是IL2重組腺病毒可顯著激活免疫細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的識(shí)別及殺死作用。
基于下述幾個(gè)理由，本發(fā)明作為一個(gè)整體是非常優(yōu)秀的，首先，腺病毒攜帶的IL-2基因進(jìn)入靶細(xì)胞高效增殖，克服了單純使用IL-2的一切弊端，其次腺病毒的E1缺失，并在其位置上插入IL-2基因，而保留重組載體的E3區(qū)，則減小了機(jī)體對(duì)腺病毒的免疫反應(yīng)，第三IL-2腺病毒在腫瘤中表達(dá)，形成IL-2梯度，可輻射性地激活免疫細(xì)胞，從而在殺死癌細(xì)胞中顯示顯著療效。
權(quán)利要求
1.攜帶白細(xì)胞介素2(IL-2)的重組腺病毒載體，其特征是所說的載體包含位于巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動(dòng)子控制下的IL-2表達(dá)區(qū)，SV-40多聚腺苷化信號(hào)序列，及一段來自SV40小DNA序列。
2.按照權(quán)利要求1的重組腺病毒載體，其特征是在其構(gòu)建時(shí)，缺失了該病毒的E1區(qū)，在缺失處導(dǎo)入IL-2表達(dá)區(qū)，也可以缺失E2A區(qū)、E2B區(qū)、Ea區(qū)或E4區(qū)，并分別在上述缺失處導(dǎo)入表達(dá)基因。
3.按照權(quán)利要求1的重組腺病毒載體，其特征是在CMV早期基因啟動(dòng)子和IL-2基因之間插入有一個(gè)使IL-2轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著提高的DNA片段。
4.按照權(quán)利要求1、2、3的重組腺病毒載體，其特征是所說的DNA片段可以是來自SV-40的小DNA片段。
5.按照權(quán)利要求1的重組腺病毒載體，其特征是可以分散于藥理學(xué)上可接受的配方中。
6.用攜帶白細(xì)胞介素2(IL-2)的重組腺病毒載體感染癌細(xì)胞的方法，其特征是將腺病毒以藥理學(xué)上可接受的形式給含有癌細(xì)胞的哺乳動(dòng)物投用。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其特征是所說的癌細(xì)胞可以是人纖維瘤細(xì)胞或人乳腺癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞。
8.產(chǎn)生重組腺病毒的方法，其特征是該方法包括通過BamHⅠ，將IL-2cDNA插入pAC-CMVpLpA質(zhì)粒的多聚接頭區(qū)域，形成pAC-CMVpLpA-SV-IL2,pAC-CMVpLpA，一種穿梭質(zhì)粒，包含E1缺失的Ad5基因組中前3.2kbpJM17是一種含有E1區(qū)缺失的Ad5部分DNA序列的質(zhì)粒，通過pJM17和pAC-CMVpLpA-SV-IL2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用噬斑檢測(cè)法分析培養(yǎng)的293細(xì)胞是否有作為同源重組病毒產(chǎn)生之指征。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所說的共轉(zhuǎn)染是由Ca2+介導(dǎo)。
10.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是其中的腺病毒載體是有復(fù)制缺陷的，并且宿主細(xì)胞又能彌補(bǔ)這一缺陷。
11.按照權(quán)利要求8、10法的方法，其特征是所說的腺病毒載體缺少功能性的E1區(qū)，所說的宿主細(xì)胞是能夠表達(dá)E1區(qū)功能性蛋白的細(xì)胞。
12.按照權(quán)利要求8、10、11的方法，其特征是所說的宿主細(xì)胞可以是293細(xì)胞。
13.按照權(quán)利要求8、10、11的方法，其特征是所說的宿主細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
14.按照權(quán)利要求8、10的方法，其特征是檢測(cè)時(shí)，從表現(xiàn)噬斑的細(xì)胞培養(yǎng)物中得到DNA并使用表達(dá)載體特異性和腺病毒基因組特異性DNA探針經(jīng)PCR方法分析DNA，以證實(shí)重組腺病毒的存在。
15.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所使用的表達(dá)基因可以是其他的細(xì)胞激動(dòng)素。
16.按照權(quán)利要求8、15的方法，其特征是所說的細(xì)胞激動(dòng)素可以是白細(xì)胞介素(IL1-IL15)、干擾素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、胞落刺激素(CSFs、GM-CSF、GCSF)、α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、生長(zhǎng)因子β(TGF-βs)。
全文摘要
攜帶白細(xì)胞介素2(IL－2)重組腺病毒載體及其產(chǎn)生方法,屬于基因治癌藥物及其制備方法。該載體包含位于巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動(dòng)子控制下的IL－2表達(dá)區(qū)和SV－40多聚腺苷化信號(hào)序列,及來自SV40一小段DNA序列,由于這段DNA序列,使得重組載體能在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)IL－2,通過pJM17和pAC－CMVpLpA－SV－IL2共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,篩選得到重組病毒,能高效表達(dá)IL－2,使癌細(xì)胞內(nèi)人白細(xì)胞抗原(HLA)表達(dá)增強(qiáng),激活免疫細(xì)胞,殺死腫瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1213004SQ9710769
公開日1999年4月7日 申請(qǐng)日期1997年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者鄭常文 申請(qǐng)人:成都拜奧生物技術(shù)研究所