專利名稱：：Ice抑制肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠結(jié)合ICE和/或ICE家族酶的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:1構(gòu)成，其中的Xaa在Asp和Ala之間選擇，在此肽的N末端和/或C末端可任選地含有一個或多個氨基酸。本發(fā)明還涉及上述肽的用途，是用于制備病理學(xué)上具有活性的藥物組合物，所述活性要求抑制ICE和/或抑制ICE家族的酶。發(fā)明背景ICE(白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶)是一種異源二聚體半胱氨酸蛋白酶，最近已被純化和克隆(1)。白介素-1β(IL-1β)合成時是一種33kDa或31kDa的非活性前體(pIL-1β)；具有完全活性的17.5kDa成熟形式的IL-1β開始于Ala117處，似乎是由Asp116和Ala117之間的加工所產(chǎn)生。所以，IL-1β前體蛋白被ICE切割成成熟的生物活性形式。已經(jīng)在單核細胞和THP1細胞中鑒定到ICE活性，此酶在Asp116-Ala117和Asp24-Gly28處切割pIL-1β，分別生成17.5kDa和28kDa的產(chǎn)物(3,4)。各位點的切割作用依賴于P1位置的天冬氨酸(4,6,7)。顯然，與秀麗穩(wěn)桿線蟲(Caenorhabditiselegans)細胞死亡蛋白ced-3相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶代表了細胞程序死亡機制的效應(yīng)物成員。ICE是最早描述的CED-3同源體，并且已知，大鼠-1成纖維細胞內(nèi)ICE或CED-3的過度表達誘導(dǎo)細胞程序死亡(8)。進一步的研究也表明，ICE家族的蛋白酶可能在細胞程序死亡機理中起著重要作用。ICE似乎是一種pIL-1β特異性加工酶，因為它不切割I(lǐng)L-1α和含有許多Asp-X鍵的其它幾種蛋白。白介素IL-1α和IL-1β是多效細胞因子，雖然它們的序列鮮有相似，但是對不同的組織具有許多相似的作用，并對許多人類疾病病理有作用，尤其是對生物體的免疫應(yīng)答和炎癥過程有作用(9)。兩種蛋白的分子量均約為17.5kDa，在合成之初都是分子量約為31kDa的較大前體分子。IL-1是強炎性和熱原性細胞因子，通常對生物體具有有益作用，但是也具有極端的致病作用。例如，它們可能參與自身免疫病理(象全身性紅斑狼瘡)癥狀的發(fā)病機制，特別是，它們作為介體與引起組織損傷有關(guān)，如在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中。IL-1的許多生物作用與在敗血癥中所見的作用類似。最近的研究顯示以1至10ng/kg劑量靜脈給予IL-1引起發(fā)燒、嗜睡、厭食、全身性肌痛、關(guān)節(jié)痛和頭痛。由于IL-1具有多效生物活性(其中許多對生物體有不利影響)，故IL-1的強烈作用應(yīng)受到嚴格的生理控制。IL-1的合成受到抗炎性細胞因子、前列腺素和糖皮質(zhì)激素的抑制，而且，存在多種水平的IL-1抑制指出有必要對這一介體進行嚴格的控制。有兩類IL-1受體，稱為IL-1RⅠ和IL-1RⅡ。IL-1RⅡ是非信號性IL-1結(jié)合分子，對IL-1起著受調(diào)節(jié)的誘惑靶作用(10-12)。目前IL-1受體的一種拮抗性多肽已有所報道迄今已知的該受體結(jié)合性蛋白家族的第3成員是IL-1受體的拮抗劑(IL-lra)(13-15)。三個成員(IL-1α、IL-1β、IL-lra)都識別并結(jié)合細胞表面上的同一受體(IL-1R)；IL-1α、IL-1β與IL-1R的結(jié)合發(fā)出一個信號，而IL-lra則不。IL-lra是一種多肽，它結(jié)合IL-1RⅠ，并以較低的親和性結(jié)合IL-1RⅡ，而沒有任何激動活性。IL-lra在不同的細胞類型(包括單核吞噬細胞、多形核白細胞(PMN)和成纖維細胞。)中經(jīng)IgG、細胞因子和細菌產(chǎn)物誘導(dǎo)而產(chǎn)生。迄今已經(jīng)鑒定和克隆了IL-lra的兩種分子形式(1)分泌性IL-lra(sIL-lra)，含有一個25氨基酸的經(jīng)典前導(dǎo)序列，由此產(chǎn)生152氨基酸的成熟蛋白；(2)胞內(nèi)IL-lra(icIL-lra)，沒有前導(dǎo)序列，所以可推測該蛋白保留在胞內(nèi)。sIL-lra和icIL-lra是由同一基因產(chǎn)生的。icIL-lra轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是從一個可變起始位點開始，并從第一可變外顯子剪接成位于sIL-lra第一外顯子中的內(nèi)部剪接受體。所以據(jù)此推測的二種蛋白質(zhì)的差異僅在于它們的NH2末端，sIL-lra此處的前21個氨基酸在icIL-lra由4氨基酸取代。編碼sIL-lra和icIL-lra的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達受到不同的調(diào)控。icIL-lra的生物學(xué)意義尚不清楚?？紤]到IL-1與許多疾病的發(fā)病機理有關(guān)，顯然需要得到一些藥物用來限制IL-1的致病作用。最近鑒定并克隆了icIL-lra一種新的分子形式(16和PCT/EP95/04023)。該分子是在icIL-lra特定形式框架中的第一和第二外顯子之間插入一新的63bp外顯子而產(chǎn)生的。這種新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物已發(fā)現(xiàn)在成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、活化單核細胞和多形核細胞內(nèi)有表達。COS細胞內(nèi)的表達顯示，這種新的分子大多數(shù)位于胞內(nèi)，經(jīng)SDS-PAGE測定的分子量約為25kDa。這種新的分子稱為Ⅱ型icIL-lra(icIL-lraⅡ)?？紤]到icIL-lraⅡ是和ICE一樣的胞內(nèi)蛋白，申請人還測試了icIL-lraⅡ抑制ICE活性的能力。本申請的實施例中報道了測試的結(jié)果，顯示，icIL-lraⅡ抑制ICE的活性。本發(fā)明的說明本發(fā)明的主要目的是提供一種新的肽，它能夠結(jié)合ICE，由此阻斷IL-1β活性形式的生成，和/或更通俗地講，能夠結(jié)合ICE家族的酶，由此阻斷這類酶的活性。所以，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合ICE和/或ICE家族酶的肽，它主要由氨基酸序列SEQIDNO:1構(gòu)成，如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3具體所示，其中的Xaa在Asp和Ala之間選擇?？扇芜x的是，該肽在其N末端和/或C末端還含有一個或多個氨基酸。所以，本發(fā)明肽的長度可以是19至40氨基酸，19至25個更好。具體地說，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述的肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:4或5構(gòu)成。ICE家族的半胱氨酸蛋白酶的非限定性名單包括CED-3(17)、Nedd-2/ICH-1(18,19),Yama/CPP-32/Apopain(20,21,22),Tx/ICH-2/rel-Ⅱ(23,24,25),ICErel-Ⅲ(25),Mch-2(26),ICE-LAP3/Mch-3/CMH-1(27,28,29),ICE-LAP-6(30)和FLICE/MACH(31,32)。本發(fā)明的另一目的是提供足夠純凈形式的該肽，以適合作為藥物組合物中的活性成份，用于需要抑制ICE和/或抑制ICE家族酶的疾病病理中。適合用本發(fā)明的新拮抗劑來進行預(yù)防、治療或診斷的疾病病理實例是致死性細菌或病毒感染，以及自身免疫和炎性疾病。具體的例子包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、敗血性休克、急性髓性單核細胞性白血病、移植物抗宿主免疫學(xué)反應(yīng)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、潰瘍性大腸炎和多發(fā)性硬化癥。以下說明將顯示本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點。本發(fā)明的一個實施方案是給予患者藥學(xué)上活性量的本發(fā)明肽，所述患者處在發(fā)病危險中，需要抑制ICE和/或抑制ICE家族酶，或者患者已經(jīng)表現(xiàn)出這類病理癥狀。與主要活性成份相容的各種給藥途徑均可使用，但是尤其好的是腸胃外給藥，因為這樣可以在短時間內(nèi)獲得全身性作用。因此，較好的給藥方式是在臨手術(shù)前，手術(shù)中或手術(shù)后靜脈注射藥團。給予的肽劑量取決于根據(jù)患者年齡、體重和個人反應(yīng)性所作的醫(yī)療處方。劑量可以是0.05至30mg/kg體重，較好的劑量是0.1至10mg/kg體重，可以將腸胃外使用的藥物組合物制備成可注射形式的，其中含有主要活性成份和合適的媒質(zhì)。用于腸胃外給藥的媒質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的，例如水、鹽水、林格(Ringer)溶液和葡萄糖。媒質(zhì)中可以含有少量賦形劑，以保持溶液的穩(wěn)定性和滲透性?？梢愿鶕?jù)一般方式來制備上述溶液，較好的是，此肽含量在1mg/ml和10mg/ml之間。以上參考具體的實施方案對本發(fā)明進行了說明，但是本說明書的內(nèi)容函蓋了本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可能進行的各種修改和替換，這些修改和替換不超出本發(fā)明權(quán)利要求所限定的含意和宗旨。以下將通過實施例對本發(fā)明進行說明，不應(yīng)將這些實施例理解成為對本發(fā)明的限定。實施例將以以下附圖為參考。圖1:COS轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ICEmRNA表達的Northern分析。用模擬載體或用編碼人ICE的cDNA轉(zhuǎn)染COS細胞，提取總mRNA，對其進行Northern分析，以證明ICE特異性mRNA的表達。具體的說，泳道1模擬；泳道2:ICE。圖2:Western印跡分析。如文獻(4)所述制備單核細胞裂解液，將pIL-1β與之一起孵育；37℃孵育60分鐘后，將混合物進行SDS-PAGE，通過Western印跡分析證明存在前體I1-1β或成熟I1-1β。具體地說，泳道1:pIL-1；泳道2:pIL-1+單核細胞裂解液。圖3:所研究的肽的氨基酸序列。肽A(SEQIDNO:6)和肽C(SEQIDNO:4)是根據(jù)icIL-lraⅡ序列設(shè)計的。肽X(SEQIDNO:7)是隨機選取的肽。肽S(SEQIDNO:5)與肽C的差別僅在于兩個Ala取代了兩個Asp殘基。肽B(SEQIDNO:8)是已知的ICE抑制劑(Ia)。圖4:低濃度的本發(fā)明肽對ICE活性的抑制。在有或沒有肽(0.25或2.5μM)存在下，pIL-1β(5ng)與ICE一起孵育，如圖2所述證明有前體或成熟形式IL-1β的存在。具體地說，泳道1:pIL-1；泳道2:pIL-1+肽A；泳道3:pIL-1+肽B；泳道4:pIL-1+肽C；泳道5:pIL-1+ICE；泳道6:pIL-1+ICE+肽A(2.5μM)；泳道7:pIL-1+ICE+肽A(0.25μM)；泳道8:pIL-1+ICE+肽B(2.5μM)；泳道9:pIL-1+ICE+肽B(0.25μM)；泳道10:pIL-1+ICE+肽C(2.5μM)；泳道11:pIL-1+ICE+肽C(0.25μM)；圖5:高濃度的本發(fā)明肽對ICE活性的抑制。在有或沒有肽(40或400μM)存在下，pIL-1β(5ng)與ICE一起孵育，如圖2所述證明有前體或成熟形式IL-1β的存在。具體地說，泳道1:pIL-1+肽A；泳道2:pIL-1+肽B；泳道3:pIL-1+肽C；泳道4:pIL-1+肽X；泳道5:pIL-1；泳道6:pIL-1+ICE；泳道7:pIL-1+ICE+肽A(400μM)；泳道8:pIL-1+ICE+肽B(400μM)；泳道9:pIL-1+ICE+肽C(400μM)；泳道10:pIL-1+ICE+肽X(400μM)；泳道11:pIL-1+ICE+肽A(40μM)；泳道12:pIL-1+ICE+肽B(40μM)；泳道13:pIL-1+ICE+肽C(40μM)；泳道14:pIL-1+ICE+肽X(40μM)；圖6:肽C和S對ICE活性的抑制。在有或沒有肽(100、300或1,000μM)存在下，pIL-1β(5ng)與ICE一起孵育，如圖2所述證明有前體或成熟形式IL-1β的存在。具體地說，泳道1:pIL-1；泳道2:pIL-1+肽C；泳道3:pIL-1+肽S；泳道4:pIL-1+肽β；泳道5:pIL-1+ICE；泳道6:pIL-1+ICE+肽C(0.1mM)；泳道7:pIL-1+ICE+肽C(0.3mM)；泳道8:pIL-1+ICE+肽C(1mM)；泳道9:pIL-1+ICE+肽S(0.1mM)；泳道10:pIL-1+ICE+肽S(0.3mM)；泳道11:pIL-1+ICE+肽S(1mM)；泳道12:pIL-1+ICE+肽B(1mM)；實施例材料和方法試劑將以下市售試劑用于細胞培養(yǎng)和分離Ficoll(Seramed,Berlin,Germany),Percoll(Pharmacia,Uppsala,Sweden),RPMI1640(Seramed,Berlin,Germany),FCS(HycloneLaboratories,Logan,UK)，谷胺酰胺(Seramed,Berlin,Germany)，和HepesMerk,Darmastadt,Germany)細胞通過Ficoll梯度離心，從健康獻血者的外周血獲得單個核細胞。室溫下，2,000rpmPercoll梯度離心30分鐘，從單個核細胞分離出純化的單核細胞(10)。COS-7細胞(購自ATCC,Rockville,MD,USA)和單核細胞被培養(yǎng)在RPMI1640+10％FCS-2mM谷胺酰胺+20mMHepes。從CistronBiotechnology,Pinebroon,NJ,USA獲得人重組IL-1β前體。在該實驗室制備了與成熟和前體形式IL-1β都反應(yīng)的多克隆抗體。PCR根據(jù)公開序列(8a)，通過RT-PCR獲得ICEcDNA。參考文獻(16)進行30輪RT-PCR,95℃1分鐘另30秒，55℃1分鐘；另30秒和72℃1分鐘另30秒。從Duotech(MilanItaly)獲得寡核苷酸。用于選擇性擴增ICE的寡核苷酸的序列為“正向”ICE1:5’-AAAAGCCATGGCCGACAAGGTC-3’(SEQIDNO:9)“反向”ICE2:5’-TCTCTTCACCCTGCCCACAGAC-3’(SEQIDNO:10)結(jié)果COS細胞內(nèi)重組ICE酶的表達用PCR擴增了編碼人ICE的cDNA。對序列進行確認，并將此cDNA亞克隆到pSG5表達載體內(nèi)。用空載體(模擬)或含ICEcDNA的載體轉(zhuǎn)染COS細胞，48小時后，分析細胞內(nèi)ICE特異性mRNA的表達。如圖3所示，用ICEcDNA轉(zhuǎn)染的COS細胞表達高水平的ICEmRNA。如現(xiàn)有技術(shù)(11)制備的單核細胞裂解液也能夠?qū)L-1β轉(zhuǎn)化成成熟形式(圖2)。所以，將重組ICE或新鮮分離得到的人單核細胞在以后的實驗中用作ICE酶活性的來源。ICE活性的抑制制備ICE活性來源，通過在37℃孵育反應(yīng)1小時來測試其切割pIL-1β的能力。然后對混合物進行SDS-PAGE，通過Western印跡法來證明pIL-1β或其成熟形式的存在。我們設(shè)計和合成了4條不同的肽，并測試了它們抑制ICE活性的能力。這些肽顯示在圖3中，是利用AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的固相合成儀獲得的。利用高壓液相層析來驗證這些肽的純度。圖3所示的四肽B(Bachem,Bubendorf,Switzerland)，即已知的ICE抑制劑(Ia)，被用作陽性對照。參考文獻1．a(chǎn))Thomberry等，“Anovel；cysteineproteaseisrequiredforimterleukin-1βprocessinginmonocytes”，單核細胞內(nèi)白介素-1β的加工需要一種新的半胱氨酸蛋白酶，自然(Nature),356,768-774,1990；b)Ceretri等，白介素-1β轉(zhuǎn)化酶的分子克隆(Molecularcloningoftheinterleukin-1βconvertingenzyme)，科學(xué)(Science),256,97-100,1992；2．Cameron等，人IL-1的氨基酸序列分析。IL-1生物化學(xué)不同形式的證據(jù)(AminoacidsequenceanalysisofhumanIL-1.EvidenceforbiochemicallydistinctformsofIL-1)，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)162,790-801,1985；3．Mosley等，白介素-1受體結(jié)合人白介素-1α前體但是不結(jié)合白介素-1β前體(Theinterleukin-1receptorbindsthehumaninterleukin-1αprecursorbutnottheinterleukin-1βprecursor)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),262.2941-2944.1987；4．Kostura等，單核細胞特異性前體白介素-1β轉(zhuǎn)化酶活性的鑒定(Identificationofamonocytespecificpre-interleukin-1βconvertaseactivity)，美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),86,5227-5231.1989；5．Black等，共誘導(dǎo)蛋白酶對白介素-1β的活化作用(Activationofinterleukin-1βbyaco-inducedprotease),FEBSLett.,427,386-390,1989；6．Howard等，為了在兩個不同的位點加工IL-1β前體，IL-1轉(zhuǎn)化酶需要天冬氨酸，并且它不切割31kDa的IL-1α(IL-1convertingenzymerequiresasparticacidforprocessingoftheIL-1βprecursorattwodistinctsitesanddosenotcleave31kDaIL-1a)，免疫學(xué)雜志(J.Immol.)147.2964-2969,1991；7．Griffin等，ⅢInt.J.Mass.Spectrom.Ion.Phys.,11,131-149,1991；8．Miura等，用白介素1β轉(zhuǎn)化酶，C.elegans細胞死亡基因ced-3的哺乳動物同源體，在成纖維細胞內(nèi)誘導(dǎo)的細胞程序死亡(Inductionofapoptosisinfibroblastsbyinterleukin-1β-comvertingemzyme,amammalianhomologueoftheC.eleganscelldeathgeneced-3)，細胞(Cell),75,653-660,1993；9．Dinarello，白介素-1和白介素-1拮抗劑(Interleukin-1ansinterleukin-1antagonism)，血液(Blood),77,1627-1652,1991；10．Colotta等，Ⅱ型白介素-1受體受IL-4調(diào)控的IL-1的誘惑靶(Interliekin-1typeⅡreceptor:adecoytargetforIL-1thatisregulatedbyIL-4)，科學(xué)(Scieuce),261,472-475.1993；11．Sims等，只通過Ⅰ型受體發(fā)生的白介素-1信號(Iinterleukin-1signallingoccursexclusivelyviathetypeIreceptor,)，美國科學(xué)院院報，90,6155-6159,1993；12．Cootta等，今日免疫學(xué)志(ImmunolToday),15,562-566,1994；13．Hannum等，一種人白介素-1抑制劑的白介素-1受體拮抗劑活性(Interleukin-1receptorantagonistactivityofahumaninterleukin-Iinhibitor)，自然，343,336-340,1990；14．Eisenberg等，人白介素-1受體拮抗劑的初級結(jié)構(gòu)和互補DNA的功能表達(PrimarysructureandfunctionalexpressionformcomplementaryDNAofahumaninterleukin-lreceptorantagonist)，自然，343,341-346,1990；15．Carter等，白介素-1受體拮抗劑蛋白的純化、克隆、表達和生物學(xué)特性描述(Purification,cloning,expressionandbiologicalcharacterisationofaninterleukin-lreceptorantagonistprotein)，自然，344,633-638,1990；16．Muzio等，一種新白介素-1(IL-1)受體拮抗劑(ILlra)同種異型體的克隆和鑒定(Cloningandcharacterisationofanewisoformofinterleuk9in-1(IL-1)receptorantagonist:(ILlra))，實驗醫(yī)學(xué)雜志(JExpMed),182632,1995；17．Yuan等，C.elegans細胞死亡基因ced-3編碼一種與哺乳動物白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶相似的蛋白(C.eleganscelldeathgeneced-3encodesaproteinsimilartomammalianinterleukin-1β-convertingenzyme)，細胞，75,641-652,1993；18．Kumar等，利用小鼠nedd2基因誘導(dǎo)細胞程序死亡，該基因編碼與C.elegans細胞死亡基因ced-3產(chǎn)物和哺乳動物白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶相似的蛋白(Inductionofapoptosisbythemousenedd2gene,whichencodesaproteinsimilartotheproductoftheC.eleganscelldeathgeneced-3andthemammalianinterleukin-1β-convertingenzyme)，遺傳學(xué)進展(GenesDev.),8,1613-1626,1994；19．Wang等，Ich-1，一種Ice/ced-3相關(guān)基因，編碼細胞程序死亡的正調(diào)控物和負調(diào)控物(Ich-1,anIce/ced-3-relatedgene,encodesbothpositiveandnegativeregulatorsofprogrammedcelldeath)，細胞，78,739-750,1994；20．Fernandes-Alnemri等，CPP-32，一種新的人細胞程序死亡蛋白，具有與C.elegans細胞死亡蛋白CED-3和哺乳動物白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶的同源性(CPP-32,anovelhumanapoptoticproteinwithhomologytoC.deleganscelldeathprotinCDE-3andmammalianinterleukin-1β-convertingenzyme)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),269,30761-30764,1994；21．Nicholson等，對哺乳動物細胞程序死亡必需的ICE/CED-3蛋白酶的鑒定和抑制(IdentificationandinhibitionofICE/CED-3proteasenecessaryformammalianapoptosis)，自然，376,37-43,1995；22．Tewari等，Yama/CPP-32β,CED-3的一種哺乳動物同源體，是切割死亡基質(zhì)聚(ADP-核糖)聚合酶的CmA-可抑制蛋白酶(Yama/CPP-32β,amammalianhomologueofCED-3,isaCmA-inhibitableproteasethatcleavesthedeathsubstratepoly(ADP-ribose)polymerase)，細胞，81,801-809,1995；23．Faucheu等，一種與白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶相似的新的人蛋白酶在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)誘導(dǎo)細胞程序死亡(Anovelhumanproteasesimilartotheinterleukin-1β-convertingenzymeinducesapoptosisintransfectedcells(EMBOJ.),14,1914-1922,1995；24．Kamens等，ICH-2的鑒定與特性描述，半胱氨酸蛋白酶白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶家族的新成員(IdentificationandcharacterisationofICH-2,anovelmemberoftheinterleukin-1β-convertingenzymefamilyofcysteineproteases)，生物化學(xué)雜志，270,15250-15256,1995；25．Munday等，ICErel-Ⅱ和ICErel-Ⅲ的分子克隆和其細胞程序死亡活性，半胱氨酸蛋白酶ICE/CED-3家族的成員(MolecularcloningandproapoptoticactivityofICErel-ⅡandICErel-ⅢmembersoftheICE/CED-3familyofcysteineproteases)，生物化學(xué)雜志，270,15870-15876,1995；26．Fernandes-Alnemri等，Mch-2，半胱氨酸蛋白酶凋亡性CED-3/ICE基團家族的新成員(Mch-2,anewmemberoftheapoptoticCED-3/ICEcysteineprotoeasegenefamily)，癌癥研究，55,2737-2742.1995；27．Duan等，C.elegans細胞死亡蛋白CED-3的一種新的哺乳動物同源體，ICE-LAP3在Fas-和TNF誘導(dǎo)的細胞程序死亡中被活化(ICE-LAP3,anovelmammalianhomologueoftheC.eleganscelldeathproteinCED-3,isactivatedduringFas-andTNF-inducedapoptosis,)，生物化學(xué)雜志，2771,35013-35035,1996；28．Fernandes-AInemri等，Mch-3，與CPP-32高度相關(guān)的一種新的人細胞程序死亡半胱氨酸蛋白酶(Mch-3,anovelhumanapoptoticcysteineproteasehighlyrelatedtoCPP-32)，癌癥研究(CancerRes),55,6045-6052,1995；29．Lippke等，CPP-32/Mch-2同源體的鑒定和特性描述，一種與CPP-32類似的新的半胱氨酸蛋白酶(IdentificationandcharacterisationofCPP-32/Mch-2homologuel,anovelcysteineproteasesimilartoCPP-32)，生物化學(xué)雜志，271,1825-1828,1996；30．Duan等，CED-3/ICE基因家族的新成員，ICE-LAP6被細胞毒性T細胞蛋白酶粒酶B激活(ICE-LAP6,anovelmemberoftheCED-3/ICEgenefamily,isactivatedbythecytotoxicTcellproteasegranzymeB)生物化學(xué)雜志，1996年出版；31．Muzio等，F(xiàn)LICE，一種新的FADD同源性ICE/CED-3樣蛋白酶，是新的CD95(Fas/Apo-1)死亡誘導(dǎo)性信號復(fù)合體(FLICE,anovelFADD-homologousICE/CED-3-likeprotease,isrecruitedtotheCD95(Fas/Apo-1)Death-InducingSignallingComplex)，細胞，85,817-827,1996；32．Boldin等，一種新的MORT-1/FADD-相互作用蛋白酶，MACH涉及Fas/Apo-1和TNF受體誘導(dǎo)的細胞死亡(InvolvementofMACH,anovelMORT-1/FADD-interactingproteases,inFas/Apo-1andTNFreceptor-inducedcelldeath)，細胞，85,803-815；序列表(1)一般詳細(ⅰ)申請人(A)名稱APPLEDRESEARCHSYSTEMSARSHOLDINGN.V.(B)街道14,JOHNB.GORSIRAWEG(C)城市CURACAO(E)國家THENETHERLANDSANTILLES(F)郵政編碼(G)電話599-9-639300(H)傳真599-9-614129(ⅱ)發(fā)明名稱ICEINHIBTINGPEPTIDES(ⅲ)序列數(shù)量10(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/代號修飾位點(B)位置2(D)其它信息/注Xaa是以Asp或Ala為佳的氨基酸，是Asp更好(ⅸ)特征(A)名稱/代號修飾位點(B)位置19(D)其它信息/注Xaa是以Asp或Ala為佳的氨基酸，是Asp更好(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1:AlaXaaLeuTyrGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGlyGluAsp151015AsnAlaXaa(2)SEQIDNO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2:AlaAspLeuTyrGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGlyGluAsp151015AsnAlaAsp(2)SEQIDNO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3:AlaAlaLeuTyrGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGlyGluAsp151015AsnAlaAla(2)SEQIDNO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4:MetAlaLeuAlaAspLeuTyrGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlu151015GlyGluAspAsnAlaAspSerLys20(2)SEQIDNO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5:MetAleLeuAlaAlaLeuTyrGluGluGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlu151015GlyGluAspAsnAlaAlaSerLys20(2)SEQIDNO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6:GluGlyGluAspAsnAlaAspSerLys15(2)SEQIDNO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:7:PheLysAspProHisGlyLeuTrpLysGlyLeuSerHis1510(2)SEQIDNO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅸ)特征(A)名稱/代號修飾位點(B)位置1(D)其它信息/注Xaa是乙?；?ⅸ)特征(A)名稱/代號修飾位點(B)位置6(D)其它信息/注Xaa是-CHO(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:8:XaaTyrValAlaAspXaa15(2)SEQIDNO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸分子(A)說明/desc表示“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:9:AAAAGCCATGGCCGACAAGGTC22(2)SEQIDNO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸分子(A)說明/desc表示“寡核苷酸”(ⅲ)假設(shè)非(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:10:TCTCTTCACCCTGCCCACAGAC2權(quán)利要求1．一種能夠結(jié)合ICE或ICE族酶的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:1構(gòu)成，其中的Xaa在Asp和Ala之間選擇，在肽的N末端和/或C末端可任選地含有一個或多個氨基酸。2．根據(jù)權(quán)利要求1所示的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:2構(gòu)成。3．根據(jù)權(quán)利要求1所示的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:3構(gòu)成。4．根據(jù)權(quán)利要求1所示的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:4構(gòu)成。5．根據(jù)權(quán)利要求1所示的肽，該肽主要由氨基酸序列SEQIDNO:5構(gòu)成。6．根據(jù)權(quán)利要求1所述肽的用途，所述用途是醫(yī)藥用途。7．根據(jù)權(quán)利要求1所述肽的用途，用于制備在病理學(xué)上具有活性的藥物組合物，此活性要求抑制ICE和/或抑制ICE家族的酶。8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的疾病病理選自自身免疫疾病。9．根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的疾病病理選自致死性細菌和病毒感染。10．根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的疾病病理選自炎性疾病。全文摘要本發(fā)明涉及能夠結(jié)合ICE和/或ICE家族酶的肽,該肽主要由序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:1構(gòu)成,其中的Xaa在Asp和Ala之間選擇,在此肽的N末端和/或C末端可任選地含有一個或多個氨基酸。本發(fā)明還涉及上述肽用于制備在病理學(xué)上具有活性的藥物組合物,此活性要求抑制ICE和/或抑制ICE家族的酶。文檔編號A61P31/00GK1234805SQ96180489公開日1999年11月10日申請日期1996年10月31日優(yōu)先權(quán)日1996年10月31日發(fā)明者M·穆西奧,M·英特羅納,A·曼托瓦尼申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司